Visualisering en analyse van intracellulair transport van organellen en andere Cargo's in astrocyten

Summary

Hier beschrijven we een in vitro Live-imaging methode om intracellulair transport van organellen en de handel in plasma membraan eiwitten in muriene astrocyten te visualiseren. Dit protocol presenteert ook een analysemethode voor het vrachtvervoer en kinetiek.

Abstract

Astrocyten behoren tot de meest overvloedige celtypen in het volwassen brein, waar ze belangrijke rollen spelen in een veelheid van functies. Als een centrale speler in de hersenen homeostase, astrocyten leveren neuronen met vitale metabolieten en buffer extracellulaire water, ionen, en glutamaat. Een integraal onderdeel van de "Tri-partite" Synapse, astrocyten zijn ook kritisch in de vorming, snoeien, onderhoud, en modulatie van synapsen. Om deze zeer interactieve functies mogelijk te maken, communiceren astrocyten onderling en met andere gliacellen, neuronen, de hersen-vasculatuur en de extracellulaire omgeving door een veelheid aan gespecialiseerde membraan eiwitten die cel bevatten adhesiemoleculen, aquaporinen, ionenkanalen, neurotransmitter transporters, en gap-junction moleculen. Ter ondersteuning van deze dynamische flux, zijn astrocyten, net als neuronen, afhankelijk van strak gecoördineerd en efficiënt intracellulair transport. In tegenstelling tot neuronen, waar intracellulaire handel uitgebreid is afgebakend, is het op microtubulus gebaseerde transport in astrocyten minder bestudeerd. Niettemin, Exo-en endocytaire handel in celmembraan eiwitten en intracellulaire organel transport regelt de normale biologie van astrocyten, en deze processen worden vaak aangetast door ziekte of als reactie op letsel. Hier presenteren we een eenvoudig protocol om hoge kwaliteit Murine astrocyten te kweken, om astrocytische eiwitten en organellen van belang fluorescentisch te labelen en om hun intracellulaire transport dynamiek op te nemen met behulp van time-lapse confocale microscopie. We laten ook zien hoe relevante transport parameters uit de gekochte films kunnen worden uitgepakt en gekwantificeren met behulp van de beschikbare software voorbeeld analyse (d.w.z. ImageJ/FIJI) plugins.

Introduction

Astrocyten zijn de meest voorkomende cellen in het centrale zenuwstelsel van de volwassene, waar ze unieke ontwikkelings-en homeostatische functies uitvoeren¹. Astrocyten moduleren synaptische ontwikkeling door direct contact met pre-en postsynaptisch terminals als onderdeel van de Tri-partite Synapse, die bevat neurotransmitter receptoren, transporters, en celadhesie moleculen die Synapse vorming vergemakkelijken en neuron-astrocyten communicatie². Bovendien, astrocyten actief controle synaptische transmissie en voorkomen neuronale excitotoxicity door het snel verwijderen van excitatory neurotransmitters uit de synaptische gespleten, recycling neurotransmitters, en deelnemen aan synaptische snoeien^{3 , 4 , 5 , 6}. om deze zeer interactieve functies mogelijk te maken, communiceren astrocyten onderling, met andere gliacellen en met neuronen via gespecialiseerde membraan proteïnen, waaronder celadhesie moleculen, aquaporinen, ionenkanalen, neurotransmitter transporteurs, en gap junction moleculen. Astrocyten veranderen actief de oppervlakte niveaus van deze eiwitten in reactie op schommelingen in hun intra-en extracellulaire omgeving⁷. Bovendien, veranderingen in de niveaus en de verdeling van de mitochondriën, lipide druppeltjes, en degradatieve en recycling organellen moduleren energietoevoer, metaboliet beschikbaarheid, en cellulaire clearing processen die essentieel zijn voor de functie van de astrocyten en Overleving.

De dynamische veranderingen in membraan proteïne en organel-handel en positionering in astrocyten worden vergemakkelijkt door de gezamenlijke functie van motor eiwitten en adapters die de beweeglijkheid van de lading bevorderen^8,9. Evenzo worden de oppervlakte niveaus van membraan proteïnen gemoduleerd door middel van internalisatie en recycling evenementen¹⁰. Deze cargo's worden getransporteerd via een ingewikkeld netwerk van actin, microtubuli, en eventueel tussenliggende filamenten tracks⁸. Studies op basis van immunofluorescentie kleuring van end-binding proteïne 1 (EB1), die zich ophogt bij de groeiende microtubulus plus uiteinden, suggereren dat in astrocyten bundels van microtubuli uit de perinucleons uitstralen en hun plus einde uitbreiden naar de periferie¹¹. Echter, een uitgebreid onderzoek van de organisatie en de polariteit van microtubuli en andere cytoskelet elementen met behulp van Live-celbeeldvorming ontbreekt nog. Hoewel veel van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de dynamiek van organellen en membraan eiwitten uitvoerig zijn bestudeerd in neuronen en andere celtypen, is de beweeglijkheid van de lading in astrocyten minder goed begrepen. De meeste van onze huidige kennis over veranderingen in de eiwit-en organel verdeling in astrocyten is gebaseerd op traditionele etikettering van vaste stoffen op basis van antilichamen, die het precieze ruimtelijke en temporele onderzoek van Cargo Dynamics⁷uitsluit^{, 12}.

Hier beschrijven we een methode om membraan eiwitten en organellen te labelen voor Live beeldvorming in primaire muis astrocyten culturen. Met behulp van dit protocol, bieden we voorbeelden waarin we de dynamische lokalisatie van groene fluorescerende eiwitten (GFP)-gelabelde membraan eiwitten in getransfunteerde astrocyten, waaronder de gap junction Protein connexin 43 (Cx43-GFP) en het excitatory aminozuur Transporter 1 (EAAT1-GFP). We beschrijven ook het gebruik van een fluorescerende acidotrope sonde om zure organellen te visualiseren en de dynamiek van hun handel in levende astrocyten te volgen. Ten slotte laten we zien hoe u de timelapse-gegevens analyseert om transport parameters voor individuele ladingen te extraheren en te evalueren.

Protocol

Alle dier procedures werden uitgevoerd met de goedkeuring van de Universiteit van North Carolina bij Chapel Hill Animal Care and use Committee (IACUC).

1. hersen dissectie en cultuur van primaire muis astrocyten

Opmerking: het volgende protocol is aangepast aan de gepubliceerde methoden, die de oorspronkelijke procedure volgt die is ontwikkeld door McCarthy en devellis^13,14,15. Gemengde celculturen van McCarthy/deVellis (MD) astrocyten worden bereid uit postnatale dag 2 − 4 (P2 − P4) muis cortices, behandeld met een anti-mitotische factor, en gezuiverd tot de uiteindelijke verrijkte astrocyten cultuur. Vier cortices van muis pups van beide seks zijn voldoende om één T75 weefselcultuur kolf cultuur te genereren.

1. Mantel de bodem van T75 kolven (100% schuine halsopening, 0,22 μm hydrofoob ventilerende filter dop) met poly-D-Lysine (1 mg/mL in 0,1 M Tris-buffer, pH 8,5) en incuberen bij 37 °C gedurende 24 uur vóór aanvang van de dissectie.
2. Voor aanvang van de dissectie procedure, warm 30 mL van de astrocyten kweekmedia (Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium [DMEM] hoge glucose, 10% warmtegeïnactiveerd foetaal serum, 1% peniciloot/streptomycine) bij 37 °C en ontdooit een 5 mL aliquot van 2,5% trypsine op ijs. Bereid twee ontsneden gerechten (60 mm diameter) op ijs gevuld met 6 mL van de gebalanceerde zoutoplossing van Hank (HBSS) zonder CA^{2 +} of mg^{2 +}.
3. Desinfecteer alle chirurgische hulpmiddelen (fijne punt pincet, ontleed schaar, vannas schaar recht, Graefe pincet met gebogen uiteinden) in 70% ethanol vóór en tussen elke sectie.
4. Spuit het hoofd en de nek van de P2 − P4 muis pups met 70% ethanol voordat u ze snel euthanateren door het onthoofding met een chirurgische schaar. Voer een posterieure van anterieure middellijn incisie langs de hoofdhuid om de schedel bloot te leggen. Snijd de schedel voorzichtig van de nek naar de neus.
5. Voer twee extra laterale incisies superieur aan de ogen. Gebruik fijne pincet om de schedel kleppen voorzichtig naar de zijkant te draaien. Verwijder de hersenen en plaats deze in de eerste ontleden Dish gevuld met ijskoude HBSS zonder CA^{2 +} of mg^{2 +}. Houd het gerecht op ijs en ga verder met het oogsten van de rest van de hersenen.
   Opmerking: Voer de rest van de dissectie procedure uit onder een ontleed bereik.
6. Verwijder de olfactorische bollen met Vannas schaar of fijne pincet (Figuur 1AI). Met de gebogen punt Tang op het snijpunt van de dwars-en interhemiferische kloven, plaatst u zachtjes een tweede paar gebogen punt Tang tussen de cortex en diencephalon, waarbij u langzaam de Tang opent om de hersenhelften van de rest van de hersenen (Figuur 1AII, AIII). Verwijder het ongewenste weefsel (Figuur 1AIV).
7. Voor elke corticale hemisfeer, verwijder voorzichtig de hersenvliezen met fijne tip pincet. Verwijder desgewenst de hippocampus van de cortices. Breng de ontleed muis cortices over in een tweede gerecht gevuld met ijskoude HBSS zonder CA^{2 +} of mg^{2 +} en houd het op ijs terwijl de overgebleven hersenen worden ontleed.
   Opmerking: Voer de volgende stappen onder aseptische omstandigheden uit in een laminaire stroom afzuigkap.
8. Snijd de ontsneden cortices in kleine stukjes (ongeveer 2 − 4 mm) met behulp van steriele scherpe chirurgische schaar of een scalpel. Breng het ontleed weefsel over in een conische buis van 50 mL met enzym oplossing (22,5 mL HBSS zonder CA^{2 +} of mg^{2 +}, 2,5 ml 2,5% trypsine). Incuberen bij 37 °C gedurende 30 minuten met zachte inversie elke 10 min.
9. Verzamel het verteerde weefsel door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten en verwijder de enzym oplossing door decantatie (gebruik geen vacuüm aspirator). Voeg 10 mL astrocyten kweekmedia toe en dissocieren het weefsel in afzonderlijke cellen door de oplossing 20 − 30x te pipetteren met behulp van een serologische Pipet van 10 mL.
10. Filtreer de celsuspensie door een 70 μm celzeef om celklonten en onverteerd weefsel te minimaliseren. Vang het filtraat op in een schone 50 mL conische buis en stel het totale volume in op 20 mL met astrocyten kweekmedia. Evalueer op dit punt de efficiëntie van de corticale dissociatie door 10 μL celsuspensie te mengen met 10 μL trypaan blauw en cellen te tellen met een hemocytometer.
    Opmerking: een preparaat van vier P2 − P4 muis cortices levert 10 − 15 x 10⁶ enkelvoudige cellen op.
11. Aspireren de poly-D-Lysine coating oplossing uit de T75 cultuur kolven en was tweemaal met steriel water. Plaat de 20 mL celsuspensie en incuberen bij 37 °C en 5% CO₂.

2. zuivering en instandhouding van de astrocyten culturen

Opmerking: Voer alle media wijzigingen uit onder aseptische omstandigheden in een laminaire stroom afzuigkap met behulp van steriel gefilterd (0,22 μm filtermembraan) astrociet-media opgewarmd tot 37 °c.

1. Vervang de celmedia 48 h na plating (dag in vitro 2, DIV2).
2. Op DIV5, vervang de media met verse astrociet cultuur media aangevuld met 10 μM Cytosine uracilarabinoside (araC).
   Opmerking: deze stap vergemakkelijkt het verwijderen van verontreiniging cellen, waaronder fibroblasten en andere gliacellen. Het is belangrijk om de culturen met AraC niet langer dan 48 uur te behandelen, omdat een langere incubatietijd de levensvatbaarheid van astrocyten vermindert.
3. Op DIV7, verander media naar astrociet cultuur media zonder araC en begin met het controleren van de cultuur confluentie dagelijks. Zodra de cellen 80% samenvloeiing hebben bereikt, worden twee-T75 kolven voor elke niet-gezuiverde astrociet cultuur kolf met poly-D-Lysine en geïninbroed bij 37 °c gedurende ten minste 8 uur tot 's nachts.
4. De volgende dag, begin de astrocyten zuivering door het schudden van de kweek kolven bij 180 rpm gedurende 30 min in een 37 °C orbitaal schudden incubator. Verwijder de media en vervang deze door verse astrocyten kweekmedia. Schud cellen bij 240 rpm gedurende 6 uur in een 37 °C orbitale schud incubator. Prewarm 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), astrocyten kweekmedia en 0,25% trypsine-EDTA tot 37 °C 20 − 30 min voor het einde van de schud periode.
   Opmerking: er is geen co₂-incubatie vereist tijdens de schud stappen. Indien gewenst, de media verzameld na de 30-min en 6-h schudden stappen kunnen worden gebruikt voor het kweken van Microglia en oligodendrocyten, respectievelijk. AraC behandeling van de gemengde cultuur zal echter de overvloed van de andere gliacellen verminderen.
5. Verwijder de kweek kolven uit de shaker en vervang de media onmiddellijk door 10 mL warme 1x PBS per kolf. Verwijder PBS en voeg 3 mL 0,25% trypsine-EDTA per kolf toe. Inincuberen bij 37 °C en 5% CO₂, elke 5 min controleren op loslating.
6. Zodra de cellen uit de kolf zijn losgemaakt, moet u trypsinoisatie stoppen door 10 mL astrocyten kweekmedia toe te voegen. Breng losgekoppelde astrocyten over in een conische buis en pellet cellen van 50 mL door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 min. aspirate supernatant en re-Suspendeer de cellen in 40 ml van de astrocyten cultuur media.
7. Was de poly-D-Lysine-gecoate T75 kolven tweemaal met steriel water en plaat 20 mL van de gezuiverde astrocyten suspensie. Keer terug naar de incubator 37 °C en 5% CO₂ . Verander de Astrocyt cultuur media om de twee dagen voor nog eens 10 dagen totdat astrocyten volwassen zijn.
   Opmerking: elke T75 kolf van gezuiverde astrocyten moet voldoende zijn om 2 nieuwe T75 kolven met 3 x 10⁵ cellen bij het beplating te produceren.
8. Herhaal stap 2.5 − 2.7 voor latere stadia of voor het plaat astrocyten voor microscopie.
   NB: de zuiverheid van de astrocyten culturen na de toevoeging van AraC en na zuivering kan kwalitatief worden beoordeeld door middel van brightfield microscopie, of meer bepaald door het percentage van gliacellen fibrylzuur proteïne (GFAP)-positief te kwantificeren cellen per gezichtsveld in fluorescerende afbeeldingen (Figuur 1B, C).

3. transfectie van fluorescendig gelabelde plasmiden

1. De dag voorafgaand aan de transfectie of labeling, zaad astrocyten op gewenste dichtheid voorbeeld vorming 24 − 48 h post-transfectie. Een aanbevolen dichtheid voor 24-Wells platen of 14 mm glazen bodem putjes is 2 x 10⁴ cellen/goed.
   Opmerking: dit protocol is geoptimaliseerd voor de transfectie van astrocyten verguld op 12 mm glazen dekstroken op 24-Wells platen of 14 mm glazen bodemputten met behulp van een lipofection-gebaseerde methode. De reagentia moeten worden geschaald afhankelijk van de grootte van de kweek schaal waarin de astrocyten groeien.
2. Verdun het lipofection-reagens (tabel met materialen) in gereduceerde serum media (tabel met materialen). Om de verhouding van lipofection reagens tot DNA te optimaliseren, test een aantal adequate verdunningen. Als u bijvoorbeeld het in dit Protocol gebruikte reagens gebruikt (tabel van de materialen), Verdun dan 2, 3, 4 en 5 μL van het lipofection-reagens in 50 μL van de media met verlaagd serum.
3. Verdun 5 μg hoog zuiver DNA in 250 μL van de media met verlaagd serum. Voeg 5 μL lipofection Enhancer reagens (tabel van materialen). Combineer de buis met het lipofection-reagens met een gelijk volume van de DNA-lipofection Enhancer mix. Meng door pipetteren en incuberen bij kamertemperatuur (RT) gedurende 15 minuten.
4. Verwijder astrocyten kweekmedia en voeg transfectie mix (stap 3,3) toe aan cellen dropwise. Na een incubatie van 6 uur bij 37 °C en 5% CO₂, vervangt u het transfectie complex door een geschikte hoeveelheid Astrocyt kweekmedia (2 ml voor glazen bodem gerechten van 14 mm). Incuberen voor een extra 24 − 72 h voordat u doorgaat naar de beeld verwerving. Bewaak nauwgezet de duur van de incubatie stap om de beste balans te bereiken tussen eiwit expressie en levensvatbaarheid van de cellen.

4. etikettering van late endosomes/lysosomes met fluorescentie sondes

Opmerking: sommige cargo's kunnen worden gelabeld met behulp van fluorescerende kleurstoffen met een hoge affiniteit voor Cargo-specifieke eiwitten. In het volgende voorbeeld wordt de etikettering van late endosomes/lysosomes toegestaan met een fluorescerende acidotrope sonde.

1. Verdun de lysosomale-etiketterings sonde (tafel van de materialen) in 200 μL van de cultuur van de astrocyten tot een werkconcentratie van 1 μM en breng deze aan op astrocyten uit stap 3,1 met een dichtheid van 2 x 10⁴ cellen/goed. Inincuberen gedurende 30 min bij 37 °C.
2. Was de cellen één keer met warme astrocyten cultuur media en vervang deze door Imaging media (tabel met materialen). Ga onmiddellijk naar Live Imaging.

5. Image Acquisition met behulp van een time-lapse Imaging systeem

Opmerking: timelapse-Live beelden moeten worden uitgevoerd met een fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een high-speed camera, duidelijke scherpstelling, incubatie kamer en een 40x-olie doelstelling met een hoog numeriek diafragma (bijv. plan-Apochromat 1.4 NA). Er is een verscheidenheid aan acquisitie software beschikbaar voor time-lapse Imaging. Selectie van het microscopie systeem en acquisitie software moet gebaseerd zijn op hun beschikbaarheid en geschiktheid voor de doelstellingen van de specifieke studie. Hieronder vindt u enkele algemene richtlijnen.

1. Plaats de kweekkamer of het gerecht in de juiste adapter op de Microscoop. Selecteer met behulp van epifluorescentie licht de cellen die fluorescerende eiwitten of sonde uitdrukken om op te nemen. Pas de fluorescerende monster verlichting aan om de geselecteerde cellen te visualiseren met behulp van de digitale camera. Vermijd het gebruik van hoge verlichting die fotobleaching en fototoxiciteit kan veroorzaken. Pas scherpstelling en zoomen aan.
2. Verkrijg één Z-stack time-lapse serie met een frequentie van 1 frame elke 2 s voor tijdsintervallen variërend tussen 300 s en 500 s met behulp van de zoom en duidelijke focus functies.
   Opmerking: de dynamiek van de handel (snelheid, bewegings frequentie, enz.) zal variëren afhankelijk van het eiwit van belang, dus het tijdsverloop van de overname kan aanpassing vereisen. Bijvoorbeeld, mitochondriën zijn minder beweegbaar dan lysosomen en vertonen frequente pauzes. In dit geval is het geschikter om de verwervings parameters aan te passen naar 1 frame elke 5 s voor 800 s.
3. Sla timelapse-afbeeldingen op en exporteer ze als AVI-of TIFF-stack bestanden.

6. beeldanalyse

Opmerking: beeldanalyse werd uitgevoerd met behulp van de KymoToolBox plugin voor ImageJ/Fiji¹⁶. Gedetailleerde stap-voor-stap schriftelijke instructies zijn online beschikbaar¹⁷. De volgende verkorte stappen moeten voldoende zijn om de kymografen te maken en de deeltjes transport parameters te extraheren.

1. Open time-lapse-beeld volgorde in ImageJ/Fiji-software. Importeer afbeeldingen uit het menu bestand als AVI-of TIFF-stack bestanden. Converteer de afbeeldingen naar 8-bits of 16-bits door een van deze afbeeldingstypen te selecteren met behulp van het gereedschap tekst in het menu afbeelding . Als u werkt met RGB-bestanden, splitst u kanalen met behulp van de tool splitsen kanaal beschikbaar onder de kleur functie in het menu afbeelding .
2. Om een kymograph (representatie in positie en tijd van deeltjes trajecten) te genereren, tekent u elk spoor waarin deeltjes bewegen door een lijn langs de trajecten van de deeltjes te traceren met behulp van het gesegmenteerde lijn gereedschap. Om de directionaliteit van de beweging correct toe te wijzen, tekent u de polylijn met dezelfde gewenste richtings Conventie voor alle films, zodat de polariteit consistent is binnen en tussen alle cellen die worden bestudeerd. Teken bijvoorbeeld de polylijn vanuit het midden van de cel naar de omtrek of omgekeerd. Pas de lijnbreedte aan de dikte van het spoor aan door te dubbelklikken op het gereedschap lijn .
3. Voer de macro Draw Kymo van de plug-in KymoToolBox uit met een lijnbreedte van 10. Er verschijnt een vraag om de afbeelding in de tijd te kalibreren (aantal frames, framesnelheid) en spatie (x, y-resolutie). Eenmaal gekalibreerd, worden de kymografen gegenereerd en kunnen ze worden opgeslagen als TIFF-bestanden voor gegevens presentatie of verdere deeltjes analyse.
4. Wijs deeltjes trajecten toe door elk deeltje in de kymograph handmatig te volgen met behulp van het gesegmenteerde lijn gereedschap voor de volledige duur van de overname. Noteer elk deeltjestraject als een regio van belang (ROI) met behulp van de ROI Manager -tool in het menu analyse/extra . Sla alle ROIs per timelapse-video op voor verdere analyse.
   Opmerking: het is van cruciaal belang om het juiste traject voor afzonderlijke deeltjes op de kymograph toe te wijzen om de meest nauwkeurige berekening van transport parameters te bereiken.
   1. Voer de macro analyze kymo van de plug-in KymoToolBox uit. Er wordt een venster geopend waarin wordt gevraagd de "uiterlijke" richting van de deeltjes beweging (van links naar rechts of omgekeerd) te definiëren in het vervolgkeuzemenu. Deze selectie is afhankelijk van de positie van de fluorescerende ladingen-afbeelding ten opzichte van de Nucleus of de rand van de cel, zoals vastgesteld in stap 6,2. Als de Nucleus bijvoorbeeld links van de cargo's is geplaatst en de polylijn in stap 6,2 van de Nucleus is verwijderd, definieert u de beweging van de uitwendige deeltjes als "van links naar rechts".
   2. Definieer de limiet snelheid (minimale snelheid waarmee een lading wordt beschouwd als motiel) in het venster Kymo analyseren . Voor cargo's die bij snelle intracellulaire transport snelheden bewegen, is 0,1 μm/seconde een geschikte keuze. Wijzig deze waarde om de gevoeligheid van de software voor elke lading van belang aan te passen. Pas de lijnbreedte aan de dikte van elk deeltjes traject aan.
   3. Selecteer in het venster kymo analyseren de optie alle gegevens en de Geëxtregeerde coördinaten van het logboek registreren. Dit berekent verschillende vrachttransport parameters, waaronder gemiddelde snelheid, actieve snelheid, uiterlijke snelheid, cumulatieve afgelegde afstand, afgelegde afstand in hetzij de binnen-of naar buiten richting, het aantal schakelopties voor elk deeltje, het percentage tijd bewegen in elke richting of onderbroken, enz. Gegevens die worden berekend voor afzonderlijke tracks worden vervolgens gegroepeerd per kymograph en opgeslagen in tekstbestanden die specifiek zijn voor elke afbeelding.
      Opmerking: de optie gekleurde Kymo tonen van de kymo -macro analyseren genereert een kleurgecodeerde overlay van het pad over de oorspronkelijke kymograph. Deeltjes die naar buiten reizen, zijn groen gekleurd, naar binnen rood en stationaire deeltjes in blauw. De rapport coördinaten op de oorspronkelijke stapel optie van de kymo analyseren macro genereert een kleurgecodeerde overlay van de geëxtrapoleerd object positie op de oorspronkelijke time-lapse video en kymograph.

Representative Results

Het protocol voor het instellen van de hierboven beschreven primaire muis-MD-astrocyten moet reproduceerbare, kwalitatief hoogstaande culturen opleveren. Hoewel culturen in eerste instantie een mengsel van astrocyten, fibroblasten en andere gliacellen bevatten, waaronder Microglia en oligodendrocyten (Figuur 1bi, BIV; rode pijlpunten), wordt de toevoeging van araC aan de gemengde cultuur tussen DIV5-DIV7 geminimaliseerd de proliferatie van deze contaminerende cellen. De gecombineerde AraC-behandeling en op schudden gebaseerde zuiverings strategie verrijkt de zuiverheid van de astrocyten culturen (Figuur 1bii) over traditionele protocollen die alleen de zuiveringsstappen bevatten (Figuur 1bv; blauw pijlpunten)¹³. De verwachte morfologie en samenstelling (beoordeeld met GFAP en 4 ', 6-diamidino-2-fenylindole [DAPI] kleuring) van de gezuiverde astrocyten culturen behandeld met AraC of onbehandeld, wordt weergegeven in Figuur 1Biii, bvi. Kwantificering van het percentage van de GFAP⁺ cellen per gezichtsveld (verhouding van het aantal cellen met GFAP-kleuring tot het totale aantal cellen geïdentificeerd door DAPI-kleuring) toont een toename van meer dan 27% in zuiverheid met araC-suppletie (Figuur 1 C). deze zeer zuivere muis astrocyten cultuur is geschikt voor de evaluatie van RNA-en eiwit expressie, celmorfologie en andere functionele assays.

We gebruikten lipofection-gebaseerde transfectie om GFP-Tagged versies van de gap junction Protein Cx43 en de EAAT1 transporter in Murine astrocyten te uiten. Deze methodologie maakt voorbijgaande expressie van eiwitten mogelijk op niveaus die optimaal zijn voor Live-celbeeldvorming zonder toxiciteit te veroorzaken of de levensvatbaarheid van astrocyten te beïnvloeden (Figuur 2A, E). Evenzo heeft het gebruik van een fluorescerende sonde een snelle en efficiënte etikettering van zure Endo-lysosomale organellen (Figuur 2I) toegestaan om hun dynamiek in astrocyten te volgen.

Figuur 2 toont representatieve resultaten van de analyses van de lading dynamiek in astrocyten die transitief overstroomde met EAAT1-GFP, CX43-GFP, of gelabeld met een selectieve kleurstof die zure endolysosomale blaasjes herkent. Elk van deze ladingen verscheen als een fluorescerende punctum het versieren van de perinucleaire regio, cytosol, en processen van astrocyten (Figuur 2a, E, I, linker panelen). De timelapse-gegevens werden gebruikt om kymografen te genereren die de vracht beweging in tijd en ruimte volgen (Figuur 2A, E, I, rechter panelen). In deze kymografen worden de anterograde en retrograde beweging van de aangegeven lading vertegenwoordigd door trajecten met negatieve (groene lijnen) en positieve (rode lijnen) hellingen, respectievelijk. Stationaire blaasjes worden weergegeven als verticale trajecten (blauwe lijnen). Kymograph analyse toonde aan dat de drie soorten van de lading geanalyseerd ondergaan bidirectionele transport met af en toe snelle, processieve runs in beide richtingen. Bovendien onthulde de kwantificering van de flux van een lading door een gebied van de astrocyten (rode doos) verschillen in het percentage van de motiel deeltjes onder de cargo's. Bijvoorbeeld, terwijl 70% van EAAT1-GFP puncta stationair (Figuur 2B), minder dan 20% van Cx43-GFP (Figuur 2F) en 45% van de sonde-gelabelde endolysosomale ladingen (Figuur 2J) zijn niet-motiel. Deze verschillen in beweeglijkheid onder de cargo's zijn waarschijnlijk representatief voor hun normale, Baseline beweeglijkheid in het gebied van de astrocyten waar de films werden verworven.

De precieze toewijzing van de verandering in X-Y positie langs de voltijdse schaal voor elk deeltje verkregen uit de kymograph kan ook worden gebruikt om andere bewegingsparameters te evalueren, zoals vracht snelheid (Figuur 2C, G, K) en Run length (afstand (Figuur 2D, H, L). Bewegingsparameters kunnen verder worden geanalyseerd voor individuele cargo's om veranderingen in directionaliteit van beweging te bepalen (anterograde versus retrograde Motion), evenals omkeringen in de bewegingsrichting van de beweging, het aantal pauzes, enz. De resultaten van deze soorten analyses kunnen zinvolle kwantitatieve informatie opleveren over veranderingen in de cellulaire distributie van organellen en membraan proteïnen in astrocyten onder basale of abnormale omstandigheden in de intra-en extracellulaire Milieu.

Figuur 1: oprichting van primaire muis astrocyten culturen.
A) stappen die nodig zijn voor dissectie van P2 − P4 muizenhersenen. B) (i, IV) brightfield-beelden van gemengde gliale culturen behandeld (i) en niet-behandeld (IV) met araC. Rode pijlpunten duiden op verontreiniging Microglia. (II, v) Beelden van gezuiverde astrocyten culturen behandeld (II) en niet-behandeld (v) met araC. Blauwe pijlpunten duiden op verontreiniging oligodendrocyten. (III, VI) Confocale beelden van gezuiverde astrocyten culturen behandeld (III) en niet-behandeld (VI) met araC. Groen toont GFAP kleuring en DAPI (blauw) labels alle kernen. C) percentage GFAP-positieve cellen. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM. * * * p < 0,001, ongepaarde t-toets. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: kwantitatieve analyses van de lading dynamiek in astrocyten.
(a, E, I) Linker panelen: astrocyten uitdrukken EAAT1-GFP (a), Cx43-GFP (E) of behandeld met een sonde die late endosomes en lysosomen (I) etiketten. Rode vakken geven regio's aan die worden gebruikt om de deeltjes dynamiek te analyseren. Rechter panelen: originele en kleurgecodeerde kymografen die trajecten weergeven voor de aangegeven cargo's. Rode lijnen vertegenwoordigen retrograde-bewegende cargo's, groene lijnen anterograde-Moving cargos, en blauwe lijnen niet-motile cargos. (B, F, J) Percentage stationaire en motiel deeltjes. (C, G, K) Kwantificering van anterograde en retrograde snelheid en (D, H, L) Run length. Gegevens staat voor gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Hier beschrijven we een experimentele aanpak om fluorescently gelabelde organellen en membraan eiwitten van belang te uiten, visualiseren en volgen met behulp van time-lapse video microscopie in hoge zuiverheid primaire muis corticale MD astrocyten. We schetsen ook een methodologie voor het meten van de deeltjes dynamiek. Directe visualisatie van eiwitten en organel dynamica in primaire astrocyten biedt een krachtig hulpmiddel om de regulering van intracellulair transport in deze cellen in vitro te bestuderen.

De hierboven beschreven methodologie voor het instellen van muis-MD-astrocyten culturen combineert stappen van andere gepubliceerde protocollen^13,14,15, wat resulteert in zowel een eenvoudigere methode als in hogere zuiverheid en kwaliteit Culturen. De combinatie van araC¹⁵ behandeling en schudden gebaseerde zuivering^13,14 kan astrocyten kweken met een zuiverheid zo hoog als 98% (beoordeeld door de verhouding van GFAp⁺ cellen totaal cellen), die in ons voorbeeld resulteert in een toename van 27% van de zuiverheid ten opzichte van culturen die alleen aan de zuiveringsstappen zijn onderworpen (Figuur 1B, C). De hoge zuiverheids culturen van muis astrocyten die met deze methode worden verkregen, zijn vergelijkbaar met de waarden die zijn gerapporteerd voor ratten Astrocyt culturen (beoordeeld door enzymatische assays en elektronenmicroscopie) door McCarthy en deVellis¹⁴. De McCarthy/deVellis-methode, die geen AraC-behandeling omvat, vereist echter een langere schud stap (15 − 18 uur) en twee extra reinigings rondes¹⁴.

In ons voorbeeld tonen we aan dat dit protocol voldoende gevoelig is om verschillen in beweeglijkheid vast te leggen tussen verschillende membraan proteïnen en organellen in astrocyten, die waarschijnlijk representatief zijn voor hun individuele intracellulaire routes en cellulaire Functie. Hoewel ons voorbeeld het nut van dit protocol onder basale omstandigheden aantoont, kan deze methodologie gemakkelijk worden aangepast om de transport parameters te meten binnen een breed scala aan onderzoeksvragen. Vergelijkbare protocollen met kleine aanpassingen kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om transport gebeurtenissen in astrocyten in vitro te karakteriseren in reactie op intra-of extracellulaire omgeving, zoals cellulaire schade, toxiciteit, pathogene mutaties, synaptische activiteit (in gemengde culturen van neuronen en astrocyten), enz. Evenzo kan co-expressie en visualisatie van meerdere cargo's of organellen, elk individueel gelabeld met verschillende fluor Foren, ook worden gebruikt om dynamische veranderingen in co-lokalisatie en complexe vorming te beoordelen, voorbijgaande interacties tussen organellen en transport van endocytische en membraan recyclingactiviteiten.

Het succes van de hier gepresenteerde methodologie berust voornamelijk op het vermogen om kwalitatief hoogstaande astrocyten culturen te verkrijgen en in het efficiënt labelen van de vracht (s) van belang. Bij gebruik van deze procedure voor Live beeldvorming is het belangrijk om de fluorescerende uitdrukking nauwlettend te bewaken om de optimale incubatietijd na Transfectie te bepalen. Gemiddeld, we vonden dat voor de ladingen geanalyseerd een 24-h incubatieperiode resulteert in een goede signaalintensiteit voor Live Imaging acquisitie. Langdurige incubatie van gegetransfunteerde astrocyten kan resulteren in een hoge expressie van fluorescently gelabelde eiwitten, die eiwit aggregatie kunnen induceren, waardoor de lokalisatie en dynamiek van de lading verandert en de gezondheid van de culturen afneemt. Astrocyten zijn zeer kwetsbaar voor lichamelijke schade en veranderingen in de cultuur omgeving, wat kan leiden tot inductie van transcriptionele en cellulaire responsen, inclusief reactiviteit. Daarom is het van cruciaal belang om de tijdsintervallen tussen wasstappen te verkorten en de blootstelling van de culturen aan lucht en significante veranderingen in temperatuur of lichtintensiteit gedurende de incubatie-en overname perioden te minimaliseren.

Samengevat, de hier gepresenteerde methoden kunnen worden gebruikt om dynamische veranderingen in eiwit en organel lokalisatie in astrocyten te evalueren en te kwantificeren. Ze bieden waardevolle hulpmiddelen die het mogelijk maken om veranderingen in astrocytische reacties onder fysiologische en pathologische omstandigheden te onderzoeken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.5% Trypsin (10x)	Gibco	15090-046
Benchtop Centrifuge	Thermo Scientific	75-203-637	Sorvall ST8 Centrifuge
Cell Culture Grade Water	Gen Clone	25-511
Cell Culture Microscope	Zeiss	WSN-AXIOVERT A1	Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities
Cytosine Arabinoside	Sigma	C1768-100MG	(AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage
DAPI	Sigma	D9542-5MG	Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.
Dissecting Microscope	Zeiss		Stemi 305
Dissecting Scissors	F.S.T	14558-09
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gen Clone	25-500
Fetal Bovine Serum	Gemini	100-106	Heat-Inactivated
FIJI (Fiji is Just Image J)	NIH	Version 1.52i
Fine Tip Tweezers	F.S.T	11254-20	Style #5
Fluorescence light source	Excelitas	012-63000	X-Cite 120Q
GFAP antibody	Cell Signaling	3670S	GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody
Glass Bottom Dishes	Mattek corporation	P35G-1.5-14-C	35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated
Graefe Forceps	F.S.T	11054-10	Graefe Iris Forceps with curved tips
Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes)	Life Technologies	L7526	LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.
Hank's Balanced Salt Solution (10x)	Gibco	14065-056	Magnesium and calcium free
Imaging Media	Life Technologies	A14291DJ	Live Cell Imaging Solution
Inverted Confocal Microscope	Zeiss		LSM 780
KymoToolBox			https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Lipofection Enhancer Reagent	Life Technologies	11514015	Plus Reagent
Lipofection Reagent	Life Technologies	15338100	Lipofectamine LTX reagent
Orbital shaking incubator	New Brunswick Scientific	8261-30-1008	Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control
Penicillin/Strepomycin solution (100x)	Gen Clone	25-512
Phosphate Buffered Saline (10x)	Gen Clone	25-507x
Poly-D-Lysine Hydrobromide	Sigma	P7405	Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing
Reduced serum medium	Gibco	31985-062	OPTI-MEM
Tissue Culture Flasks	Olympus Plastics	25-209	75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap
Tissue culture incubator	Thermo Scientific	51030285	HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control
Tris-Base	Sigma	T1503	8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Tris-HCl	Sigma	T3253	4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200072
Vacuum-Driven Filter Systems	Olympus Plastics	25-227	500 ml, PES membrane, 0.22 µm
Vannas scissors straight	Roboz	RS-5620