Visualisering og analyse af intracellulær transport af organelles og andre Cargos i astrocytter

Summary

Her beskriver vi en in vitro-Live-imaging metode til at visualisere intracellulær transport af organeller og handel med plasma membran proteiner i murine astrocytter. Denne protokol præsenterer også en billedanalyse metode til at bestemme fragttransport ruter og kinetik.

Abstract

Astrocytter er blandt de mest udbredte celletyper i den voksne hjerne, hvor de spiller nøgleroller i en mangfoldighed af funktioner. Som en central aktør i hjernens homøostase leverer astrocytter neuroner med vitale metabolitter og buffer ekstracellulært vand, ioner og glutamat. En integreret del af "Tri-Arts" synapse, astrocytter er også afgørende i dannelsen, beskæring, vedligeholdelse, og graduering af synapser. For at aktivere disse meget interaktive funktioner kommunikerer astrocytter indbyrdes og med andre gliale celler, neuroner, hjernens vaskulatur og det ekstracellulære miljø gennem et væld af specialiserede membran proteiner, der omfatter celle adhæsionsmolekyler, aquaporiner, ionkanaler, neurotransmitter transportører og Gap Junction molekyler. For at støtte denne dynamiske flux, astrocytter, ligesom neuroner, stole på stramt koordineret og effektiv intracellulær transport. I modsætning til neuroner, hvor intracellulær handel er blevet udførligt afgrænset, microtubule-baserede transport i astrocytter har været mindre undersøgt. Ikke desto mindre, EXO-og endocytisk handel med celle membran proteiner og intracellulære organelle transport orkestrere astrocytter ' normale biologi, og disse processer er ofte påvirket i sygdom eller som reaktion på skade. Her præsenterer vi en ligetil protokol til kultur høj kvalitet murine astrocytter, at fluorescently label astrocytiske proteiner og organeller af interesse, og at registrere deres intracellulære transport dynamik ved hjælp af time-lapse confokale mikroskopi. Vi demonstrerer også, hvordan man udtrækker og kvantificerer relevante transport parametre fra de erhvervede film ved hjælp af tilgængelige billedanalyse software (dvs., ImageJ/FIJI) plugins.

Introduction

Astrocytter er de mest rigelige celler i den voksne centrale nervesystem, hvor de udfører unikke udviklingsmæssige og homeostatiske funktioner¹. Astrocytter moduter synaptisk udvikling gennem direkte kontakt med præ-og postsynaptiske terminaler som en del af Tri-Arts synapse, som indeholder neurotransmitter receptorer, transportører, og celle adhæsion molekyler, der letter synapse dannelse og neuron-astrocyt kommunikation². Desuden, astrocytter aktivt kontrollere synaptisk transmission og forhindre neuronal excitotoksicitet ved hurtigt at fjerne excitatoriske neurotransmittere fra den synaptiske kløft, genbrug neurotransmittere, og deltager i synaptisk beskæring^{3 , 4 , 5 , 6}. for at aktivere disse meget interaktive funktioner kommunikerer astrocytter indbyrdes, med andre gliale celler og med neuroner gennem specialiserede membran proteiner, herunder celle vedhæftnings molekyler, aquaporiner, ionkanaler, neurotransmitter transportører og Gap Junction molekyler. Astrocytter ændrer aktivt overflade niveauerne af disse proteiner som reaktion på udsving i deres intra-og ekstracellulære miljø⁷. Endvidere, ændringer i niveauer og fordeling af mitokondrier, lipid dråber, og nedbrydelse og genanvendelse organeller modutere energiforsyningen, metabolismen tilgængelighed, og cellulære clearing processer, der er afgørende for astrocyt funktion og Overlevelse.

De dynamiske ændringer i membran protein og organelle handel og positionering i astrocytter lettes ved den samordnede funktion af motor proteiner og adaptere, der fremmer lasten motilitet^8,9. Tilsvarende er overflade niveauer af membran proteiner moduleret gennem internalisering og genbrug begivenheder¹⁰. Disse Cargos transporteres via et indviklet netværk af actin, microtubuler, og eventuelt mellemliggende filamenter spor⁸. Undersøgelser baseret på immunofluorescens farvning af bindende protein 1 (EB1), som akkumuleres ved den voksende mikrotubule plus ender, tyder på, at i astrocytter bundter af microtubuli udstråler ud fra perinucleus og udvide deres plus ende mod periferi¹¹. Men, en omfattende undersøgelse af organisation og polaritet af microtubuler og andre cytoskelet elementer ved hjælp af Live-Cell Imaging er stadig mangler. Mens mange af de mekanismer, der ligger til grund for dynamikken i organeller og membran proteiner er blevet grundigt undersøgt i neuroner og andre celletyper, er Cargo motilitet i astrocytter mindre godt forstået. De fleste af vores nuværende viden om ændringer i protein og organelle fordeling i astrocytter er baseret på traditionelle antistof-baserede mærkning af fast præparat, som udelukker præcis rumlig og tidsmæssig undersøgelse af lasten Dynamics^{7, 12}.

Her beskriver vi en metode til at mærke membran proteiner og organeller til levende billeddannelse i høj renhed primær mus astrocyt kulturer. Ved hjælp af denne protokol giver vi eksempler, hvor vi sporer den dynamiske lokalisering af grønt fluorescerende protein (gfp)-mærkede membran proteiner i transficeret astrocytter, herunder Gap Junction protein connexin 43 (Cx43-gfp) og excitatoriske aminosyre transporter 1 (EAAT1-GFP). Vi beskriver også brugen af en fluorescerende acidotropic sonde til at visualisere sure organeller og følge deres handel dynamik i levende astrocytter. Endelig viser vi, hvordan man analyserer tidsforskudt data for at udtrække og evaluere transport parametre for individuelle Cargos.

Protocol

Alle dyr procedurer blev udført med godkendelse af University of North Carolina på Chapel Hill Animal Care og use Committee (IACUC).

1. Brain dissektion og kultur af primære mus astrocytter

NB: følgende protokol er blevet tilpasset fra offentliggjorte metoder, som følger den oprindelige procedure, der er udviklet af McCarthy og devellis^13,14,15. Blandede cellekulturer af McCarthy/deVellis (MD) astrocytter er fremstillet af postnatale dag 2 − 4 (P2 − P4) mus cortices, behandlet med en anti-mitotisk faktor, og renset for at give den endelige beriget astrocyt kultur. Fire corticer fra mus pup af begge køn er tilstrækkelige til at generere en T75 vævskultur kolbe kultur.

1. Coat bunden af T75 kolber (100% vinklet nakke adgang, 0,22 μm hydrofobe ventileret filter hætte) med poly-D-lysin (1 mg/mL i 0,1 M Tris buffer, pH 8,5) og inkubere ved 37 °C i 24 timer før starten af dissektion.
2. Før du begynder dissektions proceduren, varm 30 mL astrocyt kultur medier (Dulbecco's modificerede Eagle's medium [DMEM] højt glucose, 10% varme inaktiveret føtal kvægserum, 1% penicillin/streptomycin) ved 37 °C og tø en 5 mL alikvot 2,5% trypsin på is. Forbered to dissekting retter (60 mm diameter) på is fyldt med 6 mL Hank's afbalancerede saltopløsning (HBSS) uden ca^{2 +} eller mg^{2 +}.
3. Desinficer alle kirurgiske værktøjer (fine tip tweezers, dissekere saks, Vannas saks straight, Graefe pincet med buede spidser) i 70% ethanol før og i mellem hver dissektion.
4. Spray hovedet og halsen på P2 − P4 muse hvalpe med 70% ethanol, før du hurtigt euthanizing dem ved halshugning med kirurgisk saks. Udfør en posterior til forreste midterlinje snit langs hovedbunden for at udsætte kraniet. Skær forsigtigt kraniet fra halsen til næsen.
5. Udfør to yderligere laterale indsnit bedre end øjnene. Ved hjælp af fine tip pincet forsigtigt flip kraniet flapper til siden. Fjern hjernen og Placer den i den første dissekere skål fyldt med iskold hbss uden ca^{2 +} eller mg^{2 +}. Hold skålen på isen og Fortsæt med at høste resten af hjernen.
   Bemærk: Udfør resten af dissektions proceduren under et dissekting-område.
6. Fjern olfaktoriske pærer ved hjælp af Vannas saks eller fine pincet (figur 1AI). Med den buede spids pincet i skæringspunktet mellem tværgående og interhemispheric sprækker, forsigtigt indsætte et andet par buede spids pincet mellem cortex og diencephalon, langsomt åbne pincet at adskille de cerebrale halvkugler fra resten af hjernen (figur 1AII, AIII). Fjern det uønskede væv (figur 1AIV).
7. For hver kortikale halvkugle, forsigtigt fjerne meninges med fine tip tweezers. Fjern eventuelt hippocampus fra cortices. Overfør de dissekerede mus corticer til en anden skål fyldt med iskold hbss uden ca^{2 +} eller mg^{2 +} og holde det på is, mens dissekere de resterende hjerner.
   Bemærk: Udfør de næste trin under aseptiske forhold i en laminar flow hætte.
8. Skær dissekeret corticer i små stykker (ca. 2 − 4 mm) ved hjælp af steril skarp kirurgisk saks eller en skalpel. Det dissekterede væv overføres til en 50 mL konisk tube indeholdende enzym opløsning (22,5 mL HBSS uden ca.^{2 +} eller mg^{2 +}, 2,5 ml 2,5% trypsin). Inkuber ved 37 °C i 30 minutter med blid inversion hver 10 min.
9. Det Ford øjede væv opsamles ved centrifugering ved 300 x g i 5 min., og enzymopløsningen fjernes ved dekantering (brug ikke en vakuum aspirator). Tilsæt 10 mL astrocyt kultur medier og dissociér vævet i enkeltceller ved at pipettere opløsningen 20 − 30x ved hjælp af en 10 mL serologisk pipette.
10. Filtrer cellesuspensionen gennem en 70 μm celle-si for at minimere celle klumper og ufordøjet væv. Filtratet opsamles i et rent 50 mL konisk rør, og det totale volumen justeres til 20 mL med astrocyt-kultur medier. På dette tidspunkt, evaluere effektiviteten af den kortikale dissociation ved at blande 10 μL af cellen suspension med 10 μL trypan og et blå og tælle celler med en hemocytometer.
    Bemærk: et præparat fra fire P2 − P4 muse kortices giver 10 − 15 x 10⁶ enkeltceller.
11. Sug poly-D-lysin-belægnings opløsningen fra de T75 kultur kolber og vask to gange med sterilt vand. 20 mL-cellesuspensionen og inkubaten ved 37 °C og 5% CO₂.

2. rensning og vedligeholdelse af astrocyt kulturer

Bemærk: Udfør alle medieændringer under aseptiske forhold i en laminar flow hætte ved hjælp af sterilfiltreret (0,22 μm filtermembran) astrocyt medier opvarmet til 37 °C.

1. Udskift celle mediet 48 h efter plating (dag in vitro 2, DIV2).
2. På DIV5, Udskift medierne med friske astrocyt kultur medier suppleret med 10 μM cytosin adeninarabinosid (Arac).
   Bemærk: dette trin letter fjernelsen af kontaminerende celler, herunder fibroblaster og andre gliale celler. Det er vigtigt at behandle kulturerne med AraC ikke længere end 48 h som længere inkubationstider vil reducere astrocyt levedygtighed.
3. På DIV7, skifte medie til astrocyt kultur medier uden Arac og begynde at kontrollere kulturen sammentræf dagligt. Når cellerne har nået 80% sammenløbet, frakke to-T75 kolber for hver urenset astrocyt kultur kolbe med poly-D-Lysin og inkubere ved 37 °C i mindst 8 timer til natten.
4. Den følgende dag begynder astrocyt rensningen ved at ryste kultur kolberne ved 180 rpm i 30 minutter i en 37 °C orbital ryste inkubator. Fjern mediet, og Udskift det med nye astrocyt-kultur medier. Ryst cellerne ved 240 rpm i 6 timer i en 37 °C orbital ryste inkubator. Prewarm 1x fosfat-bufferet saltvand (PBS), astrocyt kultur medier og 0,25% trypsin-EDTA til 37 °C 20 − 30 min før slutningen af ryste perioden.
   Bemærk: Co₂inkubation er ikke påkrævet under ryste trinene. Hvis det ønskes, de medier, der indsamles efter 30-min og 6-h ryste trin kan anvendes til kultur microglia og oligodendrocytter, hhv. AraC behandling af den blandede kultur vil imidlertid reducere overflod af de andre gliale celler.
5. Fjern kultur kolberne fra rysteapparatet, og Udskift straks mediet med 10 mL varm 1x PBS pr. kolbe. PBS, og tilsæt 3 mL 0,25% trypsin-EDTA pr. kolbe. Inkuberes ved 37 °C og 5% CO₂, kontrol hver 5 min for løsrivelse.
6. Når cellerne er løsrevet fra kolben, stop trypsinisering ved at tilføje 10 mL astrocyt kultur medier. Overfør fritliggende astrocytter til en 50 mL koniske slange-og pellet celler ved centrifugering ved 300 x g i 5 min. Aspirér supernatanten og re-suspendere cellerne i 40 ml astrocyt kultur medier.
7. De poly-D-lysin-belagte T75 kolber vaskes to gange med sterilt vand og 20 mL af den rensede astrocyt suspension. Vend tilbage til 37 °C og 5% CO₂ -inkubator. Skift astrocyt kultur medier hver anden dag i yderligere 10 dage indtil astrocytter modne.
   Bemærk: hver T75 kolbe af rensede astrocytter bør være tilstrækkelig til at producere 2 nye T75 kolber med 3 x 10⁵ celler hver ved plating.
8. Gentag trin 2.5 − 2.7 for efterfølgende gennemløb eller til plade astrocytter for mikroskopi.
   Bemærk: renheden af astrocyt kulturer efter tilsætning af Arac og efter rensning kan vurderes kvalitativt gennem lysfelt mikroskopi, eller mere præcist ved at kvantificere procentdelen af gliaceller fibrillsyreprotein (GFAP)-positive celler pr. synsfelt i fluorescerende billeder (figur 1B, C).

3. transfection af fluorescently mærkede plasmid'er

1. Dagen før transfektering eller mærkning, frø astrocytter ved ønsket tæthed for billeddannelse 24 − 48 h post-transfektering. En anbefalet tæthed for 24-brønd plader eller 14 mm glasbund brønde er 2 x 10⁴ celler/godt.
   Bemærk: denne protokol er optimeret til transfektering af astrocytter belagt på 12 mm glas dæksedler på 24-brønd plader eller 14 mm glasbund brønde ved hjælp af en lipofection-baseret metode. Reagenser skal skaleres afhængigt af størrelsen af den kultur skål, hvor astrocytterne vokser.
2. Fortyndet lipofection reagens (tabel over materialer) i reducerede serum medier (tabel over materialer). For at optimere forholdet af lipofection reagens til DNA, test en række passende fortyndinger. Hvis du for eksempel bruger den reagens, som er anvendt i denne protokol (tabel over materialer), fortyndes 2, 3, 4 og 5 μl af lipofection reagenset i 50 μl reducerede serum medier.
3. 5 μg højrenheds DNA fortyndes i 250 μL reducerede serum medier. Tilsæt 5 μl lipofection forstærker reagens (tabel over materialer). Kombiner røret indeholdende lipofection reagens med et tilsvarende volumen af DNA-lipofection forstærker mix. Bland ved pipettering og Inkuber ved stuetemperatur (RT) i 15 min.
4. Fjern astrocyt kultur medier og tilsæt transfektering mix (trin 3,3) til celler dropwise. Efter en 6-h inkubation ved 37 °c og 5% Co₂, Udskift transfektering kompleks med et passende volumen af astrocyt kultur medier (2 ml for 14 mm glasbund retter). Inkuber i yderligere 24 − 72 timer, før du fortsætter til billed købet. Nøje overvåge varigheden af inkubations trinnet for at opnå den bedste balance mellem protein ekspression og cellernes levedygtighed.

4. mærkning af sene endosomes/lysosomer ved hjælp af fluorescerende sonder

Bemærk: nogle Cargos kan mærkes ved hjælp af fluorescerende farvestoffer med høj affinitet for last-specifikke proteiner. Følgende eksempel tillader mærkning af sene endosomer/lysosomer med en fluorescerende acidotropic sonde.

1. Fortyndet lysosomal-mærknings sonde (tabel af materialer) i 200 μl astrocyt kultur medier til en arbejds koncentration på 1 μM og gælder for astrocytter fra trin 3,1 ved en tæthed på 2 x 10⁴ celler/brønd. Inkuber i 30 min ved 37 °C.
2. Vask cellerne én gang med varme astrocyt kultur medier og Erstat med billedmedier (tabel over materialer). Fortsæt med at Live Imaging med det samme.

5. image erhvervelse ved hjælp af et tidsforskudt billedbehandlingssystem

Bemærk: tidsforskudt Live imaging skal udføres ved hjælp af et fluorescens mikroskop udstyret med et højhastighedskamera, klart fokus, inkubations kammer og en 40x olie målsætning med en høj numerisk blænde (f. eks. plan-Apochromat 1.4 NA). En række af erhvervelse software er tilgængelig for time-lapse Imaging. Udvælgelse af mikroskopi systemet og erhvervelse software bør være baseret på deres tilgængelighed og egnethed til målene for den pågældende undersøgelse. Nogle generelle retningslinjer er angivet nedenfor.

1. Placer kultur kammeret eller skålen i den korrekte adapter på mikroskopet. Ved hjælp af epifluorescens lys skal du vælge den eller de celler, der udtrykker fluorescerende proteiner eller sonde til optagelse. Juster den fluorescerende prøvebelysning for at visualisere den eller de markerede celler ved hjælp af det digitale kamera. Undgå at bruge høj belysning, der kan forårsage foto blegning og fototoksicitet. Justér fokus og zoom.
2. Erhverve enkelt Z-stack time-lapse-serien med en frekvens på 1 frame hver 2 s for tidsintervaller, der spænder mellem 300 s og 500 s ved hjælp af zoom og bestemte fokus funktioner.
   Bemærk: handel dynamik (hastighed, bevægelses frekvens, etc.) vil variere afhængigt af det protein af interesse, således at tidsforløbet af erhvervelse kan kræve justering. For eksempel, mitochondrier er mindre motile sædceller end lysosomer og udviser hyppige pauser. I dette tilfælde er det mere hensigtsmæssigt at justere anskaffelses parametrene til 1 ramme hver 5 s for 800 s.
3. Gem tidsforskudt billeder, og Eksporter dem som AVI-eller TIFF-stak filer.

6. billedanalyse

Bemærk: billedanalyse blev udført ved hjælp af KymoToolBox plugin til ImageJ/Fiji¹⁶. Detaljerede trin-for-trin skriftlige instruktioner er tilgængelige online¹⁷. Følgende forkortede trin skal være tilstrækkelige til at skabe kymografer og udtrække partikel transport parametrene.

1. Åbn tidsforskudt billedsekvens i ImageJ/Fiji-software. Importer billeder fra menuen filer som AVI-eller TIFF-stak filer. Konverter billederne til 8-bit eller 16-bit ved at vælge en af disse billedtyper ved hjælp af tekst værktøjet fra menuen billede . Hvis du arbejder med RGB-filer, kan du opdele kanaler ved hjælp af værktøjet Opdel kanal under farve funktionen i menuen billede .
2. For at generere en kymograf (repræsentation i position og tid af partikel forløbskurver), tegne hvert spor, hvor partikler bevæger sig ved at spore en linje langs forløbskurver af partiklerne ved hjælp af segmenteret linje værktøj. Hvis du vil tildele bevægelsen korrekt, skal du tegne polylinjen ved hjælp af den samme ønskede retningsbestemt konvention for alle film, så polariteten er konsistent i og på tværs af alle celler, der undersøges. For eksempel tegne polylinjen fra midten af cellen mod periferien eller omvendt. Juster linjebredden, så den svarer til tykkelsen på sporet, ved at dobbeltklikke på værktøjet streg .
3. Kør Draw Kymo -makroen i KymoToolBox-plugin'et ved hjælp af en linjebredde på 10. En prompt beder om at kalibrere billedet i tide (antal frames, frame rate) og mellemrum (x, y opløsning) vises. Når kalibreret, kymographs genereres og kan gemmes som TIFF-filer til data præsentation eller yderligere partikel analyse.
4. Tildel partikel forløbskurver ved manuelt at spore hver enkelt partikel i kymografen ved hjælp af værktøjet segmenteret linje i hele anskaffelseens fulde varighed. Optag hver partikel bane som en region af interesse (ROI) ved hjælp af ROI Manager -værktøjet, der findes i menuen Analysér/funktioner . Gem alle ROIs pr. time-lapse-video for yderligere analyse.
   Bemærk: det er afgørende at tildele den korrekte bane for individuelle partikler på kymografen for at opnå den mest nøjagtige beregning af transport parametre.
   1. Kør Analysér Kymo -makroen i KymoToolBox-plugin'et. Der åbnes et vindue, hvor du bliver bedt om at definere den "udadvendte" retning for partikel bevægelse (fra venstre mod højre eller omvendt) i rullemenuen. Dette valg afhænger af placeringen af de fluorescerende Cargos, der er afbildet i forhold til kernen eller cellens periferi, som fastlagt i trin 6,2. For eksempel, hvis kernen er placeret til venstre for Cargos, og polylinjen i trin 6,2 blev trukket væk fra kernen, definere passiv partikel bevægelse som "fra venstre til højre".
   2. Definer den grænse hastighed (mindste hastighed, hvormed en last anses for at være motile) i vinduet Analysér Kymo . For Cargos, der bevæger sig ved hurtige intracellulære transport hastigheder, er 0,1 μm/sekund et passende valg. Ændre denne værdi for at justere softwarens følsomhed over for hver fragt af interesse. Juster linjebredden, så den passer til tykkelsen af hver partikel bane.
   3. Vælg Logfør alle data og Log ekstra polerede koordinater indstillinger i Analysér kymo vindue. Dette vil beregne forskellige last transport parametre, herunder gennemsnitlig hastighed, indadgående hastighed, passiv hastighed, kumulativ tilbagelagt distance, tilbagelagt distance i enten indad eller udadgående retning, antal afbrydere for hver partikel, procentdel af tid bevæger sig i hver retning eller sat på pause osv. Data beregnet for individuelle spor samles derefter pr. kymograph og gemmes i tekstfiler, der er specifikke for hvert billede.
      Bemærk: indstillingen Vis farvet kymo for Analysér kymo -makro genererer en farvekodet overlejring af stien til den oprindelige kymograph. Partikler, der rejser udad, er farvet i grønt, indad i rødt og stationære partikler i blåt. Rapport koordinaterne på den oprindelige stak indstilling i makroen Analysér kymo genererer en farvekodet overlejring af det ekstra polerede objekts position på den oprindelige timelapse-video og kymograph.

Representative Results

Protokollen til oprettelse af primær mus MD astrocytter skitseret ovenfor bør give reproducerbare, høj kvalitet kulturer. Selv om kulturer oprindeligt indeholder en blanding af astrocytter, fibroblaster, og andre gliaceller celler, herunder microglia og oligodendrocytter (figur 1bi, BIV; røde pilespidser), tilsætning af Arac til den blandede kultur mellem DIV5-DIV7 minimerer spredningen af disse kontaminerende celler. Den kombinerede Arac behandling og ryste-baseret rensning strategi beriger renheden af astrocyt kulturer (figur 1bii) over traditionelle protokoller, der kun omfatter rensning trin (figur 1BV; blå arrowheads)¹³. Den forventede morfologi og sammensætning (vurderet ved GFAP og 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol [DAPI]-farvning) af de rensede astrocyt kulturer behandlet med AraC eller venstre ubehandlet er vist i figur 1Biii, BVI. Kvantificering af procentdelen af GFAP^+- cellerne pr. synsfelt (forholdet mellem antallet af celler med GFAP-farvning og det samlede antal celler identificeret ved dapi-farvning) viser en stigning på over 27% i renhed med Arac-tilskud (figur 1 C). denne høj renhed mus astrocyt kultur er egnet til evaluering af RNA og protein ekspression, celle morfologi, og andre funktionelle assays.

Vi brugte lipofection-baseret transfektering til at udtrykke gfp-mærkede versioner af Gap Junction protein Cx43 og EAAT1 transporteren i murine astrocytter. Denne metode muliggør forbigående ekspression af proteiner på niveauer, der er optimale for levende celle billeder uden at forårsage toksicitet eller påvirker astrocyt levedygtighed (figur 2A, E). På samme måde tillod brugen af en fluorescerende sonde hurtig og effektiv mærkning af sure endo-lysosomale organeller (figur 2i) for at spore deres dynamik i astrocytter.

Figur 2 viser repræsentative resultater af analyserne af last dynamik i astrocytter transitivt transficeret med EAAT1-gfp, Cx43-gfp, eller mærket med en selektiv farve, der genkender sure endolysosomale vesikler. Hver af disse Cargos optrådte som en fluorescerende punktum dekorere perinukleære region, cytosol, og processer af astrocytter (figur 2a, E, I, venstre paneler). Time-lapse-data blev brugt til at generere kymografer, der sporer last bevægelse i tid og rum (figur 2A, E, I, højre paneler). I disse kymografier repræsenteres anterograd og tilbage bevægelse af den angivne last af forløbskurver med negative (grønne linjer) og positive (røde linjer) skråninger. Stationære vesikler vises som lodrette forløbskurver (blå linjer). Kymograph analyse afslørede, at de tre typer af lasten analyseres undergår tovejs transport med lejlighedsvis hurtig, processive kørsler i begge retninger. Desuden afslørede kvantificeringen af en last gennem et område af astrocytten (rød boks) forskelle i procentdelen af motile sædceller partikler blandt Cargos. For eksempel, mens 70% af EAAT1-GFP punkta er stationære (figur 2B), mindre end 20% af Cx43-gfp (figur 2F) og 45% af sonde-mærkede endolysosomale Cargos (figur 2J) er ikke-motile. Disse forskelle i motilitet blandt Cargos er sandsynligvis repræsentative for deres normale, baseline motilitet i regionen af astrocyt hvor filmene blev erhvervet.

Den præcise kortlægning af ændringen i X-Y-positionen langs den fulde tidsskala for hver partikel opnået fra kymografen kan også bruges til at evaluere andre bevægelses parametre, såsom last hastighed (figur 2C, G, K) og løbelængde (afstand (figur 2D, H, L). Motion parametre kan analyseres yderligere for individuelle Cargos at bestemme ændringer i direktionalitet bevægelighed (anterograde vs tilbage bevægelse) samt tilbageførsel i partikel retningen af bevægelse, antallet af pauser, etc. Resultaterne af disse analysetyper kan give meningsfulde kvantitative oplysninger om ændringer i den cellulære fordeling af organeller og membran proteiner i astrocytter under basal eller unormale forhold i intra-og ekstracellulær Miljø.

Figur 1: etablering af primære mus astrocyt kulturer.
A) trin, der kræves for dissektion af P2 − P4 musehjerner. (B) (i, IV) brightfield billeder af blandede gliale kulturer behandlet (i) og ikke-behandlet (IV) med Arac. Røde pilespidser indikerer kontaminerende mikroglia. (II, v) Billeder af renset astrocyt-kulturer behandlet (II) og ikke-behandlet (v) med Arac. Blå pilespidser indikerer kontaminerende oligodendrocytter. (III, vi) Konfokale billeder af renset astrocyt kulturer behandlet (III) og ikke-behandlet (vi) med Arac. Grøn viser GFAP farvning og DAPI (blå) etiketter alle kerner. C) procentdel af GFAP-positive celler. Data repræsenterer Mean ± SEM. * * * p < 0,001, uparret t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: kvantitative analyser af lastens dynamik i astrocytter.
(A, E, I) Venstre paneler: astrocytter udtrykker EAAT1-GFP (A), Cx43-GFP (E) eller behandles med en sonde, der mærker sene endosomer og lysosomer (I). Røde bokse angiver områder, der bruges til at analysere partikel dynamik. Højre paneler: originale og farvekodede kymografer, der viser forløbskurver for de angivne Cargos. Røde linjer repræsenterer retrograde-Moving Cargos, grønne linjer anterograde-Moving Cargos, og blå linjer ikke-motile Cargos. (B, F, J) Procentdel af stationære og motile sædceller partikler. (C, G, K) Kvantificering af anterograd og retrograd hastighed og (D, H, L) løbelængde. Data repræsenterer Mean ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Her beskriver vi en eksperimentel tilgang til at udtrykke, visualisere og spore fluorescently mærkede organeller og membran proteiner af interesse ved hjælp af time-lapse video mikroskopi i høj renhed primær mus kortikale MD astrocytter. Vi skitserer også en metode til måling af partikel dynamik. Direkte visualisering af protein og organelle dynamik i primære astrocytter giver et kraftfuldt værktøj til at studere reguleringen af intracellulær transport i disse celler in vitro.

Metoden til oprettelse af mus MD astrocyt kulturer beskrevet ovenfor kombinerer trin fra andre offentliggjorte protokoller^13,14,15, hvilket resulterer i både en enklere metode og i højere renhed og kvalitet Kulturer. Kombinationen af Arac¹⁵ behandling og ryste-baserede rensning^13,14 kan give astrocyt kulturer med en renhed så højt som 98% (vurderet af forholdet mellem GFAP⁺ celler samlede celler), som i vores eksempel resulterer i en 27% stigning i renhed over kulturer, der kun er underkastet rensnings trinnene (figur 1B, C). Den høje renhed kulturer af mus astrocytter opnået med denne metode svarer til de rapporterede værdier for rotte astrocyt kulturer (vurderet af enzymatiske assays og elektronmikroskopi) af McCarthy og deVellis¹⁴. McCarthy/deVellis-metoden, som ikke omfatter AraC-behandling, kræver imidlertid et længere ryste trin (15 − 18 timer) og to yderligere rensnings runder¹⁴.

I vores eksempel viser vi, at denne protokol er tilstrækkelig følsom til at fange forskelle i motilitet blandt forskellige membran proteiner og organeller i astrocytter, som sandsynligvis er repræsentative for deres individuelle intracellulære ruter og cellulære Funktion. Selv om vores eksempel viser nytten af denne protokol under basale forhold, kan denne metode let tilpasses til at måle transport parametrene inden for en bred vifte af forskningsspørgsmål. For eksempel kan lignende protokoller med mindre modifikationer bruges til at karakterisere transport begivenheder i astrocytter in vitro som reaktion på intra-eller ekstracellulære miljø, såsom cellulære skader, toksicitet, patogene mutationer, synaptisk aktivitet (i blandede kulturer af neuroner og astrocytter) osv. På samme måde kan samtidig ekspression og visualisering af flere Cargos eller organeller, der hver især er mærket med forskellige fluorophorer, også anvendes til at vurdere dynamiske ændringer i samlokalisering og kompleksdannelse, forbigående interaktioner mellem organeller , og endokytiske og membran genanvendelse transport begivenheder.

Succesen af den metode, der præsenteres her primært bygger på evnen til at opnå høj kvalitet astrocyt kulturer og i effektiv mærkning af fragt (r) af interesse. Når du udnytter denne procedure til levende billeddannelse, er det vigtigt at nøje overvåge fluorescerende udtryk til at bestemme den optimale post-transfection inkubationstiden. I gennemsnit fandt vi, at for de Cargos analyseret en 24-h inkubationsperiode resulterer i god signalintensitet for Live imaging erhvervelse. Forlænget inkubation af transficeret astrocytter kan resultere i høj ekspression af fluorescently mærkede proteiner, som kan fremkalde protein aggregering, hvilket ændrer lastens lokalisering og dynamik og mindsker kulturerne. Astrocytter er meget sårbare over for fysisk skade og ændringer i kulturmiljøet, hvilket kan føre til induktion af transkriptionelle og cellulære reaktioner, herunder reaktivitet. Derfor er det afgørende at reducere tidsintervaller mellem vaske trin og for at minimere eksponeringen af kulturerne for luft og væsentlige ændringer i temperatur eller lysintensitet i inkubations-og anskaffelses perioderne.

Sammenfattende kan de metoder, der præsenteres her, bruges til at evaluere og kvantificere dynamiske ændringer i protein og organelle lokalisering i astrocytter. De giver værdifulde værktøjer, der tillader undersøgelse af ændringer i astrocytiske reaktioner under fysiologiske og patologiske forhold.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.5% Trypsin (10x)	Gibco	15090-046
Benchtop Centrifuge	Thermo Scientific	75-203-637	Sorvall ST8 Centrifuge
Cell Culture Grade Water	Gen Clone	25-511
Cell Culture Microscope	Zeiss	WSN-AXIOVERT A1	Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities
Cytosine Arabinoside	Sigma	C1768-100MG	(AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage
DAPI	Sigma	D9542-5MG	Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.
Dissecting Microscope	Zeiss		Stemi 305
Dissecting Scissors	F.S.T	14558-09
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gen Clone	25-500
Fetal Bovine Serum	Gemini	100-106	Heat-Inactivated
FIJI (Fiji is Just Image J)	NIH	Version 1.52i
Fine Tip Tweezers	F.S.T	11254-20	Style #5
Fluorescence light source	Excelitas	012-63000	X-Cite 120Q
GFAP antibody	Cell Signaling	3670S	GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody
Glass Bottom Dishes	Mattek corporation	P35G-1.5-14-C	35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated
Graefe Forceps	F.S.T	11054-10	Graefe Iris Forceps with curved tips
Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes)	Life Technologies	L7526	LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.
Hank's Balanced Salt Solution (10x)	Gibco	14065-056	Magnesium and calcium free
Imaging Media	Life Technologies	A14291DJ	Live Cell Imaging Solution
Inverted Confocal Microscope	Zeiss		LSM 780
KymoToolBox			https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Lipofection Enhancer Reagent	Life Technologies	11514015	Plus Reagent
Lipofection Reagent	Life Technologies	15338100	Lipofectamine LTX reagent
Orbital shaking incubator	New Brunswick Scientific	8261-30-1008	Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control
Penicillin/Strepomycin solution (100x)	Gen Clone	25-512
Phosphate Buffered Saline (10x)	Gen Clone	25-507x
Poly-D-Lysine Hydrobromide	Sigma	P7405	Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing
Reduced serum medium	Gibco	31985-062	OPTI-MEM
Tissue Culture Flasks	Olympus Plastics	25-209	75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap
Tissue culture incubator	Thermo Scientific	51030285	HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control
Tris-Base	Sigma	T1503	8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Tris-HCl	Sigma	T3253	4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200072
Vacuum-Driven Filter Systems	Olympus Plastics	25-227	500 ml, PES membrane, 0.22 µm
Vannas scissors straight	Roboz	RS-5620