Summary
母乳はヒト免疫不全ウイルス(HIV)を伝播するが、HIVに感染した母親によって授乳された乳児の約15%だけが感染する。母乳で育てられた乳児は毎日〜105−108母性白血病を摂取するが、これらの細胞は研究されている。ここでは、母乳白球の単離と、その間に行能力の分析について説明する。
Abstract
抗レトロウイルス薬がなくても、HIVに感染した母親によって授乳された乳児の約15%のみが感染し、母乳(BM)の強力な保護効果を示唆している。清潔な水と適切な乳児用の処方へのアクセスが信頼できる場合を除き、WHOはHIVに感染した母親のための母乳育児の中止を推奨しません。BM伝送を減らすために、多くの要因が連携して動作する可能性が高い。母乳で育てられた乳児は毎日〜105−108母性白血病を摂取し、大部分は不明であるが、これらの細胞がBMの抗ウイルス性に対する寄与である。抗体依存性細胞性細胞細胞症(ADCP)は、HIV標的に対するBMファゴサイトによる最も本質的かつ広範な自然免疫応答の1つである。細胞を授乳の様々な段階で得られた5つのヒトBMサンプルから単離した。分離は穏やかな遠心分離を介して行われ、続いて乳脂肪を注意深く除去し、細胞ペレットを繰り返し洗浄した。HIVエンベロープ(Env)エピトープでコーティングされた蛍光ビーズをADCPの分析対象として用いた。細胞をCD45表面マーカーで染色し、白血病を同定した。ADCP活性は、HIV特異的抗体830Aを用いて対照実験を上回り、再現可能に測定可能であることが判明した。
Introduction
ヒト母乳(BM)は、>90%生存可能な母細胞で構成されています。細胞組成物は、授乳の段階、母子および乳児の健康状態、および個々の変動によって強く影響を受け、1、2、3、4の理解が不十分なままである。BMが~103−105白血病/mLを含有することを考えると、母乳で育てられた乳児が毎日〜105−108母性白血病を毎日摂取すると推定できる。様々な生体内白球が乳児に重要な免疫を提供し、初期摂取5、6、7、8のこれらの部位をはるかに超えて機能的であることを実証した。 ,9,10,11.乳児によって摂取されたすべての母体由来細胞は、乳児自身の白血病細胞12と一緒に免疫機能を実行する可能性を有する。
ヒト免疫不全ウイルス(HIV)の母子感染(MTCT)は、資源に限られた国では依然として危機的状況にある。下痢や呼吸器疾患は、資源に限られた国の乳児の死亡率の実質的な割合を占めており、これらの病気は排他的な母乳育児によって大幅に減少し、HIVに感染した母親への利益母乳育児はリスク13、14、15をはるかに上回る。きれいな水と適切な乳児用製剤へのアクセスが信頼できる場合を除き、WHOはHIVに感染した母親のための母乳育児の中止を推奨していません16.毎年約 100,000 の MtCT が BM 経由で発生します。しかし、HIVに感染した母親によって授乳された乳児の約15%のみが感染し、BM 17、18、19、20、21の強力な保護効果を示唆している。多くの要因は、伝送を防ぐために連携して動作する可能性が高いです。重要なことに、BMにおけるHIV特異的抗体(Abs)は、HIV感染によるMTCTの減少および/または乳児死亡の減少と相関している22,23である。主に不明なのは、BMの細胞画分がその抗ウイルス性に対する寄与である。
多くのAbsは、免疫グロブリン分子の「一定」領域、結晶化性断片(Fc)、事実上すべての自然免疫細胞に見られるFc受容体(FcR)との相互作用を介して媒介する様々な抗ウイルス活性を促進し、事実上その全てヒトBM24で見つかった.抗体依存性細胞性細胞症(ADCP)は、ウイルス感染のクリアランスのために必要に応じて実証されており、HIV25、26、27のMTCTの予防の場合に研究されている。28歳,29.BMファゴサイトによるHIVのMTCTの予防に対するADCP活性の潜在的な寄与に関する知識の不足を考慮し、細胞媒介性ADCPの研究を行うために、ヒトBMから細胞を単離する厳格な方法を開発することを目指した。BMは授乳の様々な段階で得られる。
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Protocol
この研究の各参加者は、IRB承認を使用してシナイ山のヒト被験者保護プログラム(PPHS)の指導と承認を受けて、倫理的および制度的レビュー委員会(IRB)の承認に合わせて募集され、インタビューを受けました。母乳サンプルを得るためのプロトコル。
1. ターゲットマイクロスフィアの準備
- 関連する標的抗原を選択します。
注:この例では、組換えタンパク質V1V2-2F5Kを使用し、ネイティブHIVエンベロープ30のトリメリック頂点を模倣するように設計された。 - 製造元のプロトコルに従って、市販キット(材料の表)を使用してバイオチニル化を実行します。
- 式を使用して5倍モル過剰の反応に追加するビオチン試薬のmmolを計算する:mmolビオチン=mLタンパク質x(mgタンパク質/mgタンパク質)x(mmolビオチン/mgタンパク質)x(5mmolビオチン/mmolタンパク質)30、31。次に、式を使用して追加するビオチン試薬のμLを計算します: μL ビオチン = mmol ビオチン x (1,000,000 μL/L) x (L/10 mmol)
- 開口前にビオチンを室温に平衡化する。上記の計算に従って、リン酸緩衝生理食べ物(PBS)の0.5-2.0 mLでタンパク質を溶解する。
- ジメチルスルホキシド(DMSO)中のビオチン試薬の10mM溶液を調作し、タンパク質溶液に10mMビオチン試薬の適切な容積を加え、氷上で2時間または室温で30分間インキュベートする。
- タンパク質濃縮器(ポリエーテルスルホン[PES]膜、3 kDa分子量カットオフ[MWCO]、0.5 mL;を使用して余分なビオチンを除去します。材料の表)製造元の指示に従って。
- サンプルをスピンカラムの上部チャンバに堆積させ、最大400 μLキャップのPBSを追加し、このサンプルチャンバーを回収管に挿入します。室温で12,000 x gで30分間遠心分離機。
- フロースルーを破棄し、PBS を 400 μL に追加します。フロースルーを破棄し、100 μL に PBS を追加します。
注:タンパク質は、使用されるまで-80°Cでアリクォートおよび凍結することができます。
2. 抗体依存性細胞性咽頭症(ADCP)アッセイプレート製剤
- ビオチン化タンパク質を1μmの微小球(ビーズ)にコンジュゲート。材料の表)製造元の指示に従って。
- 共役ビーズのプレート当たり、0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)-PBSの200 μLのストックビーズの12 μLを持つタンパク質の6 μgを室温で1時間、20分ごとに穏やかに渦を入れます。
- 13,000 x gで5分間遠心分離機を使用し、上清、渦を穏やかに廃棄し、0.1%BSA-PBSの1200 μLで再懸濁します。スピンと洗浄ステップ2xを繰り返します。0.1% BSA-PBS の 1200 μL で再中断します。
- アリコート10 μLのビーズ溶液を、丸底96ウェルプレートでウェル当たり。2%HSA HBSSの12 μLで目的の抗体または免疫血清の希釈を調作し、典型的には50μg/mLの抗体または1/100血清希釈から始まる。
注:試料データでは、モノクローナル抗体(mAb)830Aが用いられた。 - ビーズプレートに10μLのチレート抗体/セラを加え、37°Cで2時間インキュベートします。各ウェルに2%のHSA HBSSの200 μLを加え、遠心プレートを2,000 x gで10分間追加します。
- 目に見えないビーズペレットを邪魔しないように、プレートウェルから液体を素早くひっくり返してシンクにデカントすることで、上清を慎重に取り除きます。
3. 母乳細胞分離
- 健康な授乳中の女性からヒト母乳を得る, 二重電子または手動ポンプを使用して表現.発現の~4時間以内に細胞を分離し、牛乳を室温に保ちます。
- 50 mLチューブを使用して、遠心分離機50 mLミルクを800 x gで15分間注ぎ、細胞ペレットを邪魔しないでスキムミルクと脂肪を慎重に注ぎます。チューブの内側を糸くずのない拭き取りで拭き取り、チューブの壁からすべての脂肪を取り除きます。
- ハンクのバランス塩溶液(2%HSA HBSS[Ca2+またはMg+なし])に2%のヒト血清アルブミンの10 mLを加えます。細胞活性化とアポトーシスを避けるために穏やかなピペッティングによってペレットを再中断します。15 mLチューブと遠心分離機を450 x gで10分間転送します。
- 上清を注ぎ、ステップ1.3を繰り返します。次いで、期待される細胞数に応じて2%HSA HBSSの1−2mLで細胞を穏やかに再中断し、ヘモサイトメーターまたは自動細胞カウンタによって細胞をカウントし、細胞生存率にも留意する。
4. ADCPアッセイ
注: ここで説明する方法は、Ackerman et al.32から適合しています。
- 2%HSA-HBSSの200 μLで各ADCPアッセイプレートに50,000個の新たに単離したBM細胞を追加します。37 °Cで2時間インキュベートします。
- 対照実験では、10μg/mLアクチン阻害剤(サイトカラシン-D)、50μg/mL FcR遮断剤(FcBlock)、またはプレートに添加する前に両方の組み合わせを用いて37°Cで細胞を事前インキュベートする。
- 930 x gで10分間遠心プレートを2%HSA HBSSの200 μLを追加し、遠心分離を繰り返します。ステップ2.7のように上清を慎重に取り外し、洗浄を繰り返します。
- 0.5 μg/mL(最終濃度)固定可能な生存率汚れ450を2%HSA HBSSの50μLでウェル当たり使用して、上清および染色細胞を慎重に除去します。暗闇の中で室温で20分をインキュベートする。930 x gで10分間遠心プレートを使用し、ステップ2.7のように上清を除去します。2% HSA HBSS と遠心プレートの 200 μL を再度追加し、ステップ 2.7 のように上清を除去します。
- 生存率染色後、目的の白血球マーカーに対する染色細胞は、最適化された濃度でPEマウス抗ヒトCD45(クローンHI30)などのCD45特異的染色を最小限に含む(1%BSA HBSSの50μL中1μg/μL)。
注: 関心のある系統固有のマーカーを含めることができます。 - 暗闇の中で室温で20分をインキュベートする。930 x gで10分間遠心プレートを使用し、ステップ2.7のように上清を除去します。1% BSA HBSS の 200 μL を追加し、遠心分離を繰り返します。上清を取り除く。室温で30分間、または4°Cで一晩、暗闇の中で0.5%ホルムアルデヒドの200 μLで細胞を固定します。分析まで暗闇の中で冷蔵してください。
5. フローサイトメトリーによる分析
- 前方散乱(FSC)対サイドスキャッタ(SSC)プロットおよび破片(FSC = 5000より小さい材料)上の二重点を除去するために初期ゲーティングを実行します(図1参照)。死んだ細胞(生存性染色に陽性のもの)を除去するために、SSC対生存率染色(この場合はV450)プロットを使用します。
- SSC対CD45プロットを使用して、広く記載されている主要な白球細胞クラス(顆粒球、単球、リンパ球)を広く説明する33、34を区別する。
注: この分類は示唆的なものであり、細胞タイプを確認するために系統特異的マーカーが必要です。 - すべてのCD45+細胞について、または目的の各白血病細胞サブセットについて、蛍光ビーズが検出されるフルオレセインイソチオシアネート(FITC)チャネルのヒストグラム内のビーズ陽性細胞上のマーカーをゲーティングしてADCP活性を測定します。
注:ビーズが添加されなかった負のコントロールウェルは、ヒストグラム内のビーズ陽性細胞が明らかな場所、したがってゲーティングマーカーを配置する場所を示します。 - ADCPスコアを(ビーズ陽性細胞の蛍光強度の中央値[MFI])x(陽性集団におけるCD45+細胞全体の%)として計算する。グラフィックスソフトウェアを使用して、各Ab/血清濃度でスコアをプロットし、曲線の下の領域(AUC)分析を実行します。
注: AUC が非特異的負制御 mAb の ADCP スコア AUC の標準偏差の 3 倍を超える場合、ADCP は正と見なされます (この場合は 3865)。
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Representative Results
牛乳は室温またはクーラーで保つことができます(ただし、凍結していません)。しかし、牛乳が非常に冷たく保たれている場合の生存率が低下していることを考えると(データは示されていない)、周囲の温度で採取、保存、輸送が簡単であることを考えると、サンプルを減らすために冷蔵しないことをお勧めします。サンプル間の変動性。7−183日分娩後に得られた牛乳では、自動細胞カウンターによって決定された細胞濃度は16,083−222,857細胞/mLの範囲を有する。図1は、ダレット、デブリ、および死んだ細胞を排除するゲーティング戦略を示しています。生存率は~90~99%であった。生細胞全体の約1.6−12.3%がCD45+白血病であった(表1)。ほとんどの単球は、前述のように前駆体/未熟細胞であるように見えた, 示唆的なSSC対CD45ゲーティング34に基づいて.偽細胞はSSC低中間/CD45低と定義されたが、より一般的には、主張されるリンパ球集団とは異なる高いCD45染色レベルを示した人はほとんどいなかった。血液単球に関連する(図1)、以前の研究33、34と同様。と言われる顆粒球は、SSC高/CD45中間33,34(表1)として定義された。この分類は示唆的なものであり、細胞タイプを確認するために系統特異的マーカーが必要となることに注意してください。
新たに単離されたBM細胞のADCP活性は、HIVエンベロープのV2領域に特異的であり、ここで試験されたV1V2-2F5K抗原に結合するHIV特異的ヒトmAb 830Aを用いて測定した。ADCP活性は、産後1ヶ月で得られた牛乳を用いてここでの例について測定した(図2A)。例データは、CD45+セル上でゲーティングする際に見られる期待されるFITC(ビード+)ヒストグラムを示しています(1 μg/mL mAbを使用して生成されたデータが示されています)。黒いマーカーは、ADCP スコアの計算に使用される母集団を示します。試料830Aデータ(図2Aの第1パネル)では、CD45+細胞の割合及びその集団の平均蛍光が示され、これはステップ3.4の式を用いてADCPスコアを計算するために使用された。アブ結合/抗原結合ビーズを用いてインキュベーションする前にアクチン阻害剤サイトチャラシン-D(cytoD)および/またはFcR遮断Abs(FcBlock)を用いて事前インキュベートした細胞は、コントロールmAb 3865以下のレベルでADCP活性を示し、ADCPがFcRであったことを示すアクチン依存性 (図 2)CD45+細胞の合計に対して決定されたADCPスコアは、陰性対解疽mAb 3865を用いて定義されたバックグラウンドレベルより〜25−35倍であった。各主要なサブセットも個別に分析されました。造粒細胞と称される顆粒球は、背景よりも12−29倍高いADCP活性を示した。単球ADCPと称される単球ADCPは、背景の上に~2~3倍であった(図2)。期待どおりに主張されたリンパ球は測定可能なADCP活性を示さなかった(非特異的陰性対照mAb 3865のADCPスコアAUCの3倍未満の標準偏差;データは示されていない)。
図1:母乳から単離した細胞のサンプルフローサイトメトリーデータ。細胞は、プロトコルに記載されているように処理され、染色された。(A)図に示すように、FSC-H対FSC-Aプロットの二重を除去するために単一細胞をゲートオンし、FSC-Aの小さな破片<5,000をゲーティングした。(B)この集団は、SSC対V450(生存率染色)プロットにおいて生細胞(生存性色素で染色しない)にゲートするために使用された。(C)これらの生細胞は、FSC対SSCプロットで使用された。非白血病細胞の期待される位置は、主に乳状上皮細胞である可能性が高く、強調表示される(「E」)。(D)同じ FSC プロットと SSC プロットは、CD45+セルでのみ表示されます。指摘された主要な白球サブセットは、確立され、期待されるSSCパラメータ(G =顆粒球;顆粒球;に基づくアイデンティティに過ぎない。M = 単球;L=リンパ球)。(E)生存細胞は、主要な白血病サブセットを用いたSSC対CD45プロットに用いた。このプロットからのバックゲーティングは、パネルDに示されたデータを得たが、この分類は示唆的であり、細胞タイプを確認するために系統特異的マーカーが必要であることを指摘した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:母乳から単離した細胞を用いてADCPデータをサンプルする。実施されたADCPアッセイは、アッカーマンら30から適応されたアッセイに基づいている。アッセイは、上記のプロトコルで概説されているように行った。(A)サンプル FITC ヒストグラムを 1 μg/mL mAb で、ADCP スコアの決定に使用されるビーズ/FITC+ 母集団を示すマーカーを使用します。スコアは(ビーズ陽性細胞のMFI)x(ビーズ/FITC+陽性集団におけるCD45+細胞全体の%)として計算した。mAb 830A単独を用いた最初のパネルは、その例におけるADCPスコアの算出に用いられる全CD45+細胞の割合および平均蛍光強度値も示す。(B)各mAb希釈アッセイにおけるADCPスコアは、グラフィックスソフトウェアにおける曲線下面積(AUC)値の計算に使用された。対照実験では、アクチン阻害剤サイトカラシン-D(サイトD)、FcR遮断剤(FcBlock)、または両方の組み合わせを、免疫複合体に添加する前に細胞で事前にインキュベートした(凡例参照)。この細胞分類は示唆的なものであり、細胞タイプを確認するために系統特異的マーカーが必要な点に注意してください。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| サンプル | セル/mL | % CD45+ | % 顆粒球* | パーセント単球* |
| 1 | 222,857 | 12.3 ± 1.9 | 13.6 ± 3.8 | 65.9 ± 5.6 |
| 2 | 27,361 | 1.6 ± 0.01 | 25.2 ± 4.0 | 9.1 ± 5.6 |
| 3 | 161,486 | 3.6 ± 1.1 | 47.8 ± 6.8 | 24.3 ± 4.3 |
| 4 | 16,083 | 2.7 ± 0.1 | 17.9 ± 3.5 | 34.4 ± 1.0 |
| 5 | 25,155 | 4.0 ± 0.7 | 29.7 ± 2.6 | 20.5 ± 1.4 |
| *CD45+セルの | ||||
表1:典型的な母乳細胞数および特性の例。
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Discussion
ここに記載されているADCP活性を測定するためのフローサイトメトリーベースの技術は、最初に201130に記載され、それ以来、80以上の研究で堅牢であることが証明され、引用されています。ここで説明するプロトコルは、この手法を初めて一次 BM セルで使用するために適応します。BM細胞によるFc媒介機能の以前の研究は、大きく異形成後(生後0−4日)から分離された細胞を用いた酸化バーストまたは菌学ベースの食細胞症アッセイの測定に限定されていた。事実上、大敗期を過ぎたヒトBMの細胞を調べた研究はほとんどなかった。異形成細胞を用いた研究は、一般的に、異形成細胞の顆粒球は血液から単離されたものよりも活性が低いと結論付けており、血管外空間35に移動した「外因性細胞」として振る舞っている。同様の咽菌および殺菌能力36.
何十年もの間、従来の顕微鏡検査はBM白血病を同定するために使用され、このタイプの視覚同定は細胞の誤認1につながった可能性がある。授乳の最初の月を超えてBM白球組成物を比較した研究はほとんどなく、ほとんどは初乳に焦点を当てています。細胞を同定するためのフローサイトメトリーの使用は、細胞を正確に同定する可能性が高いが、この方法を用いて行われたBM研究はごくわずかであり、多くの場合、非常に小さなサンプル数を有する。現在の研究では、授乳のすべての段階におけるBMの白球含有量は、早期初乳中の〜104−7x 105白球細胞/mLに及び、成熟乳中の103-5x 104白球細胞/mLにまで及ぶ、広く変化することが示されている。すべての研究は、細胞濃度と組成物が授乳1、2、3、4、5の段階によって強く影響を受っていることを確認するが、牛乳が成熟組成に移行するにつれて、好中球濃度は増加するように見えるが、そのような研究は通常、産後34の最初の月を超えて拡張されていない。
本明細書に記載のプロトコルは、蛍光ビーズを咽頭標的として使用するが、免疫複合体や感染細胞などの様々な生物学的に関連する標的のBM ADCPを研究するために適用できる可能性が高いが、様々なAbアイソタイプによって引き起こされる。サブクラス。より大きな細胞染色パネルは、白血病をさらに分化させるために採用することができる。これらの関連する一次細胞によるADCPの包括的な理解を開発するためには、大規模な研究が不可欠です。このプロトコルは、HIVのMTCT、ならびに他の病原体の減少のための潜在的なメカニズムとしてBM白血病によるADCPの確立を可能にする。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
シナイ山のイカーン医学部の医学科と微生物学科のスーザン・ゾラ・パズナー博士に原稿のレビューを感謝します。NIH/NICHDは、補助金番号R21 HD095772-01A1の下で、このプロジェクトのための資金を提供しました。また、R.パウエルは、シナイ山のイカーン医学部感染症学科医学部の資金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres | Thermo Fisher | F8776 | |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560975 | |
| Bovine serum Albumin | MP Biomedicals | 8810025 | |
| Corning V-bottom polystyrene 96-well plate | Corning | 3894 | |
| Cytochalasin D | Sigma | 22144-77-0 | |
| EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit | Thermo Fisher | 21338 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352196 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| Fixable Viability Stain 450 | BD | 562247 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | 252549 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Life Technologies | 14175-095 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | |
| Human Serum Albumin | MP Biomedicals | 2191349 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| PBS 1x pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | |
| Polystyrene 10 mL Serological Pipettes | Corning | 4488 | |
| Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL | Pierce | 88512 |
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