Visualisation et analyse du transport intracellulaire d'organites et d'autres cargaisons dans les astrocytes

Summary

Ici nous décrivons une méthode in vitro de live-imaging pour visualiser le transport intracellulaire des organelles et le trafic des protéines de membrane de plasma dans les astrocytes murines. Ce protocole présente également une méthodologie d'analyse d'image pour déterminer les itinéraires et la cinétique du transport de marchandises.

Abstract

Les astrocytes sont parmi les types de cellules les plus abondants dans le cerveau adulte, où ils jouent des rôles clés dans une multiplicité de fonctions. En tant qu'acteur central de l'homéostasie cérébrale, les astrocytes fournissent aux neurones des métabolites vitaux et tamponnent l'eau extracellulaire, les ions et le glutamate. Composante intégrale de la synapse tri-partite, les astrocytes sont également essentiels à la formation, à l'élagage, à l'entretien et à la modulation des synapses. Pour permettre ces fonctions hautement interactives, les astrocytes communiquent entre eux et avec d'autres cellules gliales, neurones, vascularisation du cerveau et environnement extracellulaire à travers une multitude de protéines membranaires spécialisées qui incluent des cellules molécules d'adhérence, d'aquaporines, de canaux ioniques, de transporteurs de neurotransmetteurs et de molécules de jonction d'écart. Pour soutenir ce flux dynamique, les astrocytes, comme les neurones, s'appuient sur un transport intracellulaire étroitement coordonné et efficace. Contrairement aux neurones, où le trafic intracellulaire a été largement délimité, le transport à base de microtubules dans les astrocytes a été moins étudié. Néanmoins, le trafic exo- et endocytic des protéines de membrane cellulaire et du transport intracellulaire d'organelle orchestre la biologie normale des astrocytes, et ces processus sont souvent affectés dans la maladie ou en réponse aux dommages. Ici, nous présentons un protocole simple à la culture de haute qualité astrocytes murine, à fluorescentétique des protéines astrocytiques et des organites d'intérêt, et d'enregistrer leur dynamique de transport intracellulaire en utilisant la microscopie confocale time-lapse. Nous démontrons également comment extraire et quantifier les paramètres de transport pertinents des films acquis à l'aide du logiciel d'analyse d'image disponible (c.-à-d. ImageJ/FIJI).

Introduction

Les astrocytes sont les cellules les plus abondantes dans le système nerveux central adulte, où ils exécutent des fonctions développementales et homéostatiques uniques¹. Les astrocytes modulent le développement synaptique par le contact direct avec les terminaux pré- et postsynaptiques dans le cadre de la synapse tri-partite, qui contient des récepteurs de neurotransmetteur, des transporteurs, et des molécules d'adhérence de cellules qui facilitent la formation de synapse et la communication neuronale-astrocyte². En outre, les astrocytes contrôlent activement la transmission synaptique et empêchent l'excitotoxicité neuronale en supprimant rapidement les neurotransmetteurs excitatifs de la fente synaptique, en recyclant les neurotransmetteurs et en participant à l'élagage synaptique^{3 , 4 ( en} plus) ^{, 5 Annonces , 6.}Pour activer ces fonctions hautement interactives, les astrocytes communiquent entre eux, avec d'autres cellules gliales, et avec les neurones par le biais de protéines membranaires spécialisées, y compris les molécules d'adhérence cellulaire, les aquaporines, les canaux ioniques, les transporteurs de neurotransmetteurs et les molécules de jonction d'écart. Les astrocytes modifient activement les niveaux de surface de ces protéines en réponse aux fluctuations de leur environnement intra- et extracellulaire⁷. En outre, les changements dans les niveaux et la distribution des mitochondries, des gouttelettes lipidiques et des organites dégradatifs et de recyclage modulent l'approvisionnement énergétique, la disponibilité des métabolites et les processus de compensation cellulaire qui sont essentiels à la fonction des astrocytes et survie.

Les changements dynamiques dans le trafic de protéines membranaires et d'organelle et le positionnement dans les astrocytes sont facilités par la fonction concertée des protéines motrices et des adaptateurs qui favorisent la motilité de la cargaison^8,9. De même, les niveaux de surface des protéines membranaires sont modulés par l'internalisation et le recyclage des événements¹⁰. Ces cargaisons sont transportées par un réseau complexe d'actine, de microtubules et peut-être de filaments intermédiaires⁸. Les études basées sur la coloration d'immunofluorescence de la protéine de liaison final 1 (EB1), qui s'accumule au microtubule croissant plus extrémités, suggèrent que dans les faisceaux d'astrocytes des microtubules rayonnent hors du périnucleus et d'étendre leur extrémité plus vers le périphérie¹¹. Cependant, un examen complet de l'organisation et de la polarité des microtubules et d'autres éléments cytosquelettiques utilisant la formation image de cellules vivantes manque toujours. Tandis que beaucoup des mécanismes sous-jacents à la dynamique des organelles et des protéines membranaires ont été intensivement étudiés dans les neurones et d'autres types de cellules, la motilité de cargaison dans les astrocytes est moins bien comprise. La plupart de nos connaissances actuelles sur les changements dans la distribution des protéines et des organites dans les astrocytes est basée sur l'étiquetage traditionnel à base d'anticorps de la préparation fixe, ce qui empêche l'examen spatial et temporel précis de la dynamique du fret^{7, 12}.

Ici, nous décrivons une méthode pour étiqueter des protéines de membrane et des organites pour l'imagerie vivante dans les cultures primaires d'astrocyte de souris de haute pureté. À l'aide de ce protocole, nous fournissons des exemples dans lesquels nous suivons la localisation dynamique des protéines de membrane fluorescentes vertes (GFP) dans les astrocytes transfectés, y compris la connexine de protéine de jonction d'écart 43 (Cx43-GFP) et l'acide aminé excitateur transporteur 1 (EAAT1-GFP). Nous décrivons également l'utilisation d'une sonde acidotrope fluorescente pour visualiser les organites acides et suivre leur dynamique de trafic dans les astrocytes vivants. Enfin, nous démontrons comment analyser les données time-lapse pour extraire et évaluer les paramètres de transport des cargaisons individuelles.

Protocol

Toutes les procédures animales ont été effectuées avec l'approbation de l'Université de Caroline du Nord au Chapel Hill Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Dissection de cerveau et culture des astrocytes primaires de souris

REMARQUE: Le protocole suivant a été adapté à partir de méthodes publiées, qui suit la procédure originale développée par McCarthy et deVellis^13,14,15. Les cultures cellulaires mixtes des astrocytes McCarthy/deVellis (MD) sont préparées à partir des cortices de souris postnatals de jour 2-4 (P2-P4), traités avec un facteur antimitotique, et purifiés pour produire la culture finale enrichie d'astrocyte. Quatre cortices de chiots de souris de l'un ou l'autre sexe sont suffisants pour générer une culture de flacon de culture de tissu T75.

1. Enrober le fond des flacons T75 (accès au cou à 100 % incliné, bouchon de filtre hydrophobe de 0,22 m) de poly-D-lysine (1 mg/mL dans un tampon Tris de 0,1 M, pH 8,5) et incuber à 37 oC pendant 24 h avant le début de la dissection.
2. Avant de commencer la procédure de dissection, réchauffer 30 mL de milieu x adulte astrocyte (le milieu d'aigle modifié de Dulbecco [DMEM] de glucose élevé, 10% de sérum bovin inactivé par la chaleur, 1% de pénicilline/streptomycine) à 37 oC et décongeler un aliquot de 5 ml de 2,5% de trypsine sur glace. Préparer deux plats disséquants (60 mm de diamètre) sur de la glace remplie de 6 ml de solution de sel équilibrée de Hank (HBSS) sans Ca^{2 ou} Mg^2.
3. Désinfecter tous les outils chirurgicaux (pinceà d'épiler fine, ciseaux disséquants, ciseaux Vannas droits, forceps Graefe avec des pointes courbes) dans 70% d'éthanol avant et entre chaque dissection.
4. Vaporisez la tête et le cou des chiots souris P2-P4 avec 70 % d'éthanol avant de les euthanasier rapidement par décapitation avec des ciseaux chirurgicaux. Effectuer une incision postérieure à antérieure de la ligne médiane le long du cuir chevelu pour exposer le crâne. Couper soigneusement le crâne du cou au nez.
5. Effectuer deux incisions latérales supplémentaires supérieures aux yeux. À l'aide d'une pince à épiler fine, retournez délicatement les rabats du crâne sur le côté. Retirez le cerveau et placez-le dans le premier plat de dissection rempli de HBSS glacé sans Ca² ou Mg^2. Gardez le plat sur la glace et continuez à récolter le reste du cerveau.
   REMARQUE : Effectuez le reste de la procédure de dissection sous une portée de dissection.
6. Retirez les bulbes olfactifs à l'aide de ciseaux Vannas ou de pincettes fines (Figure 1Ai). Avec les forceps incurvés de pointe à l'intersection des fissures transversales et interhémissphériques, insérez doucement une deuxième paire de forceps incurvés de pointe entre le cortex et le diencephalon, ouvrant lentement les forceps pour séparer les hémisphères cérébraux du reste de le cerveau (Figure 1Aii,Aiii). Enlever les tissus indésirables (Figure 1Aiv).
7. Pour chaque hémisphère cortical, retirez soigneusement les méninges à l'aide d'une pince à épiler fine. En option, retirer l'hippocampe des cortices. Transférer les cortices de souris disséqués dans un deuxième plat rempli de HBSS glacé sans Ca^{2 ou} Mg^{2 et} le garder sur la glace tout en disséquant les cerveaux restants.
   REMARQUE : Effectuez les étapes suivantes dans des conditions aseptiques dans une hotte à débit laminaire.
8. Couper les cortices disséqués en petits morceaux (environ 2 à 4 mm) à l'aide de ciseaux chirurgicaux tranchants stériles ou d'un scalpel. Transférer le tissu disséqué dans un tube conique de 50 ml contenant une solution enzymatique (22,5 mL hbSS sans Ca^{2 ou} Mg^2,2,5 mL 2,5 % de trypsine). Incuber à 37 oC pendant 30 min avec une légère inversion toutes les 10 min.
9. Recueillir le tissu digéré par centrifugation à 300 x g pendant 5 min et enlever la solution enzymatique par décantation (ne pas utiliser un aspirateur à vide). Ajouter 10 ml de culture d'astrocytes et dissocier le tissu en cellules individuelles en pipetting la solution 20-30x à l'aide d'une pipette sérologique de 10 ml.
10. Filtrer la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 70 m pour minimiser les amas cellulaires et les tissus non digérés. Recueillir le filtrate dans un tube conique propre de 50 ml et ajuster le volume total à 20 ml avec des supports de culture d'astrocytes. À ce stade, évaluer l'efficacité de la dissociation corticale en mélangeant 10 L de la suspension cellulaire avec 10 l de cellules bleu trypan et les cellules de comptage avec un hémocytomètre.
    REMARQUE : Une préparation à partir de quatre cortices de souris P2-P4 donne 10 à 15 x 10⁶ cellules simples.
11. Aspirez la solution de revêtement poly-D-lysine des flacons de culture T75 et lavez-les deux fois avec de l'eau stérile. Plaquer la suspension cellulaire de 20 ml et incuber à 37 oC et 5 % de CO_2.

2. Purification et entretien des cultures d'astrocytes

REMARQUE : Effectuer tous les changements de milieux dans des conditions aseptiques dans une hotte à débit laminaire à l'aide de milieux d'astrocytes filtrés stériles (0,22 m) réchauffés à 37 oC.

1. Remplacer le support cellulaire 48 h après le placage (jour in vitro 2, DIV2).
2. Chez DIV5, remplacez les médias par des supports de culture d'astrocytes frais complétés par 10 m cytosine arabinoside (AraC).
   REMARQUE : Cette étape facilite l'élimination des cellules contaminantes, y compris les fibroblastes et d'autres cellules gliales. Il est important de traiter les cultures avec AraC pas plus de 48 h que les temps d'incubation plus longs permettra de réduire la viabilité des astrocytes.
3. Chez DIV7, changez les médias en médias de culture astrocytes sans AraC et commencez à vérifier la confluence culturelle tous les jours. Une fois que les cellules ont atteint 80% de confluence, enduit deux-T75 flacons pour chaque flacon de culture d'astrocyte non purifié avec la poly-D-lysine et incuber à 37 oC pendant au moins 8 h à la nuit.
4. Le lendemain, commencez la purification des astrocytes en secouant les flacons de culture à 180 tr/min pendant 30 min dans un incubateur orbital de secousses de 37 oC. Retirez les médias et remplacez-les par des supports de culture d'astrocytes frais. Secouer les cellules à 240 tr/min pendant 6 h dans un incubateur orbital de secousses de 37 oC. Préréchauffer 1x saline tamponnée par phosphate (PBS), média de culture d'astrocyte, et 0,25% trypsin-EDTA à 37 oC 20-30 min avant la fin de la période de secousse.
   REMARQUE : L'incubation du CO₂n'est pas nécessaire pendant les étapesde secousse. Si désiré, les médias recueillis après les étapes de 30 min et 6 h secouant peuvent être employés à la culture des microglies et des oligodendrocytes, respectivement. Le traitement araC de la culture mixte, cependant, réduira l'abondance des autres cellules gliales.
5. Retirer les flacons de culture du shaker et remplacer immédiatement le support par 10 ml de 1x PBS chaud par flacon. Retirez PBS et ajoutez 3 ml de 0,25 % trypsin-EDTA par flacon. Incuber à 37 oCet 5 % de CO 2, en vérifiant toutes les 5 min pour le détachement.
6. Une fois que les cellules se sont détachées du flacon, arrêtez la trypsinisation en ajoutant 10 ml de support de culture d'astrocyte. Transférer les astrocytes détachés à un tube conique de 50 ml et des cellules de granulés par centrifugation à 300 x g pendant 5 min. Aspirate supernatant et re-suspendre les cellules dans 40 mL de médias de culture d'astrocytes.
7. Laver les flacons T75 recouverts de poly-D-lysine deux fois avec de l'eau stérile et une plaque de 20 ml de suspension astrocyte purifiée. Retour à l'incubateur de CO₂ de 37 oC et 5 %. Changer le support de culture d'astrocyte tous les deux jours pendant 10 jours supplémentaires jusqu'à ce que les astrocytes mûrissent.
   REMARQUE : Chaque flacon T75 d'astrocytes purifiés devrait être suffisant pour produire 2 nouveaux flacons T75 avec 3 x 10⁵ cellules chacun au placage.
8. Répétez les étapes 2,5 à 2,7 pour les passages subséquents ou pour plaquer les astrocytes pour la microscopie.
   REMARQUE : La pureté des cultures d'astrocytes après l'ajout de l'AraC et la purification suivante peut être évaluée qualitativement par microscopie de brightfield, ou plus précisément en quantifiant le pourcentage de protéine d'acide fibrillaire glial (GFAP)-positif cellules par champ de vision dans les images fluorescentes (Figure 1B,C).

3. Transfection de plasmides marqués fluorescents

1. La veille de la transfection ou de l'étiquetage, les astrocytes de graines à la densité désirée pour l'imagerie 24 à 48 h après la transfection. Une densité recommandée pour les plaques de 24 puits ou les puits de fond en verre de 14 mm est de 2 x 10⁴ cellules/puits.
   REMARQUE : Ce protocole est optimisé pour la transfection des astrocytes plaqués sur des couvercles en verre de 12 mm sur des plaques de 24 puits ou des puits de fond en verre de 14 mm à l'aide d'une méthode à base de lipofection. Les réactifs doivent être mis à l'échelle en fonction de la taille du plat de culture dans lequel les astrocytes poussent.
2. Diluer le réactif lipofection (Table of Materials) dans un support à sérum réduit ( Tableau desmatériaux). Pour optimiser le rapport de réactif lipofection à l'ADN, testez une gamme de dilutions adéquates. Par exemple, si vous utilisez le réactif utilisé dans ce protocole (Tableau des matériaux),diluez 2, 3, 4 et 5 L du réactif lipofection dans 50 l de supports à sérum réduit.
3. Diluer 5 g d'ADN de haute pureté dans 250 l de supports à sérum réduit. Ajouter 5 ll de réactif d'améliorateur de lipofection (Tableau des matériaux). Combinez le tube contenant le réactif lipofection avec un volume égal du mélange d'améliorateur d'ADN-lipofection. Mélanger par pipetting et incuber à température ambiante (RT) pendant 15 min.
4. Retirez le support de culture d'astrocyte et ajoutez le mélange de transfection (étape 3.3) aux cellules dropwise. Après une incubation de 6 h à 37 oC et 5 % de CO_2,remplacez le complexe de transfection par un volume approprié de supports de culture d'astrocytes (2 ml pour des plats en verre de 14 mm). Incuber pendant 24 à 72 h supplémentaires avant de procéder à l'acquisition d'image. Surveillez de près la durée de l'étape d'incubation afin d'atteindre le meilleur équilibre entre l'expression des protéines et la viabilité cellulaire.

4. Étiquetage des endosomes/lysosomes tardifs à l'aide de sondes fluorescentes

REMARQUE : Certaines cargaisons peuvent être étiquetées à l'aide de colorants fluorescents ayant une forte affinité pour les protéines spécifiques à la cargaison. L'exemple suivant permet l'étiquetage des endosomes/lysosomes tardifs avec une sonde acidotrope fluorescente.

1. Diluer la sonde d'étiquetage lysosmal (Tableaudes matériaux) dans 200 l de la culture des astrocytes à une concentration de travail de 1 M et appliquer aux astrocytes à partir de l'étape 3.1 à une densité de 2 x 10⁴ cellules/puits. Incuber pendant 30 min à 37 oC.
2. Laver les cellules une fois avec des supports de culture astrocyte chaud et remplacer par des supports d'imagerie (Tableau des matériaux). Procédez immédiatement à l'imagerie en direct.

5. Acquisition d'images à l'aide d'un système d'imagerie time-lapse

REMARQUE : L'imagerie en temps partiel doit être réalisée à l'aide d'un microscope à fluorescence équipé d'une caméra haute vitesse, d'une mise au point précise, d'une chambre d'incubation et d'un objectif d'huile 40x avec une ouverture numérique élevée (p. ex., Plan-Apochromat 1.4NA). Une variété de logiciels d'acquisition est disponible pour l'imagerie en accéléré. La sélection du système de microscopie et du logiciel d'acquisition devrait être basée sur leur disponibilité et leur pertinence pour les objectifs de l'étude particulière. Quelques lignes directrices générales sont fournies ci-dessous.

1. Placez la chambre de culture ou le plat dans l'adaptateur approprié sur la scène du microscope. À l'aide de la lumière épifluorescence, sélectionnez les cellules qui expriment des protéines fluorescentes ou une sonde pour enregistrer. Ajuster l'éclairage fluorescent de l'échantillon pour visualiser la cellule sélectionnée à l'aide de l'appareil photo numérique. Évitez d'utiliser un éclairage élevé qui pourrait causer le blanchiment photo et la phototoxicité. Ajuster la mise au point et le zoom.
2. Acquérir une seule série de time-lapse Z-stack à une fréquence de 1 cadre tous les 2 s pour des intervalles de temps allant de 300 s à 500 s en utilisant le zoom et les fonctions de mise au point définies.
   REMARQUE : La dynamique du trafic (vitesse, fréquence des mouvements, etc.) varie en fonction de la protéine d'intérêt, de fait, le temps d'acquisition peut nécessiter un ajustement. Par exemple, les mitochondries sont moins motiles que les lysosomes et présentent de fréquentes pauses. Dans ce cas, il est plus approprié d'ajuster les paramètres d'acquisition à 1 cadre tous les 5 s pour 800 s.
3. Enregistrez des images en accéléré et exportez-les sous forme de fichiers AVI ou TIFF stack.

6. Analyse d'image

REMARQUE : L'analyse d'image a été effectuée à l'aide du plugin KymoToolBox pour ImageJ/Fiji¹⁶. Des instructions écrites détaillées étape par étape sont disponibles en ligne¹⁷. Les étapes abrégées suivantes devraient être suffisantes pour créer les kymographes et extraire les paramètres de transport des particules.

1. Ouvrez la séquence d'images en time-lapse dans le logiciel ImageJ/Fiji. Importez des images du menu Fichier sous forme de fichiers AVI ou TIFF stack. Convertissez les images en 8 bits ou 16 bits en sélectionnant l'un de ces types d'images à l'aide de l'outil Type dans le menu Image. Si vous travaillez avec des fichiers RGB, divisez les canaux à l'aide de l'outil Split Channel disponible sous la fonction Couleur dans le menu Image.
2. Pour générer un kymographe (représentation en position et temps des trajectoires de particules), tracez chaque piste dans laquelle les particules se déplacent en traçant une ligne le long des trajectoires des particules à l'aide de l'outil de ligne segmentée. Pour assigner correctement la directionnalité du mouvement, dessiner la polyligne en utilisant la même convention directionnelle souhaitée pour tous les films afin que la polarité soit cohérente à l'intérieur et à travers toutes les cellules étudiées. Par exemple, dessinez la polyligne du centre de la cellule vers la périphérie ou vice versa. Ajustez la largeur de la ligne pour qu'elle corresponde à l'épaisseur de la piste en cliquant en deux clics sur l'outil Line.
3. Exécutez la macro Draw Kymo du plugin KymoToolBox en utilisant une largeur de ligne de 10. Une demande rapide de calibrer l'image dans le temps (nombre d'images, taux d'image) et l'espace (x,y résolution) apparaîtra. Une fois calibrés, les kymographes sont générés et peuvent être enregistrés sous forme de fichiers TIFF pour la présentation des données ou une analyse plus poussée des particules.
4. Attribuez des trajectoires de particules en suivant manuellement chaque particule dans le kymographe à l'aide de l'outil de ligne segmentée pendant toute la durée de l'acquisition. Enregistrez chaque trajectoire de particules comme une région d'intérêt (ROI) à l'aide de l'outil de gestionnaire de retour sur investissement trouvé dans le menu Analyse/Outils. Enregistrez tous les RRO par vidéo time-lapse pour une analyse plus approfondie.
   REMARQUE : Il est essentiel d'attribuer la trajectoire correcte pour les particules individuelles sur le kymographe afin d'obtenir le calcul le plus précis des paramètres de transport.
   1. Exécutez la macro Analyze Kymo du plugin KymoToolBox. Une fenêtre s'ouvrira pour définir la direction « extérieure » du mouvement des particules (de gauche à droite ou vice versa) à partir du menu déroulant. Cette sélection dépend de la position des cargaisons fluorescentes représentées par rapport au noyau ou à la périphérie cellulaire, tel qu'établi à l'étape 6.2. Par exemple, si le noyau est positionné à gauche des cargaisons et que la polyligne à l'étape 6.2 a été tirée du noyau, définissez le mouvement extérieur des particules comme étant « de gauche à droite ».
   2. Définissez la vitesse limite (vitesse minimale à laquelle une cargaison est considérée comme motile) dans la fenêtre Analyze Kymo. Pour les cargaisons qui se déplacent à des vitesses de transport intracellulaires rapides, 0,1 m/seconde est un choix approprié. Modifier cette valeur pour ajuster la sensibilité du logiciel à chaque cargaison d'intérêt. Ajustez la largeur de la ligne pour correspondre à l'épaisseur de chaque trajectoire de particules.
   3. Sélectionnez le journal toutes les données et Log options de coordonnées extrapolées dans la fenêtre Analyze kymo. Ceci calculera divers paramètres de transport de cargaison, y compris la vitesse moyenne, la vitesse vers l'intérieur, la vitesse extérieure, la distance cumulative parcourue, la distance parcourue dans la direction vers l'intérieur ou vers l'extérieur, le nombre d'interrupteurs pour chaque particule, le pourcentage de temps se déplaçant dans chaque direction ou en pause, etc. Les données calculées pour les pistes individuelles sont ensuite mises en commun par kymographe et enregistrées dans des fichiers texte spécifiques à chaque image.
      REMARQUE: L'option Show Colored Kymo de Analyze Kymo macro génère une couverture de couleur codée du chemin sur le kymographe d'origine. Les particules qui voyagent vers l'extérieur sont colorées en vert, vers l'intérieur en rouge et les particules stationnaires en bleu. Le rapport coordonne l'option Stack originale de la macro Analyze Kymo génère une couverture codée en couleur de la position de l'objet extrapolé sur la vidéo et le kymographe en time-lapse d'origine.

Representative Results

Le protocole pour établir les astrocytes mD primaires de souris décrits ci-dessus devrait produire des cultures reproductibles et de haute qualité. Bien que les cultures contiennent initialement un mélange d'astrocytes, de fibroblastes et d'autres cellules gliales, y compris les microglies et les oligodendrocytes (figure1Bi,Biv; pointes de flèches rouges), l'ajout d'AraC à la culture mixte entre DIV5-DIV7 minimise la prolifération de ces cellules contaminantes. Le traitement araC combiné et la stratégie de purification à base de secousses enrichissent la pureté des cultures astrocytes (Figure 1Bii) par rapport aux protocoles traditionnels qui n'incluent que les étapes de purification (Figure 1Bv; bleu pointes de flèches)¹³. La morphologie et la composition attendues (évaluées par LE GFAP et la coloration 4',6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]) des cultures d'astrocytes purifiés traitées avec AraC ou non traitées est montrée dans la figure 1Biii,Bvi. La quantification du pourcentage des cellules GFAP^par champ de vision (rapport du nombre de cellules avec coloration GFAP au nombre total de cellules identifiées par la coloration DAPI) montre une augmentation de plus de 27% de pureté avec la supplémentation AraC (figure1 C). Cette culture d'astrocyte de souris de haute pureté convient à l'évaluation de l'ARN et de l'expression de protéine, de la morphologie de cellules, et d'autres essais fonctionnels.

Nous avons utilisé la transfection à base de lipofection pour exprimer des versions étiquetées GFP de la protéine cx43 et du transporteur EAAT1 dans les astrocytes murines. Cette méthodologie permet l'expression transitoire des protéines à des niveaux qui sont optimaux pour l'imagerie cellulaire vivante sans causer de toxicité ou affecter la viabilité des astrocytes (Figure 2A,E). De même, l'utilisation d'une sonde fluorescente a permis un étiquetage rapide et efficace des organites endo-lysosomals acides (Figure 2I) pour suivre leur dynamique dans les astrocytes.

La figure 2 montre les résultats représentatifs des analyses de la dynamique du fret chez les astrocytes transfectés avec EAAT1-GFP, Cx43-GFP, ou étiquetés avec un colorant sélectif qui reconnaît les vésicules endolysomal acides. Chacune de ces cargaisons est apparue comme un ponctum fluorescent décorant la région périnucléaire, le cytosol et les processus des astrocytes (figure2A,E,I, panneaux gauches). Les données time-lapse ont été utilisées pour générer des kymographes qui suivent le mouvement de la cargaison dans le temps et l'espace (Figure2A,E,I, panneauxdroit). Dans ces kymographes, le mouvement antérograde et rétrograde de la cargaison indiquée est représenté par des trajectoires avec des pentes négatives (lignes vertes) et positives (lignes rouges), respectivement. Les vésicules stationnaires sont représentées sous forme de trajectoires verticales (lignes bleues). L'analyse de Kymograph a révélé que les trois types de cargaison analysés subissent un transport bidirectionnel avec des courses rapides et processoires occasionnelles dans les deux directions. En outre, la quantification du flux d'une cargaison à travers une zone de l'astrocyte (boîte rouge) a révélé des différences dans le pourcentage de particules motiles parmi les cargaisons. Par exemple, alors que 70 % des puncta EAAT1-GFP sont stationnaires (figure 2B), moins de 20 % des Cx43-GFP (figure 2F) et 45 % des cargaisons endolysosomal étiquetées par sonde (figure 2J) sont non motielles. Ces différences de motilité entre les cargaisons sont probablement représentatives de leur motilité normale de base dans la région de l'astrocyte où les films ont été acquis.

La cartographie précise du changement de position X-Y le long de l'échelle de temps plein pour chaque particule obtenue à partir du kymographe peut également être utilisée pour évaluer d'autres paramètres de mouvement, tels que la vitesse de chargement (Figure 2C,G,K) et la longueur de l'exécution (distance voyagé) (Figure 2D,H,L). Les paramètres de mouvement peuvent être analysés plus en détail pour les cargaisons individuelles afin de déterminer les changements de directionnalité du mouvement (mouvement antérograde vs mouvement rétrograde) ainsi que les renversements dans la direction des particules du mouvement, le nombre de pauses, etc. Les résultats de ces types d'analyses peuvent fournir des informations quantitatives significatives concernant les changements dans la distribution cellulaire des organelles et des protéines membranaires dans les astrocytes dans des conditions basales ou anormales dans le intra- et extracellulaire l'environnement.

Figure 1 : Établissement de cultures primaires d'astrocytes de souris.
(A) Étapes requises pour la dissection des cerveaux de souris P2-P4. (B) (i,iv) Images Brightfield de cultures gliales mixtes traitées (i) et non traitées (iv) avec AraC. Les pointes de flèche s'indiquent des microglies contaminantes. (ii,v) ) Images de cultures d'astrocytes purifiés traitées (ii) et non traitées (v) avec AraC. Les pointes de flèche bleues indiquent les oligodendrocytes contaminants. (iii,vi) Images confocales des cultures purifiées d'astrocyte traitées (iii) et non-traitées (vi) avec AraC. Green montre la coloration GFAP et d'étiquettes DAPI (bleu) tous les noyaux. (C) Pourcentage de cellules GFAP-positives. Les données représentent la moyenne de l'essai teM. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Analyses quantitatives de la dynamique du fret chez les astrocytes.
(A,E,I) Panneaux gauches : Astrocytes exprimant EAAT1-GFP (A), Cx43-GFP (E) ou traités avec une sonde qui étiquette les endosomes tardifs et les lysosomes (I). Les boîtes rouges indiquent les régions utilisées pour analyser la dynamique des particules. Panneaux droits : Kymographes originaux et codés en couleur montrant les trajectoires des cargaisons indiquées. Les lignes rouges représentent les cargaisons rétrogrades, les cargaisons antiérogrades des lignes vertes et les cargaisons non motielles des lignes bleues. (B,F,J) Pourcentage de particules fixes et motiles. (C,G,K) Quantification de la vitesse antérograde et rétrograde et (D,H,L) longueur de course. Les données représentent la moyenne de SEM. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Ici, nous décrivons une approche expérimentale pour exprimer, visualiser, et suivre les organites fluorescents marqués et les protéines de membrane d'intérêt utilisant la microscopie vidéo time-lapse dans les astrocytes corticales corticaux primaires de souris de haute pureté de MD. Nous énoncions également une méthodologie de mesure de la dynamique des particules. La visualisation directe de la dynamique des protéines et des organites dans les astrocytes primaires fournit un outil puissant pour étudier la régulation du transport intracellulaire dans ces cellules in vitro.

La méthodologie pour établir les cultures d'astrocytes MD de souris décrites ci-dessus combine des étapes d'autres protocoles publiés^13,14,15, qui se traduit à la fois par une méthode plus simple et dans une plus grande pureté et qualité Cultures. La combinaison du traitement AraC¹⁵ et de la purification à base de secousses^13,14 peut produire des cultures d'astrocytes avec une pureté aussi élevée que 98% (évaluée par le rapport des cellules totales de GFAP), ce qui, dans notre exemple, une augmentation de 27 % de la pureté par rapport aux cultures soumises aux étapes de purification seulement (figure 1B,C). Les cultures de haute pureté des astrocytes de souris obtenues avec cette méthode sont semblables aux valeurs rapportées pour les cultures d'astrocytes de rat (évaluées par des essais enzymatiques et la microscopie électronique) par McCarthy et deVellis^14. Cependant, la méthode McCarthy/deVellis, qui n'inclut pas le traitement AraC, nécessite une étape plus longue de secousse (15-18 h) et deux tours supplémentaires de purification¹⁴.

Dans notre exemple, nous montrons que ce protocole est suffisamment sensible pour capturer les différences de motilité entre les différentes protéines membranaires et organites des astrocytes, qui sont probablement représentatifs de leurs itinéraires intracellulaires individuels et cellulaires fonction. Bien que notre exemple démontre l'utilité de ce protocole dans les conditions de base, cette méthodologie peut être facilement adaptée pour mesurer les paramètres de transport dans un large éventail de questions de recherche. Par exemple, des protocoles similaires avec des modifications mineures pourraient être utilisés pour caractériser les événements de transport dans les astrocytes in vitro en réponse à l'environnement intra- ou extracellulaire, tels que les dommages cellulaires, la toxicité, les mutations pathogènes, l'activité synaptique (en cultures mixtes de neurones et d'astrocytes), etc. De même, la co-expression et la visualisation de cargaisons multiples ou d'organites, chacune étiquetée individuellement avec différents fluorophores, peuvent également être utilisées pour évaluer les changements dynamiques dans la co-localisation et la formation complexe, les interactions transitoires entre les organites , et des événements de transport de recyclage endocytique et de membrane.

Le succès de la méthodologie présentée ici repose principalement sur la capacité d'obtenir des cultures d'astrocytes de haute qualité et sur l'étiquetage efficace des cargaisons d'intérêt. Lors de l'utilisation de cette procédure pour l'imagerie en direct, il est important de surveiller de près l'expression fluorescente pour déterminer le temps optimal d'incubation post-transfection. En moyenne, nous avons constaté que pour les cargaisons analysées une période d'incubation de 24 heures se traduit par une bonne intensité de signal pour l'acquisition d'imagerie en direct. L'incubation prolongée d'astrocytes transfectés peut entraîner une forte expression de protéines étiquetées fluorescentes, ce qui peut induire l'agrégation des protéines, modifiant ainsi la localisation et la dynamique des cargaisons, et diminuant la santé des cultures. Les astrocytes sont très vulnérables aux dommages physiques et aux changements dans l'environnement culturel, ce qui peut conduire à l'induction de réponses transcriptionnelles et cellulaires, y compris la réactivité. Par conséquent, il est essentiel de réduire les intervalles de temps entre les étapes de lavage, et de minimiser l'exposition des cultures à l'air et à des changements significatifs de température ou d'intensité lumineuse au cours des périodes d'incubation et d'acquisition.

En résumé, les méthodes présentées ici peuvent être utilisées pour évaluer et quantifier les changements dynamiques dans la localisation des protéines et des organelles dans les astrocytes. Ils fournissent des outils précieux qui permettent l'examen des changements dans les réponses astrocytiques dans des conditions physiologiques et pathologiques.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.5% Trypsin (10x)	Gibco	15090-046
Benchtop Centrifuge	Thermo Scientific	75-203-637	Sorvall ST8 Centrifuge
Cell Culture Grade Water	Gen Clone	25-511
Cell Culture Microscope	Zeiss	WSN-AXIOVERT A1	Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities
Cytosine Arabinoside	Sigma	C1768-100MG	(AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage
DAPI	Sigma	D9542-5MG	Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.
Dissecting Microscope	Zeiss		Stemi 305
Dissecting Scissors	F.S.T	14558-09
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gen Clone	25-500
Fetal Bovine Serum	Gemini	100-106	Heat-Inactivated
FIJI (Fiji is Just Image J)	NIH	Version 1.52i
Fine Tip Tweezers	F.S.T	11254-20	Style #5
Fluorescence light source	Excelitas	012-63000	X-Cite 120Q
GFAP antibody	Cell Signaling	3670S	GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody
Glass Bottom Dishes	Mattek corporation	P35G-1.5-14-C	35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated
Graefe Forceps	F.S.T	11054-10	Graefe Iris Forceps with curved tips
Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes)	Life Technologies	L7526	LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.
Hank's Balanced Salt Solution (10x)	Gibco	14065-056	Magnesium and calcium free
Imaging Media	Life Technologies	A14291DJ	Live Cell Imaging Solution
Inverted Confocal Microscope	Zeiss		LSM 780
KymoToolBox			https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Lipofection Enhancer Reagent	Life Technologies	11514015	Plus Reagent
Lipofection Reagent	Life Technologies	15338100	Lipofectamine LTX reagent
Orbital shaking incubator	New Brunswick Scientific	8261-30-1008	Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control
Penicillin/Strepomycin solution (100x)	Gen Clone	25-512
Phosphate Buffered Saline (10x)	Gen Clone	25-507x
Poly-D-Lysine Hydrobromide	Sigma	P7405	Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing
Reduced serum medium	Gibco	31985-062	OPTI-MEM
Tissue Culture Flasks	Olympus Plastics	25-209	75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap
Tissue culture incubator	Thermo Scientific	51030285	HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control
Tris-Base	Sigma	T1503	8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Tris-HCl	Sigma	T3253	4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200072
Vacuum-Driven Filter Systems	Olympus Plastics	25-227	500 ml, PES membrane, 0.22 µm
Vannas scissors straight	Roboz	RS-5620