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Immunology and Infection

जैविक नमूनों में चिटिनास गतिविधि का मापन

doi: 10.3791/60159 Published: August 22, 2019
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ प्रस्तुत इस तरह के ब्रोंकोएल्वेलर lavage या सीरम के रूप में जैविक तरल पदार्थ में chitinase गतिविधि को मापने के लिए एक सरल तरीका है।

Abstract

Chitinases एंजाइमों कि chitin छोड़ रहे हैं. यहां तक कि काटिन की अनुपस्थिति में, स्तनधारी लोगों के शरीर में महत्वपूर्ण मात्रा में चीटिनेस मौजूद होते हैं, जिनमें आधार रेखा भी शामिल है। chitinase की सटीक भूमिका ज्ञात नहीं है, हालांकि यह क्रमशः chitin युक्त भोजन और रोगजनकों के खिलाफ पाचन और मेजबान रक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए माना जाता था। हमारे सहित हाल के काम, मेजबान प्रतिरक्षा और एलर्जी रोगों में chitinase और chitinase की तरह प्रोटीन की एक महत्वपूर्ण भूमिका दिखाई है. महत्वपूर्ण बात, chitinase गतिविधियों प्रकार 2 अस्थमा और फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस के रूप में भड़काऊ रोगों सहित रोगों की एक विस्तृत रेंज में रोग गंभीरता के महत्वपूर्ण biomarkers के रूप में सेवा करते हैं. इसी तरह, गौचर रोग जैसे आनुवंशिक विकारों वाले रोगियों ने काफी ही चिटिनास स्तर को ऊंचा किया है, जो न केवल रोग की गंभीरता के साथ सहसंबंधित होता है बल्कि चिकित्सीय प्रभावशीलता के लिए एक विश्वसनीय बायोमार्कर के रूप में भी काम करता है। यहाँ उल्लिखित प्रोटोकॉल चूहों के बाल या सीरम नमूनों में chitinase गतिविधि को मापने के लिए एक सरल, त्वरित, और सीधा तरीका का वर्णन करता है और व्यापक रूप से एंजाइमों की अत्यधिक संरक्षित प्रकृति के कारण मानव विषयों और अन्य मॉडल जीवों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Introduction

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Chitin सेलूलोज़ के बाद पृथ्वी पर दूसरा सबसे प्रचुर मात्रा में polysaccharide है, कीड़े, कवक, खमीर, और शैवाल के एक्सोस्केलेटन सहित जीवों की एक किस्म के एक प्रमुख संरचनात्मक घटक के रूप में सेवा; कुछ कशेरुकियों में काटिन1भी होता है . चिटिनेस एंजाइमों का एक परिवार है जो चिटिन को तोड़ने में सक्षम है और बैक्टीरिया से लेकर स्तनधारियों2,3तक की प्रजातियों में विकास के दौरान अत्यधिक संरक्षित है . चिटिनेस के अलावा, स्तनधारियों में भी चिटिनास जैसे प्रोटीन होते हैं जो कि चिटिन को बांधने की क्षमता में चिटिनास के समान होते हैं लेकिन इसमें भिन्न होते हैं कि उनमेंकिटिनको छोड़ने की एंजाइमी क्षमता की कमी होती है।

हालाँकि काटिन और काटिनेस का लंबे समय से अध्ययन किया जा रहा है। 1900 के शुरू में हुई जाँच-रिपोर्ट का मुख्य फोकस कीड़ों और दूसरे अकशेरुकियों में उनकी भूमिका पर रहा है। वास्तव में, यह 1960 के दशक तक नहीं था जब कशेरुकी को चिटिनास पाया गया था। एक chitobiase आधारित परख का उपयोग करते हुए, chitinases छिपकली और blackbirds सहित कशेरुकियों की एक संख्या के पाचन तंत्र में पाया जा करने के लिए दिखाया गया था-एक अवलोकन ऐसे कीड़े के रूप में chitin युक्त जीवों की खपत के कारण होने के लिए hypothesized .

मैमल्स में दो एंजाइमी रूप से सक्रिय रूप होते हैं: अम्लीय स्तनधारी चिटिनासे (AMCase; जिसे CHIT2 और च्याया के नाम से भी जाना जाता है) और चीटोट्राइसिडेस (CHIT1)4. ये दोनों प्रोटीन किटिन को हाइड्रोलाजिंग करने में सक्षम हैं। हालांकि, CHIT1 मनुष्यों में अधिक एंजाइमी रूप से सक्रिय है, जहां लगभग सभी chitinase गतिविधि CHIT1 से ली गई है। 4 चूहों में, दोनों Chit1 और AMCase लगभग समान रूप से समग्र chitinase गतिविधि6में योगदान करते हैं. दूसरी ओर, काइटिनास जैसे प्रोटीन में काइटिनाज गतिविधि की कमी होती है।

Chit1 मुख्य रूप से मैक्रोफेज द्वारा स्रावित होता है और अक्सर चिटिन युक्त रोगजनकों7के लिए एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया माना जाता है। एंजाइम को भी एम 1 और एम 2 मैक्रोफेज उपप्रकारों में मोनोसाइट्स की परिपक्वता में शामिल दिखाया गया है, यहां तक कि सबस्ट्रेट चिटिन8की उपस्थिति के बिना भी। इसके अलावा, यह भी टी सहायक प्रकार 2 (Th2) कोशिकाओं और eosinophils सहित अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं की परिपक्वता में शामिल किया जा सकता है के रूप में क्रिप्टोकोकल फेफड़ों केसंक्रमण9 में मामला होना दिखाया गया था. ये अध्ययन प्रतिरक्षा प्रणाली में chitinases की एक जटिल भूमिका को इंगित करते हैं.

हाल के वर्षों में, Chit1 स्तर lysomal भंडारण रोगों, संक्रामक रोगों, श्वसन रोगों, एंडोक्रिनोलॉजिकल रोगों, हृदय सहित 40 से अधिक विभिन्न मानव रोगों के लिए प्रगति का एक महत्वपूर्ण biomarker के रूप में सेवा करने के लिए पाया गया है रोग, तंत्रिका संबंधी रोग, और दूसरों (समीक्षा10). इन रोगों में से कई में, Chit1 के स्तर रोग गंभीरता और चिकित्सीय प्रभावशीलता10के एक मजबूत भविष्यवक्ता हैं.

के रूप में chitinases गौचर रोग, उपकरण और परख सहित कई चिकित्सा शर्तों के लिए एक biomarker के रूप में एक प्रतिष्ठा प्राप्त की है chitinase उपस्थिति के लिए परीक्षण की सुविधा के लिए विकसित किया गया है. पुराने तरीकों में Schales की प्रक्रिया, एक रक्त ग्लूकोज परीक्षण से अनुकूलित प्रोटोकॉल, और 3,5 डाइनिट्रोसैलिसिलिक एसिड (DNS) विधि शामिल हैं। हालांकि, इन तरीकों अक्सर समय संवेदनशील और तकनीकी रूप से मुश्किल11कर रहे हैं. इन परीक्षणों के दोनों के लिए प्रक्रिया अकार्बनिक oxidants की कमी की आवश्यकता है, उदाहरण के लिए Schales प्रक्रिया के मामले में फेरिसायनाइड, एक रंग परिवर्तन है कि केवल स्पेक्ट्रोफोटोमीट्रिक रूप से मापा जा सकता उत्पादन. इसके अतिरिक्त, दोनों परीक्षणों में एक हीटिंग या उबलते चरण शामिल होते हैं जो 12,13को विकसित करने के लिए रंग के लिए समय लेने वाला और आवश्यक दोनों होता है।

यहाँ वर्णित एक त्वरित और सरल फ्लोरीमितीय परख है स्तनधारी नमूनों में chitinase स्तर निर्धारित करने के लिए14,15. यहाँ इस्तेमाल नमूनों में से दो सीरम और ब्रोंकोएलवेलर lavage तरल पदार्थ (BAL) शामिल हैं; चिटिनेस गतिविधि को स्तन के दूध और मूत्र के नमूनों में भी मापा गया है और इस तकनीक को उन प्रकार के नमूनों के साथ-साथ किसी अन्य जैविक तरल पदार्थ16,17में भी किया जा सकता है .

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Protocol

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सभी पशु प्रक्रियाओं चिकित्सा के येल विश्वविद्यालय स्कूल में एक IACUC अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत प्रदर्शन किया गया.

1. माउस नमूना संग्रह

  1. एनेस्थेटीकरण
    1. केटामाइन और जाइलज़ीन (100 मिलीग्राम/किलोग्राम केटामाइन और 10 मिलीग्राम/किग्रा xylazine का उपयोग करके चूहों को एनेस्थेटाइज करें)।
  2. रक्त का नमूना संग्रह
    1. एक अंगुली चुटकी करने के लिए गैर-प्रतिक्रिया द्वारा संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें।
    2. दिल को बेनकाब करने के लिए छाती की गुहा को सर्जिकल रूप से खोलें।
    3. बाएं वेंट्रिकल में 26.5 जी सुई डालें और एक सिरिंज में रक्त एकत्र करें।
      नोट: आमतौर पर, लगभग 0.5-1 एमएल रक्त को एक स्वस्थ 20-25 ग्राम माउस से काटा जा सकता है।
    4. हेपराइनीकृत ट्यूबों में रक्त एकत्र करें, प्लाज्मा संग्रह के लिए, या सीरम संग्रह के लिए गैर-हेपरिनीकृत ट्यूब।
  3. ब्रोन्कोएलवेलर लावेज तरल पदार्थ का संग्रह (BAL)
    1. BAL को इकट्ठा करने के लिए, श्वासनली को बेनकाब करने के लिए गर्दन पर एक ऊर्ध्वाधर कटौती करें।
    2. एक 22 जी कैथेटर के साथ श्वासनली cannulate और यह मजबूती से एक स्ट्रिंग का उपयोग कर सुरक्षित क्रम में माउस की नाक से बाहर रिसाव को रोकने के लिए.
    3. धीरे-धीरे श्वासनली के माध्यम से फेफड़ों में बाँझ फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस, 0.75 एमएल प्रत्येक) के दो एलिकोट्स इंजेक्ट करें और वापस पुनः प्राप्त करें।
    4. पूल alicuats और आगे के विश्लेषण के लिए बर्फ पर रहते हैं.
  4. जैविक नमूनों को संसाधित करना.
    1. रक्त का नमूना: या तो ताजा (प्लाज्मा) या 4 एच (सीरम) के लिए स्कंदन की अनुमति देने के बाद, 10 मिनट के लिए 600 x ग्राम पर अपकेंद्रण। सुपरनेंट लें और या तो संग्रहण के लिए फ़्रीज़ करें या प्रयोग के लिए उपयोग करें.
    2. बाल: 5 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर नमूना centrifuge. सुपरनेंट लें और या तो संग्रहण के लिए फ़्रीज़ करें या प्रयोग के लिए उपयोग करें.

2. चिटिनासे परख

नोट: परख के पीछे विज्ञान अपेक्षाकृत सरल है. एक गैर-फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट एक फ्लोरोसेंट उत्पाद है, जो तब chitinase गतिविधि के एक अप्रत्यक्ष मार्कर के रूप में मापा जाता है का उत्पादन करने के लिए एंजाइमी रूप से सक्रिय chitinase द्वारा cleaved है। नमूनों के भीतर chitinases नीचे सबस्ट्रेट 4-मेथिलम्बेलिफेरिल-डी-एन, एन'-diacetylchitobiose 1x McIlvain बफर में मौजूद तोड़। एक फ्लोरोसेंट अणु 4-मेथिलम्बेलिफेरिल जारी किया जाता है। प्रत्येक अच्छी तरह से कुल फ्लोरोसेंट को मापने के द्वारा, हम प्रत्येक नमूने में सक्रिय chitinase का एक सटीक माप प्राप्त करते हैं. क्योंकि chitinase द्वारा chitin के टूटने एक hydrolytic प्रतिक्रिया है, रोक बफर, 0.3 M ग्लिसिन और NaOH का एक मिश्रण (12.0 g/L pH 10.6 पर), एक वातावरण है कि एंजाइम के लिए भी बुनियादी है बनाने के द्वारा चिटिन के टूटने समाप्त होता है कार्य करने के लिए.

  1. substrates, मानकों, और समाधान तैयार करें.
    1. McIlvain बफर तैयार करें. McIlvain बफर 0.1 एम साइट्रेट और 0.2 एम फॉस्फेट के एक पीएच पर शामिल है 5.2. 1x McIlvain बफर के लिए 1:1 के अनुपात में पतला.
    2. दोनों को भंग 4-मेथिलम्बेलिफेरिल-डी-एन, एन'-डाइऐसीटिलचिटोबायोस और 4-मेथिलम्बेलिफेरिल --डी-एन, एन', एन"-ट्राइसाइटाइलचिटोट्राइज में 1x मैकिलवेन बफर में 500 डिग्री सेल्सियस की एकाग्रता के लिए।
      नोट: स्टॉक समाधान आगे का उपयोग करता है के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है; सबसे अच्छा alicots में संग्रहीत.
    3. मानक वक्र स्टॉक समाधान बनाने के लिए मानक वक्र स्टॉक समाधान बनाने के लिए मानक, 4-मेथिलम्बेल्फेरोन को स्टॉप बफर में 0.1 लाख की सांद्रता (0.3 एम ग्लिसिन और नाओएच (12.0 ग्राम/एल) को भंग करें।
  2. बनाएँ और कार्य समाधान प्लेट.
    1. 1x McIlvain बफर और chitin सबस्ट्रेट 4-मेथिलम्बेलिफेरिल-डी-एन, एन'-diacetylchitobiose काम कर समाधान बनाने के लिए गठबंधन। हर 10 नमूनों के लिए, 1x McIlvain बफर के 2.17 एमएल के साथ सब्सट्रेट के 100 डिग्री एल मिश्रण. नमूना आकार के आधार पर अतिरिक्त परिकलनों के लिए तालिका 1 देखें.
      नोट: मानव नमूनों के लिए 4-मेथिलम्बेलिफेरिल जेड-डी-एन, एन, एन"-ट्राइसाइटाइलचिटोट्राइओस का उपयोग करें। जबकि दोनों substrates या तो मानव या माउस एंजाइमों द्वारा cleaved किया जा सकता है, वे या तो मानव या माउस के नमूने के लिए सौंपा गया है दरार6की दक्षता के आधार पर .
    2. एक 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में काम कर समाधान के Pipette 95 $L.
  3. काम कर समाधान करने के लिए biospecimen नमूने जोड़ें.
    1. इसके बाद, प्रत्येक कुएं में परीक्षण नमूने (रक्त/बाल/ऊतक lysate/अन्य जैविक तरल पदार्थ) का 5 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
    2. सबसे सटीक और विश्वसनीय परिणामों के लिए काम कर समाधान में नमूना मिक्स.
      नोट: नमूने संभावित बढ़त प्रभाव के लिए भुगतान विशेष ध्यान के साथ डुप्लिकेट / सभी नमूनों को बढ़त प्रभाव को कम करने के लिए पूर्व-वार्म किया जाना चाहिए। परख के रूप में नमूना में chitinases और काम समाधान में सब्सट्रेट के बीच एक प्रतिक्रिया शामिल है, यह सबसे अच्छा है अपेक्षाकृत जल्दी काम करने के लिए जब पहले नमूना चढ़ाया है और पिछले नमूना चढ़ाया है के बीच समय में अंतर को कम करने के लिए. मल्टीचैनल पिपेट की सिफारिश की जाती है।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    1. प्लेट को ढककर संक्षेप में हिलाएं (5 s).
    2. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। यह एंजाइमी प्रतिक्रिया जगह लेने के लिए अनुमति देता है.
  5. मानक वक्र तैयार की।
    1. जबकि नमूने incubating रहे हैं, 4-मेथिलम्बेल्फेरोन के एक सीरियल कमजोर पड़ने तैयार, एक मानक अक्सर एंजाइम गतिविधि के fluorimetric निर्धारण में इस्तेमाल किया.
    2. 5 डिग्री उ की सांद्रता के लिए बफर को रोकने में मानक विलयन के स्टॉक को निरूपित करना।
    3. सारणी 2में दर्शाए गए कमजोर पड़ने की एक श्रृंखला की। संकेत राशि में घटक जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण.
      नोट: मानक वक्र यह सुनिश्चित करने में मदद करता है कि मापा गया नमूने मानक वक्र की रेखीय श्रेणी में आते हैं।
  6. रोक बफर के साथ प्रतिक्रिया बंद करो.
    1. प्रतिक्रिया को रोकने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए रोक बफर के 200 डिग्री एल जोड़ें।
  7. मानकों प्लेट.
    1. एक ही प्लेट पर डुप्लिकेट में प्रति मानक के 300 $L जोड़ें।
  8. एक फ्लोरोमेट्रिक पाठक का उपयोग कर प्लेट पढ़ें.
    1. 360 एनएम की उत्तेजना पर प्लेट पढ़ें, और 455 एनएम का उत्सर्जन।

3. डेटा विश्लेषण

  1. रिक्त स्थान घटाएँ
    1. कोई 4-मेथिलम्बेलीफेरोन है कि डुप्लिकेट मानक कमजोर पड़ने के मूल्यों औसत। इस मान को अन्य रिकॉर्ड किए गए मानों के सभी से घटाएँ.
  2. तकनीकी प्रतिकृति के औसत ले लो और मानकों साजिश.
    1. प्रत्येक एकाग्रता के लिए औसत दो रीडिंग और एकाग्रता से औसत पढ़ने ग्राफ.
      नोट: परिणामी प्लॉट रेखीय दिखना चाहिए और एक R2 मान 1 के करीब होना चाहिए। यदि यह नहीं करता है, यह मानकों को फिर से करना और डेटा विश्लेषण की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए थाली फिर से पढ़ना आवश्यक हो सकता है.
  3. रीड-आउट मानों का मानकीकरण करें.
    1. प्लॉट किए गए मानक डेटा के लिए एक श्रेष्ठ-फिट लाइन बनाएँ. सबसे अच्छा फिट लाइन की ढलान से नमूनों के पठन बहिष्कार विभाजित करें।
  4. नियंत्रण समूह और चर समूह से मानों की तुलना करें.
    1. एक टी परीक्षण या ANOVA का उपयोग करें, दो से अधिक समूहों के लिए, यदि समूहों के बीच अंतर सांख्यिकीय महत्वपूर्ण है यह निर्धारित करने के लिए. मान इकाइयों nmol/

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Representative Results

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यहाँ दिखाए गए परिणाम सीरम में chitinase गतिविधि को मापने के एक अध्ययन से कर रहे हैं और जंगली प्रकार के बाल नमूने (C57BL/6) और Chit1 ट्रांसजेनिक चूहों (C57BL/6 पृष्ठभूमि पर) कि एक doxycycline प्रमोटर पर Chit1 जीन overexpress. हमारे आंकड़े बताते हैं कि सीरम और बाल दोनों नमूनों में आधार रेखा 698.2 पर डिटेक्टकरनेबल चिटिनाज़ गतिविधि होती है - 189.9 nmol/mL$h और 485.7 - 114 nmol/ml$h, क्रमशः. 4 सप्ताह के लिए पीने के पानी में doxycycline का उपयोग कर Chit1 जीन के overexpression दोनों BAL में मनाया गया chitinase गतिविधि की ऊंचाई के परिणामस्वरूप (4,575 - 673.8 nmol/mL]h, p $ 0.003) और सीरम 1556 ] 251.2 nmol/mL]h, p ] 0.0272, जब की तुलना में ) नमूने.

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, परख इस बात की पुष्टि करती है कि चूहों में चिट1 जीन का अतिअभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप चिटिनेज़ गतिविधि में वृद्धि होती है। एक टी परीक्षण दो समूहों के साधन की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। प्रत्येक समूह में 5 चूहे थे।

Figure 1
चित्र 1: Chitinase गतिविधि. चिटिनेस गतिविधि को () सीरम और (बी) ब्रोंकोल्वेलर लावेज तरल पदार्थ जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) और चिटोट्राइसिडेस (चिटग) ओवर-डिप्रेसिंग ट्रांसजेनिक चूहों में मापा गया था। प्रत्येक बिंदु एक अलग-अलग माउस नमूने का प्रतिनिधित्व करता है. (ग) प्रोटोकॉल में वर्णित मानक वक्र की रैखिकता का उपयोग करके मानों का मानकीकरण किया गया था। फ्लोरोसेंट के स्तर को उत्तेजना के लिए 360 एनएम की तरंगदैर्ध्य पर प्लेट रीडर और उत्सर्जन के लिए 455 एनएम का उपयोग करके मापा गया और एयू के रूप में प्रस्तुत किया गया। AU ] मनमाने ढंग से इकाई * पी और lt; 0.05, * * पी और lt; 0.001. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

नमूना कुओं की संख्या सबस्ट्रेट (जेडएल) McIlvain बफर (एमएल)
20 100 2.17
50 250 5.425
100 500 10.85

तालिका 1: कार्य समाधान बनाने के लिए नमूना परिकलन।

(जेडएल) 1 2 3 4 5 6 7 8
Conc. (एन.एम.) 0 125 250 375 500 625 750 875
मानक 0 20 40 60 80 100 120 140
2x McIlvian 200 200 200 200 200 200 200 200
आसुत एच2हे 200 180 160 140 120 100 80 60
बफ़र रोकें 400 400 400 400 400 400 400 400

तालिका 2: मानक वक्र माप के लिए Dilutions.

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Discussion

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Chitinase गतिविधि रोग गंभीरता, रोग प्रगति, चिकित्सीय प्रभावशीलता और विशिष्ट रोगजनकों की उपस्थिति की भविष्यवाणी के लिए एक महत्वपूर्ण biomarker के रूप में उभराहै 18. हालांकि chitinases की भूमिका के बारे में लंबे समय सेअनुकूल सिद्धांतों के कई प्रयोगात्मक 19 सिद्ध नहीं किया गया है , नए अध्ययनविभिन्न रोगों में प्रोटीन की तरह chitinases और chitinase की भूमिका में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है2, 9,20.

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल जैविक नमूनों में chitinase गतिविधि को मापने के लिए एक सरल, त्वरित और प्रभावी तरीका है. चिटिनेस की अत्यधिक संरक्षित प्रकृति के कारण विभिन्न प्रकार के जैविक नमूनों और प्रजातियों में काइटिनाज गतिविधि को मापने के लिए कुछ भी संशोधन की आवश्यकता नहीं है। इस प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध दो substrates, जिनमें से एक के रूप में माउस के नमूने के लिए नामित किया गया है और मानव नमूनों के लिए एक कर रहे हैं; हालांकि, दोनों substrates या तो प्रजातियों पर इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में वे इस तरह के रूप में नामित किया गया है पिछले कागजात दक्षता जिसके साथ एंजाइमों सब्सट्रेट छोड़ सकते हैं के प्रदर्शन के आधार पर.

पहले से मौजूद तकनीकों की तुलना में, इस तरह के Schales प्रक्रिया और DNS विधि के रूप में, परख यहाँ उल्लिखित ऐसे उबलते या हीटिंग कि पुराने तरीकों में आवश्यक थे के रूप में समय गहन कदम के लिए की आवश्यकता को हटा. इसके अतिरिक्त, परख कम तकनीकी रूप से मुश्किल है और पिछले माप तकनीकों की तुलना में कम जटिल कदम की आवश्यकता है. सर्वोत्तम परिणामों के लिए जैविक और तकनीकी प्रतिकृति दोनों का उपयोग किया जाना चाहिए।

यदि chitinase गतिविधि बहुत अधिक है, जैविक नमूने के कमजोर पड़ने के लिए माप के लिए chitinase गतिविधि को कम करने के लिए पर्याप्त हैं, और सही मूल्यों कमजोर पड़ने के आधार पर गणना की जा सकती है. नए जैविक नमूनों पर इस प्रयोग का प्रदर्शन करते समय, यह समय के साथ एक ही थाली पर दोहराने माप प्रदर्शन करने के लिए उपयोगी हो सकता है जब तक संतृप्ति के लिए सबसे अच्छा परिणाम के लिए एक उचित ऊष्मायन समय सुनिश्चित करने के लिए. साथ ही, प्रोटोकॉल ऊपर या नीचे स्केल कर सकते हैं जब तक कि समूहों के बीच संगतता बनी रहती है। इस प्रोटोकॉल के भविष्य के आवेदन दूर तक पहुँच रहे हैं के रूप में अनुसंधान सिर्फ रोगों की एक संख्या में chitinase गतिविधि की भूमिका में उठा रहा है.

चिटिनेस गतिविधि की पहली श्रेणी में से एक गौचर की बीमारी, निमान-पिक ए/बी और सी, जीएम-1 गैंग्लिसिडोसिस और कई अन्य21सहित लाइसोमल भंडारण रोगों में प्रासंगिक पाया गया था। गौचर रोग ग्लूकोसेरेब्रोसिडेस की अपर्याप्त गतिविधि के कारण एक लाइसोसोमल भंडारण रोग है और यह ग्लूकोसिलसेरेमाइड के बिल्डअप, ग्लूकोसेरेब्रोसिडस के सबस्ट्रेट, मैक्रोफेज15के लाइसोसोम में की विशेषता है। यह एक आनुवंशिक रोग है, नैदानिक लक्षणों के साथ जिसमें तिल्ली और यकृत वृद्धि, कम प्लेटलेट गिनती, एनीमिया, थकान, और हड्डी की समस्याएं22शामिल हैं। नैदानिक अनुसंधान से पता चला है कि गौचर रोग से पीड़ित लोगों के बहुमत एक औसत chitinase गतिविधि है कि सामान्य नियंत्रण स्वयंसेवकों के औसत मूल्य 600 से अधिक है; इसके अतिरिक्त, जब गौचर रोग के साथ लोगों को एंजाइम पूरकता चिकित्सा पर डाल दिया गया था-रोग के लिए वर्तमान उपचार-their chitinase गतिविधि का स्तर काफी उधार chitinase गतिविधि दोनों रोग का एक उत्कृष्ट मार्कर होने के लिए गिरा दिया प्रगति और उपचार की निगरानी15| हालांकि इस बीमारी में चिट1 के लिए अभी तक कोई भूमिका नहीं मिली है। इसी प्रकार के अनुसंधान से कई अन्य लाइसोसोमल भंडारण रोगों के लिए चिट1 गतिविधि निगरानी की गईहै .

इसके अतिरिक्त, आगे अनुसंधान फंगल संक्रमण, मलेरिया, तपेदिक और के निमोनिया सहित विभिन्न रोगज़नक़ संक्रमण के दौरान Chit1 गतिविधि के लिए एक संभावित भूमिका का संकेत दिया है कुछनाम 2,3,10 . एक 2012 अध्ययन में पाया गया कि chitinase गतिविधि सक्रिय तपेदिक (टीबी) संक्रमण के साथ रोगियों में ऊंचा किया गया था जब थूक धब्बा नकारात्मक था, यह दर्शाता है कि chitinase गतिविधि टीबी निदान में एक प्रभावी biomarker के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, विशेष रूप से दौरान लंबे समय तक प्रतीक्षा समय है कि अक्सर सही निदान रोग23के लिए आवश्यक है . इसी तरह के निष्कर्ष प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम संक्रमण के दौरान देखे गए थे, जिसमें चीटोट्राइसिडेस सीरम का स्तर तीव्र संक्रमणवाले24 लोगों में काफी बढ़ गया था। हालांकि इन रोगों में से कई का निदान करने के लिए दिन लगते हैं, रक्त में chitinase गतिविधि के स्तर के त्वरित माप निदान में फायदेमंद अंतर्दृष्टि प्रदान किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, के रूप में मलेरिया परजीवी और तपेदिक जीवाणु तेजी से उपचार के लिए प्रतिरोधी हो जाते हैं, सीरम में chitinase गतिविधि के स्तर को मापने वास्तविक समय में अपनी प्रभावशीलता के लिए उपचार की निगरानी के साथ मदद कर सकते हैं.

अधिक से अधिक शोध प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में chitinase और chitinase की तरह प्रोटीन की भूमिका पर ध्यान केंद्रित करने के लिए शुरू कर दिया है, विशेष रूप से भड़काऊ रास्ते में अपनी भूमिका. के रूप में इस अनुसंधान जारी है, इस प्रोटोकॉल आगे अनुसंधान करने के लिए इस chitinase गतिविधि के त्वरित और सटीक माप के लिए अनुमति देगा. प्रोटोकॉल आसानी से दोनों माउस और मानव सहित प्रजातियों के नमूने के किसी भी संख्या के लिए समायोजित किया जाता है, यह व्यापक रूप से लागू कर रही है.

अनुसंधान लाभ के अलावा, नमूनों में chitinase गतिविधि का पता लगाने और मापने के लिए बेहतर तरीके नैदानिक दायरे में फायदेमंद होगा. हाल के शोध गौचर रोग, मधुमेह मेलिटस, सार्कोइडोसिस, एथेरोस्क्लेरोसिस, सूजन आंत्र रोग और कैंसर सहित कई पुरानी बीमारियों की विकृति में एक बायोमार्कर के रूप में chitinase की भूमिका का प्रदर्शन किया है3, 21,25,26.

एक biomarker के रूप में इस भूमिका की वजह से, यहाँ दिखाया गया के रूप में chitinase गतिविधि के त्वरित और सटीक माप चिकित्सा के क्षेत्र के लिए अविश्वसनीय रूप से प्रासंगिक है, स्वास्थ्य सेवा प्रदाताओं के लिए एक उचित निदान और उपचार योजना के लिए और अधिक जानकारी है की अनुमति.

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Disclosures

कोई नहीं.

Acknowledgments

इस शोध अमेरिकी फेफड़े एसोसिएशन और अमेरिकी Thoracic सोसायटी पुरस्कार एलएस के लिए द्वारा समर्थित किया गया था. लेखक ईमानदारी से ट्रांसजेनिक माउस उपभेदों प्रदान करने के लिए डॉ जैक Elias और डॉ चुन Geun ली शुक्रिया अदा करना चाहता हूँ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-methylumbelliferone Sigma M1381 Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity
4MU-GlcNAc2 Sigma M9763 fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples
4MU-GlcNAc3 Sigma M5639 fluorescent chitinase substrate for use in human samples
Citric Acid-monohydrate for use in McIlvain Buffer
Glycine for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M
Na2HPO4xH2O for use in McIlvain Buffer
NaOH for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L
Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate 4titude 4ti-0224

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References

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जैविक नमूनों में चिटिनास गतिविधि का मापन
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Amick, A. K., Liu, Q., Gautam, S., Chupp, G., Dela Cruz, C. S., Sharma, L. Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples. J. Vis. Exp. (150), e60159, doi:10.3791/60159 (2019).More

Amick, A. K., Liu, Q., Gautam, S., Chupp, G., Dela Cruz, C. S., Sharma, L. Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples. J. Vis. Exp. (150), e60159, doi:10.3791/60159 (2019).

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