Summary
Morsmelk overfører humant immunsviktvirus (HIV), men bare ~ 15% av spedbarn ammet av HIV-smittede mødre blir smittet. Ammet spedbarn svelges ~ 105− 108 mors leukocytter daglig, selv om disse cellene er lite studert. Her beskriver vi isolering av brystmelk leukocytter og en analyse av deres phagocytic kapasitet.
Abstract
Selv i fravær av antiretroviral narkotika, bare ~ 15% av spedbarn ammet av HIV-smittede mødre blir smittet, noe som tyder på en sterk beskyttende effekt av morsmelk (BM). Med mindre tilgang til rent vann og passende morsmelkerstatning er pålitelig, vil WHO ikke anbefale opphør av amming for HIV-smittede mødre. Tallrike faktorer fungerer sannsynligvis i tandem for å redusere BM overføring. Ammet spedbarn svelges ~ 105− 108 mors leukocytter daglig, men det som fortsatt er i stor grad uklart er bidraget fra disse CELLENE til antivirale kvaliteter BM. for tiden har vi som mål å ISOLERE celler fra humant BM for å måle antistoff-avhengige cellulære fagocytose (ADCP), en av de mest essensielle og gjennomgående medfødte immunresponser, av BM phagocytes mot HIV-mål. Celler ble isolert fra 5 menneskelige BM prøver innhentet på ulike stadier av amming. Isolasjon ble utført via milde sentrifugering etterfulgt av forsiktig fjerning av melkefett og gjentatt vask av cellen pellet. Fluorescerende perler belagt med HIV-konvolutt (env) epitope ble brukt som mål for analyse av ADCP. Celler ble farget med CD45 overflate markør for å identifisere leukocytter. Det ble funnet at ADCP aktivitet var betydelig over kontroll eksperimenter og reproduserbar målbare ved hjelp av en HIV-spesifikk antistoff 830A.
Introduction
Morsmelk (BM) består av mors celler som er > 90% levedyktig1. Celle sammensetning er påvirket sterkt av stadium av amming, helsetilstand av mor og spedbarn, og individuell variasjon, som fortsatt er dårlig forstått1,2,3,4. Gitt at BM inneholder ~ 103− 105 leukocytter/ml, kan det anslås at ammet spedbarn svelges ~ 105− 108 mors leukocytter daglig5. Various in vivo studier har vist at mors leukocytter gir kritisk immunitet til spedbarnet og er funksjonell langt utover disse nettstedene for innledende svelging5,6,7,8 ,9,10,11. Alle moderskap celler inntatt av spedbarnet har potensiale til å utføre immun funksjoner ved siden av eller for å kompensere for spedbarnets egne leukocytter12.
Mor-til-barn-smitte (MTCT) av humant immunsviktvirus (HIV) er fortsatt en krise i ressurs-begrensede land. Som diaré og luftveissykdommer er ansvarlig for betydelige utbredelsen av dødelighet blant spedbarn i ressurs-begrensede land, og disse sykdommene er betydelig redusert med eksklusiv amming, fordelene til HIV-smittede mødre av amming langt oppveier risikoen13,14,15. Med mindre tilgang til rent vann og passende morsmelkerstatning er pålitelig, WHO anbefaler ikke opphør av amming for HIV-smittede mødre16. Omtrent 100 000 MTCTs via BM forekommer årlig. Likevel, bare ~ 15% av spedbarn ammet av deres HIV-smittede mødre blir smittet, noe som tyder på en sterk beskyttende effekt av BM17,18,19,20,21. Tallrike faktorer fungerer sannsynligvis i tandem for å hindre overføring. Viktigere, HIV-spesifikke antistoffer (ABS) i BM har vært korrelert med redusert MTCT og/eller redusert spedbarn død fra HIV-smitte22,23. Hva er fortsatt i stor grad uklart er bidraget fra den cellulære brøkdel av BM til sine antivirale kvaliteter.
Mange ABS rette for en rekke anti-viral aktiviteter formidlet av "konstant"-regionen i immunglobulin molekylet, den crystallizable fragment (FC), via interaksjon med FC reseptorer (FcRs) funnet på nesten alle medfødte immunceller, nesten alle som er funnet i Human BM24. Antistoff-avhengige cellulære fagocytose (ADCP) har blitt demonstrert som nødvendig for clearance av virale infeksjoner og har blitt lite studert i tilfelle av forebygging av MTCT av HIV25,26,27, 28 flere , 29. gitt mangelen av kunnskap om potensialet bidrag av ADCP aktivitet av BM phagocytes til forebygging av MTCT av HIV, har vi som mål å utvikle en streng metode for å isolere celler fra humant BM for å gjennomføre en studie av ADCP mediert av celler fra BM innhentet på ulike stadier av amming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hver deltaker i denne studien ble rekruttert og intervjuet i samsvar med etiske og institusjonelle gjennomgang Board (IRB) godkjenning med veiledning og autorisasjon av Mount Sinai program for beskyttelse av menneskelige (PPHS) ved hjelp av en IRB-godkjent protokoll for å oppnå brystmelk prøver.
1. Target mikrosfære forberedelse
- Velg et relevant mål antigen.
Merk: i dette eksempelet ble rekombinant protein V1V2-2F5K brukt, som ble utformet for å etterligne trimeric Apex av innfødte HIV-konvolutt30. - Utfør biotinylation ved hjelp av et kommersielt sett (materialfortegnelsen) i henhold til produsentens protokoll.
- Beregn mmol av biotin-reagens for å legge til reaksjonen for en 5-fold molar overflødig ved hjelp av formelen: mmol biotin = ml protein x (mg protein/ml protein) x (mmol biotin/mg protein) x (5 mmol biotin/mmol protein)30,31. Beregn deretter μL av biotin-reagens for å legge til ved hjelp av formelen: μL biotin = mmol biotin x (1 000 000 μL/L) x (L/10 mmol).
- Likevekt biotin til romtemperatur før åpning. Oppløses protein i 0,5-2,0 mL av fosfat-bufret saltvann (PBS) i henhold til beregningen som er gjort ovenfor.
- Forbered en 10 mM løsning av biotin reagens i dimetylsulfoksid (DMSO) og tilsett riktig volum på 10 mM biotin reagens til protein løsningen, og ruge reaksjon på isen for 2 t eller ved romtemperatur i 30 min.
- Fjern overflødig biotin ved hjelp av protein konsentratorer (polyetersulfon [PES] membraner, 3 kDa molekylvekt cut-off [MWCO], 0,5 mL; Tabell med materialer) henhold til produsentens anvisninger.
- Sett prøven inn i øvre kammer av Spin kolonne og Legg PBS opp til 400 μL. cap, og deretter sette dette prøvekammeret inn i en samling tube. Sentrifuger ved 12 000 x g ved romtemperatur i 30 min.
- Kast gjennomstrømning og Legg PBS til 400 μL. Gjenta sentrifugering. Kast gjennomstrømning og Legg PBS til 100 μL. mål proteinkonsentrasjon med en spektrofotometer.
Merk: protein kan være aliquoted og frosset ved-80 ° c til de brukes.
2. antistoff-avhengig CELLULAR fagocytose (ADCP) analyse plate forberedelse
- Bøy biotinylated protein til 1 μm mikrosfærer (' perler '; Tabell med materialer) henhold til produsentens anvisninger.
- Per tallerken med bøyd perler, ruge 6 mikrogram protein med 12 μL av lager perler i 200 μL av 0,1% storfe serum albumin (BSA)-PBS ved romtemperatur i 1 time, virvlingen forsiktig hver 20 min.
- Sentrifuger på 13 000 x g i 5 min. kast supernatanten, Vortex forsiktig og resuspend i 1200 μL av 0,1% BSA-PBS. Gjenta spinn og vask trinn 2x. Resuspend i 1200, μL av 0,1% BSA-PBS.
- Alikvot 10 μL av bead løsning per brønn i en rund bunn 96-brønn plate. Forbered fortynninger av antistoff eller immun Sera av interesse i 12 μL av 2% HSA HBSS, vanligvis fra 50 μg/mL av antistoff eller en 1/100 serum fortynning.
Merk: i eksempeldataene ble det brukt monoklonale antistoff (mAb) 830A. - Tilsett 10 μL av titrert antistoff/Sera i perle platen og ruge for 2 timer ved 37 ° c. Tilsett 200 μL av 2% HSA HBSS til hver brønn og sentrifuge plate ved 2 000 x g i 10 min.
- Forsiktig fjerne supernatanten av en rask velt og decanting av væske fra plate brønner i en vask for å unngå å forstyrre den usynlige perle pellet.
3. brystmelk celle isolasjon
- Få morsmelk fra friske ammende kvinner, uttrykt ved hjelp av doble elektroniske eller manuelle pumper. Isolere celler innenfor ~ 4 h uttrykk, holde melk ved romtemperatur.
- Ved hjelp av 50 mL rør, sentrifuger 50 mL melk ved 800 x g i 15 min. hell av skummet melk og fett mens du forlater cellen pellet uforstyrret. Tørk av innsiden av røret med en lofri klut for å fjerne alt fettet fra rørveggen.
- Tilsett 10 mL av 2% humant serum albumen i Hank ' s balansert saltløsning (2% HSA HBSS [uten ca2 + eller mg+]). Resuspend pellet ved milde pipettering for å unngå celle aktivering og apoptose. Overføring til 15 mL rør og sentrifuge ved 450 x g i 10 min.
- Hell av supernatanten og gjenta trinn 1,3. Deretter forsiktig resuspend celler i 1 − 2 mL 2% HSA HBSS avhengig av forventet celle nummer, og telle celler med en hemocytometer eller en automatisert celle teller, og bemerker også cellen levedyktighet.
4. ADCP analysen
Merk: metoder beskrevet her er tilpasset fra Ackerman et al.32.
- Tilsett 50 000 nylig isolerte BM-celler til hver ADCP-analyse plate i 200 μL av 2% HSA-HBSS. Ruge for 2 timer ved 37 ° c.
- For kontroll eksperimenter, ruge celler ved 37 ° c med 10 μg/mL utgangen inhibitor (cytochalasin-D), 50 μg/mL FcR blokkerings middel (FcBlock), eller en kombinasjon av begge før deres tillegg til platene.
- Sentrifuge plate ved 930 x g i 10 min. Tilsett 200 μL av 2% HSA HBSS og gjenta sentrifugering. Fjern supernatanten forsiktig som i trinn 2,7 og gjenta vasken.
- Fjern forsiktig supernatanten og beis celler for levedyktighet ved hjelp av 0,5 μg/mL (endelig konsentrasjon) fixable levedyktighet beis 450 per brønn i 50 μL av 2% HSA HBSS. Ruge 20 min ved romtemperatur i mørket. Sentrifuge plate ved 930 x g i 10 min og fjern supernatanten som i trinn 2,7. Tilsett 200 μL av 2% HSA HBSS og sentrifuge platen igjen, etterfulgt av fjerning av supernatanten som i trinn 2,7.
- Etter en levedyktighet farging, flekk celler for leukocytter markører av interesse, minimalt inkludert en CD45-spesifikk flekk som PE-Mouse anti-humant CD45 (klone HI30) ved en optimalisert konsentrasjon (1 μg/μL i 50 til 1% BSA HBSS i eksempeldataene).
Merk: enhver slekts spesifikke markører av interesse kan inkluderes. - Ruge 20 min ved romtemperatur i mørket. Sentrifuge plate ved 930 x g i 10 min og fjern supernatanten som i trinn 2,7. Tilsett 200 μL av 1% BSA HBSS og gjenta sentrifugering. Fjern supernatanten. Fix celler i 200 μL av 0,5% formaldehyd i mørket ved romtemperatur i 30 min eller over natten ved 4 ° c. Kjøle i mørket til analyse.
5. analyse av Flow flowcytometri
- Utfør innledende gating for å eliminere doublets på en Forward scatter (FSC) kontra side punktdiagram (SSC) plot og rusk (materiale mindre enn FSC = 5000) (se figur 1). Bruk en SSC vs levedyktighet flekken (V450 i dette tilfellet) tomten for å eliminere døde celler (de som er positive for levedyktighet flekken).
- Bruk en SSC vs. CD45 plot å skille de store leukocytter klasser (granulocytter, monocytter, lymfocytter) så mye beskrevet33,34.
Merk: denne klassifiseringen er bare tankevekkende og avstamning-spesifikke markører er nødvendig for å bekrefte celle type. - For alle CD45 + celler, eller for hver leukocytter delsett av interesse, måle ADCP aktivitet ved gating med en markør på perle-positive celler i et histogram av fluorescein isothiocyanate (FITC) kanal, der fluorescerende perler oppdages.
Merk: de negative kontroll brønnene der perlene ikke ble lagt til vil indikere hvor de perle-positive cellene er tydelige i histogrammet og derfor hvor du skal plassere gating markør. - Beregn ADCP score AS (median fluorescens intensitet [MFI] av perle-positive celler) x (% av totalt CD45 + celler i den positive befolkningen). Bruk grafikkprogramvare til å plotte score på hver AB/serumkonsentrasjon og å utføre en område-under-The-kurve (AUC) analyse.
Merk: ADCP anses som positiv hvis AUC er større enn 3x standardavviket for ADCP-resultatet AUC for en ikke-spesifikk negativ kontroll mAb (i dette tilfellet 3865).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Melk kan oppbevares ved romtemperatur eller kjøligere (men ikke frosset); men gitt at vi har observert redusert levedyktighet når melken har blitt holdt veldig kaldt (data ikke vist), og at det er enklere å samle inn, lagre kort, og transport ved omgivelsestemperaturer, anbefales det at prøvene ikke er nedkjølt for å redusere variasjon i prøve-til-utvalg. I melk innhentet 7 − 183 dager etter partum, celle konsentrasjon bestemmes av automatiserte celle telleren varierte fra 16083 − 222857 Cells/mL. Figur 1 illustrerer gating strategien eliminerer doublets, rusk, og døde celler. Levedyktighet var ~ 90 − 99%. Omtrent 1,6 − 12.3% av de totale levende cellene var CD45+ leukocytter (tabell 1). Mest påståtte monocytter syntes å være forløpere/umodne celler som tidligere beskrevet, basert på den tankevekkende SSC g. CD45 gating34. Den påståtte monocytter ble definert som SSClav-Intermediate/CD45lav, men få utstilt høyere CD45 farging nivåer skiller fra PÅSTÅTTE lymfocytter befolkningen (SSClav/CD45lav) mer typisk assosiert med blod monocytter (figur 1), i likhet med tidligere studier33,34. Den påståtte granulocytter ble definert som SSChøy/CD45Middels33,34 (tabell 1). Merk at denne klassifiseringen er bare tankevekkende og at avstamning-spesifikke markører ville være nødvendig for å bekrefte celle type.
ADCP aktivitet av ferske isolerte BM celler ble målt ved hjelp av HIV-spesifikke menneskelige mAb 830A, som er spesifikk for v2-regionen i HIV-konvolutten og binder seg til V1V2-2F5K antigen testet her. ADCP aktivitet ble målt for eksempel her ved hjelp av melk innhentet på 1 måned post-partum (figur 2A). Eksempel data viser forventet FITC (perle +) histogrammer sett når gating på CD45+ celler (data generert ved hjelp av 1 μg/ml mAb vises). De svarte markørene angir populasjoner som brukes til å beregne ADCP-resultater. I eksempelet 830A data (første panel av figur 2A), prosentandel av CD45+ celler og mener fluorescens av at befolkningen vises, som ble brukt til å beregne ADCP score ved hjelp av ligningen i trinn 3,4. Celler pre-inkubert med utgangen inhibitor cytochalasin-D (cytoD) og/eller FcR-blokkering ABS (FcBlock) før deres inkubasjons med AB-bundet/antigen-sammenkoblede perler utstilt ADCP aktivitet på nivå med kontrollen mAb 3865 eller nedenfor, indikerer ADCP var FcR og utgangen-avhengige (figur 2). Den ADCP score bestemmes for totalt CD45+ celler var ~ 25 − 35-fold over bakgrunns nivåer definert ved hjelp av negativ kontroll anti-anthrax mAb 3865. Hver store undergruppe ble analysert separat også. Den påståtte granulocytter utstilt ADCP aktivitet ~ 12 − 29-fold høyere enn bakgrunnen. Den påståtte monocytt ADCP var ~ 2 − 3-fold over bakgrunnen (figur 2). Den påståtte lymfocytter som forventet ikke viser noen målbar ADCP aktivitet (mindre enn 3x standardavvik av ADCP score AUC for den ikke-spesifikke negativ kontroll mAb 3865; data ikke vist).
Figur 1: sample Flow flowcytometri data av celler isolert fra morsmelk. Celler ble behandlet og farget som beskrevet i protokollen. (A) enkeltceller var gated på å eliminere doublets i en FSC-H g. FSC-A tomten som vist, også gating ut de små rusk < 5000 i FSC-A. (B) denne befolkningen ble brukt til gate på levende celler (som ikke flekken med levedyktigheten fargestoff) i en SSC vs V450 (levedyktighet flekken) tomten. (C) disse levende celler ble brukt i en FSC vs SSC tomten. Den forventede plasseringen av ikke-leukocytter, sannsynligvis til å være overveiende bryst epitelceller, er uthevet ("E"). (D) det samme FSC g. SSC tomten vises bare med CD45+ celler. De store leukocytter delsett bemerket er bare påstått identiteter basert på veletablerte og forventede SSC parametere (G = granulocytter; M = monocytter; L = lymfocytter). (E) levedyktige celler ble brukt til en SSC vs CD45 tomten med de store leukocytter delsett bemerket. Tilbake-gating fra denne tomten gitt data vist i panel D. Merk at denne klassifiseringen er bare tankevekkende og at avstamning-spesifikke markører er nødvendig for å bekrefte celle type. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: eksempel på ADCP-data ved hjelp av celler isolert fra morsmelk. ADCP-analysen som utføres er basert på analysen som er tilpasset fra Ackerman et al.30. Analysen ble utført som beskrevet i protokollen ovenfor. (A) sample FITC histogrammer ved 1 μg/ml mAb, med markører som angir perle/FITC + populasjoner som brukes til å bestemme ADCP-poengsum. Resultatene ble beregnet som (MFI av perle-positive celler) x (% av totalt CD45+ celler i bead/FITC + positiv befolkning). Det for det første panel benytter mAb 830A alene likeledes viser prosenten av sum CD45+ og gjennomsnittet fluorescens intensiteten salgsverdi pleide BEREGN det ADCP snes inne det eksempel. (B) ADCP score ved hver mAb fortynning analyseres ble brukt til å beregne område-under-The-kurve (AUC) verdier i grafikkprogramvare. For kontroll eksperimenter, utgangen hemmer cytochalasin-D (cytoD), FcR blokkerende agent (FcBlock), eller en kombinasjon av begge var pre-inkubert med celler før deres tillegg til immunkomplekser (se legender). Vær oppmerksom på at denne celle klassifiseringen bare er tankevekkende, og at det er nødvendig med linje spesifikke markører for å bekrefte celletypen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Eksempel | Celler/mL | % CD45+ | Granulocytter | Monocytter |
| 1 | 222 857 | 12,3 ± 1,9 | 13,6 ± 3,8 | 65,9 ± 5,6 |
| 2 | 27 361 | 1,6 ± 0,01 | 25,2 ± 4,0 | 9,1 ± 5,6 |
| 3 | 161 486 | 3,6 ± 1,1 | 47,8 ± 6,8 | 24,3 ± 4,3 |
| 4 | 16 083 | 2,7 ± 0,1 | 17,9 ± 3,5 | 34,4 ± 1,0 |
| 5 | 25 155 | 4,0 ± 0,7 | 29,7 ± 2,6 | 20,5 ± 1,4 |
| * av CD45+ celler | ||||
Tabell 1: eksempler på typiske brystmelk celle tellinger og egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den flowcytometri teknikken for måling av ADCP-aktivitet beskrevet her ble først beskrevet i 201130 og har siden blitt påvist robust og sitert i mer enn 80 studier. Protokollen som beskrives her, tilpasser denne teknikken til bruk med primære BM-celler for første gang. Tidligere studier av FC-mediert funksjonalitet av BM celler har vært i stor grad begrenset til måling av oksidativt sprekker eller histologi-baserte fagocytose analyser ved hjelp av celler isolert fra colostrum (0 − 4 dager etter fødselen). Nesten ingen studier har undersøkt celler i menneskelig BM forbi råmelk fase. Studier med colostral celler har generelt konkludert med at granulocytter i colostrum er mindre aktive enn de som er isolert fra blod, oppfører seg som en "sekresjon celle" som har flyttet inn i ekstravaskulær plass35, men motstridende studier har rapportert liknende phagocytic og bakteriedrepende kapasiteter36.
I flere ti år ble tradisjonelle mikroskopi brukt til å identifisere BM leukocytter, og denne typen visuell identifisering kan ha ført til celle forveksling1. Få studier har sammenlignet BM leukocytter sammensetning utover den første måneden av amming, og de fleste har fokusert på colostrum. Bruken av Flow flowcytometri å identifisere celler er sannsynlig å nøyaktig identifisere celler, men bare et lite antall BM studier har blitt gjort ved hjelp av denne metoden, ofte med et svært lite eksempel nummer. Gjeldende studier har indikert at leukocytter innholdet i BM på alle stadier av amming varierer mye, fra ~ 104− 7 x 105 leukocytter/ml tidlig colostrum, reduseres til 103− 5 x 104 leukocytter/ml i moden melk, Selv om alle studier bekrefter at celle konsentrasjon og sammensetning er påvirket sterkt av den fasen av amming1,2,3,4,5. Som melk overganger til sin modne sammensetning, synes nøytrofile konsentrasjon å øke, selv om slike studier ikke har vanligvis utvidet utover den første måneden fødsel34.
Protokollen beskrevet her bruker fluorescerende perler som phagocytic mål, selv om det sannsynligvis kan anvendes for å studere BM ADCP av en rekke mer biologisk relevante mål som immunkomplekser og infiserte celler, utløst av ulike AB isotypes og Delklasser. En større celle farging panel kan anvendes for å ytterligere differensiere leukocytter. Store studier vil være avgjørende for å utvikle en helhetlig forståelse av ADCP av disse relevante primær cellene. Denne protokollen tillater etablering av ADCP av BM leukocytter som en potensiell mekanisme for reduksjon av MTCT av HIV, så vel som andre patogener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Susan Zolla-Pazner i Institutt for medisin og Institutt for mikrobiologi ved Icahn School of Medicine på Mount Sinai for manuskript vurdering. NIH/NICHD gitt midler til dette prosjektet under stipend nummer R21 HD095772-01A1. I tillegg ble R. Powell støttet av midler fra Department of Medicine, divisjon av smittsomme sykdommer, Icahn School of Medicine ved Sinai-fjellet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres | Thermo Fisher | F8776 | |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560975 | |
| Bovine serum Albumin | MP Biomedicals | 8810025 | |
| Corning V-bottom polystyrene 96-well plate | Corning | 3894 | |
| Cytochalasin D | Sigma | 22144-77-0 | |
| EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit | Thermo Fisher | 21338 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352196 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| Fixable Viability Stain 450 | BD | 562247 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | 252549 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Life Technologies | 14175-095 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | |
| Human Serum Albumin | MP Biomedicals | 2191349 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| PBS 1x pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | |
| Polystyrene 10 mL Serological Pipettes | Corning | 4488 | |
| Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL | Pierce | 88512 |
References
- Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. Cells in human milk: state of the science. Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).
- Lonnerdal, B. Nutritional and physiologic significance of human milk proteins. The American Journal of Clinical Nutrition. 77 (6), 1537S-1543S (2003).
- Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. Effect of maternal diet and body composition on lactational performance. The American Journal of Clinical Nutrition. 39 (2), 296-306 (1984).
- Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months). Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3 (5), 713-720 (1984).
- Hassiotou, F., Geddes, D. T. Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding. Advances in Nutrition. 6 (3), 267-275 (2015).
- Hanson, L. A. The mother-offspring dyad and the immune system. Acta Paediatrica. 89 (3), 252-258 (2000).
- Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. Activated and memory T lymphocytes in human milk. Cytometry. 13 (3), 282-290 (1992).
- Jain, L., et al. In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons. Archives of Disease in Childhood. 64 (7 Spec No), 930-933 (1989).
- Zhou, L., et al. Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth. Immunology. 101 (4), 570-580 (2000).
- Tuboly, S., Bernath, S. Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).
- Cabinian, A., et al. Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer's Patches of the Nursed Infant. PLoS ONE. 11 (6), e0156762 (2016).
- Filias, A., et al. Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates. BMC Pediatrics. 11, 29 (2011).
- Natchu, U. C., et al. Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women. The American Journal of Clinical Nutrition. 96 (5), 1071-1078 (2012).
- Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants. The Journal of Pediatrics. 126 (5 Pt 1), 696-702 (1995).
- WHO. Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis. Lancet. 355 (9202), 451-455 (2000).
- World Health Organization. Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee. World Health Organization. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2016).
- Nelson, C. S., et al. Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk. Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).
- Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197 (3 Suppl), S3-S9 (2007).
- Shen, R., et al. Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women. PLoS ONE. 10 (12), e0145150 (2015).
- Fouda, G. G., et al. HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies. Journal of Virology. 85 (18), 9555-9567 (2011).
- Van de Perre, P., et al. HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1. Science Translational Medicine. 4 (143), 143sr143 (2012).
- Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality. Cell Host & Microbe. 17 (4), 500-506 (2015).
- Pollara, J., et al. Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1. Journal of Virology. 89 (19), 9952-9961 (2015).
- Ackerman, M., Nimmerjahn, F. Antibody Fc. , Academic Press. Cambridge, MA. (2014).
- Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections. Journal of Immunology. 166 (12), 7381-7388 (2001).
- Fujisawa, H. Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice. Journal of Virology. 82 (6), 2772-2783 (2008).
- Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells. Journal of Virology. 81 (17), 9551-9555 (2007).
- Yasui, F., et al. Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus. Virology. 454-455, 157-168 (2014).
- Quattrocchi, V., et al. Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease. Antiviral Research. 92 (2), 262-270 (2011).
- Ackerman, M. E., et al. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. Journal of Immunological Methods. 366 (1-2), 8-19 (2011).
- Jiang, X., et al. Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits. Journal of Virology. 90 (24), 11007-11019 (2016).
- Sanders, R. W., et al. A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 9 (9), e1003618 (2013).
- Im, M., et al. Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets. The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).
- Trend, S., et al. Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry. PLoS ONE. 10 (8), e0135580 (2015).
- Buescher, E. S., McIlheran, S. M. Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).
- Franca, E. L., et al. Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).
