Summary
Aquí se describe un protocolo para caracterizar módulos de miRNAs biológicamente sinérgicos y su ensamblaje en transgenes cortos, lo que permite la sobreexpresión simultánea para aplicaciones de terapia génica.
Abstract
La relevancia biológica de los microARN (miRNAs) en salud y enfermedad se basa significativamente en combinaciones específicas de muchos miRNAs desregulados simultáneamente en lugar de la acción de un solo miRNA. La caracterización de estos módulos miRNAs específicos es un paso fundamental para maximizar su uso en la terapia. Esto es extremadamente relevante porque sus atributos combinatoriales pueden ser prácticamente explotados. Aquí se describe un método para definir una firma específica de miRNA relevante para el control de los represores de cromatina oncogénica en el glioblastoma. El enfoque define primero un grupo general de miRNAs que se desreglamentan en los tumores en comparación con el tejido normal. El análisis se perfecciona aún más mediante condiciones de cultivo diferencial, subrayando un subgrupo de miRNAs que se expresan simultáneamente durante estados celulares específicos. Por último, los miRNAs que satisfacen estos filtros se combinan en un transgenes policistrónicos artificiales, que se basa en un andamio de genes de agrupaciones de miRNA naturalmente existentes, luego se utilizan para la sobreexpresión de estos módulos de miRNA en las células receptoras.
Introduction
los miRNAs ofrecen una oportunidad inigualable para el desarrollo de un enfoque amplio de terapia génica para muchas enfermedades1,2,3, incluyendo el cáncer4,5. Esto se basa en varias características únicas de estas moléculas biológicas, incluyendo su pequeño tamaño6, biogénesis simple7,y tendencia natural a funcionar en la asociación8. Muchas enfermedades se caracterizan por patrones específicos de expresión de miRNA, que a menudo convergen en la regulación de funciones biológicas complejas9. El propósito de este método es primero definir una estrategia para identificar grupos de miRNAs que son sinérgicamente relevantes para funciones celulares específicas. En consecuencia, proporciona una estrategia para el restablecimiento de tales combinaciones de miRNA en estudios y aplicaciones posteriores.
Este método permite el análisis funcional de múltiples miRNAs a la vez, aprovechando su segmentación simultánea de un gran número de ARNm, recapitulando así los complejos paisajes de las enfermedades. Este enfoque se ha empleado recientemente para definir un grupo de tres miRNAs que 1) están simultáneamente regulados en cáncer cerebral y 2) muestran un fuerte patrón de coexpresión durante la diferenciación neuronal, así como en respuesta al estrés genotóxico por radiación o un Agente alquilante de ADN. La re-expresión combinatoria de este módulo de tres miRNAs por el método de agrupación que se describe a continuación da lugar a una profunda interferencia con la biología de las células cancerosas y se puede utilizar fácilmente como estrategia de terapia génica para estudios preclínicos10. Este protocolo puede ser de particular interés para los involucrados en la investigación de miRNA y sus aplicaciones traslacionales.
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Protocol
1. Caracterización de los miRNAs asociados funcionalmente en el Glioblastoma
- Análisis de la expresión diferencial amplia de miRNA en glioblastoma vs.
- En primer lugar, determinar los MIRNAs más significativamente desregulados en el tumor. Esto se puede lograr utilizando al menos tres métodos diferentes:
- Mina el Atlas del Genoma del Cáncer, encontrado en https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, para la secuenciación de datos11.
- Realizar análisis de microarray a partir de una nueva muestra operativa12.
- Utilice conjuntos de datos publicados anteriormente13.
NOTA: Cualquiera que sea el método elegido, la salida proporciona un conjunto masivo de miRNAs cuya expresión está estadísticamente correlacionada (ya sea directa o inversamente) con la biología tumoral. Este grupo inicial constituye el grupo de miRNAs que se analizan más a fondo para la identificación de un subconjunto de miRNAs que muestra la asociación funcional más estricta mediante la realización de un análisis más dinámico de los cambios de expresión, como se describe a continuación.
- En primer lugar, determinar los MIRNAs más significativamente desregulados en el tumor. Esto se puede lograr utilizando al menos tres métodos diferentes:
- Análisis de expresión de miRNA específico de la condición
- Inducción de la diferenciación celular:
- Utilice platos de plástico de poli-d-lisina (PDL) pre-recubiertos para favorecer la formación de un cultivo monocapa. Para el recubrimiento de platos, disolver PDL en agua a una concentración de 100 g/ml. Utilizar 1 ml de solución por superficie de 25 cm2. Enjuague 2x con PBS 6 h después de la aplicación de la solución PDL.
- Placa de células madre neuronales humanas en cantidades iguales (100.000 células/5 ml) ya sea en medio de células madre (medio neurobasal + suplemento B27 + 20 ng/mL EGF/FGF), medio de diferenciación astrocítica (DMEM + 10% FBS), o medio de diferenciación neuronal (medio neurobasal + B27 suplemento, +2 m de ácido retinoico)14. El protocolo para la diferenciación de oligodendrocitos requiere la adición de IGF-1 (200 ng/mL) después de la eliminación de EGF/FGF14,15.
- Después del revestimiento de celdas, colóquelo en la incubadora durante 1 semana a 37oC, 5% CO2.
- Extracción de ARN:
- Después de 7 días, retire las células de la incubadora y retire el medio.
- Lavar las células con PBS (5 ml). A continuación, agregue 1 ml de reactivo de lisis (ver Tabla de materiales)para atajar las células y raspar las células en un tubo de microfusión de 1,5 ml utilizando un rascador de células. Mantenga los tubos que contienen las células lysed a temperatura ambiente (RT) durante 5 min.
- Proceda al aislamiento total del ARN siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Análisis de expresión de miRNA:
- Cuantifique la expresión diferencial de miRNAs específicos identificados en el paso 1.1 entre los tres patrones de diferenciación por PCR en tiempo real, utilizando sondas TaqMan y siguiendo los protocolos del fabricante para la transcripción inversa y la amplificación de PCR ( Figura 1).
- Inducción de la diferenciación celular:
- Validación de clústeres de miRNA por desafíos específicos del estrés
- Cultivo G34 glioblastoma células similares a un tallo en medio neurobasal + suplemento B27 + 20 ng/mL EGF/FGF. Comience con 1 x 106 células en 5 ml en un matraz de 25 cm2 de baja fijación.
- A partir de 48 h después del enchapado, añada concentraciones duplicados de agente alquilante de ADN temozolomida (TMZ) cada 5 días, de la siguiente manera:
- Comience con 5 m durante 5 días. Después de 5 días, retire el medio y reemplácelo por medio fresco sin temozolomida, para permitir que las células supervivientes se recuperen. Después de 48 h, añadir 10 m TMZ e incubar durante otros 5 días.
- Repita el paso 1.3.2.1, duplicando la concentración de TMZ cada vez, hasta que se alcance una concentración de al menos 100 m y las células se vuelvan resistentes al fármaco10.
- En un experimento paralelo, irradiar células G34 de la siguiente manera:
- A partir de 48 h después de chapar 1 x 106 células en 5 ml en un matraz de 25 cm2 de baja fijación, irradiar células con 2 Gy de energía (cualquier irradiador que proporcione emisión de fotones es aceptable). Devuelva las células a la incubadora y no moleste. Después de 48 h, irradiar las células de nuevo con 2 Gy adicionales de energía.
- Repita el paso 1.3.3.1 4x hasta que se administre un total de 10 Gy de energía.
- Devuelva las células a la incubadora y deje que se recuperen en medio fresco durante al menos 5 días antes del análisis posterior.
- Después de la inducción de la resistencia, las células de la lyse usando reactivo de lisis y extraer ARN total de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Analice la expresión de los miRNAs específicos identificados en las secciones 1.1-1.2 como se describe en el paso 1.2.1(Figura 2).
- Caracterización de la convergencia funcional de los miRNAs agrupados
- Obtenga el targetome previsto de cada miRNAs definido en las secciones 1.2-1.3 obtenidas mediante herramientas de predicción de segmentación de miRNA.
NOTA: Generalmente recurrimos a TargetScan, ya que su algoritmo se actualiza periódicamente16. Las herramientas de predicción adicionales son miRanda17, miRDB18y DIANA-miRPath19. Todos estos programas son aplicaciones gratuitas basadas en la web.- En la página principal de Targetscan, seleccione el miRNA de interés en el menú desplegable rellenado previamente. Haga clic en el botón Enviar.
- Descargue la lista resultante de destinos como hoja de cálculo mediante el vínculo Descargar tabla (Figura complementaria 1).
- Para reducir las posibilidades de predicciones falsas positivas, incluya solo los destinos dentro de la columna de sitios conservados en los análisis posteriores. Además, se puede obtener más rigáscencia mediante el uso de programas de predicción de miRNA adicionales (ver arriba) y sólo incluyendo objetivos que son comunes a todos los algoritmos.
- Clasificar los targetomes resultantes de acuerdo con las categorías de Gene Ontology usando ToppGene Suite20 para evaluar el enriquecimiento de las vías que son comunes a cada miRNA.
- Pegue la lista de objetivos obtenidos del paso 1.4.1 en la ventana "Conjunto de genes de entrenamiento", utilizando el símbolo HGNC como tipo de entrada. Haga clic en Enviar > Inicio. El programa proporcionará una tabla de salida que muestra las categorías "Go" más significativas para la lista introducida de genes(Figura Suplementaria 2).
- Para establecer finalmente la contribución de cada miRNA a la regulación de una vía común o proceso celular (en este caso, regulación de la cromatina), compruebe cada targetome obtenido en el paso 1.4.1 contra la lista completa de genes implicados en el proceso celular específico ( es decir, regulación de la cromatina), utilizando la función de diagrama de Venn proporcionada en el sitio web de Bioinformática y Genómica Evolutiva http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn.
NOTA: Este programa permite la intersección de varios grupos al mismo tiempo(Figura 3). Los objetivos únicos específicos proporcionados por cada miRNA se anotan y seleccionan para experimentos funcionales posteriores.- En la primera página del programa, cargue o copie/pegue la lista si los ARNM de destino para cada miRNA o interés en las ventanas respectivas. Asigne un nombre a cada lista con un identificador único.
- Haga clic en Enviar. El programa proporcionará una salida visual de un diagrama de Venn con números de genes en cada sector, así como una lista completa de ARNm para cada subconjunto y combinaciones de intersección.
- Obtenga el targetome previsto de cada miRNAs definido en las secciones 1.2-1.3 obtenidas mediante herramientas de predicción de segmentación de miRNA.
2. Montaje de módulos miRNA en un clúster policistrónico transgénico
-
Preparación de andamios transgénicos basados en el locus de racimo miR-17-92
- Obtenga la secuencia de nucleótidos del clúster miR-17-92 del navegador del genoma de Ensembl21. Seleccione la secuencia de "núcleo" del par base de 800 que abarca las seis horquillas miRNA codificadas del locus y al menos secuencias de flanqueo de 200 nucleótidos tanto aguas arriba (5') como aguas abajo (3') de la secuencia central.
- Pegue la secuencia anterior en cualquier programa de edición de palabras.
- Defina la secuencia de cada una de las seis horquillas nativas recuperándolas en miRBase22. Marque cada una de estas secuencias dentro del intervalo de la secuencia "núcleo" previamente identificada. Cualquier secuencia entre cada horquilla representa secuencias espaciadoras, que son importantes para el correcto procesamiento del transgén.
- Retire las secuencias de horquillas nativas de la secuencia "núcleo", con la excepción de 3-5 nucleótidos en los extremos de 5' y 3' de cada horquilla, que servirán como un aceptador para las nuevas horquillas.
-
Creación de un nuevo transgén que codifica varios miRNAs de elección
- Obtener secuencias de horquillas de miRNAs destinados a ser sobreexpresados en el transgén de miRBase. Tenga en cuenta cuidadosamente los nucleótidos específicos que son los sitios de la escisión del microprocesador.
- Sustituya las horquillas eliminadas (paso 2.1.4) por las secuencias de horquilladeras de los miRNAs deseados obtenidos en el paso 2.2.1.
- Agregue las secuencias de restricción deseadas en ambas regiones flanqueantes del transgén para facilitar la subcloning en vectores de entrega de su elección. Verifique que las secuencias de restricción elegidas no estén presentes dentro de la secuencia sí misma.
- Para controles negativos, utilice secuencias revueltas de 20 nucleótidos para reemplazar la secuencia natural de 20 nucleótidos de cada miRNA maduro. Genere estas secuencias codificadas utilizando una herramienta en línea como https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence.
-
Verificar la estructura bidimensional del transgén
- Copie la secuencia transgénica completa en el programa de software de predicción de estructura de ARN RNAweb Fold23.
- Mediante la configuración estándar del programa, haga clic en Continuar.
- Analizar la salida gráfica, particularmente para la presencia de horquillas bien definidas y la presencia de estructuras de tallo de doble cadena al menos 11 nucleótidos proximales al sitio de escisión del microprocesador. Además, busque la ausencia de puntos de bifurcación dentro de las secuencias de horquilla(Figura 4).
3. Obtención de Transgenes por Síntesis de ADN
- Después del diseño y en la validación en silico del cúmulo de miRNA quimérico, obtenga la secuencia de trabajo utilizando la síntesis de ADN de los proveedores comerciales24 y proceda con la clonación aguas abajo en vectores y entrega de transgénicos. Hemos utilizado vectores lentivirales para la entrega in vitro10 y virus asociados a dedeno (AAVs) para la entrega in vivo intracraneal25.
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Representative Results
Este método permitió la caracterización de un módulo de tres miRNAs que están constantemente regulados en tumores cerebrales, que se expresan específicamente durante la diferenciación neuronal(Figura 1) e implican en la respuesta de supervivencia tumoral después de terapia(Figura 2). Esto se logra mediante la regulación de una vía represiva de cromatina oncogénica compleja. Este patrón de co-expresión sugiere una fuerte actividad sinérgica entre estos tres miRNAs(Figura 3). En consecuencia, aprovechando el pequeño tamaño y la biogénesis simple de los miRNAs, la segunda parte de este protocolo se utilizó para diseñar un transgén(Figura 4) que podría recapitular simultáneamente la expresión de los tres miRNAs en células de glioblastoma, tanto in vitro como in vivo, con interferencia significativa en la biología tumoral y una aplicación traslacional prometedora(Figura 5A,B,C)10. Además, se demostró que el grupo transgénico también es funcional en un modelo de cáncer de mama(Figura 5D,E).
Figura 1: Caracterización de un módulo miRNA funcional en el glioblastoma. (A) Gráfica volcánica que representa los miRNAs expresados diferencialmente en muestras de glioblastoma humano (n a 516) frente al cerebro normal (n a 10) obtenidos de TCGA. En verde hay miRNAs con >4 veces la diferencia. El círculo rojo representa los 10 miRNAs más significativamente regulados en glioblastoma. (B) Expresión relativa de los 10 miRNAs seleccionados en (A) durante la inducción de diferentes vías de diferenciación en las células madre neurales, mostrando una regulación clara de los módulos miR-124, miR-128 y miR-137 durante la inducción de la diferenciación neuronal. Media: SD de tres réplicas biológicas (*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001; Prueba t del estudiante, de dos colas). Esta figura se ha modificado con el permiso de la referencia10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Confirmación de patrones de coexpresión de módulos miRNA durante la tensión genotóxica. Expresión relativa de los tres miRNAs definidos en la Figura 1 en múltiples células y líneas celulares de glioblastoma (G62-mesenchymal; MGG4-proneural; U251, U87 pro-neural-like, y T98G-como líneas celulares de glioblastoma) después de la inducción de la resistencia a temozolomida (TMZ, barras rosas) o radiación ionizante (RT, barras verdes). Se notifican los medios con SD de dos réplicas independientes. Esta figura se ha modificado con el permiso de la referencia10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de la convergencia funcional de los targetomes de los miRNAs coexpresados. Salida de diagrama de Venn del sitio web de Bioinformática y Genómica Evolutiva, cruzando simultáneamente el targetome de los miRNAs etiquetados con los ARNm que constituyen una categoría GO de interés (en este caso, represores de cromatina). Los ARNM dirigidos exclusivamente por miRNAs individuales fueron elegidos para estudios funcionales posteriores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Estructura 2D de una secuencia de miRNA diseñada que codifica el clúster de tres miRNAs. Salida gráfica del programa RNAweb Fold. Observe la presencia de tres estructuras de bucle de tallo bien definidas que representan las horquillas de cada miRNA respectivo (miR-124, miR-128, miR-137) codificado por el transgén. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Evidencia del procesamiento transgénico y su efecto biológico posterior. (A) Cuantificación relativa de la expresión de miRNA después de la transducción mediada por lentiviral de células de glioblastoma G34 con el grupo de miRNA transgénico (Cluster 3) o control negativo (ctrl). Se han notificado los medios de tres experimentos independientes : SD. (B) Imágenes del microscopio de fluorescencia de esferas de glioblastoma G34 que expresan el transgén de control negativo frente al transgén del clúster 3. Barra de escala a 100 m. (C) Crecimiento in vivo de xenoinjertos de células G34 humanos intracraneales que expresan transgenes de control o de clúster 3. Barra de escala de 1 mm. Esta cifra ha sido reproducida con permiso10. (D) Cuantificación relativa de la expresión de miRNA después de la transducción mediada por lentiviral de células de cáncer de mama MDA-MB-231 con el grupo de miRNA transgénico (Cluster 3) o control negativo (ctrl). (E) Imágenes del microscopio de fluorescencia de células de cáncer de mama MDA-MB-231 que expresan transgén de control negativo frente al transgén de racimo 3. Barra de escala a 100 m. Todos los experimentos se realizaron en triplicados (*p < 0.05; **p < 0.01; Prueba t del estudiante, comparaciones múltiples de dos colas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Flujo de trabajo de TargetScan. (A) Captura de pantalla de la página de inicio, que muestra las opciones de selección para la búsqueda de miRNA. (B) Resultados de búsqueda representativos para miR-137. La lista de genes diana está en la columna izquierda. La caja roja denota genes con sitios de orientación conservados (lo que sugiere una mayor confianza en la segmentación real). Haga clic aquí para ver esta figura. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
Figura complementaria 2: flujo de trabajo de ToppGene Suite. (A) Captura de pantalla de la página de inicio que muestra el cuadro de búsqueda donde se inserta la lista de genes que se van a analizar. (B) Resultado de búsqueda representativa para el targetome miR-137, mostrando las categorías de Ontología Genética (GO) más significativas estadísticamente. Haga clic aquí para ver esta figura. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
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Discussion
Este protocolo se basa en la noción de que en lugar de funcionar de forma aislada, los miRNAs son biológicamente relevantes al trabajar en grupos, y estos grupos están determinados transcripcionalmente por contextos celulares específicos26. Para justificar este enfoque desde una perspectiva traslacional, se introduce un protocolo de seguimiento que permite la recreación de este patrón multi-miRNA en células/tejidos. Esto es posible aprovechando la biogénesis relativamente simple de los miRNAs, por lo que el reconocimiento de la horquilla miRNA característica por microprocesador es necesario y suficiente para el procesamiento correcto de miRNA27. Al mismo tiempo, este requisito mínimo permite el uso del andamio genético de los cúmulos de miRNA de origen natural como columna vertebral para la expresión de los módulos de miRNA deseados, que se encuentran dentro de secuencias de ADN cortas que se pueden instalar en cualquier vector de entrega de elección. El principal requisito de este protocolo es mantener la estructura de la horquilla y la longitud suficiente del componente del tallo para permitir un escote adecuado.
Hay dos consideraciones críticas importantes con respecto a la ejecución de este protocolo. El primer punto es la determinación precisa de las combinaciones óptimas de miRNA. Esto se determina mediante un análisis cuidadoso no sólo de la firma de expresión miRNA de células o tejidos en comparación con los controles, sino también de cualquier cambio simultáneo de expresión observado a medida que las células son manipuladas experimentalmente. Una vez definido un conjunto de miRNAs, también es fundamental comprobar que la modulación artificial de cada uno no modifica singularmente la expresión de los demás.
El segundo aspecto crítico se refiere a la construcción de secuencias quiméricas para recapitular artificialmente este clustering funcional de miRNA. Es fundamental respetar los requisitos estructurales de la maquinaria de procesamiento de miRNA, que es la presencia de una secuencia de tallos lo suficientemente larga (que mide al menos 11 nucleótidos) en el origen de cada horquilla miRNA18,así como el mantenimiento de la horquilla original secuencias de espaciado del andamio de clúster de miRNA nativo. En nuestra experiencia, el cumplimiento de estos dos requisitos ha dado consistentemente constantemente el plegado de ARN apropiado(Figura 4) y ha dado lugar a una expresión exitosa de múltiples miRNA.
La principal limitación de esta técnica es el número finito de miRNAs que se pueden agrupar en un transgén funcional. Hemos diseñado con éxito secuencias que sobreexpresan hasta seis miRNAs diferentes, pero observamos alguna disminución en la eficiencia del procesamiento a medida que aumenta el número de horquillas. Hasta ahora se ha utilizado la estructura genética del cúmulo miR-17-92, ya que es la que codifica el mayor número de horquillas (seis) dentro de la secuencia de ADN más corta (pares de bases de 800)8. Como hay otros cúmulos naturales de miRNA, se prevé que también podrían utilizarse para este propósito28. Por último, se ha observado que la modificación de las secuencias de espaciado entre la horquilla disminuye su procesamiento, por lo que hay algunas restricciones con respecto a la medida en que se puede modificar la estructura nativa.
El aspecto más significativo y ventajoso de este método propuesto es que permite la ingeniería de transgenes que son capaces de sobreexpresar simultáneamente múltiples miRNAs deseados principalmente utilizando un enfoque in silico, limitando la necesidad de tedioso y lentos pasos de clonación molecular, como se describió anteriormente29,30,31. El protocolo descrito es fácil de ejecutar y no requiere equipos o habilidades especializadas.
Teniendo en cuenta la importancia reconocida de los miRNAs en la biología molecular y su potencial en aplicaciones terapéuticas, este protocolo es de interés para una gran audiencia de investigadores. Se espera que este enfoque fomente estudios futuros que se centren en las propiedades combinatorias de los miRNAs y sirvan como una herramienta simple y robusta para su ejecución. Más importante aún, estos transgenes agrupados representan cargas ideales para vectores de terapia génica. La evidencia de la administración in vivo exitosa de un grupo de 3 miRNA ya se ha obtenido mediante inyección intratumoral intracraneal directa de vectores AAV (datos no publicados). Por lo tanto, se prevé que esta técnica impulsará significativamente los aspectos traslacionales de la investigación de miRNA.
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Disclosures
Los autores no informan de conflictos de intereses.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a los miembros del Laboratorio de Neurooncología Harvey Cushing por su apoyo y crítica constructiva. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones NINDS K12NS80223 y K08NS101091 a P. P.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% low melting temperature agarose | IBI Scientific | IB70058 | |
| 0.45 µM sterile filter unit | Merck Millipore | SLH033RS | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431081 | |
| 6-Well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Athymic mice (FoxN1 nu/nu) | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| Cell culture flask | Greiner Bio-One | 660175 | |
| Cell Scraper, 16cm | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cesium 137 irradiator | JL Sheperd and Associates | Core Facility (Harvard Medical School) | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 439142-4L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11995040 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Eosin Y solution | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEK-293 | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1573 | |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | 1051750500 | |
| Human primary glioma stem-like cells (GBM62) | Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Human primary glioma stem-like cells (MGG4) | Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) | ||
| Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP | System Biosciences | CD511B-1 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Microcentrifuge refrigerated | Eppendorf | model no. 5424 R, cat. no.5404000138 | |
| Mounting medium | Thermo Fisher Scientific | 4112APG | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3117-0380PK | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000c | |
| Neural Progenitor cells (NPC) | Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system | Nikon, Japan | 14314 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985088 | |
| PCR tubes | Sigma-Aldrich | CLS6571-960EA | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri-Dishes 94/16 | Greiner Bio-One | 632180 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma- Aldrich | P4707 | |
| Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | AF-100-18B | |
| Retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| RNA Miniprep Kit | Direct-zol | R2050 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | |
| Small Animal Image-Guided Micro Irradiator | Xstrahal Life Sciences, UK | Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA) | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75000100 | |
| StemPro Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| StepOne Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 | |
| SterilGARD biosafety cabinet | The Baker Company | SG403A-HE | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| T98-G | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1690 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4324018 | |
| Temozolomide | Tocris Bioscience | 2706 | |
| Tissue-Tek optimum cutting temperature | Fisher Scientific | NC9636948 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Lysis reagent |
| U251-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-17 | |
| U87-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-14 | |
| ViraPower Lentivector Expression system | Thermo Fisher Scientific | K4970-00 | |
| Water, HPLC grade | Fisher | W54 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 |
References
- Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
- Esteller, M.
- Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach. Scientific Reports. 8, 4767 (2018).
- Calin, G. A., et al. Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).
- Croce, C. M. Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer. Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).
- Ambros, V. miRNAs: tiny regulators with great potential. Cell. 107, 823-826 (2001).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).
- He, L., et al. A miRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435, 828-833 (2005).
- Santos, M. C., et al. miR-124, −128, and −137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network. Stem Cells. 34, 220-232 (2016).
- Bhaskaran, V., et al. The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma. Nature Communications. 10 (1), 442 (2019).
- Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs. Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).
- Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray. Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).
- Silber, J., et al. miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells. BMC Medicine. 6 (14), (2008).
- Hester, M. E., et al. Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency. PLoS ONE. 4 (9), e7044 (2009).
- Hsieh, J., et al. IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes. Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
- Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. The miRNA.org resource: targets and expression. Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).
- Wong, N., Wang, X. miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations. Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).
- Vlachos, I. S., et al. DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).
- Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization. Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).
- Aken, B. L., et al.
- Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from miRNA sequences to function. Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).
- Lorenz, R., et al.
- Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812 (2017).
- Crommentuijn, M. H., et al. Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma. Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).
- Ivey, K. N., Srivastava, D. MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions. Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).
- Han, J., et al. Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex. Cell. 125, 887-901 (2006).
- Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs. Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).
- Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron. Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).
- Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector. PLoS ONE. 6 (7), e22437 (2011).
- Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection. Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).
