Summary
وصف هنا هو بروتوكول لتوصيف وحدات miRNAs التازر بيولوجيا وتجميعها في الجينات القصيرة ، والذي يسمح التعبير الفوقي في وقت واحد لتطبيقات العلاج الجيني.
Abstract
الاهميه البيولوجية ميكرورناس (miRNAs) في مجال الصحة والمرض تعتمد بشكل كبير علي مجموعات محدده من العديد من المحررين في وقت واحد miRNAs بدلا من عمل ميرنا واحده. وصف هذه الوحدات miRNAs محدده خطوه أساسيه في تعظيم استخدامها في العلاج. وهذا أمر مهم للغاية لأنه يمكن استغلال سماتهم التوافقية عمليا. وصفت هنا هو طريقه لتحديد توقيع ميرنا محدده ذات الصلة للسيطرة علي المتحكمين الكروماتين في الورم الارومي. يعرف النهج أولا مجموعه عامه من miRNAs التي يتم تحريرها في الأورام بالمقارنة مع الانسجه العادية. ويتم صقل التحليل بشكل أكبر من خلال الظروف الثقافية التفاضلية ، مما يؤكد وجود مجموعه فرعيه من miRNAs التي يتم التعبير عنها بشكل متزامن اثناء الولايات الخلوية المحددة. وأخيرا ، فان miRNAs التي ترضي هذه المرشحات يتم دمجها في الجينات الاصطناعية متعددة الخلايا ، والتي تقوم علي سقالة من الجينات الموجودة بشكل طبيعي المجموعات ميرنا ، ثم تستخدم للتعبير المفرط من هذه الوحدات ميرنا في الخلية المتلقية.
Introduction
mirnas توفر فرصه لا مثيل لها لتطوير نهج العلاج الجيني واسعه لكثير من الامراض1،2،3، بما في ذلك السرطان4،5. ويستند هذا علي العديد من السمات الفريدة لهذه الجزيئات البيولوجية ، بما في ذلك حجمها الصغير6، التكوين الحيوي البسيط7، والميل الطبيعي للعمل في الرابطة8. وتتميز العديد من الامراض بأنماط التعبير ميرنا محدده ، والتي غالبا ما تتلاقي علي تنظيم الوظائف البيولوجية المعقدة9. والغرض من هذا الأسلوب هو أولا لتحديد استراتيجية لتحديد مجموعات miRNAs التي هي بالتازر ذات الصلة لوظائف خلوية معينه. التالي ، فانه يوفر استراتيجية لأعاده إنشاء مثل هذه التركيبات في الدراسات والتطبيقات النهائية.
هذا الأسلوب يسمح للتحليل الوظيفي للعديد من miRNAs في وقت واحد ، والاستفادة من استهدافهم في وقت واحد من عدد كبير من mRNAs ، التالي تلخيص المناظر الطبيعية المعقدة من الامراض. وقد استخدم هذا النهج مؤخرا لتحديد مجموعه من ثلاثه mirnas ان 1) هي في وقت واحد دوونريجولاتيد في سرطان المخ و 2) تظهر نمط التعبير المشترك قويه خلال التمايز العصبي وكذلك ردا علي الإجهاد الجيني من قبل الإشعاع أو الحمض النووي عامل الالكل. التوافقية أعاده التعبير عن هذه الوحدة من ثلاثه miRNAs بواسطة طريقه التجميع الموصوفة أدناه النتائج في التدخل العميق مع بيولوجيا الخلايا السرطانية ويمكن استخدامها بسهوله كاستراتيجية العلاج الجيني للدراسات قبل السريرية10. وقد يكون هذا البروتوكول ذا اهميه خاصه بالنسبة لأولئك المشاركين في بحوث ميرنا وتطبيقاتها الانتقالية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. توصيف miRNAs المرتبطة وظيفيا في الورم المفلطح
- تحليل التعبير ميرنا التفاضلي الواسع في الورم الدمى مقابل المخ
- أولا ، تحديد الأكثر بشكل ملحوظ التي حررت miRNAs في الورم. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام ثلاث طرق مختلفه علي الأقل:
- منجم السرطان الجينوم الأطلس ، وجدت في https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga ، لتسلسل البيانات11.
- اجراء تحليل ميكروصفيف من عينه المنطوق جديده12.
- استخدام مجموعات البيانات المنشورة سابقا13.
ملاحظه: أيا كان الأسلوب الذي يتم اختياره ، يوفر الإخراج مجموعه كبيره من miRNAs التي يرتبط التعبير إحصائيا (اما مباشره أو عكسيا) مع علم الاحياء الورم. هذه المجموعة الاوليه تشكل تجمع miRNAs التي يتم تحليلها بشكل أكبر لتحديد مجموعه فرعيه من miRNAs عرض الرابطة الوظيفية الأكثر صرامة من خلال اجراء تحليل أكثر ديناميكية من التغييرات التعبير ، كما هو موضح أدناه.
- أولا ، تحديد الأكثر بشكل ملحوظ التي حررت miRNAs في الورم. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام ثلاث طرق مختلفه علي الأقل:
- تحليل تعبير ميرنا الخاص بالحالة
- استقراء من خليه تمييز:
- استخدام الاطباق البلاستيكية المغلفة مسبقا بولي دي يسين (PDL) لصالح تشكيل ثقافة أحاديه الطبقة. لطلاء الطبق ، ذوب PDL في الماء بتركيز 100 ميكروغرام/مل. استخدام 1 مل من الحل لكل 25 سم2 السطح. شطف 2x مع برنامج تلفزيوني 6 ح بعد تطبيق الحل PDL.
- لوحه الخلايا الجذعية العصبية البشرية في كميات متساوية (100,000 خلايا/5 مل) اما في الخلايا الجذعية المتوسطة (المتوسطة العصبية + B27 الملحق + 20 نانوغرام/مل EGF/FGF) ، التمايز الفلكي المتوسط (DMEM + 10 ٪) ، أو التمايز العصبية المتوسطة الملحق ، + 2 μM حمض الريتينويك)14. البروتوكول ل اوليجوديندروسيتي التمايز يتطلب أضافه igf-1-1 (200 ng/mL) بعد egf/fgf أزاله14،15.
- بعد الطلاء الخلية ، ومكان في حاضنه لمده 1 أسبوع في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2.
- استخراج RNA:
- بعد 7 أيام ، وأزاله الخلايا من الحاضنة وأزاله المتوسطة.
- غسل الخلايا مع تلفزيوني (5 مل). ثم ، أضافه 1 مل من كاشف تحلل (انظر جدول المواد) لlyse الخلايا وكشط الخلايا إلى 1.5 mL أنبوب microfuge باستخدام مكشطه الخلية. الحفاظ علي الأنابيب التي تحتوي علي خلايا تفكيك في درجه حرارة الغرفة (RT) لمده 5 دقائق.
- المضي قدما إلى عزل الحمض الريبي النيبالي الإجمالي بعد تعليمات الشركة المصنعة.
- تحليل التعبير ميرنا:
- قياس التعبير التفاضلي من miRNAs محدده المحددة في الخطوة 1.1 بين أنماط التمايز الثلاثة من قبل PCR في الوقت الحقيقي ، وذلك باستخدام مجسات تقي واتباع بروتوكولات الشركة المصنعة للنسخ العكسي وتضخيم PCR ( الشكل 1).
- استقراء من خليه تمييز:
- التحقق من صحة مجموعات ميرنا حسب التحديات الخاصة بالإجهاد
- الثقافة G34 الخلايا الجذعية مثل الجذع في المتوسطة العصبية + B27 الملحق + 20 ng/mL EGF/FGF. تبدا مع 1 × 106 خلايا في 5 مل في 25 سم2 قارورة منخفضه المرفقات.
- بدءا من 48 ساعة بعد الطلاء ، أضافه تركيزات مضاعفه من الحمض النووي temozolomide عامل (TMZ) كل 5 أيام ، علي النحو التالي:
- تبدا مع 5 μM لمده 5 أيام. بعد 5 أيام ، وأزاله المتوسطة واستبدال مع المتوسطة الطازجة دون temozolomide ، للسماح للخلايا علي قيد البقاء للتعافي. بعد 48 h ، أضافه 10 μM TMZ واحتضان لمده 5 أيام أخرى.
- كرر الخطوة 1.3.2.1 ، مضاعفه تركيز TMZ في كل مره ، حتى يتم الوصول إلى تركيز ما لا يقل عن 100 μM وتصبح الخلايا مقاومه للدواء10.
- في تجربه موازيه ، تشع خلايا G34 علي النحو التالي:
- بدءا 48 ساعة بعد الطلاء 1 × 106 خلايا في 5 مل في 25 سم2 قارورة منخفضه المرفقات ، تشع الخلايا مع 2 غراي من الطاقة (اي أشرق توفير انبعاث الفوتون غير مقبول). أعاده الخلايا إلى الحاضنة وعدم الإزعاج. بعد 48 h ، تشع الخلايا مره أخرى مع 2 غراي اضافيه من الطاقة.
- كرر الخطوة 1.3.3.1 4x حتى يتم أداره ما مجموعه 10 غراي من الطاقة.
- أعاده الخلايا إلى الحاضنة والسماح لهم بالتعافي في وسط جديد لمده لا تقل عن 5 أيام قبل التحليل المصب.
- بعد تحريض المقاومة ، الخلايا lyse باستخدام كاشف تحلل واستخراج الحمض الريبي النيبالي الإجمالي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- تحليل التعبير عن miRNAs محدده المحددة في الأقسام 1.1-1.2 كما هو موضح في الخطوة 1.2.1 (الشكل 2).
- توصيف التقارب الوظيفي ل miRNAs متفاوت البعد
- الحصول علي الهدف المتوقع من كل miRNAs المعرفة في الأقسام 1.2-1.3 التي تم الحصول عليها باستخدام ميرنا استهداف أدوات التنبؤ.
ملاحظه: نحن عموما اللجوء إلى TargetScan ، كما يتم تحديث خوارزميه لها بشكل دوري16. أدوات التنبؤ الاضافيه هي ميراندا17، mirdb18، وديانا-mirdb19. كل هذه البرامج هي مجانية ، والتطبيقات القائمة علي شبكه الإنترنت.- من الصفحة الاولي من Targetscan ، حدد ميرنا الفائدة من القائمة المنسدلة التي تم ملؤها مسبقا. انقر فوق الزر إرسال .
- قم بتنزيل قائمه الأهداف الناتجة كجدول بيانات باستخدام ارتباط جدول التنزيل (الشكل الإضافي 1).
- لتقليل فرص التنبؤات الايجابيه الزائفة ، لا تشمل سوي الأهداف داخل عمود المواقع المحفوظة في التحليلات النهائية. أيضا ، يمكن الحصول علي مزيد من التقشف باستخدام برامج التنبؤ ميرنا اضافيه (انظر أعلاه) وفقط بما في ذلك الأهداف التي هي مشتركه لجميع الخوارزميات.
- تصنيف المستهدفة الناتجة وفقا لفئات علم الجينات باستخدام ToppGene جناح20 لتقييم لإثراء المسارات التي هي مشتركه لكل ميرنا.
- لصق قائمه الأهداف التي تم الحصول عليها من الخطوة 1-4-1 في اطار "مجموعه الجينات التدريب" باستخدام رمز HGNC كنوع إدخال. انقر فوق إرسال > أبدا. سيوفر البرنامج جدول مخرجات يظهر أهم فئات "Go" للقائمة التي تم إدخالها من الجينات (الشكل التكميلي 2).
- لتاسيس أخيرا مساهمه كل ميرنا لتنظيم مسار مشترك أو عمليه الخلوية (في هذه الحالة ، التنظيم الكروماتين) ، تحقق من كل targetome الحصول عليها في الخطوة 1-4-1 ضد قائمه كامله من الجينات المشاركة في عمليه خلوية محدده ( اي ، التنظيم الكروماتين) ، وذلك باستخدام وظيفة الرسم البياني Venn المقدمة في المعلوماتية الحيوية والتطور الجينوم الموقع http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn.
ملاحظه: يسمح هذا البرنامج بالتقاطع بين مجموعات متعددة في نفس الوقت (الشكل 3). ويتم بعد ذلك شرح الأهداف الفريدة المحددة التي تقدمها كل ميرنا واختيارها للتجارب الوظيفية النهائية.- في الصفحة الاولي من البرنامج ، قم بتحميل أو نسخ/لصق القائمة إذا كان الهدف mRNAs لكل ميرنا أو الفائدة في النوافذ المعنية. اسم كل قائمه مع معرف فريد.
- انقر فوق إرسال. سيوفر البرنامج إخراجا مرئيا للرسم التخطيطي Venn مع عدد من الجينات في كل قطاع ، فضلا عن قائمه كامله من mRNAs لكل مجموعه فرعيه وتقاطع التركيبات.
- الحصول علي الهدف المتوقع من كل miRNAs المعرفة في الأقسام 1.2-1.3 التي تم الحصول عليها باستخدام ميرنا استهداف أدوات التنبؤ.
2. تجميع وحدات ميرنا في كتله المحورة وراثيا بوليسيستررونيك
-
اعداد سقالة المحورة وراثيا استنادا إلى موضع الكتلة 17-92 مير
- الحصول علي تسلسل النيوكليوتيد للكتلة 17-92 من مستعرض الجينوم انسمبل21. حدد التسلسل الأساسي لزوج القاعدة ~ 800 "core" الذي يشمل جميع دبابيس الشعر الستة المشفرة من الموضع وعلي الأقل 200-النوكليوتيد التي تجمع بين المراحل التمهيدية (5 ') والمجري السفلي (3 ') من التسلسل الأساسي.
- لصق التسلسل أعلاه في اي برنامج تحرير الكلمة.
- حدد تسلسل كل واحد من دبابيس الشعر الستة الاصليه عن طريق استرجاعها في miRBase22. وضع علامة علي كل واحد من هذه التسلسلات ضمن نطاق تسلسل "الاساسيه" التي تم تحديدها مسبقا. اي تسلسل بين كل دبوس الشعر تمثل تسلسلات فاصل ، والتي هي مهمة للمعالجة الصحيحة للجينات.
- أزاله متواليات دبوس الشعر الأصلي من تسلسل "الاساسيه" ، باستثناء 3-5 النيوبوتيدس في كل من 5 ' و 3 ' نهايات كل دبوس ، والتي ستكون بمثابه متقبل لدبابيس الشعر الجديدة.
-
بناء الجينات الجديدة الترميز متعددة miRNAs من الاختيار
- الحصول علي تسلسل دبوس من miRNAs المقصود ان تكون مفرطة في الجينات عبر من Mirnas. لاحظ بعناية النيوبوتيديس المحددة التي هي مواقع الانقسام المعالج الدقيق.
- استبدل دبابيس الشعر المزالة (الخطوة 2-1-4) بالسلاسل الشعرية التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.2.1.
- أضافه تسلسل القيود المطلوبة في كل من المناطق الجانبية من الجينات لتسهيل الاستنساخ إلى ناقلات التسليم من الاختيار. تحقق من ان تسلسلات التقييد المختارة غير موجودة ضمن التسلسل نفسه.
- بالنسبة لعناصر التحكم السلبية ، استخدم التسلسلات المشفرة 20-النيوكليوتيد لاستبدال التسلسل الطبيعي لكل ميرنا الناضجة بعشرين نوكليوتيد. إنشاء هذه التسلسلات المشفرة باستخدام أداه علي الإنترنت مثل https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence.
-
التحقق من البنية ثنائيه الابعاد للجينات
- نسخ تسلسل المحورة وراثيا الكامل في الحمض الريبي النيبالي التنبؤ بنيه برنامج RNAweb طيه23.
- باستخدام إعدادات البرنامج القياسية ، انقر فوق " متابعه".
- تحليل الإخراج الرسوميه ، وخاصه بالنسبة لوجود دبابيس الشعر المحددة جيدا ووجود هياكل الجذعية التي تقطعت بها السبل المزدوجة علي الأقل 11 النيوبوتيدس القريبة إلى موقع الانقسام المعالج الدقيق. أيضا ، ابحث عن عدم وجود نقاط المتفرعة داخل تسلسل دبوس (الشكل 4).
3. الحصول علي الجينات عبر الحمض النووي التوليف
- بعد التصميم والتحقق من صحة سيليكو من مجموعه ميرنا خيالي ، والحصول علي تسلسل العمل باستخدام توليف الحمض النووي من الباعة التجاريين24 والمضي قدما في استنساخ المصب إلى ناقلات والتسليم عبر الجينات. لقد استخدمنا ناقلات لينتيفيرال للتسليم في المختبر10 و adeno-الفيروسات المرتبطة (الطائرات بالطائرات) لفي الجسم المجري تسليم25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
سمحت هذه الطريقة توصيف وحده من ثلاثه miRNAs التي يتم تقليلها باستمرار في أورام المخ ، والتي يتم التعبير عنها بشكل خاص اثناء التمايز العصبية (الشكل 1) وتشارك في استجابه الورم البقاء علي قيد الحياة بعد العلاج (الشكل 2). ويتحقق ذلك من خلال تنظيم المسار القمعي كروماتين معقده. وقد اقترح هذا النمط من التعبير المشترك نشاطا متازرا قويا بين هذه الثلاثة miRNAs (الشكل 3). التالي ، مع الاستفادة من حجم صغير وتكوين حيوي بسيط من miRNAs ، تم استخدام الجزء الثاني من هذا البروتوكول لتصميم الجينات (الشكل 4) التي يمكن ان تلخص في وقت واحد التعبير عن mirnas الثلاثة في خلايا الورم الدمى ، علي حد سواء في المختبر وفي الجسم الحيوي ، مع تدخل كبير في علم الاحياء الأورام والتطبيق الواعدة الانتقالية (الشكل 5ا ، ب ، ج)10. الاضافه إلى ذلك ، ثبت ان الكتلة المحورة وراثيا تعمل أيضا في نموذج سرطان الثدي (الشكل 5دال ، هاء).
الشكل 1: توصيف وحده الميرنا الوظيفية في الورم الدمى. (ا) المؤامرة بركان يمثل التعبير بشكل مختلف mirnas في عينات الإنسان الورم البركاني (ن = 516) مقابل الدماغ العادي (ن = 10) التي تم الحصول عليها من tcga. في الأخضر هي miRNAs مع > 4 اضعاف الفرق. تمثل الدائرة الحمراء ال 10 الأكثر انخفاضا بشكل ملحوظ miRNAs في الورم الدمى. (ب) التعبير النسبي لل 10 mirnas المختارة في (ا) اثناء استقراء مسارات التمايز المختلفة في الخلايا الجذعية العصبية ، والتي تبين الحوامل واضحة من مير-124 ، مير-128 ، ووحدات مير-137 خلال الاستقراء من التمايز العصبي. يعني ± SD من ثلاثه نسخ متماثلة البيولوجية (* p < 0.05 ؛ * * p < 0.01 ؛ * * * p < 0.001 ؛ * * * * p < 0.0001 ؛ الطالب t-اختبار ، اثنين الذيل). وقد عدل هذا الرقم باذن من المرجع10. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تاكيد أنماط التعبير المشترك لوحدات ميرنا اثناء الإجهاد الجيني. التعبير النسبي عن miRNAs الثلاثة المحددة في الشكل 1 في خلايا الورم العضلي المتعدد وخطوط الخلايا (G62. MGG4-proneural ؛ U251 ، U87 الموالية للأعصاب مثل ، و T98G التي تشبه خطوط الخلايا الخلوية الصفراوية) بعد التحريض علي المقاومة لtemozolomide (TMZ ، القضبان الوردية) أو الإشعاع المؤين (RT ، القضبان الخضراء). المبلغ عنها هي وسائل مع SD من اثنين من نسخ متماثلة مستقله. وقد تم تعديل هذا الرقم باذن من المرجع10. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليل التقارب الوظيفي للاستهدافات التي تم التعبير عنها بالاشتراك مع miRNAs. Venn الإخراج الرسم البياني من المعلوماتية الحيوية والتطورية الموقع الجينوم ، في وقت واحد عبور المستهدفة من miRNAs الموسومة مع mRNAs تشكل فئة GO من الفائدة (في هذه الحالة ، والمراقبين الكروماتين). تم اختيار mRNAs المستهدفة بشكل فريد من قبل miRNAs واحده لمزيد من الدراسات الوظيفية المصب. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الهيكل الثنائي الابعاد لتسلسل ميرنا الذي تمت هندسته وترميز مجموعه miRNAs الثلاثة. إخراج رسوميه من برنامج RNAweb طيه. لاحظ وجود ثلاثه هياكل الجذعية المحددة جيدا التي تمثل دبابيس الشعر من كل ميرنا (مير-124 ، مير-128 ، مير-137) المشفرة من قبل الجينات. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: أدله علي المعالجة عبر الجينات وتاثيرها البيولوجي المصب. (ا) القياس الكمي النسبي لتعبير ميرنا بعد لينتيفيرال المحولة من خلايا الورم الصفراوي G34 مع كتله ميرنا المحورة وراثيا (المجموعة 3) أو التحكم السلبي (ctrl). وذكرت وسائل من ثلاث تجارب مستقله ± SD. (ب) صور المجهر الفلورية من المجالات G34 الورم الصفراوي التعبير عن السيطرة السلبية عبر الجينات مقابل المجموعة 3 عبر الجينات. شريط مقياس = 100 μm. (ج) في نمو الجسم البشري في الخلايا الG34ه الإنسان داخل الجمجمة التي تعبر عن اما السيطرة أو المجموعة 3 الجينات المتحولة. شريط مقياس = 1 ملم. وقد استنسخ هذا الرقم باذن10. (د) القياس الكمي النسبي لتعبير ميرنا بعد لينتيفيرال المحولة من الخلايا السرطانية للثدي من طراز MDA-MB-231 مع مجموعه ميرنا المحورة وراثيا (المجموعة 3) أو التحكم السلبي (ctrl). (ه) صور المجهر الفلورية من الخلايا السرطانية الثدي MDA-ميغابايت-231 التعبير عن السيطرة السلبية عبر الجينات مقابل المجموعة 3 عبر الجينات. شريط مقياس = 100 μm. وأجريت جميع التجارب في ثلاثه (* p < 0.05 ؛ * * p < 0.01 ؛ الطالب t-اختبار ، ثنائي الذيل ، مقارنات متعددة). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: سير العمل TargetScan. (ا) لقطه الصفحة الرئيسية ، وعرض خيارات الاختيار للبحث ميرنا. (ب) نتائج البحث التمثيلي ل miR-137. قائمه الجينات المستهدفة في العمود الأيسر. المربع الأحمر يدل علي الجينات مع مواقع الاستهداف المحفوظة (مما يوحي بثقة اعلي من الاستهداف الحقيقي). يرجى النقر هنا للاطلاع علي هذا الرقم. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)
الشكل التكميلي 2: سير عمل جناح توبسجين. (ا) لقطه الصفحة الرئيسية تظهر مربع البحث حيث يتم ادراج قائمه الجينات التي سيتم تحليلها. (ب) نتيجة البحث التمثيلي ل137 المستهدفة لل miR ، التي تبين الفئات الأكثر دلاله من الناحية الاحصائيه لعلم الجينات (GO). يرجى النقر هنا للاطلاع علي هذا الرقم. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويستند هذا البروتوكول علي فكره انه بدلا من العمل في عزله ، miRNAs هي ذات الصلة بيولوجيا من خلال العمل في مجموعات ، ويتم تحديد هذه المجموعات الهيستونات من قبل السياقات الخلوية المحددة26. ولتبرير هذا النهج من منظور انتقالي ، استحدث بروتوكول للمتابعة يسمح بالترويح عن هذا النمط المتعدد الميرنا في الخلايا/الانسجه. وهذا ممكن من خلال الاستفادة من النشاه الحيوية بسيطه نسبيا من miRNAs ، حيث الاعتراف من السمة ميرنا المميزة من قبل المعالج الدقيق ضروري وكافيه لمعالجه ميرنا الصحيح27. وفي الوقت نفسه ، يسمح هذا الحد الأدنى من المتطلبات استخدام السقالات الجينية للمجموعات ميرنا التي تحدث بشكل طبيعي كعمود فقري للتعبير عن وحدات ميرنا المطلوبة ، والتي ترد ضمن تسلسل الحمض النووي قصيرة التي يمكن تركيبها في اي ناقلات التسليم من الاختيار. الشرط الرئيسي لهذا البروتوكول هو الحفاظ علي بنيه دبوس الشعر وطول كافيه من مكون الجذعية للسماح الانقسام المناسب.
وهناك نوعان من الاعتبارات الحاسمة الرئيسية فيما يتعلق بتنفيذ هذا البروتوكول. النقطة الاولي هي تحديد دقيق للمجموعات ميرنا الأمثل. يتم تحديد هذا عن طريق تحليل دقيق ليس فقط التوقيع ميرنا التعبير من الخلايا أو الانسجه بالمقارنة مع الضوابط ، ولكن أيضا من اي تغييرات التعبير في وقت واحد لوحظ كما يتم التلاعب الخلايا بالتجربة. مره واحده يتم تعريف مجموعه من miRNAs ، فمن الضروري أيضا التاكد من ان التحوير الاصطناعي لكل متفرد لا يعدل التعبير عن الآخرين.
ويتعلق الجانب الحرج الثاني ببناء متواليات خيالي لتلخيص هذه التكتلات الوظيفية بشكل مصطنع. فمن الضروري التزام بالمتطلبات الهيكلية للات معالجه ميرنا ، وهو وجود تسلسل الجذعية طويلة بما فيه الكفاية (قياس ما لا يقل عن 11 النيوبوتيدس) في أصل كل دبوس الشعر ميرنا18، فضلا عن صيانة الأصلي تسلسلات التباعد لسقالة الكتلة الاصليه ميرنا. في تجربتنا ، والوفاء بهذين المتطلبين قد أثمرت باستمرار المناسبة للطي RNA (الشكل 4) وأسفرت عن نجاح التعبير متعددة ميرنا.
الحد الرئيسي لهذه التقنية هو العدد المحدود من miRNAs التي يمكن تجميعها معا في الجينات الوظيفية. لقد نجحنا في هندسه متواليات تعبر عن ما يصل إلى سته miRNAs مختلفه ولكن لاحظت بعض الانخفاض في كفاءه المعالجة كما يزيد عدد دبابيس الشعر. [س فر] استعملت البنية وراثيه من ال [مير-17-92] عنقود يتلقى يكون, لان هو الواحدة الترميز الرقم [هيغست] من دبوس شعر (سته) ضمن القصيرة [دنا] تسلسل (~ 800 قاعده أزواج)8. ونظرا لوجود مجموعات أخرى من المجموعات الطبيعية ، فمن المتوقع ان تستخدم أيضا لهذا الغرض28. وأخيرا ، لوحظ ان تعديل تسلسل التباعد بين الدبوس يقلل من معالجتها ، لذلك هناك بعض القيود المتعلقة إلى اي مدي يمكن تعديل البنية الاصليه.
الجانب الأكثر اهميه وفائدة من هذه الطريقة المقترحة هو انه يسمح للهندسة الجينات التي هي قادره علي overexpress في وقت واحد العديد من mirnas المرجوة أساسا باستخدام نهج سيليكو ، مما يحد من الحاجة إلى مملة و خطوات الاستنساخ الجزيئي المستهلكة للوقت ، كما سبق وصفه في29و30و31. والبروتوكول الموصوف سهل التنفيذ ولا يتطلب معدات أو مهارات متخصصة.
بالنظر إلى الاهميه المعترف بها من miRNAs في البيولوجيا الجزيئية وإمكاناتها في التطبيقات العلاجية ، وهذا البروتوكول هو من مصلحه جمهور كبير من الباحثين. ومن المتوقع ان يشجع هذا النهج الدراسات المستقبلية التي تركز علي الخصائص التوافقية لmirnas ستكون بمثابه أداه بسيطه وقويه لتنفيذها. والاهم من ذلك ان هذه الجينات العنقودية تمثل الشحنات المثالية لنواقل العلاج الجيني. وقد تم بالفعل الحصول علي أدله ناجحه في تسليم الجسم المضاد للكتلة 3-ميرنا عن طريق الحقن داخل الجمجمة مباشره من ناقلات AAV (البيانات غير المنشورة). التالي من المتوقع ان هذه التقنية سوف تعزز بشكل كبير الجوانب الانتقالية للبحوث ميرنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولم يبلغ أصحاب البلاغ عن اي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويود أصحاب البلاغ ان يشكروا أعضاء مختبر هارفي كوشينج للأورام العصبية علي الدعم والنقد البناء. وقد دعم هذا العمل من قبل NINDS منح K12NS80223 و K08NS101091 إلى p. P.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% low melting temperature agarose | IBI Scientific | IB70058 | |
| 0.45 µM sterile filter unit | Merck Millipore | SLH033RS | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431081 | |
| 6-Well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Athymic mice (FoxN1 nu/nu) | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| Cell culture flask | Greiner Bio-One | 660175 | |
| Cell Scraper, 16cm | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cesium 137 irradiator | JL Sheperd and Associates | Core Facility (Harvard Medical School) | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 439142-4L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11995040 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Eosin Y solution | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEK-293 | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1573 | |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | 1051750500 | |
| Human primary glioma stem-like cells (GBM62) | Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Human primary glioma stem-like cells (MGG4) | Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) | ||
| Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP | System Biosciences | CD511B-1 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Microcentrifuge refrigerated | Eppendorf | model no. 5424 R, cat. no.5404000138 | |
| Mounting medium | Thermo Fisher Scientific | 4112APG | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3117-0380PK | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000c | |
| Neural Progenitor cells (NPC) | Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system | Nikon, Japan | 14314 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985088 | |
| PCR tubes | Sigma-Aldrich | CLS6571-960EA | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri-Dishes 94/16 | Greiner Bio-One | 632180 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma- Aldrich | P4707 | |
| Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | AF-100-18B | |
| Retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| RNA Miniprep Kit | Direct-zol | R2050 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | |
| Small Animal Image-Guided Micro Irradiator | Xstrahal Life Sciences, UK | Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA) | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75000100 | |
| StemPro Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| StepOne Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 | |
| SterilGARD biosafety cabinet | The Baker Company | SG403A-HE | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| T98-G | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1690 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4324018 | |
| Temozolomide | Tocris Bioscience | 2706 | |
| Tissue-Tek optimum cutting temperature | Fisher Scientific | NC9636948 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Lysis reagent |
| U251-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-17 | |
| U87-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-14 | |
| ViraPower Lentivector Expression system | Thermo Fisher Scientific | K4970-00 | |
| Water, HPLC grade | Fisher | W54 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 |
References
- Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
- Esteller, M.
- Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach. Scientific Reports. 8, 4767 (2018).
- Calin, G. A., et al. Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).
- Croce, C. M. Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer. Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).
- Ambros, V. miRNAs: tiny regulators with great potential. Cell. 107, 823-826 (2001).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).
- He, L., et al. A miRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435, 828-833 (2005).
- Santos, M. C., et al. miR-124, −128, and −137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network. Stem Cells. 34, 220-232 (2016).
- Bhaskaran, V., et al. The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma. Nature Communications. 10 (1), 442 (2019).
- Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs. Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).
- Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray. Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).
- Silber, J., et al. miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells. BMC Medicine. 6 (14), (2008).
- Hester, M. E., et al. Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency. PLoS ONE. 4 (9), e7044 (2009).
- Hsieh, J., et al. IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes. Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
- Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. The miRNA.org resource: targets and expression. Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).
- Wong, N., Wang, X. miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations. Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).
- Vlachos, I. S., et al. DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).
- Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization. Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).
- Aken, B. L., et al.
- Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from miRNA sequences to function. Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).
- Lorenz, R., et al.
- Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812 (2017).
- Crommentuijn, M. H., et al. Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma. Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).
- Ivey, K. N., Srivastava, D. MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions. Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).
- Han, J., et al. Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex. Cell. 125, 887-901 (2006).
- Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs. Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).
- Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron. Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).
- Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector. PLoS ONE. 6 (7), e22437 (2011).
- Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection. Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).
