Summary
Modermælk overfører humant immundefektvirus (HIV), men kun ~ 15% af spædbørn ammet af HIV-inficerede mødre bliver smittet. Ammede spædbørn indtager ~ 105− 108 maternel leukocytter dagligt, selv om disse celler er undersøgt. Her beskriver vi isolationen af brystmælk leukocytter og en analyse af deres fagocytiske kapacitet.
Abstract
Selv i fravær af antiretrovirale lægemidler, kun ~ 15% af spædbørn ammet af HIV-inficerede mødre bliver smittet, hvilket tyder på en stærk beskyttende effekt af modermælk (BM). Medmindre adgang til rent vand og passende modermælkserstatning er pålidelig, anbefaler WHO ikke ophør af amning for HIV-inficerede mødre. Talrige faktorer sandsynligvis arbejde i tandem for at reducere BM transmission. Ammede spædbørn indtager ~ 105− 108 maternel leukocytter dagligt, selv om det stadig er stort set uklart, er bidraget fra disse celler til de antivirale kvaliteter af BM. i øjeblikket har vi til formål at ISOLERE celler fra Human BM for at måle antistof-afhængige cellulære fagocytose (adcp), en af de mest essentielle og Pervasive medfødte immunrespons, af BM fagocytter mod hiv mål. Celler blev isoleret fra 5 humane BM-prøver opnået på forskellige stadier af amning. Isolering blev udført ved blid centrifugering efterfulgt af omhyggelig fjernelse af mælkefedt og gentagen vask af celle pellet. Fluorescerende perler belagt med hiv-kuvert (ENV) epitop blev anvendt som mål for analyse af adcp. Celler blev plettet med CD45 overflade markør til at identificere leukocytter. Det konstateredes, at ADCP-aktiviteten var signifikant over kontrol forsøgene og reproducerbart målbare ved hjælp af et HIV-specifikt antistof 830A.
Introduction
Human modermælk (BM) består af moder celler, der er > 90% levedygtige1. Celle sammensætning er påvirket stærkt af fase af amning, sundhedsstatus af mor og spædbarn, og individuelle variation, som forbliver dårligt forstået1,2,3,4. I betragtning af, at BM indeholder ~ 103− 105 leukocytter/ml, det kan anslås, at ammede spædbørn indtager ~ 105− 108 maternel leukocytter dagligt5. Forskellige in vivo undersøgelser har vist, at maternel leukocytter give kritisk immunitet til spædbarnet og er funktionelle langt ud over disse steder af første indtagelse5,6,7,8 ,9,10,11. Alle maternelle afledte celler indtaget af spædbarnet har potentiale til at udføre immun funktioner sammen med eller for at kompensere for barnets egne leukocytter12.
Mor-til-barn transmission (MTCT) af humant immundefektvirus (HIV) er fortsat en krise i ressource-begrænset lande. Da diarré og luftvejssygdomme er ansvarlige for betydelige dødelighed blandt spædbørn i ressource begrænsede lande, og disse sygdomme er væsentligt reduceret ved eksklusiv amning, fordelene for HIV-inficerede mødre af amning langt opvejer risiciene13,14,15. Medmindre adgang til rent vand og passende modermælkserstatning er pålidelig, anbefaler WHO ikke ophør af amning for HIV-inficerede mødre16. Ca. 100.000 MTCTs via BM forekommer årligt; men kun ~ 15% af spædbørn ammet af deres HIV-inficerede mødre bliver smittet, hvilket tyder på en stærk beskyttende effekt af BM17,18,19,20,21. Talrige faktorer sandsynligvis arbejde i tandem for at forhindre transmission. Det er vigtigt, at hiv-specifikke antistoffer (ABS) i BM er korreleret med reduceret MTCT og/eller reduceret spædbarns død fra HIV-infektion22,23. Hvad der er stort set uklart er bidraget fra cellulær fraktion af BM til sine antivirale kvaliteter.
Mange ABS letter en række anti-virale aktiviteter medieret af den "konstante" region af immunglobulin molekyle, krystallizable fragment (FC), via interaktion med FC-receptorer (Fcr'er) fundet på stort set alle medfødte immunceller, stort set alle findes i human BM24. Antistofafhængig cellulær fagocytose (adcp) er blevet påvist som nødvendigt for clearance af virusinfektioner og er blevet undersøgt i tilfælde af forebyggelse af MTCT af hiv25,26,27, 28 , 29. i betragtning af den manglende viden om det potentielle bidrag af adcp aktivitet af BM fagocytter til forebyggelse af MTCT af hiv, vi har til formål at udvikle en stringent metode til at isolere celler fra Human BM for at gennemføre en undersøgelse af adcp medieret af celler fra BM opnået på forskellige stadier af amning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hver deltager i denne undersøgelse blev rekrutteret og interviewet i overensstemmelse med den etiske og institutionelle Review Board (IRB) godkendelse med vejledning og autorisation af Mount Sinai's program for beskyttelse af mennesker (PPHS) ved hjælp af en IRB-godkendt protokol for opnåelse af modermælk prøver.
1. klargøring af Target microsphere
- Vælg et relevant målantigen.
Bemærk: i dette eksempel blev det rekombinante protein V1V2-2F5K brugt, som var designet til at efterligne den trikemeje spids af indfødte HIV-konvolut30. - Udføre biotinylering ved hjælp af en kommerciel Kit (tabel over materialer) i henhold til producentens protokol.
- Beregn mmol af biotin reagens til at tilføje til reaktionen for en 5-fold molær overskydende ved hjælp af formlen: mmol biotin = ml protein x (mg protein/ml protein) x (mmol biotin/mg protein) x (5 mmol biotin/mmol protein)30,31. Beregn derefter μL af biotin reagenset for at tilføje ved hjælp af formlen: μL biotin = mmol biotin x (1.000.000 μL/L) x (L/10 mmol).
- Ækvibrere biotin til stuetemperatur før åbning. Protein opløses i 0,5 − 2,0 mL fosfat-bufferet saltvand (PBS) i henhold til ovenstående beregning.
- Der fremstilles en 10 mM opløsning af biotin reagens i dimethylsulfoxid (DMSO) og tilsættes det passende volumen på 10 mM biotin reagens til protein opløsningen, og der inkuberes på is i 2 timer eller ved stuetemperatur i 30 min.
- Fjern overskydende biotin ved hjælp af protein koncentratorer (polyethersulfon [PES] membraner, 3 kDa molekylvægt cut-off [MWCO], 0,5 mL; Tabel over materialer) i henhold til producentens anvisninger.
- Indbetal prøven i det øverste kammer af spin kolonnen og tilsæt PBS op til 400 μL. hætte, og indsæt derefter dette prøvekammer i en opsamlings slange. Centrifuge ved 12.000 x g ved stuetemperatur i 30 min.
- Kassér gennemstrømning, og tilsæt PBS til 400 μL. Gentag centrifugering. Kassér gennemstrømning og tilsæt PBS til 100 μL. mål proteinkoncentrationen med et spektrofotometer.
Bemærk: protein kan aliciteres og fryses ved-80 °C, indtil det anvendes.
2. antistof-afhængig cellulær fagocytose (Adcp) assay Plate forberedelse
- Konjugat biotinyleret protein til 1 μm mikrokugler (' perler '; Tabel over materialer) i henhold til producentens anvisninger.
- Pr. plade af konjugerede perler Inkuber 6 μg protein med 12 μL lager perler i 200 μL 0,1% bovint serumalbumin (BSA)-PBS ved stuetemperatur i 1 time, og hvirve forsigtigt hver 20 min.
- Centrifuge ved 13.000 x g i 5 min. kassér supernatanten, vortex forsigtigt og resuspension i 1200 μl 0,1% BSA-PBS. Gentag spin og vask trin 2x. Resuspension i 1200 μL 0,1% BSA-PBS.
- Aliquot 10 μL perle opløsning per brønd i en rund bund 96-brønd plade. Forbered fortyndinger af antistof eller immunsera af interesse i 12 μL af 2% HSA HBSS, typisk starter ved 50 μg/mL antistof eller en 1/100 serumfortynding.
Bemærk: i eksempeldataene blev der anvendt monoclonalt antistof (mAb) 830A. - 10 μL titreret antistof/sera tilsættes til perle pladen og inkubateres i 2 timer ved 37 °C. Tilsæt 200 μL 2% HSA HBSS til hver brønd og centrifuge pladen ved 2.000 x g i 10 min.
- Fjern forsigtigt supernatanten ved en hurtig væltning og deantering af væske fra pladen brønde ind i en vask for at undgå at forstyrre den usynlige perle pellet.
3. isolation af modermælk celle
- Få humant modermælk fra raske ammende kvinder, udtrykt ved hjælp af dobbelte elektroniske eller manuelle pumper. Isoler celler inden for ~ 4 h udtryk, holde mælk ved stuetemperatur.
- Med 50 mL rør centrifugeres 50 mL mælk ved 800 x g i 15 min. hæld forsigtigt skummet mælk og fedt ud, mens du lader celle pellet være uforstyrret. Tør indersiden af røret af med en fnugfri serviet for at fjerne alt fedt fra rørvæggen.
- Tilsæt 10 mL 2% humant serum albumen i Hank's balance saltopløsning (2% HSA HBSS [uden ca2 + eller mg+]). Resuspendere pellet ved blid pipettering for at undgå celle aktivering og apoptose. Overføres til et 15 mL rør og centrifugeres ved 450 x g i 10 minutter.
- Hæld supernatanten af, og Gentag trin 1,3. Derefter skal du forsigtigt resuspendere cellerne i 1 − 2 mL af 2% HSA HBSS afhængigt af forventet celle nummer og tælle celler med et hemocytometer eller en automatiseret celle tæller, der også noterer cellens levedygtighed.
4. adcp-analyse
Bemærk: de metoder, der beskrives her, er tilpasset fra Ackerman et al.32.
- Tilsæt 50.000 nyisolerede BM-celler til hver ADCP-analyse plade godt i 200 μL 2% HSA-HBSS. Inkuber i 2 timer ved 37 °C.
- For kontrolforsøg, præ-incubate celler ved 37 °C med 10 μg/mL actin inhibitor (cytochalasin-D), 50 μg/mL FcR blokerende middel (FcBlock), eller en kombination af begge før deres tilsætning til pladerne.
- Centrifugerings pladen ved 930 x g i 10 min. Tilsæt 200 μl 2% HSA hbss og Gentag centrifugering. Fjern forsigtigt supernatanten som i trin 2,7 og Gentag vask.
- Fjern forsigtigt supernatanten og plette celler for levedygtighed ved hjælp af 0,5 μg/mL (endelig koncentration) fixable levedygtighed plet 450 pr brønd i 50 μL af 2% HSA HBSS. Inkuber 20 min ved stuetemperatur i mørket. Centrifuge pladen ved 930 x g i 10 min. og Fjern supernatanten som i trin 2,7. Tilsæt 200 μL 2% HSA HBSS og centrifuge pladen igen efterfulgt af fjernelse af supernatanten som i trin 2,7.
- Efter levedygtighed farvning, pletter celler for leukocyt markører af interesse, minimalt herunder en CD45-specifik bejdsning såsom PE-mus anti-Human CD45 (klon HI30) ved en optimeret koncentration (1 μg/μL i 50 μL af 1% BSA HBSS i eksemplet data).
Bemærk: eventuelle Lineage specifikke markører af interesse kan inkluderes. - Inkuber 20 min ved stuetemperatur i mørket. Centrifuge pladen ved 930 x g i 10 min. og Fjern supernatanten som i trin 2,7. Tilsæt 200 μL af 1% BSA HBSS og Gentag centrifugering. Fjern supernatant. Fastgør cellerne i 200 μL 0,5% formaldehyd i mørke ved stuetemperatur i 30 min. eller natten over ved 4 °C. Opbevares i køleskab i mørke indtil analyse.
5. analyse af strømnings cytometri
- Udfør indledende gating for at eliminere form på en Forward scatter (FSC) vs. side scatter (SSC) plot og snavs (materiale mindre end FSC = 5000) (Se figur 1). Brug en SSC vs. levedygtighed Stain (V450 i dette tilfælde) plot at eliminere døde celler (dem, der er positive for levedygtighed plet).
- Brug en SSC vs. CD45 plot til at differentiere de store leukocyt klasser (granulocytter, monocytter, lymfocytter) som udførligt beskrevet33,34.
Bemærk: denne klassifikation er kun suggestiv og Lineage-specifikke markører er nødvendige for at bekræfte celletype. - For alle CD45 + celler, eller for hver leukocyt delmængde af interesse, foranstaltning adcp aktivitet ved gating med en markør på perle-positive celler i et histogram af fluorescein allylisothiocyanat (FITC) kanal, hvor de fluorescerende perler detekteres.
Bemærk: de negative kontrol brønde, hvor perlerne ikke blev tilsat, vil indikere, hvor de perler-positive celler er synlige i histogrammet, og derfor hvor at placere gating markør. - Beregn ADCP-scorer som (median fluorescens intensitet [MFI] af perle-positive celler) x (% af total CD45 + celler i den positive population). Brug grafik software til at afbilde scorer ved hver AB/serumkoncentration og til at udføre en areal-under-kurven (AUC) analyse.
Bemærk: ADCP anses for at være positivt, hvis AUC er større end 3x standardafvigelse af ADCP-score AUC for en ikke-specifik negativ kontrol-mAb (i dette tilfælde 3865).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mælken kan opbevares ved stuetemperatur eller køligere (dog ikke frosset); men da vi har observeret nedsat levedygtighed, når mælken er blevet holdt meget kold (data ikke vist), og at det er enklere at indsamle, opbevare kort, og transport ved omgivelsestemperaturer, anbefales det, at prøverne ikke er nedkølet for at reducere variabilitet i stikprøver. I mælk opnået 7 − 183 dage efter partum varierede celle koncentrationen bestemt ved automatiseret celle tæller fra 16083 − 222857 celler/mL. Figur 1 illustrerer den gating strategi eliminere doublets, snavs, og døde celler. Rentabiliteten var ~ 90 − 99%. Ca. 1,6 − 12,3% af de samlede levende celler var CD45+ leukocytter (tabel 1). De fleste påståede monocytter syntes at være prækursorer/umodne celler som tidligere beskrevet, baseret på den suggestive SSC vs. CD45 gating34. De påståede monocytter blev defineret som SSClav-mellemliggende/CD45lav, selvom få udstillet de højere CD45 farvnings niveauer adskiller sig fra den påståede lymfocyt population (SSClav/CD45lav) mere typisk associeret med blodmonocytter (figur 1), svarende til tidligere undersøgelser33,34. De påståede granulocytter blev defineret som SSCHigh/CD45Intermediate33,34 (tabel 1). Bemærk, at denne klassifikation kun er suggestiv, og at Lineage specifikke markører er nødvendige for at bekræfte celle typen.
ADCP aktivitet af de nyisolerede BM celler blev målt ved hjælp af HIV-specifikke Human mAb 830A, som er specifik for v2-regionen af HIV-konvolutten og binder sig til V1V2-2F5K antigen testet her. ADCP aktivitet blev målt for eksemplet her ved hjælp af mælk opnået ved 1 måned Post-partum (figur 2A). Eksempeldata viser de forventede FITC (perle +) histogrammer, der ses, når gating på CD45+ celler (data genereret ved hjælp af 1 μg/ml Mab er vist). De sorte markører angiver de populationer, der bruges til at beregne ADCP-scorer. I eksempel 830A-data (første panel i figur 2A) vises procentdelen af CD45 + celler og den gennemsnitlige fluorescens for den pågældende population, som blev brugt til at beregne adcp- scoren ved hjælp af ligningen i trin 3,4. Celler præ-inkuberet med actin inhibitor cytochalasin-D (cytoD) og/eller FcR-blokerende ABS (FcBlock) før deres inkubation med AB-bundet/antigen-koblede perler udstillet ADCP aktivitet på niveauet af kontrol mAb 3865 eller derunder, indikerer ADCP var FcR og actin-afhængig (figur 2). ADCP-score bestemt for total CD45+ celler var ~ 25 − 35 gange over baggrundsniveauer defineret ved hjælp af den negative kontrol anti-Anthrax mab 3865. Hver større delmængde blev analyseret separat også. De påståede granulocytter udstillet ADCP aktivitet ~ 12 − 29 gange højere end baggrund. Den påståede monocyt adcp var ~ 2 − 3 gange over baggrunden (figur 2). De påståede lymfocytter som forventet udviste Ingen målbar ADCP-aktivitet (mindre end 3x standardafvigelse af ADCP-score AUC for den ikke-specifikke negative kontrol mAb 3865; data ikke vist).
Figur 1: cytometri-prøve flow data for celler isoleret fra modermælk. Celler blev behandlet og plettet som beskrevet i protokollen. (A) enkeltceller blev gated på at eliminere form i en FSC-H vs. FSC-et plot som vist, også gating ud de små snavs < 5000 i FSC-A. (B) denne population blev brugt til at Gate på levende celler (som ikke pletter med levedygtigheden farvestof) i en SSC vs. V450 (levedygtighed plet) plot. C) disse levende celler blev anvendt i et FSC vs. SSC-plot. Den forventede placering af ikke-leukocytter, der sandsynligvis vil være overvejende bryst epiteliale celler, er fremhævet ("E"). D) det samme FSC vs. SSC-plot vises kun med CD45+- celler. De vigtigste leukocyt undergrupper bemærkede er kun påståede identiteter baseret på veletablerede og forventede SSC parametre (G = granulocytter; M = monocytter; L = lymfocytter). E) levedygtige celler blev anvendt til en SSC vs. CD45 plot med de vigtigste leukocyt undergrupper bemærkede. Back-gating fra dette plot gav de data, der vises i panel D. Bemærk, at denne klassifikation kun er suggestiv, og at Lineage specifikke markører er nødvendige for at bekræfte celletype. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Sample ADCP data ved hjælp af celler isoleret fra modermælken. Den udførte ADCP-analyse er baseret på den analyse, der er tilpasset fra Ackerman et al.30. Analysen blev udført som beskrevet i ovenstående protokol. (A) prøve FITC histogrammer ved 1 μg/ml Mab, med markører, der angiver perlerne/FITC +-populationerne, som anvendes til at bestemme adcp-scoren. Scores blev beregnet som (MFI af perle-positive celler) x (% af total CD45+ celler i Perlen/FITC + positiv population). Det første panel ved hjælp af mAb 830A alene angiver også procentdelen af total CD45 + celler og den gennemsnitlige fluorescens intensitetsværdi, der anvendes til at beregne ADCP- scoren i dette eksempel. B) adcp-scorer ved hver Mab-fortyndings analyse blev anvendt til at beregne værdier for areal under kurven (AUC) i grafik software. For kontrol eksperimenter, actin inhibitor cytochalasin-D (cytoD), FcR blokerende middel (FcBlock), eller en kombination af begge var præ-inkuberet med celler forud for deres tilsætning til immunkomplekser (Se legender). Bemærk, at denne celle klassifikation kun er suggestiv, og at Lineage specifikke markører er nødvendige for at bekræfte celle typen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Prøve | Celler/mL | % CD45+ | Granulocytter | Monocytter |
| 1 | 222.857 | 12,3 ± 1,9 | 13,6 ± 3,8 | 65,9 ± 5,6 |
| 2 | 27.361 | 1,6 ± 0,01 | 25,2 ± 4,0 | 9,1 ± 5,6 |
| 3 | 161.486 | 3,6 ± 1,1 | 47,8 ± 6,8 | 24,3 ± 4,3 |
| 4 | 16.083 | 2,7 ± 0,1 | 17,9 ± 3,5 | 34,4 ± 1,0 |
| 5 | 25.155 | 4,0 ± 0,7 | 29,7 ± 2,6 | 20,5 ± 1,4 |
| * af CD45+ celler | ||||
Tabel 1: eksempler på typiske brystmælks celletal og-karakteristika.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flowcytometry-baseret teknik til måling af ADCP-aktivitet beskrevet heri blev først beskrevet i 201130 og er siden blevet påvist robust og citeret i mere end 80 undersøgelser. Den protokol, der er beskrevet her, tilpasser denne teknik til brug med primære BM-celler for første gang. Tidligere undersøgelser af FC-medieret funktionalitet af BM-celler har været stort set begrænset til måling af oxidativ brister eller histologi-baserede fagocytose analyser ved hjælp af celler isoleret fra colostrum (0 − 4 dage efter fødslen). Næsten ingen undersøgelser har undersøgt celler i human BM forbi colostrum fase. Undersøgelser med colostrale celler har generelt konkluderet, at granulocytter i colostrum er mindre aktive end dem, der er isoleret fra blod, opfører sig som en "ekssudat celle", som er flyttet ind i det ekstravaskulære rum35, selv om modstridende undersøgelser har rapporterede lignende fagocytiske og baktericide kapaciteter36.
I årtier, traditionelle mikroskopi blev brugt til at identificere BM leukocytter, og denne type visuel identifikation kan have ført til cellefejl identifikation1. Få undersøgelser har sammenlignet BM leukocyt sammensætning ud over den første måned af amning, og de fleste har fokuseret på colostrum. Brugen af strømnings cytometri til identifikation af celler vil sandsynligvis identificere cellerne nøjagtigt, selv om der kun er blevet udført et lille antal BM-undersøgelser ved hjælp af denne metode, ofte med et meget lille stikprøve nummer. Aktuelle undersøgelser har vist, at leukocyt indholdet af BM i alle stadier af amning varierer meget, lige fra ~ 104− 7 x 105 leukocytter/ml i tidlig colostrum, faldende til 103− 5 x 104 leukocytter/ml i moden mælk, selv om alle undersøgelser bekræfter, at celle koncentration og sammensætning er påvirket kraftigt af den fase af amning1,2,3,4,5. Som mælke overgange til sin modne sammensætning, neutrofilkoncentrationen synes at stige, selv om sådanne undersøgelser ikke har typisk forlænget ud over den første måned postpartum34.
Den protokol, der er beskrevet heri, bruger fluorescerende perler som det fagocytiske mål, selv om det sandsynligvis kan anvendes til at studere BM ADCP af en række mere biologisk relevante mål såsom immunkomplekser og inficerede celler, udløst af forskellige AB isotyper og Underklasser. En større celle farvning panel kan anvendes til yderligere at differentiere leukocytter. Store undersøgelser vil være afgørende for at udvikle en omfattende forståelse af ADCP ved disse relevante primære celler. Denne protokol giver mulighed for etablering af ADCP af BM leukocytter som en potentiel mekanisme til reduktion af MTCT af HIV, samt andre patogener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Susan Zolla-Pazner i Department of Medicine og Department of Microbiology på Icahn School of Medicine på Mount Sinai for manuskript gennemgang. NIH/NICHD ydede støtte til dette projekt under tilskudsnummer R21 HD095772-01A1. Desuden blev R. Powell støttet af midler fra Department of Medicine, division af smitsomme sygdomme, Icahn School of Medicine på Mount Sinai.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres | Thermo Fisher | F8776 | |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560975 | |
| Bovine serum Albumin | MP Biomedicals | 8810025 | |
| Corning V-bottom polystyrene 96-well plate | Corning | 3894 | |
| Cytochalasin D | Sigma | 22144-77-0 | |
| EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit | Thermo Fisher | 21338 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352196 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| Fixable Viability Stain 450 | BD | 562247 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | 252549 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Life Technologies | 14175-095 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | |
| Human Serum Albumin | MP Biomedicals | 2191349 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| PBS 1x pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | |
| Polystyrene 10 mL Serological Pipettes | Corning | 4488 | |
| Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL | Pierce | 88512 |
References
- Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. Cells in human milk: state of the science. Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).
- Lonnerdal, B. Nutritional and physiologic significance of human milk proteins. The American Journal of Clinical Nutrition. 77 (6), 1537S-1543S (2003).
- Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. Effect of maternal diet and body composition on lactational performance. The American Journal of Clinical Nutrition. 39 (2), 296-306 (1984).
- Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months). Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3 (5), 713-720 (1984).
- Hassiotou, F., Geddes, D. T. Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding. Advances in Nutrition. 6 (3), 267-275 (2015).
- Hanson, L. A. The mother-offspring dyad and the immune system. Acta Paediatrica. 89 (3), 252-258 (2000).
- Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. Activated and memory T lymphocytes in human milk. Cytometry. 13 (3), 282-290 (1992).
- Jain, L., et al. In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons. Archives of Disease in Childhood. 64 (7 Spec No), 930-933 (1989).
- Zhou, L., et al. Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth. Immunology. 101 (4), 570-580 (2000).
- Tuboly, S., Bernath, S. Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).
- Cabinian, A., et al. Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer's Patches of the Nursed Infant. PLoS ONE. 11 (6), e0156762 (2016).
- Filias, A., et al. Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates. BMC Pediatrics. 11, 29 (2011).
- Natchu, U. C., et al. Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women. The American Journal of Clinical Nutrition. 96 (5), 1071-1078 (2012).
- Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants. The Journal of Pediatrics. 126 (5 Pt 1), 696-702 (1995).
- WHO. Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis. Lancet. 355 (9202), 451-455 (2000).
- World Health Organization. Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee. World Health Organization. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2016).
- Nelson, C. S., et al. Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk. Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).
- Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197 (3 Suppl), S3-S9 (2007).
- Shen, R., et al. Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women. PLoS ONE. 10 (12), e0145150 (2015).
- Fouda, G. G., et al. HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies. Journal of Virology. 85 (18), 9555-9567 (2011).
- Van de Perre, P., et al. HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1. Science Translational Medicine. 4 (143), 143sr143 (2012).
- Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality. Cell Host & Microbe. 17 (4), 500-506 (2015).
- Pollara, J., et al. Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1. Journal of Virology. 89 (19), 9952-9961 (2015).
- Ackerman, M., Nimmerjahn, F. Antibody Fc. , Academic Press. Cambridge, MA. (2014).
- Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections. Journal of Immunology. 166 (12), 7381-7388 (2001).
- Fujisawa, H. Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice. Journal of Virology. 82 (6), 2772-2783 (2008).
- Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells. Journal of Virology. 81 (17), 9551-9555 (2007).
- Yasui, F., et al. Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus. Virology. 454-455, 157-168 (2014).
- Quattrocchi, V., et al. Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease. Antiviral Research. 92 (2), 262-270 (2011).
- Ackerman, M. E., et al. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. Journal of Immunological Methods. 366 (1-2), 8-19 (2011).
- Jiang, X., et al. Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits. Journal of Virology. 90 (24), 11007-11019 (2016).
- Sanders, R. W., et al. A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 9 (9), e1003618 (2013).
- Im, M., et al. Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets. The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).
- Trend, S., et al. Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry. PLoS ONE. 10 (8), e0135580 (2015).
- Buescher, E. S., McIlheran, S. M. Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).
- Franca, E. L., et al. Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).
