Astrositlerde Organeller ve Diğer Kargoların Hücre İçi Taşınmasının Görselleştirilmesi ve Analizi

Summary

Burada, organellerin hücre içi naklini ve murine astrositlerinde plazma membran proteinlerinin ticaretini görselleştirmek için in vitro canlı görüntüleme yöntemini açıklıyoruz. Bu protokol aynı zamanda kargo taşımacılığı güzergahları ve kinetik belirlemek için bir görüntü analizi metodolojisi sunar.

Abstract

Astrositler yetişkin beyninde en bol hücre tipleri arasında yer alır, onlar fonksiyonların çokluğu önemli rol oynarlar. Beyin homeostaz merkezi bir oyuncu olarak, astrositler hayati metabolitleri ve tampon ekstrasellüler su, iyonlar ve glutamat ile nöronkaynağı. "Üçlü" sinapsayrılmaz bir bileşeni olan astrositler, sinapsların oluşumunda, budamasında, bakımında ve modülasyonunda da önemlidir. Bu son derece etkileşimli fonksiyonları etkinleştirmek için, astrositler kendi aralarında ve diğer glial hücreler, nöronlar, beyin vaskülatürü ve hücre dışı çevre ile hücre içeren özel membran proteinleri çok sayıda iletişim yapışma molekülleri, aquaporinler, iyon kanalları, nörotransmitter taşıyıcılar ve boşluk bağlantı molekülleri. Bu dinamik akı desteklemek için, astrositler, nöronlar gibi, sıkı koordine ve verimli hücre içi taşıma güveniyor. Hücre içi ticaretin yaygın olarak açıklandığı nöronların aksine, astrositlerde mikrotübül bazlı ulaşım daha az çalışılmıştır. Bununla birlikte, hücre zarı proteinlerinin ekolog ve endositik ticareti ve hücre içi organel nakli astrositlerin normal biyolojisini düzenler ve bu süreçler genellikle hastalıktan veya yaralanmaya yanıt olarak etkilenir. Burada kültür yüksek kaliteli murine astrositler için basit bir protokol savuruyoruz, floresan astrositik proteinleri ve organelleri ilgi çekici olarak etiketlemek ve zaman atlamalı konfokal mikroskopi kullanarak hücre içi aktarım dinamiklerini kaydetmek için. Ayrıca, mevcut görüntü analiz yazılımlarını (imageJ/FIJI) eklentilerini kullanarak edinilen filmlerden ilgili taşıma parametrelerinin nasıl ayıklanıp ölçültüldünü de gösteriyoruz.

Introduction

Astrositler yetişkin merkezi sinir sisteminde en bol hücrelerdir, onlar benzersiz gelişimsel ve homeostatik fonksiyonları gerçekleştirmek^{nerede 1}. Astrositler, nörotransmitter reseptörleri, taşıyıcılar ve sinaps oluşumunu kolaylaştıran hücre adezyon moleküllerini içeren üçlü sinapsların bir parçası olarak pre-ve postsinaptik terminallerle doğrudan temas yoluyla sinaptik gelişimi modüle eder. ve nöron-astrosit iletişimi². Buna ek olarak, astrositler sinaptik iletimi aktif olarak kontrol eder ve sinaptik yarıktan çıkarıcı nörotransmitterleri hızla çıkararak nöronal eksitotoksisiteyi önler, nörotransmitterleri geri dönüştürer ve sinaptik budama da^{katılır3 , 4.2.2 , 5.000 , 6}. Bu son derece etkileşimli fonksiyonları etkinleştirmek için, astrositler kendi aralarında iletişim kurmak, diğer glial hücreleri ile, ve özel membran proteinleri aracılığıyla nöronlar ile, hücre adezyon molekülleri de dahil olmak üzere, aquaporins, iyon kanalları, nörotransmitter taşıyıcılar ve boşluk kavşak molekülleri. Astrositler, hücre içi ve hücre dışı ortamlarındaki dalgalanmalara yanıt olarak buproteinlerin yüzey düzeylerini aktif olarak değiştirirler 7. Ayrıca, astrosit fonksiyonu için gerekli olan mitokondri, lipid damlacıkları ve bozunatif ve geri dönüşüm organellerinin seviyelerinde ve dağılımındaki değişiklikler enerji arzını, metabolit kullanılabilirliğini ve hücresel temizleme süreçlerini modüle eder ve Hayatta kalma.

Membran protein ve organel ticareti ve astrositlerde konumlandırma dinamik değişiklikler motor proteinlerve adaptörlerin uyumlu fonksiyonu ile kolaylaştırılır kargo hareketliliği teşvik^8,9. Benzer şekilde, membran proteinlerinin yüzey seviyeleri içselleştirme ve geri dönüşüm olayları ile modüle edilir¹⁰. Bu kargolar aktin, mikrotübüller ve muhtemelen ara filamentler parça karmaşık bir ağ üzerinden taşınır⁸. Büyüyen mikrotübül artı uçlarında biriken son bağlayıcı protein 1'in (EB1) immünororesans boyamasını temel alan çalışmalar, mikrotübüllerin astrosit demetlerinde perinükleustan dışarı yayılarak artı uçlarını çevre¹¹. Ancak, canlı hücre görüntüleme kullanarak mikrotübüller ve diğer sitoskeletal elementlerin organizasyon ve polarite kapsamlı bir inceleme hala eksiktir. Organellerin ve membran proteinlerinin dinamiğinin altında yatan mekanizmaların çoğu nöronlarda ve diğer hücre tiplerinde kapsamlı bir şekilde incelenmekle birlikte, astrositlerde kargo hareketliliği daha az anlaşılmaktadır. Astrositlerde protein ve organel dağılımındaki değişiklikler hakkındaki mevcut bilgilerimizin çoğu, kargo dinamiklerinin hassas mekansal ve zamansal incelemesini engelleyen sabit preparatın geleneksel antikor bazlı etiketlemesini temel alıyor^{7, 12. Yıl.}

Burada, yüksek saflıkta birincil fare astrosit kültürlerinde canlı görüntüleme için membran proteinleri ve organelleri etiketlemek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokolü kullanarak, transfekte astrositlerde yeşil floresan proteinin (GFP) etiketli membran proteinlerinin dinamik lokalizasyonunu izlediğimiz, gap kavşak proteinconnexin 43 (Cx43-GFP) ve uyarıcı amino asit dahil olmak üzere örnekler salıyoruz. taşıyıcı 1 (EAAT1-GFP). Ayrıca asidik organelleri görselleştirmek ve canlı astrositlerde insan ticareti dinamiklerini takip etmek için floresan asiotropik prob kullanımını da tanımlıyoruz. Son olarak, tek tek kargolar için taşıma parametrelerini ayıklamak ve değerlendirmek için hızlandırılmış verilerin nasıl analiz edilebildiğini gösteriyoruz.

Protocol

Tüm hayvan prosedürleri Chapel Hill Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) Kuzey Carolina Üniversitesi onayı ile yapıldı.

1. Beyin diseksiyonu ve birincil fare astrositkültürü

NOT: Aşağıdaki protokol, McCarthy ve deVellis^13,14,15tarafından geliştirilen orijinal prosedürü takip eden yayınlanmış yöntemlerden uyarlanmıştır. McCarthy/deVellis (MD) astrositlerinin karışık hücre kültürleri doğum sonrası 2−4 (P2−P4) fare kortekslerinden hazırlanır, anti-mitotik faktörle tedavi edilir ve nihai zenginleştirilmiş astrosit kültürünü ortaya çıkarmak için saflaştırılır. Her iki cinsten fare yavrularından dört korteks bir T75 doku kültürü şişesi kültürü oluşturmak için yeterlidir.

1. T75 şişelerinin alt kısmını (%100 açılı boyun erişimi, 0,22 m hidrofobik havalandırmalı filtre kapağı) poli-D-lizin (0,1 M Tris tamponunda 1 mg/mL, pH 8,5) ve diseksiyon başlamadan önce 24 saat için 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
2. Diseksiyon işlemine başlamadan önce, 37 °C'de usturit kültür medyasının (Dulbecco modifiye Eagle'S medium [DMEM] yüksek glikozu, %10 ısı-inaktive fetal sığır serumu, %1 penisilin/streptomisin) 37 °C'de sıcak 30 mL aliquot'u buzüzerinde %2,5 tripsin eritmesi. Ca²⁺ veya Mg²⁺olmadan Hank'in dengeli tuz çözeltisinin (HBSS) 6 mL'si ile dolu buz üzerinde iki kesme yemeği (60 mm çapında) hazırlayın.
3. Her diseksiyonöncesinde ve arasında %70 etanolde tüm cerrahi aletleri (ince uçlu cımbız, makas diseksiyon, Vannas makas düz, Graefe kavisli uçlu) %70 etanol de dezenfekte edin.
4. P2−P4 fare yavrularının baş ve boyunlarını %70 etanol ile püskürtün ve cerrahi makasla kafa larını keserek hızla ötenazi edin. Kafatası ortaya çıkarmak için kafa derisi boyunca ön orta hat kesi için bir posterior gerçekleştirin. Kafatasını boynundan buruna kadar dikkatlice kesin.
5. Gözlere göre iki ek lateral kesi yapın. Ince uçlu cımbız kullanarak kafatası kapaklarını hafifçe yana çevirin. Beyni çıkarın ve Ca²⁺ veya Mg²⁺olmadan buz gibi HBSS ile dolu ilk kesişen tabağa yerleştirin. Çanak buz üzerinde tutun ve beyin geri kalanı hasat devam edin.
   NOT: Diseksiyon işleminin geri kalanını bir diseksiyon kapsamı altında gerçekleştirin.
6. Vannas makas veya ince cımbız kullanarak koku ampulleri çıkarın (Şekil1Ai). Enine ve interhemisferik fissürlerin kesiştiği noktada ki kavisli uç forceps ile, nazikçe korteks ve diensefalon arasında kavisli uç forceps ikinci bir çift takın, yavaş yavaş geri kalanından serebral hemisfer ayırmak için çerseps açılması beyin (Şekil 1Aii,Aiii). İstenmeyen dokuyu çıkarın (Şekil 1Aiv).
7. Her kortikal yarımküre için, dikkatle ince ucu cımbız ile menenjler kaldırın. İsteğe bağlı olarak, kortekslerden hipokampus kaldırın. İncelenmiş fare kortekslerini Ca²⁺ veya Mg²⁺ olmadan buz gibi HBSS ile dolu ikinci bir tabağa aktarın ve kalan beyinleri parçalarken buzüzerinde tutun.
   NOT: Sonraki adımları aseptik koşullar altında laminar akış kaputunda gerçekleştirin.
8. İncelenmiş kortikleri steril keskin cerrahi makas veya neşter kullanarak küçük parçalara (yaklaşık 2−4 mm) kesin. İncelenen dokuyu enzim solüsyonu içeren 50 mL konik tüpe transfer edin (Ca²⁺ veya Mg²⁺olmadan 22,5 mL HBSS , 2,5 mL %2,5 tripsin). 37 °C'de 30 dk'da her 10 dakikada bir hafif inversiyon ile kuluçkaya yatırın.
9. 5 dk için 300 x g santrifüj ile sindirilmiş doku toplamak ve dekantasyon (vakum aspiratör kullanmayın) ile enzim çözeltisi kaldırmak. 10 mL astrosit kültür ortamı ekleyin ve 10 mL serolojik pipet kullanarak çözeltiyi 20−30x pipetleyerek dokuyu tek hücrelere ayırın.
10. Hücre kümelerini ve sindirilmemiş dokuyu en aza indirmek için hücre süspansiyonuna 70 μm'lik bir süzgeçten süzün. Temiz bir 50 mL konik tüp içinde filtrat toplamak ve astrosit kültür medya ile 20 mL toplam hacmi ayarlayın. Bu noktada, 10 μL'lik hücre süspansiyonunu 10 μL trypan mavisi ile karıştırarak kortikal dissosinasyonun etkinliğini değerlendirin ve hücreleri hemositometre ile sayın.
    NOT: Dört P2−P4 fare korteksinden bir preparat 10−15 x 10⁶ tek hücre verir.
11. T75 kültür şişelerinden poli-D-lizin kaplama çözeltisini aspire edin ve steril suyla iki kez yıkayın. Plaka 20 mL hücre süspansiyon ve inkübat 37 °C ve 5% CO₂.

2. Astrosit kültürlerinin arıtMa ve sürdürülmesi

NOT: 37 °C'ye ısıtılan steril filtreli (0,22 μm filtre membranı) astrosit ortamı kullanarak laminar akış kaputunda aseptik koşullar altında tüm ortam değişikliklerini gerçekleştirin.

1. Kaplamadan sonra hücre ortamını 48 saat değiştirin (gün in vitro 2, DIV2).
2. DIV5'te, medyayı 10 μM sitozin arabinoside (AraC) ile desteklenen taze astrosit kültür ortamıile değiştirin.
   NOT: Bu adım, fibroblastlar ve diğer glial hücreler de dahil olmak üzere kirletici hücrelerin uzaklaştırılmasını kolaylaştırır. Daha uzun kuluçka süreleri astrosit canlılığını azaltacaktır.
3. DIV7'de, arac olmadan astrosit kültür medyasını değiştirin ve kültür birleşimini her gün kontrol etmeye başlayın. Hücreler %80 birleştiğinde, her saflaştırılmış astrosit kültür şişesi için poli-D-lizin ve inkübat 37 °C'de en az 8 saat ila bir gecede iki-T75 şişekat.
4. Ertesi gün, 37 °C orbital sallayarak inkübatör 30 dakika için 180 rpm kültür şişeleri sallayarak astrosit arınma başlar. Ortamı çıkarın ve taze astrosit kültür ortamı ile değiştirin. 37 °C orbital sallayarak inkübatör 6 saat için 240 rpm hücreleri çalkalayın. Prewarm 1x fosfat tamponlu salin (PBS), astrosit kültür ortamı ve %0.25 tripsin-EDTA için 37 °C 20−30 dk sallayarak dönemin bitiminden önce.
   NOT: Co₂kuluçka sıkışma adımları sırasındagerekli değildir. İstenirse, 30-dk ve 6-h sallayarak adımlar sonra toplanan medya kültür microglia ve oligodendrocytes için kullanılabilir, sırasıyla. Karışık kültürün AraC tedavisi, ancak, diğer glial hücrelerin bolluğunu azaltacaktır.
5. Kültür şişelerini çalkalayıcıdan çıkarın ve ortamı şişe başına 10 mL sıcak 1x PBS ile hemen değiştirin. PBS'yi çıkarın ve şişe başına %0,25 tripsin-EDTA 3 mL ekleyin. 37 °C ve %5 CO2'de kuluçkaya yatırın, her 5 dakikada bir müfreze için kontrol edin.
6. Hücreler şişeden ayrıldıktan sonra, 10 mL astrosit kültür ortamı ekleyerek tripsinizasyonu durdurun. Müstakil astrositleri 5 00 mL konik tüp ve pelet hücrelerine 5 dk. Aspire süpernatant için 300 x g santrifüj ile aktarın ve astrosit kültür medyasının 40 mL'lik hücrelerini yeniden askıya alın.
7. Poli-D-lizin kaplı T75 şişelerini steril su ve saflaştırılmış astrosit süspansiyonun 20 mL plakası ile iki kez yıkayın. 37 °C ve %5 CO₂ kuluçka makinesine geri dönün. Astrositler olgunlanına kadar 10 gün boyunca her iki günde bir astrosit kültür medyasını değiştirin.
   NOT: Saflaştırılmış astrositlerin her T75 şişesi kaplama da 3 x 10⁵ hücreleri ile 2 yeni T75 şişeleri üretmek için yeterli olmalıdır.
8. Sonraki geçişler için veya mikroskopi için plaka astrositleri için 2.5−2.7 adımlarını tekrarlayın.
   NOT: AraC eklenmesi nden sonra astrosit kültürlerin saflığı ve arınma takibi brightfield mikroskobu ile niteliksel olarak veya glial fibrillary asit proteini (GFAP)-pozitif yüzdesi ölçülerek daha doğrusu değerlendirilebilir floresan görüntülerde görüş alanı başına hücreler (Şekil1B,C).

3. Floresan etiketli plazmidlerin transfeksiyonu

1. Transfeksiyon veya etiketlemeden bir gün önce, 24−48 saat post-transfection görüntüleme için istenilen yoğunlukta tohum astrositleri. 24 kuyulu plakalar veya 14 mm cam alt kuyular için önerilen yoğunluk 2 x 10⁴ hücre/kuyudur.
   NOT: Bu protokol, 12 mm cam kapaklı 12 mm cam kapaklı astrositlerin 24 kuyulu plakalar veya 14 mm cam alt kuyularda lipofection tabanlı bir yöntem kullanılarak transfeksiyonu için optimize edilebiyiz. Reaktifler astrositlerin yetiştikleri kültür yemeğinin büyüklüğüne bağlı olarak ölçeklendirilmelidir.
2. Azaltılmış serum lu ortamda (MalzemeTablosu) lipofection reaktifini seyreltin. Lipofection reaktifinin DNA'ya oranını optimize etmek için, bir dizi yeterli seyreltme testi yapın. Örneğin, bu protokolde kullanılan reaktifikullanıyorsanız (Malzeme Tablosu), 50 μL azaltılmış serum lu ortamda lipofection reaktifinin 2, 3, 4 ve 5'li l'lerini seyreltin.
3. Azaltılmış serum lu ortam250 μL'de 5 μg yüksek saflıkta DNA seyreltin. 5 μL lipofection arttırıcı reaktif (MalzemeTablosu)ekleyin. Lipofection reaktifini içeren tüpü DNA-lipofection arttırıcı karışımının eşit hacmiyle birleştirin. 15 dakika oda sıcaklığında (RT) pipetleme ve kuluçka ile karıştırın.
4. Astrosit kültür ortamını kaldırın ve hücrelere transfeksiyon karışımı (adım 3.3) ekleyin. 37 °C ve %5 CO 2'de6 saatlik kuluçkadan sonra transfeksiyon kompleksini uygun bir astrosit kültür ortamı hacmiyle (14 mm cam alt tabaklar için 2 mL) değiştirin. Görüntü edinimi devam etmeden önce ek bir 24−72 saat için kuluçka. Protein ekspresyonu ve hücre canlılığı arasında en iyi dengeyi sağlamak için kuluçka adımının süresini yakından izleyin.

4. Floresan problar kullanılarak geç endozomların/lyzozomların etiketlemi

NOT: Bazı kargolar floresan boyalar kullanılarak etiketlenebilir ve kargoya özgü proteinlere karşı yüksek afiyetlidir. Aşağıdaki örnek, geç endozomların/lyzozomların floresan asidozotropik probu ile etiketlenmesine izin verir.

1. Astrosit kültür medyasının 200μL'lik lysosomal etiketleme sondasını (Malzeme Tablosu) 1 μM'lik bir çalışma konsantrasyonuna seyreltin ve 2 x 10⁴ hücre/kuyu yoğunluğunda 3.1'den itibaren astrositlere uygulayın. 37 °C'de 30 dk kuluçka.
2. Hücreleri sıcak astrosit kültür ortamıyla bir kezyıkayın ve görüntüleme ortamı (Tablo Malzemeler) ile değiştirin. Hemen canlı görüntülemeye geçin.

5. Hızlandırılmış görüntüleme sistemi kullanarak görüntü edinimi

NOT: Hızlandırılmış canlı görüntüleme, yüksek hızlı kamera, kesin odaklama, kuluçka odası ve yüksek sayısal diyafram açıklığına sahip 40x yağ hedefi (örneğin, Plan-Apochromat 1.4NA) ile donatılmış floresan mikroskobu kullanılarak yapılmalıdır. Hızlandırılmış görüntüleme için çeşitli satın alma yazılımları mevcuttur. Mikroskopi sistemi ve satın alma yazılımının seçimi, belirli bir çalışmanın amaçlarına uygunluk ve kullanılabilirlik lerine dayanmalıdır. Bazı genel yönergeler aşağıda verilmiştir.

1. Kültür odasını veya kabını mikroskop aşamasında uygun adaptöre yerleştirin. Epifloresan ışığını kullanarak, floresan proteinleri ifade eden hücre(ler)'i veya kaydetmek için sondayı seçin. Dijital kamerayı kullanarak seçili hücreyi görselleştirmek için floresan örnek aydınlatmayı ayarlayın. Fotobeyaztasyon ve fototoksisiteye neden olabilecek yüksek aydınlatma kullanmaktan kaçının. Odak ve yakınlaştırmayı ayarlayın.
2. Zum ve kesin odaklama işlevlerini kullanarak 300 s ile 500 s arasında değişen zaman aralıkları için her 2 s'de 1 karelik bir frekansta tek z-stack zaman atlamalı seri elde edin.
   NOT: Kaçakçılık dinamiği (hız, hareket sıklığı, vb.) ilginin proteinine bağlı olarak değişir, bu nedenle edinme süresi nin ayarlanması gerekebilir. Örneğin, mitokondri lizozomlar daha az hareketli ve sık duraklamalar sergilemek. Bu durumda, edinme parametrelerini 800 s için her 5 s'de 1 kare olarak ayarlamak daha uygundur.
3. Hızlandırılmış görüntüleri kaydedin ve bunları AVI veya TIFF yığın dosyaları olarak dışa aktarın.

6. Görüntü analizi

NOT: ImageJ/Fiji¹⁶için KymoToolBox eklentisi kullanılarak görüntü analizi yapıldı. Ayrıntılı adım adım yazılı talimatlar online¹⁷mevcuttur. Aşağıdaki kısaltılmış adımlar kymographs oluşturmak ve parçacık taşıma parametrelerini ayıklamak için yeterli olmalıdır.

1. ImageJ/Fiji yazılımında hızlandırılmış görüntü dizisini açın. Dosya menüsünden görüntüleri AVI veya TIFF yığın dosyaları olarak aktarın. Resim menüsünden Tür aracını kullanarak bu görüntü türlerinden birini seçerek görüntüleri 8 bit veya 16-bit'e dönüştürün. RGB dosyalarıyla çalışıyorsanız, Görüntü menüsündeki Renk özelliği nin altında bulunan Split Channel aracını kullanarak kanalları bölün.
2. Bir kymograph (parçacık yörüngelerinin konumu ve zamanı temsili) oluşturmak için, parçacıklar segmentli çizgi aracını kullanarak parçacıkların yörüngeleri boyunca bir çizgi izleyerek hareket eden her parça çizin. Hareketin yönünü doğru bir şekilde atamak için, incelenen tüm hücrelerde ve tüm hücrelerde polaritenin tutarlı olması için tüm filmler için aynı istenilen yön kuralını kullanarak poliline çizin. Örneğin, hücrenin merkezinden çevreye doğru poliline çizin veya tam tersi. Çizgi aracını çift tıklatarak çizgi genişliğini parçanın kalınlığıyla eşleşecek şekilde ayarlayın.
3. 10 çizgi genişliği kullanarak KymoToolBox eklentisinin Draw Kymo makroçalıştırın. Görüntüyü zaman (kare sayısı, kare hızı) ve boşluk (x,y çözünürlüğü) olarak kalibre etmek isteyen bir istem görüntülenir. Kalibre edildikten sonra, kymographs oluşturulur ve veri sunumu veya daha fazla parçacık analizi için TIFF dosyaları olarak kaydedilebilir.
4. Kazanım boyunca segmentli çizgi aracını kullanarak kymograph'taki her parçacığı el ile izleyerek parçacık yörüngelerini atayın. Çözümleme/Araçlar menüsünde bulunan YG yöneticisi aracını kullanarak her parçacık yörüngesini ilgi alanı (YG) olarak kaydedin. Daha fazla analiz için her hızlandırılmış video başına tüm ROI'ları kaydedin.
   NOT: Taşıma parametrelerinin en doğru hesaplanmasını sağlamak için mimografüzerindeki tek tek parçacıklar için doğru yörüngenin ataması çok önemlidir.
   1. KymoToolBox eklentisinin Analiz Kymo makroçalıştırın. Açılan menüden parçacık hareketinin "dışa doğru" yönünü (soldan sağa veya tam tersi) tanımlamak isteyen bir pencere açılır. Bu seçim, 6.2 adımda belirtildiği gibi, çekirdek veya hücre çevresine göre görüntülenen floresan kargoların konumuna bağlıdır. Örneğin, çekirdek kargoların soluna yerleştirilmişse ve 6.2.
   2. Analiz Kymo penceresinde limit hızını (bir kargonun hareketli olarak kabul edildiği minimum hız) tanımlayın. Hızlı hücre içi taşıma hızlarında hareket eden kargolar için 0,1 m/saniye uygun bir seçimdir. Yazılımın ilgi çeken her kargoya karşı hassasiyetini ayarlamak için bu değeri değiştirin. Çizgi genişliğini her parçacık yörüngesinin kalınlığıyla eşleşecek şekilde ayarlayın.
   3. Tüm verileri Günlüğe kaydedin ve Kymo'yu Analiz Et penceresinde ekstrapolated koordinat seçeneklerini kaydedin. Bu, ortalama hız, içe doğru hız, dışa doğru hız, seyahat edilen kümülatif mesafe, içe veya dışa doğru seyahat edilen mesafe, her parçacık için anahtar sayısı, zaman yüzdesi dahil olmak üzere çeşitli kargo taşıma parametrelerini hesaplar her yönde hareket eden veya duraklatılmış, vb. Tek tek parçalar için hesaplanan veriler daha sonra kymograph başına biraraya gelir ve her görüntüye özgü metin dosyalarına kaydedilir.
      NOT: Analyze Kymo makro'nun Renkli Kymo göster seçeneği, orijinal kymograph üzerinde yolun renk kodlu bir bindirmesini oluşturur. Dışa doğru hareket eden parçacıklar yeşil, içe doğru kırmızı ve sabit parçacıklar mavi renkterendir. Analiz Kymo makrosunorijinal Yığın da Rapor Koordinatları, tahmin edilen nesnenin orijinal hızlandırılmış video ve kymograph üzerindeki konumunun renk kodlu bir bindirmesini oluşturur.

Representative Results

Yukarıda özetlenen birincil fare MD astrositleri oluşturmak için protokol tekrarlanabilir, yüksek kaliteli kültürler vermelidir. Kültürler başlangıçta astrositler, fibroblastlar ve mikroglia ve oligodendrositler (Şekil1Bi,Biv; kırmızı ok başları) dahil olmak üzere diğer glial hücrelerin bir karışımını içermesine rağmen, ARAC'nin DIV5-DIV7 arasındaki karışık kültüre eklenmesi en aza indirgenmiştir. bu kirletici hücrelerin çoğalması. Kombine AraC tedavi ve sallayarak tabanlı arınma stratejisi astrosit kültürlerin saflığını zenginleştirir (Şekil1Bii) sadece arınma adımları içeren geleneksel protokoller üzerinde (Şekil1Bv; mavi ok başları)¹³. AraC ile tedavi edilen veya tedavi edilmeyen arınmış astrosit kültürlerin beklenen morfolojisi ve bileşimi (GFAP ve 4',6-diamidino-2-fenilindole [DAPI] boyama tarafından değerlendirilir) Şekil1Biii,Bvi'degösterilmiştir. GFAP⁺ hücrelerin in görüş alanı başına yüzdesi (GFAP boyama ile hücre sayısının DAPI boyama ile tanımlanan toplam hücre sayısına oranı) AraC takviyesi ile saflıkta %27'nin üzerinde bir artış göstermektedir (Şekil1 C). Bu yüksek saflıkta fare astrosit kültürü RNA ve protein ekspresyonu, hücre morfolojisi ve diğer fonksiyonel tahlillerin değerlendirilmesi için uygundur.

Gap junction protein Cx43 ve eaat1 taşıyıcımin murine astrositlerinde GFP etiketli versiyonlarını ifade etmek için lipofection tabanlı transfeksiyon kullandık. Bu metodoloji, proteinlerin canlı hücre görüntülemesi için en uygun düzeyde, toksisiteye neden olmadan veya astrosit canlılığını etkilemeden geçici olarak ifade edilmesine olanak sağlar (Şekil2A,E). Benzer şekilde, floresan sonda kullanımı astrositlerde dinamiklerini izlemek için asidik endo-lysozomal organellerin (Şekil2I) hızlı ve etkili bir şekilde etiketlenmesine izin ver.

Şekil 2, EAAT1-GFP, Cx43-GFP ile geçici olarak aktarılan veya asidik endolysomal vezikülleri tanıyan seçici boya ile etiketlenmiş astrositlerde kargo dinamiği analizlerinin temsili sonuçlarını göstermektedir. Bu kargoların her biri perinükleer bölgeyi, sitosolu ve astrosit süreçlerini süsleyen floresan bir paçık olarak ortaya çıkmıştır (Şekil2A,E,I, sol paneller). Zaman atlamalı veriler, zaman ve mekandaki kargo hareketini izleyen mimograflar oluşturmak için kullanılmıştır (Şekil2A,E,I, sağ paneller). Bu mimograflarda, belirtilen kargonun anterograd ve retrograd hareketi sırasıyla negatif (yeşil çizgiler) ve pozitif (kırmızı çizgiler) eğimli yörüngelerle temsil edilir. Sabit veziküller dikey yörüngeler (mavi çizgiler) olarak gösterilir. Kymograph analizi, analiz edilen üç tip kargonun her iki yönde de hızlı ve işlem gerektiren çift yönlü taşımacılıktan geçtiğini ortaya koymuştur. Ayrıca, astrosit (kırmızı kutu) bir alan üzerinden bir kargo akı nicelik kargolar arasında hareketli parçacıkların yüzdesi farklılıkları ortaya koymuştur. Örneğin, EAAT1-GFP punctalarının %70'i sabit iken (Şekil2B),Cx43-GFP 'nin %20'sinden azı (Şekil2F) ve prob etiketli endolysomal kargoların %45'i (Şekil2J)hareketsizdir. Kargolar arasındaki hareketlilik teki bu farklılıklar, filmlerin edinildiği astrosit bölgesindeki normal, temel hareketliliklerinin büyük olasılıkla temsilcisidir.

Kymografdan elde edilen her bir parçacık için x-y pozisyonundaki değişimin kesin haritalaması, kargo hızı (Şekil 2C,G,K)ve çalışma uzunluğu (mesafe) gibi diğer hareket parametrelerini değerlendirmek için de kullanılabilir. gezdi) (Şekil 2D,H,L). Hareket parametreleri, hareketin yön tuşlarındaki değişiklikleri (anterograd vs retrograd hareket) ve parçacık hareketi yönünde geri dönüşleri, duraklama sayısı vb. belirlemek için tek tek kargolar için daha fazla analiz edilebilir. Bu tür analizlerin sonuçları, intra-ve hücre dışı olarak bazal veya anormal koşullar altında astrositlerde organellerin ve membran proteinlerinin hücresel dağılımındaki değişikliklere ilişkin anlamlı nicel bilgiler sağlayabilir. Ortam.

Şekil 1: Birincil fare astrosit kültürlerinin kurulması.
(A) P2−P4 fare beyinlerinin diseksiyonu için gerekli adımlar. (B) (i,iv) AraC ile tedavi edilen ve tedavi edilmeyen(iv)karışık glial kültürlerin Brightfield görüntüleri. Kırmızı ok uçları kirletici mikrogliayı gösterir. (ii,v) AraC ile tedavi edilenvetedavi edilmeyen (v)arınmış astrosit kültürlerinin görüntüleri. Mavi ok uçları kirletici oligodendrositleri gösterir. (iii,vi) AraC ile tedavi edilenvetedavi edilmeyen (vi)saf astrosit kültürlerinin konfokal görüntüleri. Yeşil GFAP boyama ve DAPI (mavi) etiketleri tüm çekirdekleri gösterir. (C) GFAP pozitif hücrelerin yüzdesi. Veriler ortalama ± SEM. ***p < 0.001, eşleşmemiş t-testini temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Astrositlerde kargo dinamiklerinin nicel analizleri.
(A,E,I) Sol paneller: EAAT1-GFP (A), Cx43-GFP (E) ifade eden veya geç endozom ve lizozomları etiketleyen bir sonda ile tedavi edilen astrositler(I). Kırmızı kutular parçacık dinamiklerini analiz etmek için kullanılan bölgeleri gösterir. Sağ paneller: Belirtilen kargolar için yörüngeleri gösteren orijinal ve renk kodlu kymographs. Kırmızı çizgiler retrograd hareket eden kargolar, yeşil çizgiler anterograd-hareketli kargolar ve mavi çizgiler olmayan hareketli kargolar temsil eder. (B,F,J) Sabit ve hareketli parçacıkların yüzdesi. (C,G,K) Anterograd ve retrograd hızın sayısallaştırılması ve (D,H,L)çalışma uzunluğu. Veriler ortalama ± SEM'i temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Burada, yüksek saflıkta birincil fare kortikal MD astrositlerinde hızlandırılmış video mikroskobu kullanarak floresan etiketli organelleri ve membran proteinlerini ifade etmek, görselleştirmek ve izlemek için deneysel bir yaklaşımı tanımlıyoruz. Ayrıca parçacık dinamiklerini ölçmek için bir metodoloji anahat. Birincil astrositlerde protein ve organel dinamiğinin doğrudan görselleştirilmesi, bu hücrelerde hücre içi taşımanın düzenlenmesini in vitro olarak incelemek için güçlü bir araç sağlar.

Fare MD astrosit kültürleri kurmak için metodoloji yukarıda açıklanan diğer yayınlanan protokolleri adımları birleştirir^13,14,15, hangi hem daha basit bir yöntem ve daha yüksek saflık ve kalite sonuçları Kültür. AraC¹⁵ tedavisi ve sallayarak esaslı arınma^{kombinasyonu 13,14%} 98 gibi yüksek bir saflık ile astrosit kültürleri verebilir (GFAP oranı ile değerlendirilir⁺ hücre toplam hücreleri), hangi bizim örnek sonuçları sadece arınma adımlarına tabi tutulan kültürlere göre saflıkta %27'lik bir artış (Şekil1B,C). Bu yöntemle elde edilen fare astrositlerinin yüksek saflıktaki kültürleri, McCarthy ve deVellis¹⁴tarafından fare astrosit kültürleri (enzimatik tahliller ve elektron mikroskobu ile değerlendirilir) için bildirilen değerlere benzer. Ancak, AraC tedavisi içermeyen McCarthy/deVellis yöntemi daha uzun bir sallayarak adım (15−18 saat)ve iki ek arınma 14 tur gerektirir.

Örneğimizde, bu protokolün çeşitli membran proteinleri ve astrositlerde organeller arasındaki hareketlilik farklılıklarını yakalamak için yeterince hassas olduğunu göstermekteyiz. Işlev. Örneğimiz bu protokolün bazal koşullarda yararını gösterse de, bu metodoloji çok çeşitli araştırma soruları içinde taşıma parametrelerini ölçmek için kolayca uyarlanabilir. Örneğin, hücresel hasar, toksisite, patojenik mutasyonlar, sinaptik aktivite (in-hücre içi veya hücre dışı ortama yanıt olarak astrositlerdeki taşıma olaylarını karakterize etmek için küçük modifikasyonlarla benzer protokoller kullanılabilir( nöronların ve astrositlerin karışık kültürleri), vb. Aynı şekilde, her biri farklı floroforlarla etiketlenen birden fazla kargo veya organelin birlikte ifade edilmesi ve görselleştirilmesi, birlikte yerelleştirme ve karmaşık oluşumdaki dinamik değişiklikleri, organeller arasındaki geçici etkileşimleri değerlendirmek için de kullanılabilir. , ve endositik ve membran geri dönüşüm taşıma olayları.

Burada sunulan metodolojinin başarısı öncelikle yüksek kaliteli astrosit kültürleri elde etme yeteneğine ve kargo(lar)ın etkin bir şekilde etiketleme yeteneğine dayanmaktadır. Canlı görüntüleme için bu yordamı kullanırken, en uygun transfeksiyon sonrası kuluçka süresini belirlemek için floresan ekspresyonu yakından izlemek önemlidir. Ortalama olarak, kargolar için 24-h kuluçka dönemi analiz canlı görüntüleme edinimi için iyi sinyal yoğunluğu sonuçları bulundu. Transfected astrositlerin uzun süreli kuluçka, protein agregasyonuna neden olabilecek, böylece kargo lokalizasyonunu ve dinamiği değiştirerek kültürlerin sağlığını azaltan floresan etiketli proteinlerin yüksek ekspresyonuna neden olabilir. Astrositler fiziksel hasara ve kültür ortamındaki değişikliklere karşı çok savunmasızdır, bu da transkripsiyonel ve hücresel tepkilerin indüksiyonuna yol açabilir, buna reaktivite de dahil. Bu nedenle, yıkama adımları arasındaki zaman aralıklarını azaltmak ve kültürlerin havaya maruz kalmasını ve kuluçka ve edinim dönemlerinde sıcaklık veya ışık yoğunluğunda önemli değişikliklere maruz kalmalarını en aza indirmek önemlidir.

Özetle, burada sunulan yöntemler astrositlerde protein ve organel lokalizasyonundaki dinamik değişimleri değerlendirmek ve ölçmek için kullanılabilir. Fizyolojik ve patolojik koşullar altında astrositik tepkilerdeki değişikliklerin incelenmesine izin veren değerli araçlar sağlarlar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.5% Trypsin (10x)	Gibco	15090-046
Benchtop Centrifuge	Thermo Scientific	75-203-637	Sorvall ST8 Centrifuge
Cell Culture Grade Water	Gen Clone	25-511
Cell Culture Microscope	Zeiss	WSN-AXIOVERT A1	Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities
Cytosine Arabinoside	Sigma	C1768-100MG	(AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage
DAPI	Sigma	D9542-5MG	Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.
Dissecting Microscope	Zeiss		Stemi 305
Dissecting Scissors	F.S.T	14558-09
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gen Clone	25-500
Fetal Bovine Serum	Gemini	100-106	Heat-Inactivated
FIJI (Fiji is Just Image J)	NIH	Version 1.52i
Fine Tip Tweezers	F.S.T	11254-20	Style #5
Fluorescence light source	Excelitas	012-63000	X-Cite 120Q
GFAP antibody	Cell Signaling	3670S	GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody
Glass Bottom Dishes	Mattek corporation	P35G-1.5-14-C	35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated
Graefe Forceps	F.S.T	11054-10	Graefe Iris Forceps with curved tips
Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes)	Life Technologies	L7526	LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.
Hank's Balanced Salt Solution (10x)	Gibco	14065-056	Magnesium and calcium free
Imaging Media	Life Technologies	A14291DJ	Live Cell Imaging Solution
Inverted Confocal Microscope	Zeiss		LSM 780
KymoToolBox			https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Lipofection Enhancer Reagent	Life Technologies	11514015	Plus Reagent
Lipofection Reagent	Life Technologies	15338100	Lipofectamine LTX reagent
Orbital shaking incubator	New Brunswick Scientific	8261-30-1008	Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control
Penicillin/Strepomycin solution (100x)	Gen Clone	25-512
Phosphate Buffered Saline (10x)	Gen Clone	25-507x
Poly-D-Lysine Hydrobromide	Sigma	P7405	Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing
Reduced serum medium	Gibco	31985-062	OPTI-MEM
Tissue Culture Flasks	Olympus Plastics	25-209	75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap
Tissue culture incubator	Thermo Scientific	51030285	HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control
Tris-Base	Sigma	T1503	8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Tris-HCl	Sigma	T3253	4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200072
Vacuum-Driven Filter Systems	Olympus Plastics	25-227	500 ml, PES membrane, 0.22 µm
Vannas scissors straight	Roboz	RS-5620