Summary
Aquí describimos y validamos un método para generar consistentemente cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos robustos y caracterizar su función. Estas técnicas pueden ayudar a desarrollar información mecanicista sobre las vías de señalización, proporcionar una plataforma para la detección de drogas a gran escala y modelar de forma fiable las enfermedades cardíacas.
Abstract
Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por el hombre (iPSC-CP) proporcionan una valiosa fuente humana para estudiar la ciencia básica de las vías de manejo y señalización del calcio (Ca2+),así como los ensayos de toxicidad y detección de fármacos de alto rendimiento. En este documento, proporcionamos una descripción detallada de las metodologías utilizadas para generar iPSC-CP de alta calidad que pueden reproducir consistentemente características moleculares y funcionales a través de diferentes líneas celulares. Además, se describe un método para evaluar de forma fiable su caracterización funcional mediante la evaluación de las propiedades de manipulación de Ca2+. Las condiciones de bajo oxígeno (O2),la selección de lactato y el tiempo prolongado en el cultivo producen cardiomiocitos ventriculares de alta pureza y alta calidad. Al igual que los cardiomiocitos adultos aislados de ratas (ARCM), los iPSC-CP de 3 meses de edad presentan una mayor amplitud de Ca2+, una tasa más rápida de retoma de Ca2+ (decay-tau) y una respuesta lusitrópica positiva a la estimulación adrenérgica en comparación con el día 30 iPSC-CP. La estrategia es técnicamente simple, rentable y reproducible. Proporciona una plataforma robusta para modelar enfermedades cardíacas y para el cribado de fármacos a gran escala para apuntar a Ca2+ manipulando proteínas.
Introduction
Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por el hombre (iPSC-CP) son una atractiva plataforma basada en el hombre para modelar una gran variedad de enfermedades cardíacas in vitro1,2,3,4,5,6,7,8. Además, los iPSC-CP se pueden utilizar para la predicción de las respuestas de los pacientes a fármacos novedosos o existentes, para detectar compuestos de éxito, y desarrollar nuevos fármacos personalizados9,10. Sin embargo, a pesar de los progresos significativos, deben tenerse en cuenta varias limitaciones y desafíos al utilizar iPSC-CP11. En consecuencia, se han estudiado intensamente métodos para mejorar los protocolos de diferenciación cardíaca, para mejorar la eficiencia y maduración de los IPSC-CPM, y para generar subtipos específicos de cardiomiocitos (ventricular, auricular y nodal) y ya han llevado a numerosas estrategias de cultivo para superar estos obstáculos12,13,14,15.
A pesar de la robustez de estos protocolos, una de las principales preocupaciones para el uso de iPSC-CP es la reproducibilidad de procedimientos largos y complejos para obtener cardiomiocitos de alta calidad que pueden garantizar el mismo rendimiento reproducible y resultados ibles. La reproducibilidad es fundamental no sólo cuando se comparan líneas celulares con diferentes orígenes genéticos, sino también cuando se repiten las comparaciones celulares y moleculares de la misma línea celular. La variabilidad celular, como las diferencias bien a pozos en la densidad de los ISPc, pueden afectar la diferenciación cardíaca, generando un cardiomiocitos de bajo rendimiento y mala calidad. Estas células todavía podrían utilizarse para realizar experimentos que no requieren una población pura de CMs (por ejemplo, al realizar mediciones transitorias de Ca2+). De hecho, al realizar análisis electrofisiológicos, los no-CMs no golpearán, ni espontáneamente ni bajo estimulación eléctrica, por lo que será fácil excluirlos del análisis. Sin embargo, debido a la mala calidad, iPSC-CP puede mostrar características electrofisiológicas alteradas (por ejemplo, Ca2+ irregular transitorio, baja ca2+ amplitud) que no se deben a su composición genética. Por lo tanto, especialmente cuando se utilizan iPSC-CM para modelar enfermedades cardíacas, es importante no confundir los resultados de un CM de mala calidad con el fenotipo de la enfermedad. Se requieren procesos cuidadosos de detección y exclusión antes de proceder a estudios electrofisiológicos.
Este método incluye protocolos optimizados para generar cardiomiocitos de alta pureza y alta calidad y para evaluar su función realizando mediciones transitorias de Ca2+ utilizando un sistema de adquisición y análisis de calcio y contractilidad. Esta técnica es una forma sencilla, pero potente, de distinguir entre preparaciones iPSC-CM de alta eficiencia y baja eficiencia y proporcionar una caracterización más relevante fisiológicamente de los iPSC-CM humanos.
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Protocol
Los experimentos con cardiomiocitos adultos de ratas en este estudio se llevaron a cabo con protocolos aprobados del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Escuela de Medicina de Icahn en Mount Sinai. Los cardiomiocitos adultos de ratas fueron aislados de los corazones de rata Sprague Dawley por el método basado en Langendorff como se describió anteriormente16.
1. Preparación de medios
- Prepare los medios hiPSC.
- Equilibrar el suplemento y la temperatura basal media-ambiente (RT). Asegúrese de que el suplemento se ha desconscongelado por completo. Mezclar 400 ml del medio basal y 100 ml del suplemento y filtro utilizando un filtro accionado por vacío de 0,22 m. Conservar a 4oC y equilibrar a RT antes de su uso.
- Preparar RPMI + B27.
- Equilibrar el suplemento B27 y el medio basal (RPMI 1640) a RT. Asegúrese de que el suplemento se ha desconsado completamente. Mezclar 490 ml del medio basal y 10 ml del suplemento 50x y el filtro utilizando un filtro accionado por vacío de 0,22 m. Conservar a 4oC y equilibrar a RT antes de su uso.
- Preparar la insulina RPMI + B27 (-).
- Equilibrar el suplemento de insulina B27 (-) y el medio basal (RPMI 1640) a RT. Asegúrese de que el suplemento se ha desconshielo completamente. Mezclar 490 ml del medio basal y 10 ml del suplemento 50x y el filtro utilizando un filtro accionado por vacío de 0,22 m. Conservar a 4oC y equilibrar a RT antes de su uso.
- Preparar medios de selección (RPMI (-) glucosa + B27 + lactato).
- Equilibrar el suplemento B27 y el medio basal (RPMI 1640 (-) glucosa) a RT. Asegúrese de que el suplemento se ha desconshielo completamente. Mezclar 490 ml del medio basal y 10 ml del suplemento 50x, añadir 4 mM de lactato sódico constituido en agua estéril y filtrar con un filtro accionado por vacío de 0,22 m. Conservar a 4oC y equilibrar a RT antes de su uso.
- Prepare RPMI 20.
- Equilibrar el medio basal (RPMI 1640) a RT. Mezclar suero bovino fetal (FBS) (20% concentración final) y RPMI. Filtrar con un filtro accionado por vacío de 0,22 m y guardarlo a 4 oC. Equilibrar a RT antes de su uso.
- Prepare los medios de paso añadiendo inhibidor de la proteína quinasa (ROCK) asociado a Rho a los medios de hiPSC.
- Preparar los medios D0 añadiendo el inhibidor GSK-3, CHIR 99021 a LOS medios de insulina RPMI + B27 (-) (10 M final).
- Preparar los medios D3 y D4 mezclando los medios de insulina RPMI + B27 (-) con IWR-1 (5 M final).
NOTA: Los medios D1 y D5 están constituidos por insulina RPMI + B27 (-). Los medios D7 están constituidos por RPMI + B27. - Preparar el tampón de bloqueo (2% albúmina sérica bovina [BSA], 2% FBS, 0.05% NP-40 en solución salina con fosfato tamponada [PBS]): En un tubo cónico de 50 ml, agregue 1 g de BSA, 1 ml de FBS, 49 ml de PBS y 250 l de NP-40. Mezclar hasta que se disuelva por completo.
2. Preparación de células madre embrionarias humanas (hESC) calificadas con placas y cubiertas
NOTA: Realice todos los pasos bajo una capucha de cultivo de tejido esterilizado.
- Descongelar la solución de matriz calificada por hESC durante la noche sobre hielo a 4 oC. Consulte la hoja de especificaciones del producto para determinar los volúmenes de alícuota apropiados, ya que esto puede variar dependiendo de la existencia. Almacene estas alícuotas a -20 oC en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Para utilizar la matriz para placas de recubrimiento o tapas de vidrio, primero descongelar una alícuota de matriz calificada por hESC a 4 oC durante 30 min.
- Aliquot 24 mL de medio águila modificado (DMEM) de Dulbecco en frío: mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F:12) en un tubo cónico de 50 ml.
- Mezcle el medio DMEM/F:12 frío con una pipeta de vidrio de 2 ml para enfriar la superficie de la pipeta.
- Con la misma pipeta, tome aproximadamente 500-700 ml de DMEM/F:12 en frío y mezcle con la alícuota de matriz calificada por hESC dentro del propio tubo de microcentrífuga.
- Una vez mezclado correctamente, transfiera la solución al tubo cónico de 50 ml que contiene el DMEM/F:12 frío y mezcle de nuevo.
- Para una placa estándar de 6 pocillos, agregue 1 ml de esta mezcla a cada poca. Asegúrese de que el pozo esté completamente cubierto. Deje las placas en RT debajo de la campana de cultivo de tejido durante al menos 30 minutos. Si lo desea, conservar a 4 oC inmediatamente después de la chapado durante un máximo de 1 semana y equilibrar a RT durante 30 minutos antes de su uso.
- Para utilizar las placas, aspirar la matriz y reemplazarla con los medios apropiados. Utilícelo inmediatamente.
- Almacene los cubreobjetos de vidrio en un ambiente estéril (por ejemplo, dentro de una capucha de cultivo de tejido estéril).
- Antes de recubrir, limpie cada cubreobjetos individuales con 70% de etanol. Una vez que el cubreobjetos esté seco, colóquelo dentro de un pozo de una placa estéril de 6 pocillos.
- Tomar 250 a 300 ml de la solución de matriz calificada por hESC y dispensarla cuidadosamente directamente en el centro de la cubierta de vidrio. Deje los cubreobjetos en RT debajo de la capucha de cultivo de tejido durante al menos 30 minutos antes de su uso.
3. Preparación de moléculas pequeñas
NOTA: Reconstituya todas las moléculas pequeñas y moduladores Wnt en DMSO a menos que se indique lo contrario.
- Preparar alícuotas de 10 mM de 25 ml cada una de IWR-1 y CHIR 99021 y almacenar a -20 oC.
- Reconstituir 10 mM alícuotas de 50 ml cada una de tiazovivin (inhibidor de LAN) y almacenar a -20 oC.
4. Mantenimiento y Passaging de iPSCs
NOTA: Realice todos los pasos siguientes bajo una capucha de cultivo de tejido estéril.
- Mantenga los iPSC en 6 placas de pozo estándar y realice todos los pasos en condiciones estériles. Mantenga las células con 2 ml de medios hiPSC por pozo. Cambie los medios cada dos días. Mantenga las células a 37 oC, 6% O2,5% CO2. Pasaje de las células cuando están entre 70-80% confluentes.
- Equilibrar PBS sin Ca2+ y Mg2+ a RT.
- Para iniciar el proceso de passaging, agregue 1 mL de PBS sin Ca2+ y Mg2+ al pozo que necesita ser pasado. Incubar a RT durante 7 x 10 minutos. Compruebe las células debajo del microscopio para asegurarse de que el tratamiento con PBS no ha dado lugar a una disociación completa de la monocapa.
- Retire PBS y sustitúyalo por 1 ml de medios de paso. Utilice un levantador de células para raspar y levantar suavemente las células de la superficie del pozo.
- Disociar mecánicamente las células con una pipeta de vidrio estéril de 2 ml. Repita hasta que las células se disocien uniformemente en pequeñas colonias cuando se observen bajo un microscopio.
- Una vez que las células se han disociado lo suficiente, agregue 5 ml de medios de paso para dividir las celdas 1:6. Ajuste la cantidad de medios de paso que se agregarán para que coincidan con la relación de división preferida.
- Aspirar la matriz calificada por hESC de la placa recubierta de matriz calificada por hESC y reemplazarla con 1 ml de medios de paso por pocido. Añadir 1 ml de células disociadas por pozo.
5. Diferenciación de cardiomiocitos
- Utilizar líneas hiPSC bien establecidas (más de 20 pasajes) y exhibir una morfología homogénea antes de iniciar la diferenciación cardíaca.
- Asegúrese de que los iPSC son alrededor del 70-80% confluente.
- Lave las células 1x en PBS sin Ca2+ y Mg2+.
- Agregue 2 ml de medios D0 (paso 1.7) por pozo y transfiera las células de nuevo a la incubadora.
- Después de 24 h, reemplazar con 3 mL de medios D1 por pozo durante 48 h.
- En el día 3, reemplace el medio por 2 ml de medios D3 por pozo. Repita con el soporte D4 el día 4.
- En el día 5, reemplace el medio por 3 ml de medios D5 por pozo.
- En el día 7, sustituya el medio por 3 ml de medios D7 por poca y transfiera a una incubadora con 37oC, 5%CO2y concentración normal deO2. Sustituya el soporte D7 (RPMI + B27) cada 2 días.
6. Procedimiento de selección y disociación iPSC-CM
- Diez días antes de realizar las mediciones transitorias Ca2+ o cualquier análisis funcional, sustituya el soporte RPMI + B27 por 3 ml de soporte de selección por pozo durante 48 h.
- Sustituya el soporte por 3 ml de soporte de selección por otros 48 h.
- Sustituya el soporte por 2 ml de RPMI + B27 por pozo durante 24 horas.
- Capa estándar 6 placas de pozo según se describe en la sección 2.
- Añadir 1 ml de trippsina estéril 0.25% con EDTA a cada pocto. Incubar la placa a 37oC durante 5 min.
- Usando una pipeta de 1.000 l, disocia mecánicamente las células para que se puedan ver células individuales cuando se observen bajo un microscopio.
- Transfiera las células a un tubo cónico estéril de 15 ml y agregue 2 ml de RPMI 20 media por poca. Centrífuga durante 5 min a 800 x g.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en medios RPMI + B27. Aspirar la matriz calificada por hESC de las placas y reemplazar con 1 mL de medios RPMI + B27.
- Usando una punta de pipeta de 1.000 ml, disocia mecánicamente el pellet celular hasta que la solución parezca homogénea.
- Transfiera aproximadamente 500.000 células a cada pozo. Traslado a incubadora durante 24 h.
- Sustituya el soporte por 3 ml de soporte de selección por pozo durante 48 h.
- Sustituya el soporte por 3 ml de RPMI + B27 por pozo. Mantenga las celdas en medios D7 (RPMI + B2 cambiando el medio cada 2 días hasta que estén listos para el análisis funcional.
7. Preparación de iPSC-CP para la citometría de flujo
- Una vez que las células son de la edad deseada y han sido sometidas a selección metabólica (sección 6), lave las células con PBS sin Ca2+ y Mg2+.
- Añadir 1 mL por pozo de tripsina 0,25% e incubar durante 5 x 7 min a 37 oC.
- Pipetear la mezcla de 5 a 10x con una punta P1000 para singularizar las células, y transferir a un tubo de 15 ml que contiene 2 ml de RPMI 20.
- Gire las células a 600 x g durante 5 min.
- Añadir 100 l de solución de fijación (4% PFA) al pellet celular. Agregue la solución en gota con un vórtice continuo y suave y luego colóquela en hielo durante 15 minutos.
- Agregue 1,5 mL de PBS. Recoger las células por centrifugación y aspirar el sobrenadante.
- Para cada experimento, incluya un control sin mancha por condición de fijación/permeabilización.
- Resuspender las células en 500 sL de solución de bloqueo (2% FBS/2% BSA en PBS con 0.1% NP-40) durante 30 min en RT.
- Sin extraer la solución de bloqueo, añada el anticuerpo primario MLC2V/MLC2A (5 mg/mlL) e incubar 45 min a RT.
- Lavar con tampón de bloqueo. Recoger las células por centrifugación y solución de aspiración.
- Añadir anticuerpo secundario Alexa Fluor 555/488(1:750) diluido en el tampón de bloqueo durante 45 minutos a RT o durante la noche a 4 oC.
- Agregue 1,5 mL de PBS. Recoger las células por centrifugación y solución de aspiración.
- Resuspenda las células en 250 a 300 l de PBS. Utilice una pipeta P1000 para desagregar las células.
- Prepare tubos inferiores redondos con una tapa de colador de celda de malla de nylon de 35 m. Humedezca previamente el colador celular con 50 ml de PBS y ponga el tubo en hielo.
- Transfiera la solución con las células desagregadas a los tubos inferiores redondos con las tapas del colador de las células. Permita que la solución celular drene naturalmente o toque la parte inferior del tubo contra una superficie plana, según sea necesario, para asegurar el drenaje completo y la recolección de las células en el tubo. Asegúrese de volver a poner el tubo en hielo tan pronto como sea posible.
- Enjuague el colador de células con 250 ml de PBS para recuperar las células residuales.
- Mantenga los tubos sobre hielo y cubra con papel de aluminio hasta el análisis de citometría de flujo.
8. Placar cardiomiocitos en Glass Coverslips
NOTA: Realice todos los pasos en un entorno estéril.
- Prepare los labios de las cubiertas de vidrio como se describe en los pasos 2.10 y 2.11.
- Una vez que los iPSC-CP se han seleccionado y son de la edad deseada, siga los pasos 6.5-6.7 para disociar los iPSC-CP.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en una cantidad suficiente de RPMI 20 medios para tener aproximadamente 300.000 células por 250 s.
- Usando una pipeta de vidrio de 2 ml, disocia mecánicamente el pellet celular hasta que la solución parezca homogénea.
- Aspirar la matriz calificada por hESC desde los labios de las cubiertas.
- Con una pipeta de 1000 ml, mezcle y extraiga 250 ml de la solución del tubo cónico de 15 ml.
- Dispensar lentamente los 250 ml de la solución en los revestimientos de vidrio, teniendo especial cuidado de añadir sólo a la zona donde está presente el recubrimiento de matriz calificado por hESC.
- Transfiera cuidadosamente a la incubadora y deje durante la noche, teniendo cuidado de no agitar o esparcir las células en los labios de las cubiertas. A la mañana siguiente, agregue suavemente 2 ml de medios D7 (RPMI + B27) a cada poca con el cubreobjetos. Cambie el medio después de 24 h y cada 2 días después de eso.
9. Fijación de células
- Asegúrese de que una cantidad adecuada de PBS con Ca2+ y Mg2+ se equilibra a 4 oC.
- Preparar una solución de paraformaldehído (PFA) del 4% diluida en PBS con Ca2+ y Mg2+ y equilibrar a 4 oC.
- Una vez que los iPSC-CMs son de edad apropiada, han sido sometidos a selección metabólica (sección 6), y han sido chapados en cubres (sección 8), lavar las células 3x con 1 mL de PBS frío con Ca2+ y Mg2+ por pozo.
- Añadir 1 ml de frío 4% PFA y dejar las células en RT debajo de la campana durante 15 min.
- Lave las células con PBS frío para eliminar el exceso de PFA.
- Añadir 2 mL de PBS con Ca2+ y Mg2+ y almacenar a 4 oC.
10. Mancha de inmunofluorescencia
- Quite el PBS de las células fijas y agregue 1 mL del buffer de bloqueo. Incubar durante 1 h a RT.
- Retire el tampón de bloqueo y añada el anticuerpo primario (5 mg/ml) diluido en el tampón de bloqueo. Incubar durante la noche a 4oC.
- Lavar 3 x en PBS con Ca2+ y Mg2+ durante 5 min cada uno.
- Añadir anticuerpo secundario diluido en el tampón de bloqueo 1:1.000.
- Cubra la placa con papel de aluminio para protegerla de la luz e incubar durante 45 minutos en RT. Mantenga la lámina de aluminio para los siguientes pasos.
- Lavar 3x en PBS con Ca2+ y Mg2+, 5 min cada uno.
- Agregue una cantidad suficiente de solución de trabajo DAPI para cubrir completamente las células e incubar a RT durante 10 minutos.
- Lave bien la muestra con PBS con Ca2+ y Mg2+ para eliminar el exceso de DAPI.
- Tome nuevos portaobjetos de vidrio y agregue una gota de soporte de montaje en el medio. Utilice el cuentagotas para extender uniformemente el soporte de montaje. Coloque los labios de las cubiertas con las células boca abajo en las diapositivas.
NOTA: Las celdas se pueden almacenar durante 30 días si están protegidas de la luz.
11. Evaluación de los transitorios Intracellular Ca2+
- Una vez que los iPSC-CMtengan al menos 3 meses de edad, hayan sido sometidos a selección metabólica (sección 6), y hayan sido chapados en cubreobjetos, trátenlos con 2 ol de Fura-2, AM (concentración final: 1 m) e incuban a 37 oC durante 10 min.
NOTA: Fura-2 es sensible a la luz. Realice todos los procedimientos de carga y experimentos en la oscuridad. - Preparar el sistema de adquisición y análisis de calcio y contractilidad.
- Encienda el sistema asegurándose de que la lámpara de arco está iniciada(Figura 1B).
- Coloque la cámara en el sistema y conecte los tubos de la bomba a la entrada y salidas apropiadas y el cable eléctrico del estimulador a la cámara como se muestra en la Figura 1C.
- Llene el tubo de perfusión que atraviesa el calentador en línea fluido con la solución de Tyrode precalentada a 37 oC.
- Ajuste las dimensiones de apertura de la cámara y el encuadre para minimizar el área de fondo.
- Monte una cubierta de vidrio con iPSC-CMs en la cámara y fíjela.
- Agregue 500 ml de la solución de Tyrode directamente encima de la cubierta de vidrio sujetado suavemente y comience a perfumar la cámara (1,5 ml/min) con la solución de Tyrode.
- Pace iPSC-CMs con estimulación de campo de 1 Hz utilizando el estimulador eléctrico (10 V, 4 ms).
- Incubar iPSC-CMs en la cámara con estimulación durante al menos 3 x 5 min para que las células laven el tinte Fura-2 y se adapten al medio ambiente y lave el tinte fluorescente.
- Ajuste la ventana de visualización a la parte superior izquierda del cubreobjetos de vidrio.
- Comience a grabar.
- Después de recopilar una secuencia coherente de 5 a 10 picos, haga clic en Pausar para detener temporalmente la grabación.
- Asegurarse de que ni el enfoque ni las dimensiones de la ventana de visualización se alteren, mueva la etapa del microscopio al área adyacente, moviéndose hacia el extremo opuesto y reanude la grabación.
- Repita los pasos 11.9 y 11.10 para escanear a través de la cubierta, moviéndose inicialmente a la izquierda, luego hacia abajo de una manera en zig-zag para cubrir toda el área de la cubierta. Esto consiste en 80 a 100 mediciones por cubretapa.
NOTA: Restringir el tiempo total de medición a 10 min ya que los factores secundarios causan una disminución en Ca2+ transitorio. - Una vez adquiridos los transitorios Ca2+, analice los datos con el software de análisis de trazas de fluorescencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
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Representative Results
El protocolo descrito en la Figura 1A generó cardiomiocitos altamente puros que adquieren un fenotipo ventricular/adulto con tiempo en cultivo. Según se evalúa mediante la tinción de inmunofluorescencia para las isoformas de la cadena de luz reguladora de miosina auricular y ventricular 2 (MLC2A y MLC2V, respectivamente), la mayoría de las células generadas por este protocolo fueron MLC2A-positivas en el día 30 después de la inducción de la diferenciación cardíaca, mientras que MLC2V se expresó en cantidades mucho más bajas al mismo tiempo(Figura 2A,paneles superiores). A medida que aumentaba el tiempo en el cultivo (día 60 y 90), se observó un interruptor completo de isoformas MLC2 (MLC2A a MLC2V)(Figura 2A,paneles inferiores). Para cuantificar las células MLC2A y MLC2V-positivas, se realizó el análisis de citometría de flujo. De acuerdo con los resultados de la inmunofluorescencia, los datos de citometría de flujo demostraron etapa temprana (día 30) iPSC-CP en su mayoría que expresan MLC2A (29,8% MLC2A + vs. 1.9% MLC2V +) (véase la Figura 2B, panel izquierdo), en comparación con la etapa tardía (día 90) iPSC-CP, que en su mayoría expresó MLC2V (41,3% MLC2V + vs. 16,7% MLC2A +) (véase la figura 2B, panel derecho). Debido a que se sabe que el patrón de expresión de MLC2A y MLC2V es un sello distintivo de la diferenciación y maduración cardíaca, estos resultados sugieren que el tiempo de cultivo prolongado aumenta la maduración de los iPSC-CP Y que la mayoría de las células parecen estar comprometidas con el fenotipo ventricular. A continuación, evaluamos la dependencia temporal de Ca2+ manipulando la maduración. Ca2+ transitorio se midió en iPSC-CP en los tres momentos de diferenciación (días 30, 60 y 90), y en comparación con los cardiomiocitos adultos aislados de ratas (ARCM). La amplitud De Ca2+ se incrementó significativamente en los iPSC-CP en el día 90 y fue similar a las ARCM(Figura 3A,B). La tasa de retoma de Ca2+ (decay-tau) en el día 90 fue significativamente más rápida en comparación con el día 30 iPSC-CP, y más cercana a los ARCM(Figura 3C). El efecto de la estimulación adrenérica en los transitorios Ca2+ se evaluó aún más mediante el tratamiento de las células con 10 nM de isoproterenol (ISO) durante 10 min a 37 oC. Como se observó en los ARCM, ISO aumentó significativamente Ca2+ transitorio y aceleró la tasa de retoma de Ca2+ en el día 90 iPSC-CP. No se observaron cambios en el día 30 iPSC-CP(Figura 3D-F). Curiosamente, el día 90 iPSC-CMs fueron capaces de seguir el aumento de la estimulación eléctrica (de 0,5 a 3 Hz), de una manera similar a la observada en arcMs(Figura 4B). En conjunto, estos resultados muestran que los iPSC-CP derivados de este método tienen características similares a las que se ven en los CP nativos, específicamente fenotipos similares a los ventriculares, propiedades maduras de manejo de Ca2+ y respuestas adrenérgicas positivas.
La contaminación de las células no cardíacas puede influir en la maduración funcional de los iPSC-CP humanos durante la diferenciación17. La Figura 4A muestra una comparación entre las células de 3 meses de edad obtenidas de diferencias de alta eficiencia (paneles superiores, Video 1),expresando robustamente el marcador ventricular específico (MLC2V), y células de 3 meses de edad obtenidas de diferencias de baja eficiencia (paneles inferiores, Video 2),mostrando iPSC-CP mezcladas con células positivas de actina muscular alfa-suave . Curiosamente, el análisis funcional demostró transitorios Ca2+ alterados en la preparación mixta iPSC-CP/no-CMs en comparación con los iPSC-CP de la diferenciación de alta eficiencia. En particular, las células obtenidas de diferencias de baja eficiencia mostraron una amplitud y automaticidad muy pequeñas de Ca2+ (Figura 4B,panel medio) en comparación con los iPSC-CM puros(Figura 4B,panel superior) y ARVCs(Figura 4B,panel inferior). Además, las células de diferencias de baja eficiencia presentaban patrones arritmicos(Figura 4C).
Es importante tener en cuenta que los iPSC-CP mostrados en el panel superior de la Figura 4A también se sometieron a una selección metabólica, que es un paso importante para enriquecer aún más a una población de iPSC-CP que ya se deriva de una diferenciación altamente eficiente. Estos datos indican que los protocolos de diferenciación cardíaca de alta eficiencia que generan cajeros automáticos de alta calidad son necesarios para recapitular con precisión un fenotipo cardíaco in vitro.
La Figura 5 muestra la variabilidad de amplitud Ca2+ a través de diferentes áreas de la monocapa de los MM, trazada en un curso de tiempo de 1.200 s. Las amplitudes Ca2+ medidas al principio de una frecuencia de estimulación de 1 Hz (200 s) fueron muy variables y se volvieron más consistentes a medida que la estimulación continuó (200-900 s). Sin embargo, después de un período de tiempo de 900 s la amplitud Ca2+ se redujo considerablemente. Estos datos indican que, al registrar cotros2+ transitorios en iPSC-CP, es necesario dejar que las células se estabilicen a 37 oC bajo estimulación constante durante al menos 200 s. Además, las grabaciones deben restringirse a una ventana de tiempo específica (200-900 s) para garantizar resultados reproducibles.
Figura 1: Esquema general de la preparación de iPCS-CM e instrumentos transitorios Ca2+. (A) Esquema de protocolo de diferenciación cardiaca que muestra las etapas de desarrollo de los ISC diferenciadores. Barra de escala a 50 m. (B) El sistema de adquisición y análisis de calcio y contractilidad. a) Bomba peristáltica b) Microscopio invertido c) Fuente de alimentación para la cámara digital d) Estimulador eléctrico e) Interfaz del sistema de fluorescencia f) Controlador de rueda de filtro (C) Cámara del sistema. a) Cuerpo de la cámara del sistema. b) Entrada fluida. c) Salida de fluidos. d) Calentador de solución en línea fluida. f) Electrodos que conectan la cámara del sistema al estimulador eléctrico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Comparación de la expresión MLC2A y MLC2V en iPSC-CM en diferentes días de diferenciación. (A) Tinción de inmunofluorescencia de iPSC-CP en los días 30, 60 y 90 después de la inducción de diferenciación para MLC2A y MLC2V. Barra de escala a 20 m. (B) Análisis de citometría de flujo de iPSC-CP para MLC2V y MLC2A a 1 mes y 3 meses después de la diferenciación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Comparación de propiedades iPSC-CM en diferentes días de diferenciación. (A) Representante Ca2+ trazas transitorias en diferentes días de diferenciación. (B-C) La amplitud media de Ca2+ y la descomposición de Ca2+ provocaron durante la estimulación a 1 Hz. (D-F) Efecto del tratamiento de isoproterenol (ISO, 10 nM) en iPSC-CP en diferentes días de diferenciación. Los ARCM indican cardiomiocitos adultos de rata aislados. N 70 a 100 áreas; *p < 0.05; p < 0.001, según lo determinado por la prueba tdel estudiante. Los datos se representan como Media s.E.M. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Comparación entre diferenciaciones de alta eficiencia y baja eficiencia de iPSC-CM. (A) Tinción de inmunofluorescencia de iPSC-CP Para sSMA y MLC2V. Barra de escala a 20 m. (B) Rastros representativos que muestran C2+ transitorios de diferenciaciones de alta eficiencia (arriba) y baja eficiencia (media), y cardiomiocitos adultos de rata aislada (abajo). Los miocitos fueron estimulados a 0,5 Hz, 1 Hz, 1,5 Hz, 2 Hz y 3 Hz. (C) Rastro representativo que muestra un patrón arritmico de una mala diferenciación. Las flechas indican el ritmo de punto. Los ARCM indican cardiomiocitos adultos de rata aislados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Amplitud Ca2+ dependiente del tiempo desde un solo tapón. Las amplitudes Ca2+ de diferentes áreas en un cubreobjetos se trazaron de una manera dependiente del tiempo. Los períodos de tiempo no recomendados para medir Ca2+ transitoriose se indican en las áreas discontinuas (<200 s o >900 s). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Vídeo 1: Vídeo representativo que muestra un ejemplo de una diferenciación de alta eficiencia. Haga clic aquí para descargar este video.
Vídeo 2: Vídeo representativo que muestra un ejemplo de una diferenciación de baja eficiencia. Haga clic aquí para descargar este video.
Vídeo 3: Vídeo representativo que muestra un ejemplo de una distribución monocapa homogénea de iPSC-CM en una cubierta de vidrio. Este vídeo muestra la densidad de celda recomendada que se utilizará para el análisis funcional. Haga clic aquí para descargar este video.
Vídeo 4: Vídeo representativo que muestra un ejemplo de células de una diferenciación de baja eficiencia chapada en una cubierta de vidrio. Las células del vídeo se obtuvieron de una diferenciación de baja eficiencia. Las células de tales diferenciaciones generalmente no se distribuyen homogéneamente a través de la cubierta y es difícil encontrar constantemente las células latiendo. Haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
Los pasos críticos para utilizar iPSC-CM humanos como modelos experimentales son: 1) generar cardiomiocitos (CM) de alta calidad que pueden garantizar el rendimiento consistente y resultados reproducibles; 2) permitir que las células maduren en cultivo durante al menos 90 días para evaluar adecuadamente su fenotipo; 3) realizar estudios electrofisiológicos, por ejemplo, mediciones transitorias de calcio (Ca2+),para proporcionar una caracterización funcional fisiológicamente relevante de los iPSC-CP humanos. Desarrollamos un método de diferenciación basado en monocapas que produce iPSC-CP similares a ventriculares de alta calidad. Nuestro método se basa en varios factores cruciales y es una variante de los protocolos existentes14,18. A diferencia de otros protocolos, este utiliza condiciones bajas de oxígeno (5% O2) para el mantenimiento de iPSCs, así como durante la primera semana de su diferenciación en MMs. Bajos niveles de oxígeno imitan la condición ambiental durante el desarrollo embrionario y fetal del corazón19. También se ha demostrado que las condiciones hipoxicas aumentan la proliferación de iPSC y su posterior diferenciación a los CP20. La densidad de sembración y el paso adecuado de los iPSC también son factores críticos para una diferenciación cardíaca exitosa. Se observa una alta eficiencia de diferenciación cuando los ISPC confluentes del 70 al 80% se disocian en agregados de células pequeñas utilizando una solución libre de enzimas, y se sembran en una proporción dividida de 1:6. La diferenciación cardíaca se puede iniciar cuando las células alcanzan una confluencia del 70-80%, esperada alrededor de 4 días después de la división. El tratamiento con CHIR99021 (10 m) al comienzo de la diferenciación causará una muerte celular significativa. Sin embargo, la proliferación celular se observa cuando CHIR99021 se elimina de la cultura al día siguiente. Un equilibrio correcto entre la muerte celular y la proliferación es esencial para preservar un cultivo monocapa a lo largo de la diferenciación, que es otro factor importante para una diferenciación exitosa. Si la densidad del iPSC es demasiado baja o demasiado alta, la diferenciación posterior será una diferenciación cardíaca de baja eficiencia(Figura 4A, Video 2). La Figura 4A muestra un ejemplo de una diferenciación de baja eficiencia, donde los cardiomiocitos derivados de un donante sano se mezclan con otros tipos de células, como las células de la actina positiva del músculo suave. Es importante destacar que los transitorios Ca2+ registrados a partir de tales preparaciones mostraron características alteradas, como baja amplitud Ca2+ y patrones arritmicos, que fácilmente podrían ser malinterpretados como variación biológica. Una diferenciación exitosa y de alta eficiencia de la misma línea celular, en su lugar, generó una población pura de cardiomiocitos ventriculares(Figura 4A, Video 1) junto con transitorios Regulares Ca2+ (Figura 4B,panel superior). Por lo tanto, la calidad de la diferenciación juega un papel importante en la magnitud general, forma, regularidad y frecuencia de un transitorio Ca2+.
Otro aspecto importante de una diferenciación exitosa y eficiente es la obtención de una población enriquecida de cardiomiocitos. Mientras que las células madre indiferenciadas y otros tipos de células derivadas de iPSC utilizan la glucosa como fuente de energía, los CP pueden utilizar lactato eficientemente para la producción de ATP y glutamato21. Por lo tanto, con el fin de obtener una población aún más pura de M, las células se cultivan en medio de cultivo cargado de lactato y glucosa. La cultuación de iPSC-CMs en este medio de selección durante mucho tiempo, sin embargo, puede conducir a un deterioro funcional. Por lo tanto, para purificar los iPSC-CP y preservar aún su función, la selección metabólica se realiza sólo durante 10 días, desde los días 80-90 desde la inducción de la diferenciación. Después de este período, se reemplaza el medio de selección y las celdas se mantienen en los medios RPMI/B27. Mientras que el protocolo de selección se puede implementar mucho antes22 (por ejemplo, alrededor del día 15), es aconsejable esperar hasta el día 80, ya que hacerlo puede evitar que los ISP residuales u otros tipos de células proliferen en el momento en que las células estén listas para estudios funcionales (día 90). Por lo tanto, es vital que para una diferenciación cardíaca exitosa, eficiente y robusta, se tengan en cuenta todos los factores antes mencionados.
Además de la robustez y eficiencia de los protocolos de diferenciación cardíaca, la maduración y la especificación de tipo celular (por ejemplo, los tipos de células auriculares y ventriculares) también plantean un desafío importante para el uso de iPSC-CP para modelar enfermedades cardíacas. En los últimos años, se han reportado muchas estrategias prometedoras de maduración, incluyendo estimulación eléctrica, estiramiento mecánico y rigidez del sustrato23. Sin embargo, el cultivo prolongado in vitro de iPSC-CMs sigue siendo un enfoque sencillo y práctico para generar cardiomiocitos adultos24,25.
De acuerdo con otros informes publicados12, iPSC-CP generados por este protocolo de diferenciación in vitro muestran una expresión robusta de MLC2V específico del ventrículo y niveles mucho más bajos de MLC2A en el día 90(Figura 2A,B). Mientras que los MC fetales contienen isoformas MLC2A y MLC2V, los CP ventriculares adultos solo contienen MLC2V. Este cambio en la prevalencia isoforme MLC ocurre durante la etapa neonatal26.
Los cardiomiocitos generados a través de este protocolo expresan marcador específico ventricular, como MLC2V, que aumenta progresivamente en abundancia a medida que las células se mantienen en cultivo durante más tiempo(Figura 2A,B). Esto indica que un cultivo in vitro prolongado mejora la maduración de los MN que parecen estar comprometidos con el fenotipo ventricular.
El tiempo en el cultivo también afecta en gran medida A2+ manejo de la maduración24,25. Los informes anteriores describían que después de 20 días de la inducción de la diferenciación, no hubo cambios importantes en el calc Ca2+ transitorios a medida que las células crecían25. Sin embargo, los cardiomiocitos generados a partir del protocolo detallado aquí muestran cambios progresivos en la amplitud Ca2+ y la decadencia Ca2+ en los tres puntos de tiempo evaluados (30, 60 y 90 días después de la inducción de la diferenciación cardíaca)(Figura 3A-C). Curiosamente, estos datos muestran que los parámetros transitorios Ca2+, como la amplitud Ca2+ y la descomposición de Ca2+, medidos en el día 90 iPSC-CP fueron similares a los medidos en cardiomiocitos adultos de rata aislada (ARCM). Además, los iPSC-CP de 90 días también fueron capaces de seguir diversas estimulaciones eléctricas que van de 0,5 Hz a 3 Hz de forma consistente, similar a los ARCM(Figura 4B). En el trabajo futuro, sería interesante ver cómo un tiempo aún más largo en la cultura afecta a las características funcionales de estos iPSC-CP en comparación con los ARCM.
Además, dado que la señalización del receptor adrenérgico muestra un patrón maturacional distinto dependiente del tiempo después de la inducción cardíaca27,se probó el efecto del isoproterenol en Ca2+ transitorio en iPSC-CMs generados a través de este protocolo. La estimulación con isoproterenol condujo a una respuesta lusitrópica positiva en el día 90 iPSC-CP, similar a lo observado en ARCMs(Figura 3D-F).
Las evaluaciones funcionales de los iPSC-CM realizados en este estudio tienen algunas diferencias y limitaciones en comparación con los CM adultos aislados. Los CP adultos tienen sarcomeres bien desarrollados y bien organizados. Esto permite mediciones de contractilidad a través de la detección del movimiento sarcomere. Debido a que ninguno de los protocolos actuales genera iPSC-CP completamente maduros, similares a adultos, las mediciones de contractilidad a través de la detección de sarcomere no son factibles. Si bien es posible detectar el movimiento de los bordes de la célula cuando la célula se contrae, es significativamente más difícil rastrear esos movimientos de una manera precisa en iPSC-CMs. A partir de ahora, se necesitan avances tecnológicos para permitir evaluaciones precisas de la contractilidad en estas células. Por otro lado, es posible medir Ca2+ transitorios de iPSC-CP utilizando un indicador Ca2+ como Fura-2. Sin embargo, a diferencia de los CP adultos, los iPSC-CP están agrupados y no tienen un borde bien definido. Por lo tanto, los transitorios Ca2+ registrados generalmente no representan una sola celda, sino más bien un grupo de celdas en un área específica. Si bien es posible ajustar el tamaño del área, la grabación de transitorios Ca2+ desde una sola celda es increíblemente difícil. Es fundamental que cuando los MC se celen en los cubreobjetos, la densidad sea tal que logren una distribución monocapa homogénea (Video 3), lo que permite encontrar constantemente áreas con células. Si las células no se distribuyen como una monocapa en el cubreobjetos (Video 4), habrá áreas sin celdas, y si el cubreobjetos se examinan específicamente para áreas con células vencidas para realizar las mediciones, esto puede conducir a un "sesgo de selección". En lugar de seleccionar un área específica de células ventosas, se recomienda recopilar datos de varias áreas a lo largo de la cubierta, lo que sólo es posible cuando las células se distribuyen como una monocapa homogénea. Las mediciones de 100 áreas tan diferentes, que tardan unos 10 minutos, son suficientes para proporcionar propiedades funcionales confiables de las células. Por último, como se muestra en la Figura 5,los iPSC-CP necesitan tiempo para ajustarse a las condiciones de medición. Para mediciones fiables, se recomienda estabilizar las células en las condiciones de medición durante al menos 3 minutos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por la Subvención de Desarrollo Científico de la AHA 17SDG33700093 (F.S.); Premio de Los Becarios Mount Sinai KL2 para el Desarrollo de la Carrera de Investigación Clínica y Traslacional KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 y AHA 18TPA34170460 (C.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal | Sigma Aldrich | A5228 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti mouse | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti rabbit | Invitrogen | A21428 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| B27(-) insulin Supplement | Gibco | A18956-01 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DAPI nuclear stain | ThermoFisher | D1306 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes | Gibco | 11330-032 | |
| Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook | Celltreat | 229306 | |
| Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well | Corning | 353046 | |
| Fluidic inline heater | Live Cell Instrument | IL-H-10 | |
| Fura-2, AM | Invitrogen | F1221 | |
| hESC-qualified matrix | Corning | 354277 | Matrigel Matrix |
| hPSC media | Gibco | A33493-01 | StemFlex Basal Medium |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| Live cell imaging chamber | Live Cell Instrument | EC-B25 | |
| MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody | Synaptic Systems | 311011 | |
| Myocyte calcium and contractility system | Ionoptix | ISW-400 | |
| Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V) | Proteintech | 10906-1-AP | |
| Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane | ThermoFisher | 124-0045 | |
| PBS with Calcium and Magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| PBS without Calcium and Magensium | Corning | 21-031-CV | |
| Premium Glass Cover Slips | Lab Scientific | 7807 | |
| RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X) | Gibco | 11879-020 | |
| RPMI medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | |
| StemFlex Supplement | Gibco | A33492-01 | |
| Thiazovivin | Tocris | 3845 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Tyrode's solution | Boston Bioproducts | BSS-355w | Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride |
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