Summary
Muttermilch überträgt das humane Immundefizienzvirus (HIV), obwohl sich nur 15 % der säuglingsgestillten Säuglinge, die von HIV-infizierten Müttern gestillt werden, anstecken. Gestillte Säuglinge nehmen täglich 105bis 108 mütterliche Leukozyten auf, obwohl diese Zellen unteruntersucht sind. Hier beschreiben wir die Isolierung von Muttermilchleukozyten und eine Analyse ihrer phagozytischen Kapazität.
Abstract
Selbst in Ermangelung antiretroviraler Medikamente werden nur 15 % der Säuglinge infiziert, die von HIV-infizierten Müttern gestillt werden, was auf eine starke schützende Wirkung der Muttermilch (BM) hindeutet. Sofern der Zugang zu sauberem Wasser und geeigneter Säuglingsnahrung nicht zuverlässig ist, empfiehlt die WHO für HIV-infizierte Mütter keine Einstellung des Stillens. Zahlreiche Faktoren arbeiten wahrscheinlich zusammen, um die BM-Übertragung zu reduzieren. Gestillte Säuglinge nehmen täglich 105bis 108 mütterliche Leukozyten auf, was jedoch weitgehend unklar bleibt, ist der Beitrag dieser Zellen zu den antiviralen Qualitäten von BM. Antikörperabhängige zelluläre Phagozytose (ADCP), eine der essentiellen und durchdringendsten angeborenen Immunantworten, durch BM-Phagozyten gegen HIV-Ziele. Die Zellen wurden aus 5 menschlichen BM-Proben isoliert, die in verschiedenen Stadien der Laktation gewonnen wurden. Die Isolierung erfolgte durch sanfte Zentrifugation, gefolgt von einer sorgfältigen Entfernung von Milchfett und wiederholtem Waschen des Zellpellets. Fluoreszierende Perlen, die mit DEM Epitop hiv-hüllt waren, wurden als Ziele für die Analyse von ADCP verwendet. Die Zellen wurden mit dem CD45-Oberflächenmarker befleckt, um Leukozyten zu identifizieren. Es wurde festgestellt, dass die ADCP-Aktivität über Kontrollexperimenten signifikant war und reproduzierbar mit einem HIV-spezifischen Antikörper 830A messbar war.
Introduction
Muttermilch (BM) besteht aus mütterlichen Zellen, die >90% lebensfähig sind1. Die Zellzusammensetzung wird stark durch das Stadium der Stillzeit, den Gesundheitszustand von Mutter und Kind und die individuelle Variation beeinflusst, die nach wie vor wenig verstanden wird1,2,3,4. Da BM 103€105 Leukozyten/ml enthält, kann geschätzt werden, dass gestillte Säuglinge täglich 105x 108 mütterliche Leukozyteneinnehmen. Verschiedene In-vivo-Studien haben gezeigt, dass mütterliche Leukozyten dem Säugling eine kritische Immunität bieten und weit über diese Orte der Erstaufnahme hinaus funktionieren5,6,7,8 ,9,10,11. Alle mütterlich abgeleiteten Zellen, die vom Säugling aufgenommen werden, haben das Potenzial, Nebenfunktionen neben dem Säugling samt Leukozyten auszuführen oder zu kompensieren12.
Die Mutter-Kind-Übertragung (MTCT) des humanen Immundefizienzvirus (HIV) bleibt in ressourcenbegrenzten Ländern eine Krise. Da Durchfall- und Atemwegserkrankungen für eine erhebliche Sterblichkeitsrate bei Säuglingen in ressourcenbegrenzten Ländern verantwortlich sind und diese Krankheiten durch exklusives Stillen deutlich reduziert werden, sind die Vorteile für HIV-infizierte Mütter von Stillen weit überwiegt die Risiken13,14,15. Sofern der Zugang zu sauberem Wasser und geeigneter Säuglingsnahrung nicht zuverlässig ist, empfiehlt die WHO für HIV-infizierte Mütter16keine Einstellung des Stillens. Jährlich treten ca. 100.000 MTCTs über BM auf; doch, nur 15% der Säuglinge gestillt von ihren HIV-infizierten Müttern infiziert, was auf eine starke Schutzwirkung von BM17,18,19,20,21. Zahlreiche Faktoren arbeiten wahrscheinlich im Tandem, um eine Übertragung zu verhindern. Wichtig ist, dass HIV-spezifische Antikörper (Abs) in BM mit reduziertem MTCT und/oder reduziertem Tod von Säuglingen durch HIV-Infektion korreliert wurden22,23. Weitgehend unklar bleibt der Beitrag des zellulären Anteils von BM zu seinen antiviralen Qualitäten.
Viele Abs ermöglichen eine Vielzahl antiviraler Aktivitäten, die durch die "konstante" Region des Immunglobulinmoleküls, das kristallisierbare Fragment (Fc), über die Interaktion mit Fc-Rezeptoren (FcRs) vermittelt werden, die auf praktisch allen angeborenen Immunzellen gefunden werden, von denen praktisch alle finden sie in human BM24. Die antikörperabhängige zelluläre Phagozytose (ADCP) wurde als notwendig für die Clearance von Virusinfektionen nachgewiesen und im Falle der Prävention von MTCT von HIV25,26,27, 28 , 29. Angesichts des Mangels an Wissen über den potenziellen Beitrag der ADCP-Aktivität durch BM-Phagozyten zur Prävention von MTCT von HIV, wollten wir eine strenge Methode entwickeln, um Zellen aus menschlichen BM zu isolieren, um eine Studie über ADCP durchzuführen, die von Zellen aus BM in verschiedenen Stadien der Laktation erhalten.
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Protocol
Jeder Teilnehmer an dieser Studie wurde in Übereinstimmung mit der Zustimmung des Ethik- und Institutionellen Prüfungsausschusses (IRB) mit der Anleitung und Genehmigung des Mount Sinai Program for the Protection of Human Subjects (PPHS) unter Verwendung eines Von IRB zugelassenen Programms für menschliche Subjekte (PPHS) rekrutiert und interviewt. für die Gewinnung von Muttermilchproben.
1. Ziel Mikrosphäre nerische Vorbereitung
- Wählen Sie ein relevantes Zielantigen aus.
HINWEIS: In diesem Beispiel wurde das rekombinante Protein V1V2-2F5K verwendet, das entwickelt wurde, um die trimerische Spitze der nativen HIV-Hüllkurve30nachzuahmen. - Biotinylierung mit einem kommerziellen Kit (Tabelle der Materialien) nach dem Herstellerprotokoll durchführen.
- Berechnen Sie mmol des Biotin-Reagenzes, um die Reaktion für einen 5-fachen Molüberschuss mit der Formel hinzuzufügen: mmol biotin = mL Protein x (mg Protein/mL Protein) x (mmol biotin/mg protein) x (5 mmol biotin/mmol protein)30,31. Berechnen Sie dann die L des Biotin-Reagenzes, das sie nach der Formel hinzufügen: "L biotin = mmol biotin x "1.000.000 l/L) x (L/10 mmol).
- Biotin vor dem Öffnen auf Raumtemperatur ausstellen. Auflösen Sie Dasprotein in 0,5 bis 2,0 ml Phosphatgepufferter Saline (PBS) nach der oben durchgeführten Berechnung.
- Bereiten Sie eine 10 mM Lösung des Biotinreagenzes in Dimethylsulfoxid (DMSO) vor und fügen Sie der Proteinlösung das entsprechende Volumen von 10 mM Biotinreagenz hinzu und inkubieren Sie die Reaktion auf Eis für 2 h oder bei Raumtemperatur 30 min.
- Überschüssiges Biotin mit Proteinkonzentratoren (Polyethersulfon [PES]-Membranen, 3 kDa Molekulargewichtsabschaltung [MWCO], 0,5 ml entfernen; Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Legen Sie die Probe in die obere Kammer der Spinsäule ein und fügen Sie PBS bis zu 400 l. Kappe hinzu, und legen Sie diese Probenkammer dann in ein Sammelrohr ein. Zentrifuge bei 12.000 x g bei Raumtemperatur für 30 min.
- Durchfluss durchlassen und PBS zu 400 l hinzufügen. Zentrifugation wiederholen. Durchfluss durchlassen und PBS zu 100 l hinzufügen. Messen Sie die Proteinkonzentration durch ein Spektralphotometer.
HINWEIS: Protein kann bei -80 °C eingefroren werden, bis es verwendet wird.
2. Antikörper-abhängige zelluläre Phagozytose (ADCP) Assay Plate Preparation
- Konjugieren Sie biotinyliertes Protein zu 1 m Mikrosphären ("Perlen"; Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Pro Teller konjugierter Perlen 6 g Protein mit 12 l Stockperlen in 200 l 0,1% Rinderserumalbumin (BSA)-PBS bei Raumtemperatur für 1 h inkubieren und alle 20 min sanft wirbeln.
- Zentrifuge bei 13.000 x g für 5 min. Überstand entsorgen, sanft wirbeln und in 1200 l mit 0,1% BSA-PBS wieder aufsetzen. Wiederholen Sie Spin und waschen Schritt 2x. Resuspend in 1200 l von 0,1% BSA-PBS.
- Aliquot 10 l Perlenlösung pro Brunnen in einer runden 96-Well-Platte. Bereiten Sie Verdünnungen von Antikörpern oder Immunseren von Interesse in 12 l von 2% HSA HBSS, in der Regel beginnend bei 50 g/ml Antikörper oder einer 1/100 Serumverdünnung.
HINWEIS: In den Probendaten wurde monoklonaler Antikörper (mAb) 830A verwendet. - 10 L titrierter Antikörper/Sera auf die Perlenplatte geben und 2 h bei 37 °C brüten. Fügen Sie jedem Brunnen 200 l von 2% HSA HBSS und zentrifugenplatte bei 2.000 x g für 10 min hinzu.
- Entfernen Sie den Überstand vorsichtig durch ein schnelles Umkippen und Dekantieren von Flüssigkeit aus den Plattenbrunnen in eine Spüle, um das unsichtbare Perlenpellet nicht zu stören.
3. Isolierung der Muttermilchzellen
- Erhalten Sie Muttermilch von gesunden laktierenden Frauen, ausgedrückt mit doppelten elektronischen oder manuellen Pumpen. Isolieren Sie Zellen innerhalb von 4 h expression, wobei Die Milch bei Raumtemperatur gehalten wird.
- Mit 50 ml Tuben Zentrifuge 50 ml Milch bei 800 x g für 15 min. Vorsichtig die Magermilch und Fett abgießen, während das Zellpellet ungestört bleibt. Wischen Sie die Innenseite des Rohres mit einem fusselfreien Wisch, um das gesamte Fett aus der Rohrwand zu entfernen.
- Fügen Sie 10 ml 2% humanes Serumalbumen in Hanks ausgewogene Salzlösung hinzu (2% HSA HBSS [ohne Ca2+ oder Mg+]). Setzen Sie das Pellet durch sanftes Pipettieren wieder auf, um Zellaktivierung und Apoptose zu vermeiden. 10 min in ein 15 ml Rohr und eine Zentrifuge bei 450 x g übertragen.
- Überstand abgießen und Schritt 1.3 wiederholen. Dann, sanft resuspendieren Zellen in 1-2 ml von 2% HSA HBSS in Abhängigkeit von der erwarteten Zellzahl, und zählen Zellen durch ein Hämozytometer oder einen automatisierten Zellzähler, beachten Sie auch die Zelllebensfähigkeit.
4. ADCP-Test
HINWEIS: Die hier beschriebenen Methoden sind von Ackerman et al.32angepasst.
- Fügen Sie 50.000 frisch isolierte BM-Zellen zu jeder ADCP-Assayplatte gut in 200 l von 2% HSA-HBSS hinzu. 2 h bei 37 °C inkubieren.
- Für Kontrollexperimente vorinkubierten Zellen bei 37 °C mit 10 g/ml-Aktininhibitor (Cytochalasin-D), 50 g/ml FcR-Blockiermittel (FcBlock) oder eine Kombination aus beidem vor deren Zugabe zu den Platten.
- Zentrifugenplatte bei 930 x g für 10 min. Fügen Sie 200 l von 2% HSA HBSS und Wiederholungzentrifugation hinzu. Entfernen Sie überstand vorsichtig wie in Schritt 2.7 und wiederholen Sie die Wäsche.
- Entfernen Sie vorsichtig Überstand- und Fleckenzellen für die Lebensfähigkeit mit 0,5 g/ml (Endkonzentration) fixierbaren Lebensfähigkeitsfleck 450 pro Bohrung in 50 l von 2% HSA HBSS. 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln bebrüten. Zentrifugenplatte bei 930 x g für 10 min und entfernen Überstand wie in Schritt 2.7. Fügen Sie 200 l von 2% HSA HBSS und Zentrifugenplatte wieder hinzu, gefolgt von der Entfernung von Überstand wie in Schritt 2.7.
- Nach der Lebensfähigkeitsfärbung, Fleckenzellen für Leukozytenmarker von Interesse, minimal einschließlich eines CD45-spezifischen Flecks wie PE-Maus Anti-Human CD45 (Klon HI30) in einer optimierten Konzentration (1 g / l in 50 l von 1% BSA HBSS in den Beispieldaten).
HINWEIS: Alle linienspezifischen Markierungen können einbezogen werden. - 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln bebrüten. Zentrifugenplatte bei 930 x g für 10 min und entfernen Überstand wie in Schritt 2.7. Fügen Sie 200 L von 1% BSA HBSS und Wiederholungzentrifugation hinzu. Entfernen Sie Überstand. Fixzellen in 200 l von 0,5% Formaldehyd im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 min oder über Nacht bei 4 °C. Kühlen Sie im Dunkeln bis zur Analyse.
5. Analyse durch Durchflusszytometrie
- Führen Sie anfängliches Gating durch, um Doublets auf einem Vorwärtsstreuungsdiagramm (FSC) und Einem SSC-Plot (Material kleiner als FSC = 5000) zu eliminieren (siehe Abbildung 1). Verwenden Sie ein SSC vs. Lebensfähigkeitsfleck (in diesem Fall V450), um abgestorbene Zellen zu beseitigen (solche, die positiv für den Lebensfähigkeitsfleck sind).
- Verwenden Sie ein SSC vs. CD45-Diagramm, um die wichtigsten Leukozytenklassen (Granulozyten, Monozyten, Lymphozyten) zu unterscheiden, wie ausführlich beschrieben33,34.
HINWEIS: Diese Klassifizierung ist nur suggestiv und linienspezifische Marker sind erforderlich, um den Zelltyp zu bestätigen. - Für alle CD45+-Zellen oder für jede Leukozyten-Teilmenge von Interesse messen SIE die ADCP-Aktivität, indem sie mit einem Marker auf den Perlen-positiven Zellen in einem Histogramm des Fluoresceinisothiocyanat(FITC)-Kanals, in dem die fluoreszierenden Perlen nachgewiesen werden, gegatingt werden.
HINWEIS: Die negativen Kontrollbrunnen, in denen keine Perlen hinzugefügt wurden, zeigen an, wo die Perlen-positiven Zellen im Histogramm sichtbar sind und wo daher der Gating-Marker platziert werden soll. - Berechnen Sie ADCP-Werte als (mediane Fluoreszenzintensität [MFI] von Perlen-positiven Zellen) x (% der gesamten CD45 + Zellen in der positiven Population). Verwenden Sie Grafiksoftware, um Partituren bei jeder Ab/Serum-Konzentration zu zeichnen und eine AUC-Analyse (Area-under-the-curve) durchzuführen.
HINWEIS: ADCP gilt als positiv, wenn die AUC größer als die 3x Standardabweichung des ADCP-Scores AUC eines unspezifischen Negativkontroll-mAb ist (in diesem Fall 3865).
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Representative Results
Milch kann bei Raumtemperatur oder kühler (wenn auch nicht gefroren) aufbewahrt werden; Da wir jedoch eine verminderte Lebensfähigkeit beobachtet haben, wenn Milch sehr kalt gehalten wurde (Daten nicht gezeigt), und dass es einfacher ist, kurz zu sammeln, zu lagern und bei Umgebungstemperaturen zu transportieren, wird empfohlen, Proben nicht zu kühlen, um Beispiel-zu-Probe-Variabilität. In Milch, die 7 bis 183 Tage nach der Partumato erhalten wurde, lag die durch den automatisierten Zellzähler ermittelte Zellkonzentration zwischen 16.083 und 222.857 Zellen/ml. Abbildung 1 zeigt die Gating-Strategie zur Eliminierung von Doublets, Schutt und abgestorbenen Zellen. Die Lebensfähigkeit lag bei 90 bis 99 %. Etwa 1,6 bis 12,3 % aller lebenden Zellen waren CD45+ Leukozyten (Tabelle 1). Die meisten angeblichen Monozyten schienen Vorläufer/unreife Zellen zu sein, wie zuvor beschrieben, basierend auf dem suggestiven SSC vs. CD45 gating34. Die angeblichen Monozyten wurden als SSCLow-Intermediate/CD45lowdefiniert, obwohl nur wenige die höheren CD45-Färbungen aufwiesen, die sich von der angeblichen Lymphozytenpopulation (SSClow/CD45low)unterschieden. mit Blutmonozyten assoziiert (Abbildung 1), ähnlich wie frühere Studien33,34. Die angeblichen Granulozyten wurden als SSChigh/CD45intermediate33,34 ( Tabelle1) definiert. Beachten Sie, dass diese Klassifizierung nur suggestiv ist und dass linienspezifische Marker erforderlich wären, um den Zelltyp zu bestätigen.
Die ADCP-Aktivität der frisch isolierten BM-Zellen wurde mit dem HIV-spezifischen Human mAb 830A gemessen, der spezifisch für die V2-Region der HIV-Hüllkurve ist und an das hier getestete V1V2-2F5K-Antigen bindet. Die ADCP-Aktivität wurde hier anhand von Milch gemessen, die nach der Partumuma 1 Monat erhalten wurde (Abbildung 2A). Beispieldaten zeigen die erwarteten FITC-Histogramme (bead+), die beim Gating auf CD45+ Zellen gesehen werden (Daten, die mit 1 g/ml mAb generiert werden, werden angezeigt). Die schwarzen Markierungen geben die Populationen an, die zur Berechnung der ADCP-Werte verwendet werden. In der Stichprobe 830A Daten (erstes Panel von Abbildung 2A), Prozentsatz der CD45+ Zellen und mittlere Fluoreszenz dieser Grundgesamtheit werden gezeigt, die verwendet wurden, um den ADCP-Score mit der Gleichung in Schritt 3.4 zu berechnen. Zellen, die vor ihrer Inkubation mit den Ab-gebundenen/antigengekoppelten Perlen mit dem Actin-Inhibitor Cytochalasin-D (CytoD) und/oder FcR-blockierenden Abs (FcBlock) vorihrer Inkubation mit den Ab-gebundenen/antigengekoppelten Perlen vorgeschaltet wurden, zeigten ADCP adCP-Aktivität auf der Ebene der Kontrolle mAb 3865 oder darunter, was darauf hindeutet, dass ADCP FcR war. und actin-abhängig (Abbildung 2). Der ADCP-Wert, der für die Gesamt-CD45+-Zellen ermittelt wurde, lag 25-mal über den Hintergrundwerten, die mit dem negativen Kontrollanti-Anthrax mAb 3865 definiert wurden. Jede Hauptteilmenge wurde ebenfalls separat analysiert. Die angeblichen Granulozyten wiesen adCP-Aktivität auf, die um das 12-29-fache höher war als der Hintergrund. Der angebliche Monozyten ADCP lag 2-fach über dem Hintergrund(Abbildung 2). Die angeblichen Lymphozyten zeigten wie erwartet keine messbare ADCP-Aktivität (weniger als die 3x Standardabweichung des ADCP-Scores AUC der unspezifischen Negativkontrolle mAb 3865; Daten nicht dargestellt).
Abbildung 1: Probenflusszytometriedaten von Zellen, die aus der Muttermilch isoliert sind. Die Zellen wurden wie im Protokoll beschrieben verarbeitet und gefärbt. (A) Einzelne Zellen wurden angezäut, um Doublets in einem FSC-H vs. FSC-A-Plot wie gezeigt zu eliminieren, auch die kleinen Trümmer <5.000 in FSC-A herauszukleben. (B) Diese Population wurde verwendet, um auf lebenden Zellen (die nicht mit dem Lebensfähigkeitsfarbstoff färben) in einem SSC vs. V450 (Lebensfähigkeitfleck) Diagramm zu gate. (C) Diese lebenden Zellen wurden in einem FSC vs. SSC-Plot verwendet. Die erwartete Position von Nicht-Leukozyten, die wahrscheinlich überwiegend Brustepithelzellen sind, wird hervorgehoben ("E"). (D) Das gleiche FSC vs. SSC-Diagramm wird nur mit CD45+ Zellen angezeigt. Die wichtigsten leukozyten-Teilmengen sind nur angebliche Identitäten, die auf etablierten und erwarteten SSC-Parametern basieren (G = Granulozyten; M = Monozyten; L = Lymphozyten). (E) Lebensfähige Zellen wurden für ein SSC vs. CD45-Diagramm mit den wichtigsten Leukozyten-Teilmengen verwendet. Zurück-Gating aus diesem Diagramm ergab die Daten in Panel D gezeigt. Beachten Sie, dass diese Klassifizierung ist nur suggestiv und dass Linie-spezifische Marker sind erforderlich, um Zelltyp zu bestätigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Beispiel ADCP-Daten unter Verwendung von Zellen, die aus der Muttermilch isoliert sind. Der adCP-Assay basiert auf dem von Ackerman et al.30adaptierten Assay. Der Test wurde wie im obigen Protokoll beschrieben durchgeführt. (A) Beispiel-FITC-Histogramme bei 1 g/ml mAb, wobei Marker die Perlen-/FITC+-Populationen angeben, die zur Bestimmung des ADCP-Scores verwendet werden. Die Werte wurden als (MFI von Perlen-positiven Zellen) x (% der gesamten CD45+ Zellen in der Bead/FITC+ positiven Population) berechnet. Das erste Panel, das mAb 830A allein verwendet, gibt auch den Prozentsatz der gesamten CD45+ Zellen und den mittleren Fluoreszenzintensitätswert an, der zur Berechnung des ADCP-Scores in diesem Beispiel verwendet wird. (B) ADCP-Werte bei jedem mAb-Verdünnungstest wurden zur Berechnung von AUC-Werten (Area-under-the-curve) in Grafiksoftware verwendet. Für Kontrollexperimente wurden der Aktin-Inhibitor Cytochalasin-D (CytoD), das FcR-Blockierungsmittel (FcBlock) oder eine Kombination beider vorderinkubiert mit Zellen vor ihrer Zugabe zu den Immunkomplexen (siehe Legenden). Beachten Sie, dass diese Zellklassifizierung nur suggestiv ist und dass linienspezifische Marker erforderlich sind, um den Zelltyp zu bestätigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| probe | Zellen/ml | % CD45+ | % Granulozyten* | % Monozyten* |
| 1 | 222,857 | 12,3 € 1,9 | 13,6 x 3,8 | 65,9 € 5,6 |
| 2 | 27,361 | 1,6 x 0,01 | 25,2 x 4,0 | 9,1 bis 5,6 |
| 3 | 161,486 | 3,6 x 1,1 | 47,8 x 6,8 | 24,3 x 4,3 |
| 4 | 16,083 | 2,7 x 0,1 | 17,9 x 3,5 | 34,4 x 1,0 |
| 5 | 25,155 | 4,0 bis 0,7 | 29,7 € 2,6 | 20,5 x 1,4 |
| *von CD45+ Zellen | ||||
Tabelle 1: Beispiele für typische Anzahl und Eigenschaften von Muttermilchzellen.
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Discussion
Die hier beschriebene Strömungszytometrie-basierte Technik zur Messung der ADCP-Aktivität wurde erstmals 201130 beschrieben und hat sich seitdem als robust erwiesen und in mehr als 80 Studien zitiert. Das hier beschriebene Protokoll passt diese Technik erstmals für die Verwendung mit primären BM-Zellen an. Frühere Studien über die Fc-vermittelte Funktionalität durch BM-Zellen beschränkten sich weitgehend auf die Messung oxidativer Ausbrüche oder histologiebasierte Phagozytose-Assays mit Zellen, die aus Kolostrum isoliert wurden (0 bis 4 Tage nach der Geburt). Nahezu keine Studien haben Zellen im menschlichen BM über die Kolostrumphase hinaus untersucht. Studien mit Kologoralzellen sind im Allgemeinen zu dem Schluss gekommen, dass die Granulozyten in Kolostrum weniger aktiv sind als die aus dem Blut isolierten, und verhalten sich als "Exutatzelle", die sich in den extravaskulären Raum35bewegt hat, obwohl widersprüchliche Studien ähnliche phagozytäre und bakterizide Kapazitätengemeldet 36.
Jahrzehntelang wurde die traditionelle Mikroskopie verwendet, um BM-Leukozyten zu identifizieren, und diese Art der visuellen Identifizierung könnte zu einer Identifizierung von Zellen geführt haben1. Nur wenige Studien haben DIE Zusammensetzung von BM-Leukozyten über den ersten Monat der Laktation hinaus verglichen, und die meisten haben sich auf Kolostrum konzentriert. Die Verwendung der Durchflusszytometrie zur Identifizierung von Zellen ist wahrscheinlich, um Zellen genau zu identifizieren, obwohl nur eine kleine Anzahl von BM-Studien mit dieser Methode durchgeführt wurden, oft mit einer sehr kleinen Stichprobenzahl. Aktuelle Studien haben gezeigt, dass der Leukozytengehalt von BM in allen Stadien der Stillzeit sehr unterschiedlich ist und von 104x 105 Leukozyten/ml im frühen Kolostrum reicht, die bis zu 103x 104 Leukozyten/ml in reifer Milch abnehmen, obwohl alle Studien bestätigen, dass die Zellkonzentration und -zusammensetzung durch das Stadium der Stillzeitstarkbeeinflusst wird 1,2,3,4,5. Da Milch zu seiner reifen Zusammensetzung übergeht, scheint die Neutrophilenkonzentration zu zunehmen, obwohl solche Studien in der Regel nicht über den ersten Monat nach der Stelle34hinausgegangen sind.
Das hier beschriebene Protokoll verwendet fluoreszierende Perlen als phagozytisches Ziel, obwohl es wahrscheinlich angewendet werden kann, um BM ADCP einer Vielzahl von biologisch relevanteren Zielen wie Immunkomplexen und infizierten Zellen zu untersuchen, die durch verschiedene Ab-Isotypen ausgelöst werden und Unterklassen. Eine größere Zellfärbung stäbchen, um die Leukozyten weiter zu differenzieren. Große Studien werden für die Entwicklung eines umfassenden Verständnisses von ADCP durch diese relevanten Primärzellen unerlässlich sein. Dieses Protokoll ermöglicht die Etablierung von ADCP durch BM-Leukozyten als möglichen Mechanismus zur Reduktion von MTCT von HIV sowie anderen Krankheitserregern.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Susan Zolla-Pazner in der Abteilung für Medizin und Abteilung für Mikrobiologie an der Icahn School of Medicine am Berg Sinai für die Manuskriptüberprüfung. Das NIH/NICHD stellte Mittel für dieses Projekt unter der Fördernummer R21 HD095772-01A1 bereit. Darüber hinaus wurde R. Powell durch Mittel des Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Icahn School of Medicine am Mount Sinai unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres | Thermo Fisher | F8776 | |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560975 | |
| Bovine serum Albumin | MP Biomedicals | 8810025 | |
| Corning V-bottom polystyrene 96-well plate | Corning | 3894 | |
| Cytochalasin D | Sigma | 22144-77-0 | |
| EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit | Thermo Fisher | 21338 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352196 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| Fixable Viability Stain 450 | BD | 562247 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | 252549 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Life Technologies | 14175-095 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | |
| Human Serum Albumin | MP Biomedicals | 2191349 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| PBS 1x pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | |
| Polystyrene 10 mL Serological Pipettes | Corning | 4488 | |
| Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL | Pierce | 88512 |
References
- Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. Cells in human milk: state of the science. Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).
- Lonnerdal, B. Nutritional and physiologic significance of human milk proteins. The American Journal of Clinical Nutrition. 77 (6), 1537S-1543S (2003).
- Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. Effect of maternal diet and body composition on lactational performance. The American Journal of Clinical Nutrition. 39 (2), 296-306 (1984).
- Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months). Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3 (5), 713-720 (1984).
- Hassiotou, F., Geddes, D. T. Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding. Advances in Nutrition. 6 (3), 267-275 (2015).
- Hanson, L. A. The mother-offspring dyad and the immune system. Acta Paediatrica. 89 (3), 252-258 (2000).
- Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. Activated and memory T lymphocytes in human milk. Cytometry. 13 (3), 282-290 (1992).
- Jain, L., et al. In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons. Archives of Disease in Childhood. 64 (7 Spec No), 930-933 (1989).
- Zhou, L., et al. Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth. Immunology. 101 (4), 570-580 (2000).
- Tuboly, S., Bernath, S. Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).
- Cabinian, A., et al. Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer's Patches of the Nursed Infant. PLoS ONE. 11 (6), e0156762 (2016).
- Filias, A., et al. Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates. BMC Pediatrics. 11, 29 (2011).
- Natchu, U. C., et al. Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women. The American Journal of Clinical Nutrition. 96 (5), 1071-1078 (2012).
- Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants. The Journal of Pediatrics. 126 (5 Pt 1), 696-702 (1995).
- WHO. Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis. Lancet. 355 (9202), 451-455 (2000).
- World Health Organization. Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee. World Health Organization. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2016).
- Nelson, C. S., et al. Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk. Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).
- Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197 (3 Suppl), S3-S9 (2007).
- Shen, R., et al. Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women. PLoS ONE. 10 (12), e0145150 (2015).
- Fouda, G. G., et al. HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies. Journal of Virology. 85 (18), 9555-9567 (2011).
- Van de Perre, P., et al. HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1. Science Translational Medicine. 4 (143), 143sr143 (2012).
- Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality. Cell Host & Microbe. 17 (4), 500-506 (2015).
- Pollara, J., et al. Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1. Journal of Virology. 89 (19), 9952-9961 (2015).
- Ackerman, M., Nimmerjahn, F. Antibody Fc. , Academic Press. Cambridge, MA. (2014).
- Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections. Journal of Immunology. 166 (12), 7381-7388 (2001).
- Fujisawa, H. Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice. Journal of Virology. 82 (6), 2772-2783 (2008).
- Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells. Journal of Virology. 81 (17), 9551-9555 (2007).
- Yasui, F., et al. Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus. Virology. 454-455, 157-168 (2014).
- Quattrocchi, V., et al. Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease. Antiviral Research. 92 (2), 262-270 (2011).
- Ackerman, M. E., et al. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. Journal of Immunological Methods. 366 (1-2), 8-19 (2011).
- Jiang, X., et al. Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits. Journal of Virology. 90 (24), 11007-11019 (2016).
- Sanders, R. W., et al. A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 9 (9), e1003618 (2013).
- Im, M., et al. Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets. The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).
- Trend, S., et al. Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry. PLoS ONE. 10 (8), e0135580 (2015).
- Buescher, E. S., McIlheran, S. M. Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).
- Franca, E. L., et al. Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).
