Visualizando e analisando o transporte intracelular de organelas e outras cargas em astrócitos

Summary

Aqui nós descrevemos um método vivo-imagem latente in vitro para visualizar o transporte intracelular das organelas e o tráfico de proteínas da membrana de plasma em astrocytes murino. Este protocolo também apresenta uma metodologia de análise de imagem para determinar itinerários de transporte de carga e cinética.

Abstract

Os astrocytes estão entre os tipos os mais abundantes da pilha no cérebro adulto, onde jogam papéis chaves em um multiplicidade das funções. Como um jogador central na homeostase cerebral, os astrócitos fornecem neurônios com metabólitos vitais e água tampão extracelular, íons e glutamato. Um componente integrante da sinapse "Tri-partite", os astrócitos também são críticos na formação, poda, manutenção e modulação das sinácias. Para habilitar essas funções altamente interativas, os astrócitos se comunicam entre si e com outras células gliais, neurônios, vasculatura cerebral e o ambiente extracelular através de uma infinidade de proteínas de membrana especializadas que incluem células moléculas de adesão, aquaporinas, canais iônicos, transportadores de neurotransmissores e moléculas de junção de Gap. Para apoiar este fluxo dinâmico, astrocytes, como neurônios, dependem de transporte intracelular firmemente coordenado e eficiente. Ao contrário dos neurônios, onde o tráfico intracelular tem sido extensivamente delineado, o transporte baseado em microtúcitos em astrócitos tem sido menos estudado. No entanto, o tráfico EXO-e endocítico de proteínas da membrana celular e o transporte intracelular de organela orquestram a biologia normal dos astrócitos, e esses processos são freqüentemente afetados na doença ou em resposta a lesões. Aqui nós apresentamos um protocolo direto aos astrocytes murino da alta qualidade da cultura, às proteínas astrocytic da etiqueta cDNAs e aos organelas do interesse, e para gravar sua dinâmica intracelular do transporte usando a microscopia confocal do tempo-lapso. Também demonstramos como extrair e quantificar os parâmetros de transporte relevantes dos filmes adquiridos usando o software de análise de imagem disponível (ou seja, ImageJ/FIJI) plugins.

Introduction

Os astrocytes são as pilhas as mais abundantes no sistema nervoso central adulto, onde executam funções desenvolventes e homeostático originais¹. Os astrócitos modulam o desenvolvimento sináptico através do contato direto com terminais pré e pós-sinápticos como parte da sinapse Tri-partite, que contém receptores de neurotransmissores, transportadores e moléculas de adesão celular que facilitam a formação de sinapse e comunicação do Neuron-astrocyte². Além disso, os astrócitos controlam ativamente a transmissão sináptica e impedem a excitotoxicidade neuronal removendo rapidamente neurotransmissores excitatórios da fenda sináptica, reciclando neurotransmissores e participando da poda sináptica^{3 , 4. º , 5. º , 6}. para habilitar essas funções altamente interativas, os astrócitos se comunicam entre si, com outras células gliais, e com neurônios através de proteínas de membrana especializadas, incluindo moléculas de adesão celular, aquaporinas, canais iônicos, transportadores de neurotransmissores e moléculas de junção de Gap. Os astrocytes mudam ativamente os níveis de superfície destas proteínas em resposta às flutuações em seu ambiente intra e extracelular⁷. Além disso, mudanças nos níveis e na distribuição de mitocôndrias, gotículas lipídicas e organelas degradantes e recicladoras modulam o suprimento energético, a disponibilidade de metabolito e os processos de compensação celular que são essenciais para a função de astrocite e Sobrevivência.

As mudanças dinâmicas na proteína da membrana e no tráfico de organelas e posicionamento em astrócitos são facilitadas pela função concertada das proteínas motoras e dos adaptadores que promovem a motilidade de carga^8,9. Da mesma forma, os níveis superficiais das proteínas da membrana são modulados através de eventos de internalização e reciclagem¹⁰. Estas cargas são transportadas através de uma intrincada rede de actina, microtúbulos e, possivelmente, faixas de filamentos intermediários⁸. Os estudos baseados na coloração da imunofluorescência da proteína de ligação final 1 (EB1), que se acumula no microtubule mais extremidades crescentes, sugerem que nos astrócitos os feixes dos microtúbulos irradiam para fora do perinucleus e estenda sua extremidade mais para a periferia¹¹. Entretanto, uma examinação detalhada da organização e da polaridade dos microtúbulos e de outros elementos cytoesqueléticos usando a imagem latente da vivo-pilha é ainda falta. Embora muitos dos mecanismos subjacentes à dinâmica das organelas e das proteínas da membrana tenham sido extensivamente estudados em neurônios e outros tipos de células, a motilidade da carga nos astrócitos é menos bem compreendida. A maioria de nosso conhecimento atual sobre mudanças na distribuição da proteína e do organela nos astrócitos é baseada na rotulagem anticorpo-baseada tradicional da preparação fixa, que impede o exame espacial e temporal preciso da dinâmica de carga^{7, doze anos}.

Aqui, nós descrevemos um método para etiquetar proteínas e organelas da membrana para a imagem latente viva em culturas preliminares do astrocyte do rato da pureza elevada. Usando este protocolo, nós fornecemos exemplos em que nós rastreamos a localização dinâmica de proteína fluorescente verde (GFP)-etiquetada proteínas de membrana em astrocytes transfected, incluindo a junção de Gap proteína conexina 43 (Cx43-GFP) e o aminoácido excitatória transportador 1 (EAAT1-GFP). Nós igualmente descrevemos o uso de uma ponta de prova acidotropic fluorescente para visualizar organelas ácidos e para seguir sua dinâmica do tráfico em astrocytes vivos. Finalmente, demonstramos como analisar os dados de lapso de tempo para extrair e avaliar os parâmetros de transporte para cargas individuais.

Protocol

Todos os procedimentos animais foram realizados com a aprovação da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill, cuidado animal e Comitê de uso (IACUC).

1. dissecção cerebral e cultura de astrócitos primários de camundongo

Nota: o seguinte protocolo foi adaptado a partir de métodos publicados, que segue o procedimento original desenvolvido por McCarthy e devellis^13,14,15. Culturas de células mistas de astrócitos de McCarthy/devellis (MD) são preparadas a partir do dia pós-Natal 2 − 4 (P2 − P4) córtices de camundongo, tratados com um fator antimitótico, e purificados para produzir a cultura final enriquecida do astrocite. Quatro córtices de filhotes de rato de ambos os sexos são suficientes para gerar uma cultura de balão de cultura de tecido T75.

1. Cubra o fundo dos frascos de T75 (100% de acesso em ângulo de pescoço, 0,22 μm de tampão de filtro ventilado hidrofóbico) com poli-D-lisina (1 mg/mL no tampão Tris de 0,1 M, pH 8,5) e incubar a 37 ° c durante 24 horas antes do início da dissecção.
2. Antes de iniciar o procedimento de dissecção, aqueça 30 mL de meios de cultura astrocitais (Dulbecco ' s modificado Eagle ' s médio [DMEM] alta glicose, 10% de calor-inativado soro bovino fetal, 1% penicilina/estreptomicina) em 37 ° c e descongelar uma alíquota de 5 mL de 2,5% tripsina no gelo. Prepare dois pratos de dissecação (60 mm de diâmetro) em gelo preenchido com 6 mL de solução de sal balanceada de Hank (HBSS) sem CA^{2 +} ou mg^{2 +}.
3. Desinfecte todas as ferramentas cirúrgicas (pinça de ponta fina, tesoura de dissecação, Tesoura Vannas em linha reta, pinça Graefe com pontas curvas) em 70% de etanol antes e entre cada dissecção.
4. Pulverize a cabeça e o pescoço dos filhotes de mouse P2 − P4 com 70% de etanol antes de eutanizar-los rapidamente por decapitação com tesouras cirúrgicas. Realize uma incisão posterior à linha média anterior ao longo do couro cabeludo para expor o crânio. Corte cuidadosamente o crânio do pescoço para o nariz.
5. Realize duas incisões laterais adicionais superiores aos olhos. Usando pinças finos da ponta lanç delicadamente as aletas do crânio ao lado. Retire o cérebro e coloque-o no primeiro prato de dissecação preenchido com HBSS gelada sem CA^{2 +} ou mg^{2 +}. Mantenha o prato no gelo e continue colhendo o resto do cérebro.
   Nota: realize o restante do procedimento de dissecção um escopo de dissecação.
6. Retire os bulbos olfatório usando as tesouras de Vannas ou as pinças finas (Figura 1ai). Com o fórceps curvo da ponta na interseção das fissuras transversais e interhemisféricas, introduza delicadamente um segundo par de fórceps curvado da ponta entre o córtice e o diencephalon, abrindo lentamente o fórceps para separar os hemisférios cerebrais do descanso de o cérebro (Figura 1aIi, Aiii). Remova o tecido indesejado (Figura 1AIV).
7. Para cada hemisfério cortical, Retire cuidadosamente as meninges com pinça de ponta fina. Opcionalmente, retire o hipocampo dos córtices. Transfira os córtices dissecados do rato em um segundo prato enchido com o HBSS gelo-frio sem CA^{2 +} ou magnésio^{2 +} e mantenha-o no gelo ao dissecação os cérebros restantes.
   Nota: realize as próximas etapas condições assépticas em uma capa de fluxo laminar.
8. Corte os córtices dissecados em pedaços pequenos (aproximadamente 2 − 4 mm) usando uma tesoura cirúrgica afiada estéril ou um bisturi. Transfira o tecido dissecado para um tubo cônico de 50 mL contendo solução enzimática (22,5 mL de HBSS sem CA^{2 +} ou mg^{2 +}, 2,5 ml 2,5% tripsina). Incubar a 37 ° c por 30 min com inversão suave a cada 10 min.
9. Colete o tecido digerido por centrifugação em 300 x g por 5 min e retire a solução enzimática por decantação (não use um aspirador a vácuo). Adicione 10 ml de meios de cultura do astrocyte e dissociar o tecido em únicas pilhas introduzindo a solução 20 − 30x usando uma pipeta sorológicos de 10 ml.
10. Filtre a suspensão celular através de um filtro de células de 70 μm para minimizar os aglomerados celulares e o tecido não digerido. Colete o filtrado em um tubo cônico 50 mL limpo e ajuste o volume total a 20 mL com meios de cultura do astrocyte. Neste ponto, avalie a eficiência da dissociação cortical misturando 10 μL da suspensão da pilha com 10 μl do azul do Tripan e contando pilhas com um Hemocytometer.
    Nota: uma preparação de quatro córtices do rato P2 − P4 rende 10 − 15 x 10⁶ únicas pilhas.
11. Aspirar a solução de revestimento poli-D-lisina das garrafas de cultura T75 e lave duas vezes com água estéril. Placa a suspensão celular de 20 mL e incubar a 37 ° c e 5% CO₂.

2. purificação e manutenção de culturas astrocícitos

Nota: realize todas as mudanças de mídia condições assépticas em uma capa de fluxo laminar usando estéril filtrado (0,22 μm membrana filtro) astrocyte mídia aquecida para 37 ° c.

1. Substitua a mídia celular 48 h após o chapeamento (dia in vitro 2, DIV2).
2. Em DIV5, substitua os meios com os meios de cultura frescos do astrocyte suplementados com o arabinoside do citosina de 10 μm (arac).
   Nota: este passo facilita a remoção de células contaminantes, incluindo fibroblastos e outras células gliais. É importante tratar as culturas com AraC não mais do que 48 h porque uns tempos mais longos da incubação reduzirão a viabilidade do astrocyte.
3. Em DIV7, mude meios para meios de cultura do astrocyte sem arac e comece verific diariamente o confluência da cultura. Uma vez que as pilhas alcangaram a confluência de 80%, o revestimento dois-T75 frascos para cada balão não purificada da cultura do astrocyte com poli-D-lysine e incubar em 37 ° c por pelo menos 8 h à noite.
4. No dia seguinte, comece a purificação do astrocyte agitando os frascos da cultura em 180 rpm por 30 minutos em uma incubadora de agitação orbital de 37 ° c. Retire a mídia e substituí-lo com meios de cultura frescos astrocyte. Agitar as células a 240 rpm por 6 h em uma incubadora de agitação orbital de 37 ° c. Pré-aqueça 1x fosfato-tampão salino (PBS), meios de cultura do astrocyte, e 0,25% Trypsin-EDTA a 37 ° c 20 − 30 minutos antes do fim do período de agitação.
   Nota: a incubação de co₂não é exigida durante as etapas de agitação. Se desejado, a mídia coletada após as etapas de agitação de 30 min e 6 h pode ser usada para cultura microglia e oligodendrócitos, respectivamente. O tratamento de AraC da cultura misturada reduzirá, entretanto, a abundância das outras pilhas glial.
5. Retire as garrafas de cultura da coqueteleira e substitua imediatamente a mídia por 10 mL de 1X PBS quente por balão. Retire o PBS e adicione 3 mL de 0,25% de tripsina-EDTA por frasco. Incubar a 37 ° c e 5% CO₂, verificando a cada 5 min para descolamento.
6. Uma vez que as pilhas se separaram do balão, pare o tripsinização adicionando 10 ml de meios de cultura do astrocyte. Transfira astrócitos destacados para um tubo cônico de 50 mL e células da pelota por centrifugação a 300 x g por 5 min. aspirar sobrenadante e re-suspender as células em 40 ml de meios de cultura astrocícitos.
7. Lave as garrafas de T75 revestidas com poli-D-lisina duas vezes com água estéril e placa de 20 mL da suspensão de astrocite purificada. Retorne ao ° c 37 e à incubadora de 5% CO₂ . Mude os meios de cultura do astrocyte cada dois dias para uns 10 dias adicionais até que os astrócitos amadureça.
   Nota: cada balão T75 de astrócitos purificados deve ser suficiente para produzir 2 novos frascos de T75 com 3 x 10⁵ células cada no chapeamento.
8. Repita os passos 2.5 − 2.7 para passagens subsequentes ou para placas astrócitos para microscopia.
   Nota: a pureza das culturas do astrocyte após a adição de AraC e após a purificação pode ser avaliada qualitativamente através da microscopia de brightfield, ou mais precisamente quantificando a porcentagem de proteína ácido fibrilary glial (GFAP)-positivo células por campo de visão em imagens fluorescentes (Figura 1B, C).

3. transfection de plasmídeos cDNAs etiquetados

1. O dia antes do transfection ou da rotulagem, astrócitos da semente na densidade desejada para a imagem latente 24 − 48 h borne-transfection. Uma densidade recomendada para placas de 24 poços ou 14 mm de fundo de vidro é de 2 x 10⁴ células/poço.
   Nota: Este protocolo é otimizado para a transfecção de astrócitos revestidos em coberturas de vidro de 12 mm em placas de 24 poços ou 14 mm de fundo de vidro, utilizando um método baseado em lipofection. Os reagentes devem ser dimensionados dependendo do tamanho do prato de cultura em que os astrócitos estão crescendo.
2. Diluir o reagente de lipofecção (tabela de materiais) em meios séricos reduzidos (tabela de materiais). Para optimizar a relação entre o reagente de lipofecção e o ADN, teste uma gama de diluições adequadas. Por exemplo, se utilizar o reagente empregado neste protocolo (tabela de materiais), diluir 2, 3, 4 e 5 μl do reagente de lipofecção em 50 μL de meios séricos reduzidos.
3. Diluir 5 μg de ADN de alta pureza em 250 μL de meios séricos reduzidos. Adicionar 5 μL de reagente de potenciador de lipofecção (tabela de materiais). Combine o tubo que contém o reagente da lipofecção com um volume igual da mistura do potenciador do ADN-lipofecção. Misture com pipetagem e incubar à temperatura ambiente (RT) durante 15 min.
4. Remova os meios de cultura do astrocyte e adicione a mistura do transfection (etapa 3,3) às células Dropwise. Após uma incubação de 6 h a 37 ° c e 5% CO₂, substitua o complexo de transfecção por um volume adequado de meios de cultura astrocícitos (2 ml para pratos inferiores de vidro de 14 mm). Incubar por um adicional 24 − 72 h antes de prosseguir para a aquisição de imagem. Monitore atentamente a duração da etapa de incubação para alcançar o melhor equilíbrio entre a expressão protéica e a viabilidade celular.

4. rotulagem de endosomes/lisossomos atrasados usando sondas fluorescentes

Nota: algumas cargas podem ser rotuladas usando corantes fluorescentes com alta afinidade para proteínas específicas da carga. O exemplo a seguir permite a rotulagem de endosomas/lisossomas tardios com uma sonda acidópica fluorescente.

1. Diluir a sonda de rotulagem lisossomal (tabela de materiais) em 200 μL de meios de cultura astrocitária para uma concentração de trabalho de 1 μm e aplicar aos astrócitos do passo 3,1 a uma densidade de 2 x 10⁴ células/poço. Incubar por 30 min a 37 ° c.
2. Lave as células uma vez com os meios de cultura de astrocite quentes e substitua por meios de imagem (tabela de materiais). Prossiga para imagens ao vivo imediatamente.

5. aquisição de imagens usando um sistema de imagem de lapso de tempo

Nota: a imagem latente viva do lapso de tempo deve ser feita usando um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera de alta velocidade, um foco definitivo, uma câmara da incubação, e um objetivo do óleo 40x com uma abertura numérica elevada (por exemplo, Plan-apochromat 1.4 NA). Uma variedade de software de aquisição está disponível para imagens de lapso de tempo. A seleção do sistema de microscopia e software de aquisição deve basear-se na sua disponibilidade e adequação para os objetivos do estudo em particular. Algumas diretrizes gerais são fornecidas abaixo.

1. Coloc a câmara ou o prato da cultura no adaptador apropriado na fase do microscópio. Usando a luz epifluorescência, selecione as células que expressam proteínas fluorescentes ou sonda para gravar. Ajuste a iluminação da amostra fluorescente para visualizar as células selecionadas usando a câmera digital. Evite usar alta iluminação que pode causar fotobranqueamento e fototoxicidade. Ajuste o foco e o zoom.
2. Adquira uma série de lapso de tempo de pilha Z em uma frequência de 1 quadro a cada 2 s para intervalos de tempo variando entre 300 s e 500 s usando o zoom e funções de foco definidas.
   Nota: a dinâmica do tráfico (velocidade, frequência de movimento, etc.) variará dependendo da proteína de interesse, portanto, o curso de tempo de aquisição pode exigir ajuste. Por exemplo, as mitocôndrias são menos motile do que lisossomos e exibem pausas freqüentes. Neste caso, é mais apropriado ajustar os parâmetros de aquisição para 1 quadro a cada 5 s para 800 s.
3. Salve imagens de lapso de tempo e exporte-as como arquivos de pilha AVI ou TIFF.

6. análise de imagem

Nota: a análise de imagem foi realizada usando o plugin KymoToolBox para ImageJ/Fiji¹⁶. Detalhado passo-a-passo instruções escritas estão disponíveis on-line¹⁷. As seguintes etapas abreviadas devem ser suficientes para criar os kymographs e extrair os parâmetros de transporte de partículas.

1. Abra a sequência de imagens de lapso de tempo no software ImageJ/Fiji. Importe imagens do menu arquivo como arquivos AVI ou TIFF Stack. Converta as imagens para 8 bits ou 16 bits, selecionando um desses tipos de imagem usando a ferramenta de tipo no menu de imagem . Se estiver trabalhando com arquivos RGB, divida os canais usando a ferramenta dividir canal disponível no recurso cor no menu imagem .
2. Para gerar um quimógrafo (representação em posição e tempo de trajetórias de partículas), desenhe cada faixa na qual as partículas estão se movendo traçando uma linha ao longo das trajetórias das partículas usando a ferramenta de linha segmentada . Para atribuir corretamente a direcionalidade do movimento, desenhe a polilinha usando a mesma convenção direcional desejada para todos os filmes para que a polaridade seja consistente dentro e entre todas as células que estão sendo estudadas. Por exemplo, desenhe a polilinha do centro da célula em direção à periferia ou vice-versa. Ajuste a largura da linha para corresponder à espessura da faixa clicando duas vezes na ferramenta linha .
3. Execute o draw Kymo macro do plugin KymoToolBox usando uma largura de linha de 10. Um prompt pedindo para calibrar a imagem no tempo (número de quadros, taxa de quadros) e espaço (x, y resolução) aparecerá. Uma vez calibrado, os kymographs são gerados e podem ser conservados como limas do TIFF para a apresentação dos dados ou a análise de partícula mais adicional.
4. Atribua trajetórias de partículas rastreando manualmente cada partícula no quimógrafo usando a ferramenta de linha segmentada para a duração total da aquisição. Registre cada trajetória de partícula como uma região de interesse (ROI) usando a ferramenta ROI Manager encontrada no menu Analyze/Tools . Salve todos os ROIs por cada vídeo de lapso de tempo para análise posterior.
   Nota: é crítico atribuir a trajetória correta para as partículas individuais no quimógrafo para conseguir o cálculo o mais exato de parâmetros do transporte.
   1. Execute a macro analisar Kymo do plugin KymoToolBox. Uma janela abrirá pedindo para definir a direção "externa" do movimento de partículas (da esquerda para a direita ou vice-versa) no menu suspenso. Esta seleção depende da posição das cargas fluorescentes imaged em relação ao núcleo ou à periferia celular, conforme estabelecido na etapa 6,2. Por exemplo, se o núcleo está posicionado à esquerda das cargas, e a polilinha na etapa 6,2 foi desenhada para longe do núcleo, definir o movimento de partículas externas como "da esquerda para a direita".
   2. Defina a velocidade limite (velocidade mínima na qual uma carga é considerada motile) na janela analisar Kymo . Para cargas que se movem em velocidades de transporte intracelulares rápidas, 0,1 μm/segundo é uma escolha apropriada. Modifique esse valor para ajustar a sensibilidade do software a cada carga de juros. Ajuste a largura da linha para corresponder à espessura de cada trajetória de partícula.
   3. Selecione o log de todos os dados e registre as opções de coordenadas extrapoladas na janela analisar kymo . Isso calculará vários parâmetros de transporte de carga, incluindo velocidade média, velocidade interna, velocidade externa, distância cumulativa percorrida, distância percorrida no sentido interno ou externo, número de switches para cada partícula, percentual de tempo movendo-se em cada direção ou em pausa, etc. Os dados calculados para faixas individuais são agrupados por quimógrafo e salvos em arquivos de texto específicos para cada imagem.
      Nota: a opção Mostrar Kymo colorido de analisar macro kymo gera uma sobreposição codificada por cores do caminho sobre o kymograph original. As partículas que viajam para fora são coloridas no verde, para dentro no vermelho, e as partículas estacionárias no azul. A opção coordenadas de relatório na pilha original da macro analisar kymo gera uma sobreposição codificada por cores da posição do objeto extrapolado no vídeo de lapso de tempo original e no kymograph.

Representative Results

O protocolo para o estabelecimento de astrócitos primários de MD do mouse descritos acima deve produzir culturas reprodutíveis e de alta qualidade. Embora as culturas contenham inicialmente uma mistura de astrócitos, fibroblastos e outras células gliais, incluindo microglia e oligodendrócitos (Figura 1bi, Biv; pontas de seta vermelhas), a adição de arac à cultura mista entre DIV5-DIV7 minimiza proliferação dessas células contaminantes. O tratamento combinado com AraC e a estratégia de purificação baseada em agitação enriquece a pureza das culturas astrocitários (Figura 1BII) sobre os protocolos tradicionais que incluem apenas as etapas de purificação (Figura 1BV; azul ARROWHEADS)¹³. A morfologia e a composição esperadas (avaliadas pela coloração de GFAP e 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]) das culturas de astrocite purificadas tratadas com AraC ou não tratadas são mostradas na Figura 1BiII, BVI. A quantificação da percentagem de células GFAP⁺ por campo de visão (proporção do número de células com coloração de GFAP para o número total de células identificadas pela coloração DAPI) mostra um aumento de mais de 27% na pureza com a suplementação de arac (Figura 1 C). esta cultura do astrocyte do rato da elevado-pureza é apropriada para a avaliação da expressão do RNA e da proteína, da morfologia da pilha, e de outros ensaios funcionais.

Nós usamos o transfection lipofection-baseado para expressar versões GFP-etiquetadas da proteína Cx43 da junção da abertura e do transportador EAAT1 em astrocytes murino. Esta metodologia permite a expressão transitória de proteínas em níveis ideais para imagens de células ao vivo, sem causar toxicidade ou afetar A viabilidade do astrocite (Figura 2A, E). Da mesma forma, o uso de uma sonda fluorescente permitiu a rotulagem rápida e eficiente de organelas Endo-lisossomais ácidas (Figura 2I) para rastrear sua dinâmica em astrócitos.

A Figura 2 mostra resultados representativos das análises de dinâmica de carga em astrócitos transfectados transitoriamente com EAAT1-GFP, CX43-GFP, ou rotulados com corante seletivo que reconhece vesículas endolysossômicas ácidas. Cada uma destas cargas apareceu como um punctum fluorescente que decora a região perinuclear, o cytosol, e os processos dos astrócitos (Figura 2a, e, I, painéis esquerdos). Os dados de lapso temporal foram utilizados para gerar kymografias que rastreavam o movimento de carga no tempo e no espaço (Figura 2A, E, I, painéis direito). Nestas kymografias, o movimento anterógrado e retrógrado da carga indicada é representado por trajetórias com declives negativos (linhas verdes) e positivas (linhas vermelhas), respectivamente. As vesículas estacionárias são mostradas como trajetórias verticais (linhas azuis). A análise de kymograph revelou que os três tipos de carga analisados submetem-se ao transporte bidirecional com rápido ocasional, funcionamentos processivos em ambos os sentidos. Além disso, a quantificação do fluxo de uma carga através de uma área do astrocyte (caixa vermelha) revelou diferenças na porcentagem de partículas motile entre cargas. Por exemplo, enquanto 70% do puncta EAAT1-GFP são estacionários(Figura 2B), menos de 20% de Cx43-GFP (figura 2F) e 45% de cargas endolysossômicas rotuladas por sonda (Figura 2J) são não-motile. Estas diferenças na motilidade entre as cargas são prováveis representativos de sua motilidade normal, basal na região do astrocyte onde os filmes foram adquiridos.

O mapeamento preciso da mudança na posição X-Y ao longo da escala de tempo integral para cada partícula obtida a partir do quimógrafo também pode ser usado para avaliar outros parâmetros de movimento, como velocidade de carga (Figura 2C, G, K) e comprimento de execução (distância percorrida) (Figura 2D, H, L). Os parâmetros de movimento podem ser analisados para cargas individuais para determinar mudanças na direcionalidade do movimento (anterógrada versus movimento retrógrado), bem como reversões em direção de partículas de movimento, número de pausas, etc. Os resultados destes tipos de análises podem fornecer informações quantitativas significativas sobre as alterações na distribuição celular de organelas e proteínas de membrana em astrócitos em condições basais ou anormais no intra e extracelular Ambiente.

Figura 1: estabelecimento de culturas primárias de astrocícitos de camundongo.
(A) passos necessários para A dissecção de cérebros de rato P2 − P4. (B) (i, IV) brightfield imagens de culturas gliais mistas tratadas (i) e não tratadas (IV) com arac. As pontas de seta vermelhas indicam a microglia contaminante. (II, v) Imagens de culturas de astrocite purificadas tratadas (II) e não tratadas (v) com arac. As pontas de seta azuis indicam oligodendrócitos contaminantes. (III, vi) Imagens confocais de culturas de astrocícitos purificadas tratadas (III) e não tratadas (vi) com arac. Verde mostra GFAP coloração e DAPI (azul) rótulos de todos os núcleos. (C) percentagem de células GFAP positivas. Os dados representam média ± SEM. * * * p < 0, 1, teste t não pareado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: análise quantitativa da dinâmica de carga em astrócitos.
(A, E, I) Painéis esquerdos: astrócitos expressando EAAT1-GFP (A), Cx43-GFP (E) ou tratados com uma sonda que rotula endosomas tardios e lisossomas (I). As caixas vermelhas indicam regiões usadas para analisar a dinâmica das partículas. Painéis direito: kymographs originais e cor-codificados que mostram trajetórias para as cargas indicadas. Linhas vermelhas representam cargas de movimento retrógrado, linhas verdes anterógrada-movendo cargas, e linhas azuis não-motile cargas. (B, F, J) Percentual de partículas estacionárias e motile. (C, G, K) Quantificação da velocidade anterograda e retrógrada e (D, H, L) comprimento de execução. Os dados representam média ± SEM. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Aqui, descrevemos uma abordagem experimental para expressar, Visualizar e rastrear organelas fluorescentamente marcadas e proteínas de membrana de interesse usando a microscopia de vídeo de lapso de tempo em astrocytes de MD cortical do mouse primário de alta pureza. Também Delineamos uma metodologia para medir a dinâmica das partículas. A visualização direta da dinâmica protéica e organela nos astrócitos primários fornece uma poderosa ferramenta para estudar a regulação do transporte intracelular nessas células in vitro.

A metodologia para o estabelecimento de culturas de astrocite de mouse MD descrita acima combina etapas de outros protocolos publicados^{13,14,15, o}que resulta em um método mais simples e em maior pureza e qualidade Culturas. A combinação de tratamento arac¹⁵ e de purificação à base de agitação^{13,14pode produzir} culturas de astrocite com uma pureza tão alta quanto 98% (avaliada pela proporção de células totais de GFAP⁺ células), que em nosso exemplo resulta em um aumento de 27% na pureza sobre culturas submetidas apenas às etapas de purificação (Figura 1B, C). As culturas de alta pureza de astrócitos de camundongo obtidas com este método são semelhantes aos valores relatados para as culturas de astrocícitos de ratos (avaliados por ensaios enzimáticos e microscopia eletrônica) por McCarthy e deVellis¹⁴. Entretanto, o método de McCarthy/deVellis, que não inclui o tratamento de AraC, exige uma etapa de agitação mais longa (15 − 18 h) e duas voltas adicionais da purificação¹⁴.

Em nosso exemplo, mostramos que este protocolo é suficientemente sensível para captar diferenças de motilidade entre várias proteínas de membrana e organelas em astrócitos, que são prováveis representativos de seus itinerários intracelulares individuais e celulares Função. Embora o nosso exemplo demonstre a utilidade deste protocolo em condições basais, esta metodologia pode ser facilmente adaptada para medir parâmetros de transporte dentro de uma ampla gama de questões de pesquisa. Por exemplo, protocolos semelhantes com pequenas modificações podem ser usados para caracterizar eventos de transporte em astrócitos in vitro em resposta ao ambiente intra ou extracelular, como danos celulares, toxicidade, mutações patogênicas, atividade sináptica (em culturas mistas de neurônios e astrócitos), etc. Da mesma forma, a coexpressão e a visualização de múltiplas cargas ou organelas, individualmente marcadas com diferentes fluoróforos, também podem ser usadas para avaliar mudanças dinâmicas na colocalização e formação complexa, interações transitórias entre organelas , e eventos de transporte de reciclagem de membrana e endocitic.

O sucesso da metodologia aqui apresentada baseia-se principalmente na capacidade de obter culturas de astrocícitos de alta qualidade e na rotulagem eficiente de cargas de interesse. Ao utilizar este procedimento para a imagem latente viva, é importante monitorar pròxima a expressão fluorescente para determinar o tempo óptimo da incubação do borne-transfection. Em média, verificou-se que para as cargas analisadas um período de incubação de 24 h resulta em boa intensidade de sinal para aquisição de imagens ao vivo. A incubação prolongada de astrócitos transfected pode conduzir à expressão elevada das proteínas cDNAs etiquetadas, que podem induzir a agregação da proteína, assim mudando a localização e a dinâmica da carga, e diminuindo a saúde das culturas. Os astrócitos são muito vulneráveis a danos físicos e mudanças no ambiente da cultura, o que pode levar à indução de respostas transcricional e celular, incluindo reatividade. Portanto, é fundamental reduzir os intervalos de tempo entre as etapas de lavagem e minimizar a exposição das culturas ao ar e a mudanças significativas de temperatura ou intensidade de luz nos períodos de incubação e de aquisição.

Em síntese, os métodos aqui apresentados podem ser utilizados para avaliar e quantificar mudanças dinâmicas na localização de proteínas e organelas em astrócitos. Eles fornecem ferramentas valiosas que permitem o exame de alterações nas respostas astrocíticas condições fisiológicas e patológicas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.5% Trypsin (10x)	Gibco	15090-046
Benchtop Centrifuge	Thermo Scientific	75-203-637	Sorvall ST8 Centrifuge
Cell Culture Grade Water	Gen Clone	25-511
Cell Culture Microscope	Zeiss	WSN-AXIOVERT A1	Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities
Cytosine Arabinoside	Sigma	C1768-100MG	(AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage
DAPI	Sigma	D9542-5MG	Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.
Dissecting Microscope	Zeiss		Stemi 305
Dissecting Scissors	F.S.T	14558-09
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gen Clone	25-500
Fetal Bovine Serum	Gemini	100-106	Heat-Inactivated
FIJI (Fiji is Just Image J)	NIH	Version 1.52i
Fine Tip Tweezers	F.S.T	11254-20	Style #5
Fluorescence light source	Excelitas	012-63000	X-Cite 120Q
GFAP antibody	Cell Signaling	3670S	GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody
Glass Bottom Dishes	Mattek corporation	P35G-1.5-14-C	35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated
Graefe Forceps	F.S.T	11054-10	Graefe Iris Forceps with curved tips
Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes)	Life Technologies	L7526	LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.
Hank's Balanced Salt Solution (10x)	Gibco	14065-056	Magnesium and calcium free
Imaging Media	Life Technologies	A14291DJ	Live Cell Imaging Solution
Inverted Confocal Microscope	Zeiss		LSM 780
KymoToolBox			https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Lipofection Enhancer Reagent	Life Technologies	11514015	Plus Reagent
Lipofection Reagent	Life Technologies	15338100	Lipofectamine LTX reagent
Orbital shaking incubator	New Brunswick Scientific	8261-30-1008	Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control
Penicillin/Strepomycin solution (100x)	Gen Clone	25-512
Phosphate Buffered Saline (10x)	Gen Clone	25-507x
Poly-D-Lysine Hydrobromide	Sigma	P7405	Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing
Reduced serum medium	Gibco	31985-062	OPTI-MEM
Tissue Culture Flasks	Olympus Plastics	25-209	75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap
Tissue culture incubator	Thermo Scientific	51030285	HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control
Tris-Base	Sigma	T1503	8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Tris-HCl	Sigma	T3253	4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200072
Vacuum-Driven Filter Systems	Olympus Plastics	25-227	500 ml, PES membrane, 0.22 µm
Vannas scissors straight	Roboz	RS-5620