Summary
ここでは、マウスアストロサイトにおけるオルガネラの細胞内輸送と血漿膜タンパク質の取引を可視化するインビトロライブイメージング法について述べる。このプロトコルはまた、貨物輸送の旅程と運動学を決定するための画像分析方法論を提示する。
Abstract
アストロサイトは、成人の脳の中で最も豊富な細胞型の一つです, 彼らは機能の多重性で重要な役割を果たしています.脳恒常性の中心的なプレーヤーとして、アストロサイトは重要な代謝産物と緩衝細胞外水、イオン、グルタミン酸をニューロンに供給します。「三分詞」シナプスの不可欠なコンポーネントは、アストロサイトもシナプスの形成、剪定、メンテナンス、および変調において重要です。これらの高度にインタラクティブな機能を可能にするために、アストロサイトは、細胞を含む多数の特殊な膜タンパク質を介して、他のグリア細胞、ニューロン、脳血管系、および細胞外環境と通信します。接着分子、アクアポリン、イオンチャネル、神経伝達物質トランスポーター、ギャップ接合分子。この動的フラックスをサポートするために、星状細胞は、ニューロンと同様に、緊密に調整され、効率的な細胞内輸送に依存しています。細胞内人身売買が広範囲に減少しているニューロンとは異なり、アストロサイトにおける微小管ベースの輸送はあまり研究されていない。それにもかかわらず、細胞膜タンパク質および細胞内オルガネラ輸送の外細胞および内嚢胞性人身売買は、アストロサイトの正常な生物学を調整し、これらのプロセスはしばしば病気または傷害に反応して影響を受ける。ここでは、高品質のマウスアストロサイトを培養し、目的の星状タンパク質および小器官を蛍光的に標識し、タイムラプス共焦点顕微鏡を用いて細胞内輸送ダイナミクスを記録するための簡単なプロトコルを提示する。また、利用可能な画像解析ソフトウェア(ImageJ/FIJI)プラグインを使用して、取得したムービーから関連するトランスポートパラメータを抽出および定量化する方法についても説明します。
Introduction
アストロサイトは、成人中枢神経系で最も豊富な細胞であり、そこではユニークな発達および恒容性機能1を実行する。アストロサイトは、シナプス形成を促進する神経伝達物質受容体、トランスポーター、および細胞接着分子を含む三分詞シナプスの一部として、前および後の末端との直接接触を通じてシナプスの発達を調節するとニューロン-星状細胞通信2.さらに、アストロサイトはシナプス伝達を積極的に制御し、シナプス裂から興奮性神経伝達物質を迅速に除去し、神経伝達物質をリサイクルし、シナプス剪定に参加することにより、神経興奮毒性を防ぎます3,4,5,6.これらの非常にインタラクティブな機能を可能にするために、アストロサイトは、他のグリア細胞と、細胞接着分子、アクアポリン、イオンチャネルを含む特殊な膜タンパク質を介してニューロンと、自分自身の間で通信します。神経伝達物質トランスポーター、およびギャップ接接点分子。アストロサイトは、細胞内および細胞外環境の変動に応じて、これらのタンパク質の表面レベルを積極的に変化させる7.さらに、ミトコンドリア、脂質液滴、分解およびリサイクルオルガネラのレベルと分布の変化は、エネルギー供給、代謝物の利用可能性、および星状細胞機能に不可欠な細胞クリアリングプロセスを調節し、生存。
アストロサイトにおける膜タンパク質およびオルガネラの人身売買および位置の動的変化は、貨物運動性を促進する運動タンパク質およびアダプターの協調機能によって促進される8、9。同様に、膜タンパク質の表面レベルは、内部化およびリサイクルイベント10を通じて変調される。これらの貨物は、アクチン、微小管、およびおそらく中間フィラメントトラック8の複雑なネットワークを介して輸送されます。成長する微小管プラス末端に蓄積する末結合タンパク質1(EB1)の免疫蛍光染色に基づく研究は、微小管の鎖束が末端から放射し、そのプラス端を向いて拡張することを示唆している。周辺11.しかし、生細胞イメージングを用いて微小管やその他の細胞骨格素子の組織と極性を総合的に調べると、まだ不足している。オルガネラや膜タンパク質のダイナミクスの基礎となるメカニズムの多くは、ニューロンやその他の細胞型で広く研究されているが、アストロサイトの貨物運動性はあまりよく理解されていない。アストロサイトにおけるタンパク質およびオルガネラ分布の変化に関する我々の現在の知識のほとんどは、貨物ダイナミクス7の正確な空間的および時間的検査を妨げる固定製剤の従来の抗体ベースの標識に基づいている。 12.
ここでは、高純度の一次マウス星状細胞培養におけるライブイメージング用膜タンパク質および小器官に標識する方法について説明する。このプロトコルを使用して、ギャップ接合タンパク質コネキシン43(Cx43-GFP)および興奮性アミノ酸を含むトランスフェクト星状細胞における緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付き膜タンパク質の動的局在を追跡する例を提供します。トランスポーター1(EAAT1-GFP)。また、蛍光酸性プローブを用いて酸性小器官を可視化し、生きた星状細胞におけるその人身売買のダイナミクスに従うことも説明する。最後に、タイムラプスデータを分析して、個々の貨物の輸送パラメータを抽出して評価する方法を示します。
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Protocol
すべての動物の手順は、チャペルヒル動物ケアと使用委員会(IACUC)でノースカロライナ大学の承認を得て行われました。
1. 一次マウス星細胞の脳解剖と培養
注:以下のプロトコルは、マッカーシーとデベリス13、14、15によって開発された元の手順に従って、公開された方法から適応されました。マッカーシー/デベリス(MD)アストロサイトの混合細胞培養は、生後2−4(P2−P4)マウス皮質から調製され、抗有化因子で処理し、最終的に濃縮された星細胞培養物を得るために精製される。いずれかの性別のマウスの子犬からの4つの皮質は、1つのT75組織培養フラスコ培養を生成するのに十分である。
- T75フラスコの底部(100%斜めの首のアクセス、0.22 μm疎水性通気フィルターキャップ)をポリD-リジン(0.1Mトリスバッファーで1mg/mL、pH 8.5)でコーティングし、解剖開始前に24時間37°Cでインキュベートします。
- 解剖手順を開始する前に、アストロサイト培養培地の温かい30 mL(ダルベッコの修飾イーグル培地[DMEM]高グルコース、10%熱不活性化胎児ウシ血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン)を37°Cで解凍し、5mLのアリコートを2.5%の試料で解凍する。Ca2+または Mg2+なしでハンクのバランス塩溶液(HBSS)の6 mLで満たされた氷の上に2つの解剖皿(直径60ミリメートル)を準備します。
- すべての外科用具(細かい先端ピンセット、解剖はさみ、ヴァンナスはさみストレート、曲がった先端を持つGraefe鉗子)を各解剖の前および間に70%のエタノールで消毒する。
- 70%のエタノールでP2−P4マウスの頭と首をスプレーしてから、外科的なはさみで首を切り落とすことによってそれらを素早く安楽死させます。頭皮に沿って前中間線切開に後部を行い、頭蓋骨を露出させる。頭蓋骨を首から鼻まで慎重に切り取る。
- 目より優れた2つの追加の横切開を行う。細かい先端ピンセットを使用して、頭蓋骨のフラップを横にそっと反転します。脳を削除し、Ca2+またはMg2+なしで氷冷HBSSで満たされた最初の解剖皿に置きます.氷の上に皿を維持し、脳の残りの部分を収穫し続けます。
注: 解剖スコープの下で解剖手順の残りの部分を実行します。 - バンナスはさみや細かいピンセットを使用して嗅球を取り外します(図1Ai)。横方向と半球間の裂け目の交点に曲げられた先端の鉗子を使用して、皮質と二脳症の間に2番目の曲面先端鉗子を静かに挿入し、ゆっくりと鉗子を開いて、残りの部分から大脳半球を分離します。脳(図1愛井、愛井)。不要な組織を取り除く(図1Aiv)。
- 皮質半球ごとに、細かい先端ピンセットで髄膜を慎重に取り除きます。必要に応じて、皮質から海馬を取り除きます。解剖したマウスコルティスをCa2+またはMg2+なしで氷冷HBSSで満たされた第2の皿に移し、残りの脳を解剖しながら氷の上に保管してください。
注:層流フードの無菌条件下で次のステップを行います。 - 滅菌した皮質を、無菌の鋭い外科はさみまたはメスを使って小片(約2−4mm)に切る。解剖した組織を酵素溶液を含む50 mL円錐管に移す(Ca2+またはMg2+なし、2.5 mL 2.5%トリプシンなし)。37 °Cで30分間インキュベートし、10分ごとに穏やかな反転を行います。
- 消化された組織を300 x gで5分間遠心分離して回収し、デカンテーションにより酵素溶液を除去する(真空吸引器を使用しないでください)。10 mLのアストロサイト培養培養培養剤を添加し、10mLの血清ピペットを用いて溶液20−30xをピペッティングして組織を単一細胞に解離する。
- 70 μmの細胞ストレーナーを通して細胞懸濁液をろ過し、細胞の塊および未消化組織を最小にする。きれいな50 mL円錐形チューブで濾液を収集し、アストロサイト培養培養物で総体積を20mLに調整します。この時点で、細胞懸濁液の10μLを10μLのトリパンブルーと混合し、細胞をヘモサイトメーターで計数することにより、皮質解離の効率を評価する。
注:4つのP2−P4マウス皮質からの1つの調製物は10−15 x 10 6の単一細胞を得る。 - T75培養フラスコからポリD-リジンコーティング液を吸引し、無菌水で2回洗浄します。20 mLセル懸濁液をプレートし、37 °Cおよび5%CO2でインキュベートする。
2. アストロサイト培養の精製と維持
注:無菌濾過(0.22 μmフィルター膜)アストロサイトメディアを37°Cに温めたアストロサイト培地を使用して、層流フード内の無菌条件下ですべてのメディア変更を行います。
- めっき後48hの細胞媒体を交換する(インビトロ2、DIV2で1日)。
- DIV5では、10μMシトシンアラビノシド(AraC)を補充した新鮮なアストロサイト培養培養培養培養培養培養物で培養する。
注:このステップは、線維芽細胞および他のグリア細胞を含む汚染物質細胞の除去を容易にする。長いインキュベーション時間がアストロサイトの生存率を減少させるので、AraCで培養を48時間より長く扱う必要があります。 - DIV7では、AraCを持たないアストロサイト培養メディアにメディアを変更し、毎日文化合流をチェックし始めます。細胞が80%の合流点に達したら、ポリD-リジンで各未精製星細胞培養フラスコに2-T75フラスコを塗り、37°Cで37°Cで一晩に少なくとも8時間インキュベートします。
- 翌日、培養フラスコを37°C軌道揺振りインキュベーターで30分間180rpmで振ってアストロサイト精製を開始する。メディアを取り外し、新鮮なアストロサイト培養メディアに置き換えます。37°Cの軌道振盪インキュベーターで6時間240rpmで細胞を振る。予め1xリン酸緩衝生理食べ物(PBS)、アストロサイト培養培養培養物、および0.25%トリプシン-EDTAを37°C 20−30分に振盪期間の終了前に。
注:揺れのステップの間にCO2のインキュベーションは要求されない。 必要に応じて、30分および6-h振盪ステップの後に収集された培養物は、それぞれミクログリアおよびオリゴデンドロサイトを培養するために使用され得る。しかし、混合培養のAraC処理は、他のグリア細胞の豊富さを減少させる。 - シェーカーから培養フラスコを取り外し、すぐにフラスコあたり10 mLの暖かい1x PBSでメディアを交換します。PBSを取り出し、フラスコあたり0.25%トリプシン-EDTAの3 mLを追加します。37 °C および 5% CO2でインキュベートし、5 分ごとに剥離を確認します。
- 細胞がフラスコから切り離されたら、10mLのアストロサイト培養培養培養培養を加えてトリプシン化を停止する。切り離されたアストロサイトを50mLの円錐形チューブとペレット細胞に300 x gで5分間遠心分離して移管し、上清上清を吸引し、40mLの星細胞培養培養培養培養培養物で細胞を再中断する。
- ポリD-リジンコーティングされたT75フラスコを滅菌水で2回洗浄し、精製されたアストロサイト懸濁液のプレート20 mLを洗浄します。37 °C および 5% CO2インキュベーターに戻します。アストロサイト培養培養培養剤を2日おきに交換し、アストロサイトが成熟するまでさらに10日間使用します。
注:精製された星状細胞の各T75フラスコは、めっきでそれぞれ3 x 105細胞を持つ2つの新しいT75フラスコを生成するのに十分であるべきです。 - 後続のパスの手順 2.5−2.7 を繰り返すか、顕微鏡検査用のアストロサイトをプレートします。
注:AraCの添加後のアストロサイト培養物の純度と以下の精製は、明視野顕微鏡を通じて、またはグリア線維性酸タンパク質(GFAP)陽性の割合を定量化することによって、より正確に定性的に評価することができる。蛍光画像における視野ごとの細胞(図1B,C)。
3. 蛍光タグ付きプラスミドのトランスフェクション
- トランスフェクションまたは標識の前日に、トランスフェクション後24−48hポストトランスフェクションを撮像するための所望の密度で種アストロサイト。24ウェルプレートまたは14mmガラス底部ウェルの推奨密度は、2 x 104セル/ウェルです。
注:このプロトコルは、リポフェクションベースの方法を使用して、24ウェルプレートまたは14mmガラス底部ウェル上の12mmガラスカバーリップにめっきされたアストロサイトのトランスフェクション用に最適化されています。試薬は、アストロサイトが成長している培養皿の大きさに応じて拡大する必要があります。 - リポフェクション試薬(材料の表)を還元血清媒体(材料の表)で希釈する。リポフェクション試薬とDNAの比率を最適化するには、適切な希釈の範囲をテストします。例えば、このプロトコル(材料の表)で用いられる試薬を用いれば、リポフェクション試薬の2、3、4、および5μLを還元血清培地の50μLで希釈する。
- 還元血清培中の250μLの高純度DNAを5μg希釈する。リポフェクションエンハンサー試薬(材料の表)の5 μLを追加します。リポフェクション試薬を含むチューブを、DNAリポフェクションエンハンサーミックスの等しい体積と組み合わせます。ピペッティングで混合し、室温(RT)で15分間インキュベートします。
- アストロサイト培養培養物を取り除き、トランスフェクションミックス(ステップ3.3)を細胞にドロップワイズに加えます。37°Cおよび5%CO2で6時間のインキュベーションを行った後、トランスフェクション複合体を適切な体積のアストロサイト培養培地(14mmガラス底皿用2mL)に置き換えます。画像取得に進む前に、さらに24~72時間インキュベートしてください。タンパク質発現と細胞生存率の最適なバランスを達成するために、インキュベーションステップの持続時間を注意深く監視します。
4. 蛍光プローブを用した後期エンドソーム/リソソームの標識
注:一部の貨物は、貨物特異的タンパク質に対して親和性の高い蛍光色素を使用して標識することができます。次の例は、蛍光酸性プローブを使用した後期エンドソーム/リソソームの標識を可能にする。
- アストロサイト培養培地の200μLのリソソーム標識プローブ(材料表)を1μMの作動濃度に希釈し、2 x 104細胞/ウェルの密度でステップ3.1からアストロサイトに適用します。37°Cで30分間インキュベートします。
- 温かい星状細胞培養培地で細胞を一度洗い、イメージング培地(材料の表)に置き換えます。すぐにライブイメージングに進みます。
5. タイムラプスイメージングシステムを用いた画像集録
注:タイムラプスライブイメージングは、高速カメラ、明確な焦点、インキュベーションチャンバー、および高い数値絞り(例えば、Plan-Apochromat 1.4NA)を備えた40倍の油目的を備えた蛍光顕微鏡を使用して行う必要があります。タイムラプスイメージングには、さまざまな集録ソフトウェアが用意されています。顕微鏡検査システムと取得ソフトウェアの選択は、特定の研究の目標に対する可用性と適合性に基づいて行う必要があります。一般的なガイドラインを以下に示します。
- 培養室または皿を顕微鏡ステージの適切なアダプターに置きます。エピ蛍光光を使用して、蛍光タンパク質またはプローブを発現する細胞を選択して記録します。蛍光サンプルイルミネーションを調整して、デジタルカメラを使用して選択したセルを視覚化します。光漂白や光毒性を引き起こす可能性のある高い照明の使用は避けてください。フォーカスとズームを調整します。
- ズームと明確なフォーカス機能を使用して、300秒から500秒の間の時間間隔のために、2秒ごとに1フレームの周波数で単一のZスタックタイムラプスシリーズを取得します。
注:人身売買のダイナミクス(速度、運動周波数など)は、目的のタンパク質によって異なるため、取得の時間経過には調整が必要な場合があります。例えば、ミトコンドリアはリソソームよりもモチ性が低く、頻繁に休止を示す。この場合、取得パラメータを 800 s の場合は 5 s ごとに 1 フレームに調整する方が適切です。 - タイムラプス画像を保存し、AVIまたはTIFFスタックファイルとしてエクスポートします。
6. 画像解析
注:画像解析は、ImageJ/Fiji16用のKymoToolBoxプラグインを使用して行いました。詳細なステップバイステップの書かれた指示は、オンライン17で利用可能です。次の省略された手順は、キモグラフを作成し、パーティクル トランスポート パラメータを抽出するのに十分である必要があります。
- ImageJ/Fiji ソフトウェアでタイムラプスイメージシーケンスを開きます。ファイルメニューから AVI または TIFF スタック ファイルとしてイメージをインポートします。[イメージ]メニューから[タイプ]ツールを使用して、これらの種類の 1 つを選択して、イメージを 8 ビットまたは 16 ビットに変換します。RGB ファイルを操作する場合は、[イメージ]メニューの [色]機能で使用可能なチャンネル分割ツールを使用してチャンネルを分割します。
- キモグラフ(パーティクル軌道の位置と時間の表現)を生成するには、セグメント化された線ツールを使用してパーティクルの軌道に沿った線をトレースして、パーティクルが移動している各トラックを描画します。ムーブメントの方向性を正しく割り当てるには、すべてのムービーに同じ目的の方向規則を使用してポリラインを描画し、調査対象のすべてのセル間で極性が一貫するようにします。たとえば、セルの中心から周辺に向かってポリラインを描画したり、ポリラインを描画したりできます。[ライン]ツールをダブルクリックして、トラックの太さに合わせて線幅を調整します。
- 10の線幅を使用してKymoToolBoxプラグインの描画Kymoマクロを実行します。画像を時間(フレーム数、フレームレート)とスペース(x,Y解像度)で調整するよう求めるプロンプトが表示されます。キャリブレーションが完了すると、キモグラフが生成され、データ表示やさらなる粒子解析のためにTIFFファイルとして保存できます。
- 集録の全期間、セグメント化された線ツールを使用して、カイモグラフ内の各パーティクルを手動で追跡してパーティクル軌道を割り当てます。[分析/ツール]メニューにあるROI マネージャツールを使用して、各パーティクル 軌道を対象領域 (ROI) として記録します。さらなる分析のために、各タイムラプスビデオごとにすべてのROIsを保存します。
注:輸送パラメータの最も正確な計算を達成するためには、キモグラフ上の個々の粒子に正しい軌道を割り当てすることが重要です。- KymoToolBoxプラグインの分析Kymoマクロを実行します。ドロップダウン メニューからパーティクル モーションの"外側"方向(左から右へ、またはその逆)を定義するように求めるウィンドウが開きます。この選択は、ステップ6.2で確立された核または細胞周辺に対して画像化された蛍光貨物の位置に依存する。たとえば、核が貨物の左側に配置され、ステップ 6.2 のポリラインが核から離れて描画された場合、外側のパーティクルモーションを「左から右へ」と定義します。
- [Kymoの分析] ウィンドウで制限速度 (貨物がモチルと見なされる最小速度) を定義します。細胞内輸送速度が速い貨物の場合、0.1 μm/秒が適切な選択です。この値を変更して、対象の各貨物に対するソフトウェアの感度を調整します。各パーティクル軌道の厚さに合わせて線幅を調整します。
- [kymoの分析] ウィンドウで[すべてのデータをログに記録]を選択し、外挿された座標をログに記録します。これは、平均速度、内向き速度、外向き速度、累積距離、内向きまたは外側の方向に移動した距離、各粒子のスイッチ数、時間のパーセンテージを含む様々な貨物輸送パラメータを計算します。各方向に移動したり、一時停止したりする場合個々のトラックに対して計算されたデータは、kymograph ごとにプールされ、各画像に固有のテキスト ファイルに保存されます。
注:分析Kymoマクロの[色付きKymoを表示]オプションは、元のキモグラフ上のパスの色分けされたオーバーレイを生成します。外側に移動するパーティクルは緑色、内側は赤色、静止したパーティクルは青色で表示されます。Kymoの分析マクロの[元のスタックのレポート座標] オプションは、元のタイムラプス ビデオとキモグラフ上の外挿されたオブジェクトの位置の色分けされたオーバーレイを生成します。
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Representative Results
上記で概説した一次マウスMDアストロサイトを確立するためのプロトコルは、再現性の高い高品質の培養物を生み出す必要があります。培養物は当初、アストロサイト、線維芽細胞、およびミクログリアおよびオリゴデンドロサイトを含む他のグリア細胞の混合物を含むが(図1Bi,Biv;赤い矢頭)、DIV5-DIV7間の混合培養物へのAraCの添加は最小化するこれらの汚染物質細胞の増殖。AraC処理と揺れベースの精製戦略を組み合わせることで、精製工程のみを含む従来のプロトコル(図1Bv;青)よりもアストロサイト培養の純度を豊かにします(図1Bv;青)。矢印)13.アラCまたは未処理で処理された精製星細胞培養物の期待形態および組成物(GFAPおよび4'、6-ジアミディーノ-2−フェニリンドール[DAPI]染色)を図1 Biii、Bviに示す。視野当たりのGFAP+細胞の定量化(DAPI染色によって同定された細胞の総数に対するGFAP染色を持つ細胞数の割合)は、AraC補充による純度の27%以上の増加を示す(図1)C)この高純度マウスアストロサイト培養は、RNAおよびタンパク質発現、細胞形態、およびその他の機能的アッセイの評価に適しています。
我々は、マウスアストロサイトにおけるギャップ接合タンパク質Cx43およびEAAT1トランスポーターのGFPタグ付きバージョンを発現するために、脂肪フェクションベースのトランスフェクションを使用した。この方法論により、毒性を引き起こしたり、アストロサイトの生存率に影響を与えることなく、生細胞イメージングに最適なレベルでタンパク質を一時的に発現することができます(図2A,E)。同様に、蛍光プローブの使用により、酸性内方性リソソーム小器官(図2I)の迅速かつ効率的な標識が可能となり、アストロサイトにおけるそのダイナミクスを追跡した。
図2は、EAAT1-GFP、Cx43-GFP、または酸性内因性小胞を認識する選択的色素で標識されたアストロサイトにおける貨物ダイナミクスの分析の代表的な結果を示す。これらの貨物のそれぞれは、周核領域、サイトソール、およびアストロサイトのプロセスを飾る蛍光穿刺として現れた(図2A,E,I,左パネル)。タイムラプスデータは、時間と空間で貨物の動きを追跡するキモグラフを生成するために使用されました(図2A、E、I、右パネル)。これらのキモグラフでは、示された貨物の前立腺および逆行運動は、それぞれ負(緑色の線)と正(赤い線)の傾きを持つ軌道によって表されます。静止小胞は、垂直軌道(青い線)として示されます。Kymograph分析は、分析された3種類の貨物が、時折速く、プロセス的に両方向に走る双方向輸送を受けることを明らかにしました。さらに、アストロサイト(赤い箱)の領域を通る貨物のフラックスの定量化は、貨物間の動体粒子の割合の違いを明らかにした。例えば、EAAT1-GFPパンクタの70%が静止しているのに対し(図2B)、Cx43-GFP(図2F)の20%未満、プローブ標識された内引異性凝異性荷積(図2J)の45%が非モチルです。貨物間の運動性のこれらの違いは、映画が獲得された星状細胞の領域における通常のベースライン運動性を表している可能性が高い。
キモグラフから得られた各粒子のフルタイムスケールに沿ったX-Y位置の変化の正確なマッピングは、貨物速度(図2C、G、K)や走行長(距離)などの他のモーションパラメータを評価するためにも使用できます。(図2D,H,L)モーションパラメータは、個々の貨物についてさらに分析して、動きの方向の変化(逆行運動と逆行運動)、粒子方向の反転、一時停止回数などを決定できます。これらのタイプの分析の結果は、基礎細胞下または細胞外の異常な状態下での星状細胞における小器および膜タンパク質の細胞分布の変化に関する有意義な定量的情報を提供できる。環境。
図1:一次マウス星状細胞培養の確立
(A) P2−P4マウス脳の解剖に必要なステップ。(B) (i,iv) アラCで処理された混合グリア培養物のブライトフィールド画像 (i) と非処理 (iv)を使用した。赤い矢印は、汚染物質ミクログリアを示します。(ii, v)精製された星状細胞培養物の画像(ii)および非処理(v)をAraCで処理した。青い矢印は、汚染物質オリゴデンドロサイトを示す。(iii,vi)精製された星状細胞培養物の共焦点画像をAraCで処理(iii)および非処理(vi)とした。緑色は、GFAP染色およびDAPI(青)ラベル全ての核を示す。(C) GFAP陽性細胞の割合。データは平均 ± SEM. ***p < 0.001、ペアなしのt検定を表します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:星状細胞における貨物ダイナミクスの定量的分析
(A,E, I)左パネル:EAAT1-GFP(A)を発現するアストロサイト、Cx43-GFP(E)、または後期エンドソームおよびリソソーム(I)に標識するプローブで処理した。赤いボックスは、パーティクル ダイナミクスの解析に使用される領域を示します。右パネル:示された貨物の軌道を示すオリジナルおよび色分けされたキモグラフ。赤い線は逆行移動貨物、緑色の線は移動する貨物、青い線は非動性の貨物を表します。(B,F,J)静止粒子およびモチル粒子の割合。(C,G, K)前立腺および逆行速度および(D,H,L)の走り長さの定量化。データは平均 ±SEM を表し、この図のより大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、高純度一次マウス皮質MDアストロサイトにおけるタイムラプスビデオ顕微鏡を用いて、蛍光タグ付きオルガネラおよび目的の膜タンパク質を発現、視覚化、追跡する実験的アプローチについて説明する。また、粒子ダイナミクスを測定する方法論についても概説する。一次星状細胞におけるタンパク質および小器官ダイナミクスの直接可視化は、インビトロでこれらの細胞における細胞内輸送の調節を研究するための強力なツールを提供する。
上記のマウスMDアストロサイト培養を確立するための方法論は、他の公開プロトコル13、14、15からのステップを組み合わせたものであり、より単純な方法と高純度と品質の両方をもたらす文化。AraC15処理と振盪ベースの精製13、14の組み合わせは、98%(GFAP+細胞総細胞の比率によって評価される)と高い純度を有する星状細胞培養物を得ることができ、我々の例では、精製工程のみの培養物に対する純度の27%増加(図1B,C)。この方法で得られたマウスアストロサイトの高純度培養は、マッカーシーおよびデベリス14によるラットアストロサイト培養(酵素アッセイおよび電子顕微鏡検査によって評価される)に報告された値に類似している。しかし、AraC処理を含まないマッカーシー/デベリス法は、より長い揺振り工程(15−18時間)と2回の追加の精製14を必要とする。
この例では、このプロトコルが、個々の細胞内旅程および細胞を代表する可能性が高い星状細胞における様々な膜タンパク質と小器官の間の運動性の違いを捕捉するのに十分に敏感であることを示す。関数。この例では基底条件でこのプロトコルの有用性を示していますが、この方法論は、幅広い研究問題の中で輸送パラメータを測定するために容易に適合させることができる。例えば、マイナーな変更を伴う同様のプロトコルは、細胞損傷、毒性、病原性突然変異、シナプス活性などの細胞内または細胞外環境に応答してインビトロのアストロサイトにおける輸送事象を特徴付けるために使用することができる。ニューロンと星状細胞の混合培養)など同様に、複数の貨物またはオルガネラの共発現および可視化は、それぞれ異なる蛍光色素で個別にタグ付けされ、共局在化および複雑な形成、オルガネラ間の一時的な相互作用の動的変化を評価するためにも使用できる。、エンドサイトおよび膜リサイクル輸送イベント。
ここで提示される方法論の成功は、主に高品質のアストロサイト培養物を得る能力と、関心のある貨物の効率的な標識に依存しています。ライブイメージングにこの手順を利用する場合、蛍光発現を注意深く監視して、最適なトランスフェクション後インキュベーション時間を決定することが重要です。平均して、貨物が24時間のインキュベーション期間を分析した結果、ライブイメージング取得のための良好な信号強度が生まれることがわかりました。トランスフェクトされた星状細胞の長時間のインキュベーションは、蛍光タグ付きタンパク質の高発現をもたらし、タンパク質凝集を誘発し、貨物の局在化とダイナミクスを変化させ、培養物の健康を低下させる可能性があります。アストロサイトは、物理的な損傷や文化環境の変化に非常に脆弱であり、反応性を含む転写および細胞応答の誘導につながる可能性があります。したがって、洗浄工程間の時間間隔を短縮し、培養物の空気への曝露を最小限に抑え、インキュベーションおよび集録期間にわたって温度または光強度の大幅な変化を最小限に抑えることが重要です。
要約すると、ここで提示される方法は、アストロサイトにおけるタンパク質および小器官の局在化における動的変化を評価および定量するために使用することができる。それらは生理学的および病理学的条件の下で星星細胞応答の変化の調査を可能にする貴重な用具を提供する。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
DNLは、シモンズ学者としてチャペルヒル(UNC)医学部のノースカロライナ大学によってサポートされました。TWR は UNC PREP グラント R25 GM089569 によってサポートされました。UNC神経科学センター顕微鏡コア施設を用いる研究は、NIH-NINDS神経科学センター支援助成金P30 NS045892及びNIH-NICHD知的発達障害研究センター支援助成金U54の助成を受け、一部支援を受けた。HD079124
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Scientific | 75-203-637 | Sorvall ST8 Centrifuge |
| Cell Culture Grade Water | Gen Clone | 25-511 | |
| Cell Culture Microscope | Zeiss | WSN-AXIOVERT A1 | Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities |
| Cytosine Arabinoside | Sigma | C1768-100MG | (AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage |
| DAPI | Sigma | D9542-5MG | Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining. |
| Dissecting Microscope | Zeiss | Stemi 305 | |
| Dissecting Scissors | F.S.T | 14558-09 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gen Clone | 25-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | Heat-Inactivated |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | Version 1.52i | |
| Fine Tip Tweezers | F.S.T | 11254-20 | Style #5 |
| Fluorescence light source | Excelitas | 012-63000 | X-Cite 120Q |
| GFAP antibody | Cell Signaling | 3670S | GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody |
| Glass Bottom Dishes | Mattek corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated |
| Graefe Forceps | F.S.T | 11054-10 | Graefe Iris Forceps with curved tips |
| Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes) | Life Technologies | L7526 | LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice. |
| Hank's Balanced Salt Solution (10x) | Gibco | 14065-056 | Magnesium and calcium free |
| Imaging Media | Life Technologies | A14291DJ | Live Cell Imaging Solution |
| Inverted Confocal Microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| KymoToolBox | https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox | ||
| Lipofection Enhancer Reagent | Life Technologies | 11514015 | Plus Reagent |
| Lipofection Reagent | Life Technologies | 15338100 | Lipofectamine LTX reagent |
| Orbital shaking incubator | New Brunswick Scientific | 8261-30-1008 | Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control |
| Penicillin/Strepomycin solution (100x) | Gen Clone | 25-512 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Gen Clone | 25-507x | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide | Sigma | P7405 | Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing |
| Reduced serum medium | Gibco | 31985-062 | OPTI-MEM |
| Tissue Culture Flasks | Olympus Plastics | 25-209 | 75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap |
| Tissue culture incubator | Thermo Scientific | 51030285 | HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control |
| Tris-Base | Sigma | T1503 | 8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | 4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Vacuum-Driven Filter Systems | Olympus Plastics | 25-227 | 500 ml, PES membrane, 0.22 µm |
| Vannas scissors straight | Roboz | RS-5620 |
References
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