Summary
Descritto qui è un protocollo per caratterizzare i moduli di miRNA biologicamente sinergici e il loro assemblaggio in transgeni brevi, che consente la sovraespressione simultanea per applicazioni di terapia genica.
Abstract
La rilevanza biologica dei microRNA (miRNA) nella salute e nella malattia si basa in modo significativo su combinazioni specifiche di molti miRNA contemporaneamente deregolamentati piuttosto che sull'azione di un singolo miRNA. La caratterizzazione di questi moduli specifici di miRNA è un passo fondamentale per massimizzare il loro uso in terapia. Questo è estremamente rilevante perché i loro attributi combinatori possono essere praticamente sfruttati. Descritto qui è un metodo per definire una firma miRNA specifica rilevante per il controllo dei repressori di cromatina oncogenia nel glioblastoma. L'approccio definisce prima un gruppo generale di miRNA che sono deregolati nei tumori rispetto al tessuto normale. L'analisi viene ulteriormente perfezionata dalle condizioni di coltura differenziali, sottolineando un sottogruppo di miRNA che vengono co-espressi contemporaneamente durante specifici stati cellulari. Infine, i miRNA che soddisfano questi filtri sono combinati in un transgene policistronico artificiale, che si basa su uno scaffolding di geni di cluster miRNA naturalmente esistenti, quindi utilizzati per la sovraespressione di questi moduli miRNA nelle cellule riceventi.
Introduction
I miRNA offrono un'opportunità ineguagliabile per lo sviluppo di un ampio approccio di terapia genica a molte malattie1,2,3, compreso il cancro4,5. Questo si basa su diverse caratteristiche uniche di queste molecole biologiche, tra cui la loro piccola dimensione6, semplice biogenesi7, e la tendenza naturale a funzionare in associazione8. Molte malattie sono caratterizzate da specifici modelli di espressione del miRNA, che spesso convergono sulla regolazione di funzioni biologiche complesse9. Lo scopo di questo metodo è innanzitutto quello di definire una strategia per identificare gruppi di miRNA che sono sinergicamente rilevanti per funzioni cellulari specifiche. Di conseguenza, fornisce una strategia per il ripristino di tali combinazioni di miRNA in studi e applicazioni a valle.
Questo metodo consente l'analisi funzionale di più miRNA contemporaneamente, sfruttando il loro targeting simultaneo di un gran numero di mRNA, ricapitolando così i complessi paesaggi delle malattie. Questo approccio è stato recentemente impiegato per definire un gruppo di tre miRNA che 1) sono contemporaneamente downregolati nel cancro al cervello e 2) mostrano un forte modello di co-espressione durante la differenziazione neurale, nonché in risposta allo stress genotossico da radiazioni o un Agente alchiante del DNA. La riequivocazione combinatoria di questo modulo di tre miRNA con il metodo di clustering descritto di seguito si traduce in una profonda interferenza con la biologia delle cellule tumorali e può essere facilmente utilizzata come strategia di terapia genica per studi preclinici10. Questo protocollo può essere di particolare interesse per coloro che sono coinvolti nella ricerca sui miRNA e sulle sue applicazioni traslazionali.
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Protocol
1. Caratterizzazione dei miRNA associati funzionalmente in Glioblastoma
- Analisi dell'espressione di miRNA differenziale ampia nel glioblastoma rispetto al cervello
- In primo luogo, determinare i miRNA più significativamente deregolamentati nel tumore. Ciò può essere ottenuto utilizzando almeno tre diversi metodi:
- Estrarre l'Atlante del Genoma del Cancro, trovato a https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, per i dati di sequenziamento11.
- Eseguire l'analisi microarray da un nuovo campione operativo12.
- Utilizzare i set di dati pubblicati in precedenza13.
NOT: Qualunque sia il metodo scelto, l'output fornisce un insieme di massa di miRNA la cui espressione è statisticamente correlata (direttamente o inversamente) con la biologia del tumore. Questo gruppo iniziale costituisce il pool di miRNA che vengono ulteriormente analizzati per l'identificazione di un sottoinsieme di miRNA che mostra l'associazione funzionale più rigorosa eseguendo un'analisi più dinamica delle modifiche di espressione, come descritto di seguito.
- In primo luogo, determinare i miRNA più significativamente deregolamentati nel tumore. Ciò può essere ottenuto utilizzando almeno tre diversi metodi:
- Analisi dell'espressione miRNA specifica della condizione
- Induzione della differenziazione cellulare:
- Utilizzare piatti di plastica poli-D-lysina (PDL) pre-rivestiti per favorire la formazione di una coltura monostrato. Per il rivestimento dei piatti, sciogliere la PDL in acqua a una concentrazione di 100 g/mL. Utilizzare 1 mL di soluzione per 25 cm2 superficie. Risciacquare 2x con PBS 6 h dopo l'applicazione della soluzione PDL.
- Piastra di cellule staminali neurali umane in quantità uguali (100.000 cellule/5 mL) o nel mezzo di cellule staminali (mezzo neurobasale , integratore B27 , 20 ng/mL EGF/FGF), mezzo di differenziazione astrocitica (DMEM - 10% FBS), o mezzo di differenziazione neuronale (mezzo neurobasale 2 - acido retinoico M)14. Il protocollo per la differenziazione oligodendrociti richiede l'aggiunta di IGF-1 (200 ng/mL) dopo la rimozione EGF/FGF14,15.
- Dopo la placcatura cellulare, inserire in incubatrice per 1 settimana a 37 gradi centigradi, 5% di CO2.
- Estrazione dell'RNA:
- Dopo 7 giorni, rimuovere le cellule dall'incubatrice e rimuovere il mezzo.
- Lavare le cellule con PBS (5 mL). Quindi, aggiungere 1 mL di reagente di lisi (vedi Tabella dei materiali) per lesiare le cellule e raschiare le cellule nel tubo di microfuge da 1,5 mL utilizzando un raschietto cellulare. Conservare i tubi contenenti le cellule lismi a temperatura ambiente (RT) per 5 min.
- Procedere all'isolamento totale dell'RNA seguendo le istruzioni del produttore.
- Analisi dell'espressione miRNA:
- Quantificare l'espressione differenziale di miRNA specifici identificati nel passaggio 1.1 tra i tre modelli di differenziazione da PCR in tempo reale, utilizzando sonde TaqMan e seguendo i protocolli del produttore per la trascrizione inversa e l'amplificazione PCR ( Figura 1).
- Induzione della differenziazione cellulare:
- Convalida dei cluster di miRNA per difficoltà specifiche dello stress
- Coltura G34 glioblastoma cellule staminali nel mezzo neurobasale - supplemento B27 - 20 ng/mL EGF/FGF. Iniziare con 1 x 106 celle in 5 mL in un fiaschetta di fissaggio basso di 25 cm2.
- A partire da 48 h dopo la placcatura, aggiungere le concentrazioni di raddoppio del DNA di alchilante agente temozolomide (TM) ogni 5 giorni, come segue:
- Iniziare con 5 M per 5 giorni. Dopo 5 giorni, rimuovere il mezzo e sostituire con un mezzo fresco senza temolomide, per consentire alle cellule sopravvissute di recuperare. Dopo 48 h, aggiungere 10 M TM e incubare per altri 5 giorni.
- Ripetere ogni volta il passo 1.3.2.1, raddoppiando la concentrazione di TM, fino a quando non viene raggiunta una concentrazione di almeno 100 M e le cellule diventano resistenti al farmaco10.
- In un esperimento parallelo, irradiare le cellule G34 come segue:
- A partire da 48 h dopo la placcatura di 1 x 106 cellule in 5 mL in un fiascheta a basso attaccamento di 25 cm2, è accettabile irradiare le cellule con 2 Gy di energia (qualsiasi irradiatore che fornisce emissione di fotoni è accettabile). Riportare le cellule all'incubatrice e non disturbare. Dopo 48 h, irradiare nuovamente le cellule con ulteriori 2 Gy di energia.
- Ripetere il passaggio 1.3.3.1 4x fino a somministrare un totale di 10 Gy di energia.
- Riportare le cellule all'incubatrice e lasciarle recuperare in mezzo fresco per almeno 5 giorni prima dell'analisi a valle.
- Dopo l'induzione della resistenza, le cellule di lisi che utilizzano il reagente di lisi ed estrarre l'RNA totale secondo il protocollo del produttore.
- Analizzare l'espressione dei miRNA specifici identificati nelle sezioni 1.1-1.2 come descritto nel passaggio 1.2.1 (Figura 2).
- Caratterizzazione della convergenza funzionale dei miRNA raggruppati
- Ottenere il targetoma previsto di ogni miRNA definito nelle sezioni 1.2-1.3 ottenuto utilizzando gli strumenti di previsione del targeting miRNA.
NOT: Generalmente ricorriamo a TargetScan, come il suo algoritmo viene periodicamente aggiornato16. Gli strumenti di stima aggiuntivi sono miRanda17, miRDB18e DIANA-miRPath19. Tutti questi programmi sono applicazioni gratuite basate sul web.- Dalla prima pagina di Targetscan, selezionare il miRNA di interesse dal menu a discesa pre-popolato. Fare clic sul pulsante Invia.
- Scaricare l'elenco risultante delle destinazioni come foglio di calcolo utilizzando il collegamento Scarica tabella (Supplementary Figure 1).
- Per ridurre le possibilità di previsioni di falsi positivi, includere solo gli obiettivi all'interno della colonna siti conservati nelle analisi a valle. Inoltre, è possibile ottenere ulteriore rigore utilizzando ulteriori programmi di previsione del miRNA (vedi sopra) e includendo solo gli obiettivi comuni a tutti gli algoritmi.
- Classificare i targetomi risultanti in base alle categorie di Ontologia genica utilizzando ToppGene Suite20 per valutare l'arricchimento dei percorsi comuni a ciascun miRNA.
- Incollare l'elenco degli obiettivi ottenuti dal passaggio 1.4.1 nella finestra "Set di geni di formazione", utilizzando il simbolo HGNC come tipo di voce. Fare clic su Invia > Avvia. Il programma fornirà una tabella di output che mostra le categorie "Go" più significative per l'elenco di geni inserito (Figura supplementare 2).
- Per stabilire infine il contributo di ciascun miRNA alla regolazione di un percorso comune o di un processo cellulare (in questo caso, regolazione della cromatina), controllare ogni targetoma ottenuto nel passaggio 1.4.1 rispetto all'elenco completo dei geni coinvolti nel processo cellulare specifico ( regola della cromatina), utilizzando la funzione diagramma di Venn fornita nel sito web Bioinformatics and Evolutionary Genomics http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn.
NOT: Questo programma consente l'intersezione di più gruppi contemporaneamente (Figura 3). Gli obiettivi unici specifici forniti da ogni miRNA vengono quindi annotati e selezionati per esperimenti funzionali a valle.- Nella prima pagina del programma, caricare o copiare/incollare l'elenco se i mRNA di destinazione per ogni miRNA o interesse nelle rispettive finestre. Assegnare un nome a ogni elenco con un identificatore univoco.
- Fare clic su Invia. Il programma fornirà un output visivo di un diagramma di Venn con un numero di geni in ogni settore, nonché un elenco completo di mRNA per ogni subset e combinazioni di intersezioni.
- Ottenere il targetoma previsto di ogni miRNA definito nelle sezioni 1.2-1.3 ottenuto utilizzando gli strumenti di previsione del targeting miRNA.
2. Assemblaggio di moduli miRNA in un cluster transgenico policistronico
-
Preparazione dello scaffold transgenico a base di locus a grappolo miR-17-92
- Ottenere la sequenza nucleotidica dell'ammasso miR-17-92 dal browser genoma Ensembl21. Selezionare la sequenza "core" della coppia di basi da 800 dollari che comprende tutte e sei forcine miRNA codificate del locus e almeno 200-nucleotide flanking sequenze sia a monte (5') che a valle (3') della sequenza di core.
- Incollare la sequenza precedente in qualsiasi programma di modifica delle parole.
- Definire la sequenza di ciascuna delle sei forcine native recuperandole in miRBase22. Contrassegnare ciascuna di queste sequenze nell'intervallo della sequenza "core" identificata in precedenza. Tutte le sequenze tra ogni tornante rappresentano sequenze distanziali, che sono importanti per la corretta elaborazione del transgene.
- Rimuovere le sequenze di tornanti nativi dalla sequenza "core", con l'eccezione di 3-5 nucleotidi a entrambe le estremità 5' e 3' di ogni forcina, che servirà come accettatore per le nuove forcine.
-
Costruire un nuovo transgene che codifica più miRNA di scelta
- Ottenere sequenze fornacchia di miRNA destinati ad essere sovraespressi nel transgene da miRBase. Notare attentamente i nucleotidi specifici che sono i siti di scissione microprocessore.
- Sostituire le forcine rimosse (passaggio 2.1.4) con le sequenze di tornanti dei miRNA desiderati ottenute nel passaggio 2.2.1.
- Aggiungere le sequenze di restrizione desiderate in entrambe le regioni di fianco del transgene per facilitare la subclonazione nei vettori di consegna di scelta. Verificare che le sequenze di restrizione scelte non siano presenti all'interno della sequenza stessa.
- Per i controlli negativi, utilizzare sequenze criptato a 20 nucleotidi per sostituire la sequenza naturale di 20 nucleotidi di ogni miRNA maturo. Generare queste sequenze criptate utilizzando uno strumento online come https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence.
-
Verifica della struttura bidimensionale del transgene
- Copiare la sequenza transgenica completa nel programma software di previsione della struttura dell'RNA RNAweb Fold23.
- Utilizzando le impostazioni standard del programma, fare clic su Procedi.
- Analizzare l'output grafico, in particolare per la presenza di forcine ben definite e la presenza di strutture staminali a doppio filamento almeno 11 nucleotidi proximali al sito di scissione microprocessore. Inoltre, cercare l'assenza di punti di diramazione all'interno delle sequenze di tornanti (Figura 4).
3. Ottenere i Transgeni mediante sintesi del DNA
- Dopo la progettazione e la convalida in silico dell'ammasso di miRNA chimerico, ottenere la sequenza di lavoro utilizzando la sintesi del DNA da fornitori commerciali24 e procedere con la clonazione a valle in vettori e consegna transgenica. Abbiamo usato vettori lentivirali per la consegna in vitro10 e virus adeno-associati (AAV) per la consegna invivo intracranica25.
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Representative Results
Questo metodo ha permesso la caratterizzazione di un modulo di tre miRNA che sono costantemente downregolati nei tumori cerebrali, che sono co-espressi specificamente durante la differenziazione neuronale (Figura 1) e coinvolti nella risposta di sopravvivenza del tumore dopo terapia (Figura 2). Ciò si ottiene regolando un complesso percorso repressivo della cromatina oncogenica. Questo modello di co-espressione ha suggerito una forte attività sinergica tra questi tre miRNA (Figura 3). Di conseguenza, sfruttando le piccole dimensioni e la semplice biogenesi dei miRNA, la seconda parte di questo protocollo è stata utilizzata per progettare un transgene (Figura 4) che potrebbe ricapitolare contemporaneamente l'espressione dei tre miRNA nelle cellule glioblastoma, sia in vitro che in vivo, con un'ingerenza significativa nella biologia tumorale e una promettente applicabilità traslazionale (Figura 5A,B,C)10. Inoltre, è stato dimostrato che l'ammasso transgenico è anche funzionale in un modello di cancro al seno (Figura 5D,E).
Figura 1: Caratterizzazione di un modulo miRNA funzionale nel glioblastoma. (A) Terreno vulcano che rappresenta i miRNA espressi in modo differenziale in campioni di glioblastoma umano (n - 516) vs cervello normale (n - 10) ottenuto da TCGA. In verde sono miRNA con > 4 volte differenza. Il cerchio rosso rappresenta i 10 miRNA più significativamente downregolati nel glioblastoma. (B) Espressione relativa dei 10 miRNA selezionati in (A) durante l'induzione di diversi percorsi di differenziazione nelle cellule staminali neurali, mostrando una chiara regolazione dei moduli miR-124, miR-128 e miR-137 durante l'induzione della differenziazione neurale. Media : SD da tre repliche biologiche ('p < 0.05; 'p < 0.01; 'p < 0.001; Test t dello studente, a due code). Questa cifra è stata modificata con l'autorizzazione del riferimento10. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Conferma dei modelli di co-espressione dei moduli miRNA durante lo stress genotossico. Espressione relativa dei tre miRNA definiti nella Figura 1 in più cellule glioblastoma e linee cellulari (G62-mesenchymal; MGG4-proneurale; U251, U87 pro-neural-like, e T98G linee cellulari glioblastoma mesenchymal-like) dopo l'induzione di resistenza a temozolomide (TM, barre rosa) o radiazioni ionizzanti (RT, barre verdi). Segnalati sono mezzi con SD da due repliche indipendenti. Questa cifra è stata modificata con l'autorizzazione del riferimento10. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi della convergenza funzionale dei targetomi dei miRNA coespressi. Uscita diagramma di Venn dal sito web Bioinformatics and Evolutionary Genomics, che attraversa contemporaneamente il targetoma dei miRNA etichettati con gli mRNA che costituno una categoria di interesse GO (in questo caso, repressori della cromatina). Gli mRNA mirati in modo univoco da singoli miRNA sono stati scelti per ulteriori studi funzionali a valle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: struttura 2D di una sequenza miRNA ingegnerizzata che codifica il cluster di tre miRNA. Output grafico del programma RNAweb Fold. Si noti la presenza di tre strutture del ciclo stelo ben definite che rappresentano le forne di ogni rispettivo miRNA (miR-124, miR-128, miR-137) codificate dal transgene. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Prova della lavorazione transgenica e del suo effetto biologico a valle. (A) Quantificazione relativa dell'espressione del miRNA dopo la trasduzione lentivirale di cellule glioblastoma G34 con cluster di miRNA transgenico (cluster 3) o controllo negativo (ctrl). Sono riportati i mezzi di tre esperimenti indipendenti - SD. (B) Immagini al microscopio fluorescenza di sfere glioblastoma G34 che esprimono transgene di controllo negativo contro transgene del Cluster 3. Barra di scala - 100 m. (C) Crescita in vivo di xenografi della cellula umana intracranica che esprimono transgeni di controllo o di cluster 3. Barra della scala: 1 mm. Questa cifra è stata riprodotta con il permesso10. (D) Quantificazione relativa dell'espressione di miRNA dopo la trasduzione di MDA-MB-231 con cluster di miRNA transgenico (cluster 3) o controllo negativo (ctrl). (E) Immagini al microscopio fluorescenza di cellule mEDIT-MB-231 che esprimono transgene a controllo negativo contro transgene del cluster 3. Barra della scala: 100 m. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicati (< 0,05; Test t dello studente, confronto multiplo a due code). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare Figura 1: flusso di lavoro TargetScan. (A) Schermata Home page, che mostra le opzioni di selezione per la ricerca miRNA. (B) Risultati di ricerca rappresentativi per miR-137. L'elenco dei geni bersaglio si trova nella colonna di sinistra. La casella rossa denota i geni con siti di targeting conservati (suggerendo una maggiore fiducia nel targeting reale). Si prega di fare clic qui per visualizzare questa figura. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
Figura supplementare 2: flusso di lavoro di ToppGene Suite. (A) Schermata Della home page che mostra la casella di ricerca in cui è inserito l'elenco dei geni da analizzare. (B) Risultato rappresentativo della ricerca per il targetoma miR-137, che mostra le categorie di ontologia genica (GO) più significative dal livello statistico. Si prega di fare clic qui per visualizzare questa figura. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
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Discussion
Questo protocollo si basa sulla nozione che, invece di funzionare in isolamento, i miRNA sono biologicamente rilevanti lavorando in gruppi, e questi gruppi sono stabiliti trascrizionalmente da contesti cellulari specifici26. Per giustificare questo approccio da una prospettiva traslazionale, viene introdotto un protocollo di follow-up che consente la ricreazione di questo modello multi-miRNA nelle cellule/tessuti. Ciò è possibile sfruttando la biogenesi relativamente semplice dei miRNA, per cui il riconoscimento del caratteristico tornante miRNA da microprocessore è necessario e sufficiente per una corretta elaborazione del miRNA27. Allo stesso tempo, questo requisito minimo consente l'uso dello scaffold genetico dei cluster di miRNA naturali come spina dorsale per l'espressione dei moduli miRNA desiderati, che sono contenuti all'interno di brevi sequenze di DNA che possono essere inserite in qualsiasi vettore di somministrazione di scelta. Il requisito principale di questo protocollo è mantenere la struttura della forcina e la lunghezza sufficiente del componente stelo per consentire un'adeguata scissione.
Ci sono due principali considerazioni critiche per quanto riguarda l'esecuzione di questo protocollo. Il primo punto è la determinazione accurata delle combinazioni ottimali di miRNA. Ciò è determinato da un'attenta analisi non solo della firma dell'espressione miRNA di cellule o tessuti rispetto ai controlli, ma anche di eventuali cambiamenti di espressione simultanea osservati quando le cellule vengono manipolate sperimentalmente. Una volta definito un insieme di miRNA, è anche fondamentale accertare che la modulazione artificiale di ogni singolare non modifichi l'espressione degli altri.
Il secondo aspetto critico riguarda la costruzione di sequenze chimeriche per ricapitolare artificialmente questo clustering di miRNA funzionale. È fondamentale rispettare i requisiti strutturali del meccanismo di lavorazione del miRNA, che è la presenza di una sequenza di gambi sufficientemente lunga (misurando almeno 11 nucleotidi) all'origine di ogni hairpin miRNA18, così come il mantenimento di originale sequenze di spaziatura dello scaffold a grappolo del miRNA nativo. Nella nostra esperienza, soddisfare questi due requisiti ha prodotto costantemente un adeguato ripiegamento dell'RNA (Figura 4) e ha portato a un'espressione multi-miRNA di successo.
La limitazione principale di questa tecnica è il numero finito di miRNA che possono essere raggruppati insieme in un transgene funzionale. Abbiamo progettato con successo sequenze sovraesprimendo fino a sei diversi miRNA, ma abbiamo osservato una certa diminuzione dell'efficienza di elaborazione con l'aumentare del numero di tornanti. Finora è stata utilizzata la struttura genetica dell'ammasso miR-17-92, perché è quella che codifica il maggior numero di tornanti (sei) all'interno della sequenza di DNA più breve (coppie di base)8. Poiché ci sono altri cluster di miRNA naturali, si prevede che potrebbero essere utilizzati anche per questo scopo28. Infine, è stato osservato che la modifica delle sequenze di spaziatura tra i forni riduce la loro elaborazione, quindi ci sono alcuni vincoli per quanto riguarda in che misura la struttura nativa può essere modificata.
L'aspetto più significativo e vantaggioso di questo metodo proposto è che permette l'ingegneria di transgeni che sono in grado di sovraesprimere contemporaneamente molteplici miRNA desiderati principalmente utilizzando un approccio in silico, limitando la necessità di noiosi e passaggi di clonazione molecolare che richiedono molto tempo, come descritto in precedenza29,30,31. Il protocollo descritto è facile da eseguire e non richiede attrezzature o competenze specializzate.
Tenendo conto dell'importanza riconosciuta dei miRNA nella biologia molecolare e del loro potenziale nelle applicazioni terapeutiche, questo protocollo è di interesse per un vasto pubblico di ricercatori. Questo approccio dovrebbe incoraggiare studi futuri che si concentrino sulle proprietà combinatorie dei miRNA e fungeranno da strumento semplice e robusto per la loro esecuzione. Ancora più importante, questi transgeni raggruppati rappresentano carichi ideali per i vettori di terapia genica. La prova di una corretta somministrazione in vivo di un cluster di 3 miRNA è già stata ottenuta tramite l'iniezione intracranica diretta di vettori AAV (dati inediti). Si prevede quindi che questa tecnica aumenterà significativamente gli aspetti traslazionali della ricerca sui miRNA.
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Disclosures
Gli autori non segnalano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare i membri del Laboratorio di Oncologia Neuro Harvey Cushing per il sostegno e la critica costruttiva. Questo lavoro è stato supportato da NINDS concede K12NS80223 e K08NS101091 a P. P.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% low melting temperature agarose | IBI Scientific | IB70058 | |
| 0.45 µM sterile filter unit | Merck Millipore | SLH033RS | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431081 | |
| 6-Well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Athymic mice (FoxN1 nu/nu) | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| Cell culture flask | Greiner Bio-One | 660175 | |
| Cell Scraper, 16cm | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cesium 137 irradiator | JL Sheperd and Associates | Core Facility (Harvard Medical School) | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 439142-4L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11995040 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Eosin Y solution | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEK-293 | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1573 | |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | 1051750500 | |
| Human primary glioma stem-like cells (GBM62) | Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Human primary glioma stem-like cells (MGG4) | Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) | ||
| Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP | System Biosciences | CD511B-1 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Microcentrifuge refrigerated | Eppendorf | model no. 5424 R, cat. no.5404000138 | |
| Mounting medium | Thermo Fisher Scientific | 4112APG | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3117-0380PK | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000c | |
| Neural Progenitor cells (NPC) | Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system | Nikon, Japan | 14314 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985088 | |
| PCR tubes | Sigma-Aldrich | CLS6571-960EA | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri-Dishes 94/16 | Greiner Bio-One | 632180 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma- Aldrich | P4707 | |
| Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | AF-100-18B | |
| Retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| RNA Miniprep Kit | Direct-zol | R2050 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | |
| Small Animal Image-Guided Micro Irradiator | Xstrahal Life Sciences, UK | Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA) | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75000100 | |
| StemPro Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| StepOne Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 | |
| SterilGARD biosafety cabinet | The Baker Company | SG403A-HE | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| T98-G | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1690 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4324018 | |
| Temozolomide | Tocris Bioscience | 2706 | |
| Tissue-Tek optimum cutting temperature | Fisher Scientific | NC9636948 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Lysis reagent |
| U251-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-17 | |
| U87-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-14 | |
| ViraPower Lentivector Expression system | Thermo Fisher Scientific | K4970-00 | |
| Water, HPLC grade | Fisher | W54 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 |
References
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