Summary
Hier wird ein Protokoll zur Charakterisierung von Modulen biologisch synergistischer miRNAs und deren Montage in kurze Transgene beschrieben, das eine gleichzeitige Überexpression für Gentherapieanwendungen ermöglicht.
Abstract
Die biologische Relevanz von microRNAs (miRNAs) in Gesundheit und Krankheit hängt signifikant von spezifischen Kombinationen vieler gleichzeitig deregulierter miRNAs ab und nicht von der Wirkung einer einzelnen miRNA. Die Charakterisierung dieser spezifischen miRNAs-Module ist ein grundlegender Schritt zur Maximierung ihrer Anwendung in der Therapie. Dies ist äußerst relevant, da ihre kombinatorischen Eigenschaften praktisch ausgenutzt werden können. Hier wird eine Methode beschrieben, um eine spezifische miRNA-Signatur zu definieren, die für die Kontrolle von onkogenen Chromatin-Repressoren bei Glioblastom relevant ist. Der Ansatz definiert zunächst eine allgemeine Gruppe von miRNAs, die bei Tumoren im Vergleich zu normalem Gewebe dereguliert werden. Die Analyse wird durch differenzielle Kulturbedingungen weiter verfeinert, was eine Untergruppe von miRNAs unterstreicht, die gleichzeitig während bestimmter Zellzustände mitexprimiert werden. Schließlich werden die miRNAs, die diese Filter zufriedenstellen, zu einem künstlichen polycistronischen Transgenes kombiniert, das auf einem Gerüst natürlich vorhandener miRNA-Clustergene basiert und dann zur Überexpression dieser miRNA-Module in empfangende Zellen verwendet wird.
Introduction
miRNAs bieten eine unübertroffene Möglichkeit für die Entwicklung eines breiten Gentherapie-Ansatzes für viele Krankheiten1,2,3, einschließlich Krebs4,5. Dies basiert auf mehreren einzigartigen Merkmalen dieser biologischen Moleküle, einschließlich ihrer kleinen Größe6, einfache Biogenese7, und natürliche Tendenz, in Assoziation zu funktionieren8. Viele Krankheiten sind durch spezifische miRNA-Expressionsmuster gekennzeichnet, die oft auf die Regulierung komplexer biologischer Funktionen konvergieren9. Der Zweck dieser Methode ist zunächst eine Strategie zu definieren, um Gruppen von miRNAs zu identifizieren, die synergistisch relevant für bestimmte zelluläre Funktionen sind. Folglich bietet sie eine Strategie für die Wiederherstellung solcher miRNA-Kombinationen in nachgelagerten Studien und Anwendungen.
Diese Methode ermöglicht die funktionelle Analyse mehrerer miRNAs auf einmal, indem sie ihre gleichzeitige Ausrichtung auf eine große Anzahl von mRNAs nutzt und so die komplexen Landschaften von Krankheiten rekapituliert. Dieser Ansatz wurde vor kurzem verwendet, um eine Gruppe von drei miRNAs zu definieren, die 1) gleichzeitig bei Hirntumor enregulierung sind und 2) ein starkes Ko-Expressionsmuster während der neuronalen Differenzierung sowie als Reaktion auf genotoxischen Stress durch Strahlung oder DNA-Alkylierungsmittel. Die kombinatorische Reexpression dieses Moduls von drei miRNAs durch die unten beschriebene Clustering-Methode führt zu tiefgreifenden Eingriffen in die Biologie von Krebszellen und kann leicht als Gentherapiestrategie für präklinische Studien verwendet werden10. Dieses Protokoll kann für diejenigen von besonderem Interesse sein, die an der miRNA-Forschung und ihren translationalen Anwendungen beteiligt sind.
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Protocol
1. Charakterisierung von funktional assoziierten miRNAs bei Glioblastom
- Analyse der breiten differentialen miRNA-Expression bei Glioblastom vs. Gehirn
- Bestimmen Sie zunächst die am deutlichsten deregulierten miRNAs im Tumor. Dies kann mit mindestens drei verschiedenen Methoden erreicht werden:
- Mine the Cancer Genome Atlas, gefunden in https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, zur Sequenzierung von Daten11.
- Führen Sie eine Mikroarray-Analyse von einer frischen operativen Probe12durch.
- Verwenden Sie zuvor veröffentlichte Datasets13.
HINWEIS: Unabhängig davon, welche Methode gewählt wird, stellt die Ausgabe einen Massensatz von miRNAs bereit, deren Ausdruck statistisch (entweder direkt oder umgekehrt) mit der Tumorbiologie korreliert. Diese anfängliche Gruppe bildet den Pool von miRNAs, die weiter analysiert werden, um eine Teilmenge von miRNAs zu identifizieren, die die strengste funktionelle Assoziation anzeigen, indem eine dynamischere Analyse von Ausdrucksänderungen durchgeführt wird, wie unten erläutert.
- Bestimmen Sie zunächst die am deutlichsten deregulierten miRNAs im Tumor. Dies kann mit mindestens drei verschiedenen Methoden erreicht werden:
- Bedingungsspezifische miRNA-Expressionsanalyse
- Induktion der Zelldifferenzierung:
- Verwenden Sie vorbeschichtete Poly-D-Lysin (PDL) Kunststoffschalen, um die Bildung einer Monolayer-Kultur zu begünstigen. Für die Schalenbeschichtung PDL in Wasser in einer Konzentration von 100 g/ml auflösen. Verwenden Sie 1 ml Lösung pro 25 cm2 Oberfläche. 2x mit PBS 6 h nach Anwendung der PDL-Lösung abspülen.
- Platte menschliche neuronale Stammzellen in gleichen Mengen (100.000 Zellen/5 ml) entweder im Stammzellmedium (neurobasales Medium + B27-Ergänzung + 20 ng/mL EGF/FGF), astrozytäres Differenzierungsmedium (DMEM + 10% FBS) oder neuronales Differenzierungsmedium (neurobasales Medium + B27 Ergänzung, + 2 M Retinsäure)14. Das Protokoll für Oligodendrozyten Differenzierung erfordert Zugabe von IGF-1 (200 ng/mL) nach EGF/FGF Entfernung14,15.
- Nach der Zellbeschichtung 1 Woche bei 37 °C, 5%CO2in den Inkubator geben.
- RNA-Extraktion:
- Entfernen Sie nach 7 Tagen die Zellen aus dem Inkubator und entfernen Sie das Medium.
- Waschen Sie die Zellen mit PBS (5 ml). Fügen Sie dann 1 ml Lysereagenz (siehe Materialtabelle) hinzu, um die Zellen zu lysieren und die Zellen mit einem Zellschaber in ein 1,5 ml Mikrofugerohr zu zerkleinern. Bewahren Sie die Rohre, die die lysierten Zellen enthalten, bei Raumtemperatur (RT) 5 min aufbewahren.
- Fahren Sie mit der vollständigen RNA-Isolierung gemäß den Anweisungen des Herstellers fort.
- miRNA-Expressionsanalyse:
- Quantifizieren Sie die differenzielle Expression spezifischer miRNAs, die in Schritt 1.1 unter den drei Differenzierungsmustern durch Echtzeit-PCR identifiziert wurden, mit Hilfe von TaqMan-Sonden und nach den Protokollen des Herstellers für Reverse Transkription und PCR-Verstärkung ( Abbildung 1).
- Induktion der Zelldifferenzierung:
- Validierung von miRNA-Clustern durch stressspezifische Herausforderungen
- Kultur G34 Glioblastom Stamm-ähnliche Zellen in neurobasalen Medium + B27 Ergänzung + 20 ng/mL EGF/FGF. Beginnen Sie mit 1 x 106 Zellen in 5 ml in einem 25 cm2 niedrigen Befestigungskolben.
- Ab 48 h nach der Beschichtung, fügen Sie die Verdoppelung der Konzentrationen des DNA-Alkylierungsmittels Temozolomid (TMZ) alle 5 Tage wie folgt hinzu:
- Beginnen Sie mit 5 m für 5 Tage. Nach 5 Tagen, entfernen Sie das Medium und ersetzen Sie mit frischem Medium ohne Temozolomid, damit die überlebenden Zellen sich erholen können. Nach 48 h 10 'M TMZ hinzufügen und weitere 5 Tage brüten.
- Wiederholen Sie Schritt 1.3.2.1, wobei die TMZ-Konzentration jedes Mal verdoppelt wird, bis eine Konzentration von mindestens 100 m erreicht ist und die Zellen gegen das Medikament10resistent werden.
- Bestrahlen Sie in einem parallelen Experiment G34-Zellen wie folgt:
- Ab 48 h nach der Beschichtung von 1 x 106 Zellen in 5 ml in einem 25 cm2 Niedrigbefestigungskolben, bestrahlen Zellen mit 2 Gy Energie (jeder Bestrahlungskörper, der Photonenemission liefert, ist akzeptabel). Geben Sie die Zellen in den Inkubator zurück und stören Sie nicht. Nach 48 h die Zellen wieder mit zusätzlichen 2 Gy Energie bestrahlen.
- Wiederholen Sie Schritt 1.3.3.1 4x, bis insgesamt 10 Gy Energie verabreicht wird.
- Geben Sie die Zellen in den Inkubator zurück und lassen Sie sie sich mindestens 5 Tage vor der nachgelagerten Analyse in frischem Medium erholen.
- Nach der Induktion der Resistenz, Lyse-Zellen mit Lyse-Reagenz und extrahieren gesamt RNA nach dem Herstellerprotokoll.
- Analysieren Sie die Expression der spezifischen miRNAs, die in den Abschnitten 1.1-1.2 identifiziert sind, wie in Schritt 1.2.1 (Abbildung 2) beschrieben.
- Charakterisierung der funktionalen Konvergenz von gruppierten miRNAs
- Erhalten Sie das vorhergesagte Targetome jedes miRNAs, das in den Abschnitten 1.2-1.3 definiert ist, die mit miRNA-Targeting-Vorhersagewerkzeugen erhalten wurden.
HINWEIS: Wir greifen in der Regel auf TargetScan zurück, da sein Algorithmus regelmäßig aktualisiert wird16. Weitere Vorhersagetools sind miRanda17, miRDB18und DIANA-miRPath19. Alle diese Programme sind kostenlose, webbasierte Anwendungen.- Wählen Sie auf der Titelseite von Targetscan die miRNA aus dem vorab ausgefüllten Dropdown-Menü aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Senden.
- Laden Sie die resultierende Liste der Ziele als Tabellenkalkulation mithilfe des Link Tabelle herunterladen herunter (ergänzende Abbildung 1).
- Um die Wahrscheinlichkeit falsch positiver Vorhersagen zu verringern, beziehen Sie nur Ziele innerhalb der Spalte "Konservierte Standorte" in nachgelagerte Analysen ein. Darüber hinaus kann eine weitere Stringenz durch die Verwendung zusätzlicher miRNA-Vorhersageprogramme (siehe oben) und nur mit Zielen erreicht werden, die allen Algorithmen gemeinsam sind.
- Klassifizieren Sie die resultierenden Targetome nach Gene Ontology Kategorien mit ToppGene Suite20, um die Anreicherung von Pfaden zu bewerten, die jeder miRNA gemeinsam sind.
- Fügen Sie die Liste der Ziele, die aus Schritt 1.4.1 stammen, in das Fenster "Training gene set" ein, indem Sie das HGNC-Symbol als Eintragstyp verwenden. Klicken Sie auf Senden > Starten. Das Programm stellt eine Ausgabetabelle mit den wichtigsten "Go"-Kategorien für die eingegebene Liste der Gene bereit (Ergänzende Abbildung 2).
- Um schließlich den Beitrag jeder miRNA zur Regulierung eines gemeinsamen Signalwegs oder zellulären Prozesses (in diesem Fall der Chromatinregulation) zu ermitteln, überprüfen Sie jedes in Schritt 1.4.1 erhaltene Targetome anhand der vollständigen Liste der Gene, die am spezifischen zellulären Prozess beteiligt sind ( z.B. Chromatinregulation), mit der Venn-Diagrammfunktion, die auf der Website bioinformatics and Evolutionary Genomics http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn bereitgestellt wird.
HINWEIS: Dieses Programm ermöglicht den Schnittpunkt mehrerer Gruppen gleichzeitig (Abbildung 3). Die spezifischen einzigartigen Ziele, die von jeder miRNA zur Verfügung gestellt werden, werden dann mit Anmerkungen versehen und für nachgelagerte funktionelle Experimente ausgewählt.- Laden Sie auf der Startseite des Programms die Liste hoch oder kopieren/kleben Sie sie, wenn Sie die Ziel-mRNAs für jede miRNA oder das Interesse an den jeweiligen Fenstern ansprechen. Benennen Sie jede Liste mit einem eindeutigen Bezeichner.
- Klicken Sie auf Senden. Das Programm wird eine visuelle Ausgabe eines Venn-Diagramms mit einer Anzahl von Genen in jedem Sektor sowie eine vollständige Liste der mRNAs für jede Teilmenge und Schnittpunktkombinationen bereitstellen.
- Erhalten Sie das vorhergesagte Targetome jedes miRNAs, das in den Abschnitten 1.2-1.3 definiert ist, die mit miRNA-Targeting-Vorhersagewerkzeugen erhalten wurden.
2. Montage von miRNA-Modulen in einen polycistronischen Transgenen Cluster
-
Herstellung eines transgenen Gerüsts auf Basis von miR-17-92 Cluster-Lokus
- Die Nukleotidsequenz des miR-17-92-Clusters beziehen Sie sich über den Ensembl Genombrowser21. Wählen Sie die Sequenz "Kern" des Basispaares mit der Basispaarsequenz aus, die alle sechs codierten miRNA-Haarnadeln des Locus und mindestens 200-Nukleotid-Flankensequenzen sowohl vor- (5') als auch nachgeschaltet (3') der Kernsequenz umfasst.
- Fügen Sie die Sequenz oben in ein beliebiges Wortbearbeitungsprogramm ein.
- Definieren Sie die Reihenfolge jeder der sechs nativen Haarnadeln, indem Sie sie in miRBase22abrufen. Markieren Sie jede dieser Sequenzen innerhalb der zuvor identifizierten "Kernsequenz". Alle Sequenzen zwischen den einzelnen Haarnadeln stellen Abstandssequenzen dar, die für die korrekte Verarbeitung des Transgens wichtig sind.
- Entfernen Sie die nativen Haarnadelsequenzen aus der "Kern"-Sequenz, mit Ausnahme von 3-5 Nukleotiden an den 5' und 3' Enden jeder Haarnadel, die als Akzeptor für die neuen Haarnadeln dienen.
-
Erstellen einer neuen Transgencodierung mehrerer miRNAs der Wahl
- Erhalten Sie Haarnadelsequenzen von miRNAs, die im Transgen von miRBase überexprimiert werden sollen. Beachten Sie sorgfältig die spezifischen Nukleotide, die die Standorte der Mikroprozessorspaltung sind.
- Ersetzen Sie die entfernten Haarnadeln (Schritt 2.1.4) durch die Haarnadelsequenzen der gewünschten miRNAs, die in Schritt 2.2.1 erhalten wurden.
- Fügen Sie gewünschte Restriktionssequenzen an beiden flankierenden Bereichen des Transgens hinzu, um das Subklonen in Dietionsvektoren ihrer Wahl zu erleichtern. Stellen Sie sicher, dass die ausgewählten Einschränkungssequenzen nicht innerhalb der Sequenz selbst vorhanden sind.
- Für negative Kontrollen verwenden Sie 20-Nukleotid-Scrambled-Sequenzen, um die natürliche 20-Nukleotid-Sequenz jeder reifen miRNA zu ersetzen. Generieren Sie diese verschlüsselten Sequenzen mit einem Online-Tool wie https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence.
-
Überprüfung der zweidimensionalen Struktur des Transgens
- Kopieren Sie die vollständige transgene Sequenz in das RNA-Strukturvorhersage-Softwareprogramm RNAweb Fold23.
- Klicken Sie unter Verwendung der Standardprogrammeinstellungen auf Fortfahren.
- Analysieren Sie die grafische Ausgabe, insbesondere für das Vorhandensein von gut definierten Haarnadeln und das Vorhandensein von doppelsträngigen Stammstrukturen mindestens 11 Nukleotide proximal zur Mikroprozessorspaltungsstelle. Achten Sie auch auf das Fehlen von Verzweigungspunkten innerhalb der Haarnadelsequenzen (Abbildung 4).
3. Erhalt von Transgenen durch DNA-Synthese
- Nach dem Entwurf und in der Silico-Validierung des chimeric miRNA Clusters erhalten Sie die Arbeitssequenz mittels DNA-Synthese von kommerziellen Anbietern24 und gehen Sie mit nachgelagertem Klonen in Vektoren und Transgenabgabe fort. Wir haben lentivirale Vektoren für die In-vitro-Verabreichung10 und Adeno-assoziierte Viren (AAVs) für die intrakranielle In-vivo-Verabreichung25verwendet.
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Representative Results
Diese Methode ermöglichte die Charakterisierung eines Moduls von drei miRNAs, die bei Hirntumoren konsequent downreguliert werden, die speziell während der neuronalen Differenzierung koexprimiert werden (Abbildung 1) und an der Tumorüberlebensreaktion nach Therapie (Abbildung 2). Dies wird durch die Regulierung eines komplexen onkogenen Chromatin-Repressionswegs erreicht. Dieses Co-Expressions-Muster deutete auf eine starke synergistische Aktivität unter diesen drei miRNAs hin (Abbildung 3). Unter Ausnutzung der geringen Größe und einfachen Biogenese von miRNAs wurde der zweite Teil dieses Protokolls verwendet, um ein Transgen zu entwerfen (Abbildung 4), das gleichzeitig die Expression der drei miRNAs in Glioblastomzellen rekapitulieren könnte. sowohl in vitro als auch in vivo, mit erheblichen Eingriffen in die Tumorbiologie und vielversprechender translationaler Anwendbarkeit (Abbildung 5A,B,C)10. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass der transgene Cluster auch in einem Brustkrebsmodell funktionsfähig ist (Abbildung 5D,E).
Abbildung 1: Charakterisierung eines funktionellen miRNA-Moduls bei Glioblastom. (A) Vulkandiagramm, das die differenziell exprimierten miRNAs in humanen Glioblastomproben (n = 516) im Vergleich zum normalen Gehirn (n = 10) darstellt, die aus TCGA gewonnen wurden. In grün sind miRNAs mit >4-facher Differenz. Der rote Kreis stellt die 10 am stärksten herunterregulierten miRNAs bei Glioblastom dar. (B) Relative Expression der 10 miRNAs, die in (A) während der Induktion verschiedener Differenzierungswege in neuronalen Stammzellen ausgewählt wurden, was eine klare Aufregulationsregulation der Module miR-124, miR-128 und miR-137 während der Induktion der neuronalen Differenzierung zeigt. Mittelwert sD aus drei biologischen Replikationen (*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001; Schüler-T-Test, zweischwanzend). Diese Zahl wurde mit Genehmigung von Verweis10geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bestätigung von Co-Expressionsmustern von miRNA-Modulen während genotoxischem Stress. Relative Expression der drei miRNAs, die in Abbildung 1 in mehreren Glioblastomzellen und Zelllinien definiert sind (G62-mesenchymal; MGG4-proneural; U251, U87 pro-neural-like, und T98G mesenchymal-ähnliche Glioblastom-Zelllinien) nach Induktion der Resistenz gegen Temozolomid (TMZ, rosa Balken) oder ionisierende Strahlung (RT, grüne Balken). Gemeldet sind Mittel wertet mit SD aus zwei unabhängigen Replikationen. Diese Zahl wurde mit Genehmigung von Verweis10geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Analyse der funktionellen Konvergenz der Ziele der ko-exprimierte miRNAs. Venn-Diagramm-Ausgabe von der Bioinformatik und Evolutionäre Genomik-Website, gleichzeitig überkreuzt das Zielome der markierten miRNAs mit den mRNAs bilden eine GO-Kategorie von Interesse (in diesem Fall Chromatin-Repressoren). mRNAs, die eindeutig von einzelnen miRNAs ins Visier genommen wurden, wurden für weitere nachgelagerte funktionelle Studien ausgewählt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: 2D-Struktur einer entwickelten miRNA-Sequenz, die den drei miRNAs-Cluster kodiert. Grafische Ausgabe aus dem RNAweb Fold Programm. Beachten Sie das Vorhandensein von drei gut definierten Stammschleifenstrukturen, die die Haarnadeln jeder jeweiligen miRNA (miR-124, miR-128, miR-137) darstellen, die durch das Transgen kodiert sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Nachweis der Transgenverarbeitung und ihrer nachgelagerten biologischen Wirkung. (A) Relative Quantifizierung der miRNA-Expression nach lentiviral-vermittelter Transduktion von G34-Glioblastomzellen mit dem transgenen miRNA-Cluster (Cluster 3) oder Negativkontrolle (Ctrl). Berichtet werden Mittel aus drei unabhängigen Experimenten sD. (B) Fluoreszenzmikroskopbilder von G34-Glioblastom-Kugeln, die negative Kontrolltransgene vs. Cluster-3-Transgen exezieren. Skala bar = 100 m. (C) In vivo Wachstum der intrakraniellen menschlichen G34-Zell-Xenografts, die entweder Kontroll- oder Cluster-3-Transgene exemiten. Skalenstange = 1 mm. Diese Zahl wurde mit Genehmigung10reproduziert. (D) Relative Quantifizierung der miRNA-Expression nach lentiviral-vermittelter Transduktion von MDA-MB-231 Brustkrebszellen mit dem transgenen miRNA-Cluster (Cluster 3) oder Negativkontrolle (Ctrl). (E) Fluoreszenzmikroskopbilder von MDA-MB-231 Brustkrebszellen, die negative Kontrolltransgene vs. Cluster-3-Transgene exdrücken. Skalenbalken = 100 m. Alle Experimente wurden in Triplicaten (*p < 0,05; **p < 0,01; Schüler-T-Test, zweischwanzige, mehrfache Vergleiche). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzender Abbildung 1: TargetScan-Workflow. (A) Homepage-Screenshot mit Auswahloptionen für die miRNA-Suche. (B) Repräsentative Suchergebnisse für miR-137. Die Liste der Zielgene befindet sich in der linken Spalte. Red Box bezeichnet Gene mit konservierten Targeting-Sites (was auf ein höheres Vertrauen in echtes Targeting hindeutet). Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Ergänzender Abbildung 2: ToppGene Suite-Workflow. (A) Startseite Screenshot zeigt das Suchfeld, in dem die Liste der zu analysierenden Gene eingefügt wird. (B) Repräsentatives Suchergebnis für das miR-137 targetome, das die statistisch bedeutendsten Kategorien der GenOntologie (GO) aufzeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
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Discussion
Dieses Protokoll basiert auf der Vorstellung, dass miRNAs, anstatt isoliert zu funktionieren, biologisch relevant sind, indem sie in Gruppen arbeiten, und diese Gruppen werden transkriptionsweise durch spezifische zelluläre Kontexte bestimmt26. Um diesen Ansatz aus einer translationalen Perspektive zu rechtfertigen, wird ein Follow-up-Protokoll eingeführt, das die Nachbildung dieses Multi-miRNA-Musters in Zellen/Geweben ermöglicht. Dies ist möglich durch die relativ einfache Biogenese von miRNAs, wobei die Erkennung der charakteristischen miRNA-Haarnadel durch Mikroprozessor notwendig und ausreichend für die korrekte miRNA-Verarbeitungist 27. Gleichzeitig ermöglicht diese minimale Anforderung die Verwendung des genetischen Gerüstes natürlich vorkommender miRNA-Cluster als Rückgrat für die Expression der gewünschten miRNA-Module, die in kurzen DNA-Sequenzen enthalten sind, die in beliebige Liefervektoren eingepasst werden können. der Wahl. Die Hauptanforderung dieses Protokolls ist die Aufrechterhaltung der Haarnadelstruktur und der ausreichenden Länge der Stammkomponente, um eine angemessene Spaltung zu ermöglichen.
Es gibt zwei wichtige kritische Überlegungen zur Ausführung dieses Protokolls. Der erste Punkt ist die genaue Bestimmung der optimalen miRNA-Kombinationen. Dies wird durch eine sorgfältige Analyse nicht nur der miRNA-Expressionssignatur von Zellen oder Geweben im Vergleich zu Kontrollen bestimmt, sondern auch von gleichzeitigen Expressionsänderungen, die beobachtet werden, wenn die Zellen experimentell manipuliert werden. Sobald ein Satz von miRNAs definiert ist, ist es auch von grundlegender Bedeutung, festzustellen, dass die künstliche Modulation jedes Einzelnen den Ausdruck der anderen nicht ändert.
Der zweite kritische Aspekt betrifft die Konstruktion von chimerischen Sequenzen, um dieses funktionelle miRNA-Clustering künstlich zu rekapitulieren. Es ist von grundlegender Bedeutung, die strukturellen Anforderungen der miRNA-Verarbeitungsmaschinerie einzuhalten, d. h. das Vorhandensein einer ausreichend langen Stammsequenz (Messung von mindestens 11 Nukleotiden) am Ursprung jeder miRNA-Haarnadel18,sowie die Aufrechterhaltung der ursprünglichen Abstandssequenzen des nativen miRNA-Clustergerüsts. Nach unserer Erfahrung hat die Erfüllung dieser beiden Anforderungen konsequent zu einer angemessenen RNA-Faltung geführt (Abbildung 4) und zu einer erfolgreichen Multi-miRNA-Expression geführt.
Die Hauptbeschränkung dieser Technik ist die endliche Anzahl von miRNAs, die zu einem funktionellen Transgen zusammengefasst werden können. Wir haben erfolgreich Sequenzen entwickelt, die bis zu sechs verschiedene miRNAs überexzättigen, aber eine gewisse Abnahme der Verarbeitungseffizienz beobachtet, wenn die Anzahl der Haarnadeln zunimmt. Bisher wurde die genetische Struktur des miR-17-92-Clusters verwendet, da es diejenige ist, die die höchste Anzahl von Haarnadeln (sechs) innerhalb der kürzesten DNA-Sequenz (ca. 800 Basenpaare)kodiert 8. Da es andere natürliche miRNA-Cluster gibt, wird erwartet, dass sie auch für diesen Zweck verwendet werden könnten28. Schließlich wurde beobachtet, dass die Änderung der Abstandssequenzen zwischen den Haarnadeln ihre Verarbeitung verringert, so dass es einige Einschränkungen in Bezug darauf gibt, inwieweit die native Struktur geändert werden kann.
Der bedeutendste und vorteilhafteste Aspekt dieser vorgeschlagenen Methode ist, dass sie die Konstruktion von Transgenen ermöglicht, die in der Lage sind, mehrere gewünschte miRNAs gleichzeitig mit einem in silico Ansatz zu überexprimieren, wodurch der Bedarf an mühsamen und zeitaufwändige molekulare Klonschritte, wie zuvor beschrieben29,30,31. Das beschriebene Protokoll ist einfach auszuführen und erfordert keine spezielle Ausrüstung oder Fähigkeiten.
Angesichts der anerkannten Bedeutung von miRNAs in der Molekularbiologie und ihres Potenzials in therapeutischen Anwendungen ist dieses Protokoll für ein großes Forscherpublikum von Interesse. Dieser Ansatz soll zukünftige Studien fördern, die sich auf die kombinatorischen Eigenschaften von miRNAs konzentrieren und als einfaches und robustes Werkzeug für ihre Ausführung dienen werden. Noch wichtiger ist, dass diese gruppierten Transgene ideale Ladungen für Gentherapievektoren darstellen. Beweise für eine erfolgreiche In-vivo-Lieferung eines 3-miRNA-Clusters wurden bereits durch direkte intratumorale intrakranielle Injektion von AAV-Vektoren (unveröffentlichte Daten) erterfolgt. Es wird daher erwartet, dass diese Technik die translationalen Aspekte der miRNA-Forschung deutlich steigern wird.
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Disclosures
Die Autoren berichten von keinen Interessenkonflikten.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei den Mitgliedern des Harvey Cushing Neuro Oncology Laboratory für die Unterstützung und konstruktive Kritik. Diese Arbeit wurde durch die NINDS-Zuschüsse K12NS80223 und K08NS101091 an P. P. unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% low melting temperature agarose | IBI Scientific | IB70058 | |
| 0.45 µM sterile filter unit | Merck Millipore | SLH033RS | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431081 | |
| 6-Well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Athymic mice (FoxN1 nu/nu) | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| Cell culture flask | Greiner Bio-One | 660175 | |
| Cell Scraper, 16cm | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cesium 137 irradiator | JL Sheperd and Associates | Core Facility (Harvard Medical School) | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 439142-4L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11995040 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Eosin Y solution | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEK-293 | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1573 | |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | 1051750500 | |
| Human primary glioma stem-like cells (GBM62) | Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Human primary glioma stem-like cells (MGG4) | Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) | ||
| Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP | System Biosciences | CD511B-1 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Microcentrifuge refrigerated | Eppendorf | model no. 5424 R, cat. no.5404000138 | |
| Mounting medium | Thermo Fisher Scientific | 4112APG | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3117-0380PK | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000c | |
| Neural Progenitor cells (NPC) | Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system | Nikon, Japan | 14314 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985088 | |
| PCR tubes | Sigma-Aldrich | CLS6571-960EA | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri-Dishes 94/16 | Greiner Bio-One | 632180 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma- Aldrich | P4707 | |
| Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | AF-100-18B | |
| Retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| RNA Miniprep Kit | Direct-zol | R2050 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | |
| Small Animal Image-Guided Micro Irradiator | Xstrahal Life Sciences, UK | Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA) | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75000100 | |
| StemPro Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| StepOne Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 | |
| SterilGARD biosafety cabinet | The Baker Company | SG403A-HE | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| T98-G | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1690 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4324018 | |
| Temozolomide | Tocris Bioscience | 2706 | |
| Tissue-Tek optimum cutting temperature | Fisher Scientific | NC9636948 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Lysis reagent |
| U251-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-17 | |
| U87-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-14 | |
| ViraPower Lentivector Expression system | Thermo Fisher Scientific | K4970-00 | |
| Water, HPLC grade | Fisher | W54 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 |
References
- Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
- Esteller, M.
- Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach. Scientific Reports. 8, 4767 (2018).
- Calin, G. A., et al. Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).
- Croce, C. M. Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer. Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).
- Ambros, V. miRNAs: tiny regulators with great potential. Cell. 107, 823-826 (2001).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).
- He, L., et al. A miRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435, 828-833 (2005).
- Santos, M. C., et al. miR-124, −128, and −137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network. Stem Cells. 34, 220-232 (2016).
- Bhaskaran, V., et al. The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma. Nature Communications. 10 (1), 442 (2019).
- Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs. Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).
- Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray. Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).
- Silber, J., et al. miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells. BMC Medicine. 6 (14), (2008).
- Hester, M. E., et al. Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency. PLoS ONE. 4 (9), e7044 (2009).
- Hsieh, J., et al. IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes. Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
- Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. The miRNA.org resource: targets and expression. Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).
- Wong, N., Wang, X. miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations. Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).
- Vlachos, I. S., et al. DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).
- Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization. Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).
- Aken, B. L., et al.
- Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from miRNA sequences to function. Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).
- Lorenz, R., et al.
- Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812 (2017).
- Crommentuijn, M. H., et al. Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma. Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).
- Ivey, K. N., Srivastava, D. MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions. Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).
- Han, J., et al. Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex. Cell. 125, 887-901 (2006).
- Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs. Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).
- Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron. Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).
- Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector. PLoS ONE. 6 (7), e22437 (2011).
- Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection. Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).
