Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

המחשה וניתוח של תחבורה תאיים של אורגלים וcargos אחרים באסטרוציטים

doi: 10.3791/60230 Published: August 28, 2019
* These authors contributed equally

Summary

כאן אנו מתארים בשיטת הדמיה לחיות מחוץ לתמונה כדי להמחיש הובלה תאיים של אורגלים וסחר של חלבונים קרום פלזמה ב astrocytes מורטין. פרוטוקול זה מציג גם מתודולוגיה לניתוח תמונה כדי לקבוע מסלולים להובלת מטענים וקינטיקה.

Abstract

Astrocytes הם בין סוגי התאים הנפוצים ביותר במוח המבוגר, שם הם משחקים תפקידים מרכזיים בריבוי של פונקציות. כשחקן מרכזי בהומאוסטזיס המוח, האסטרוציטים לספק נוירונים עם מטבוליטים חיוניים מאגר המים, יונים, ו גלוטמט. מרכיב אינטגרלי של "tri-פרטיטה" סינפט, אסטרוציטים הם גם קריטיים היווצרות, גיזום, תחזוקה, ואפנון של הסינפסות. כדי להפעיל פונקציות אינטראקטיביות מאוד אלה, אסטרוציטים לתקשר בינם לבין עצמם עם תאים גליה אחרים, נוירונים, המוח ולוח הסביבה באמצעות המון חלבונים ממברנה מיוחדים הכוללים תא מולקולות הדבקה, אקואפונס, ערוצי יונים, מובילי נוירוטרנסמיטר ומולקולות של צומת הפער. כדי לתמוך השטף הדינמי הזה, astrocytes, כמו נוירונים, להסתמך על תחבורה מתואמת היטב ויעיל הובלה תאיים. בניגוד לנוירונים, שם הסחר התאיים היתה מבוססת בהרחבה, הובלה microtubule דורית מבוסס אסטרוציטים כבר נחקרו פחות. עם זאת, הסחר exo-ו endocytic של ממברנות התא חלבונים והתחבורה התאיים ארגונית הובלה בביולוגיה נורמלית, תהליכים אלה מושפעים לעתים קרובות במחלה או בתגובה לפציעה. כאן אנו מציגים פרוטוקול ישיר לתרבות האסטרוציטים באיכות גבוהה, כדי לסמן חלבונים אסטרוציטוטיים התווית והאורגלים של עניין, ולהקליט את הדינמיקה התחבורה התאיים שלהם באמצעות הזמן לשגות במיקרוסקופ קונפוקלית. כמו כן, אנו מדגימים כיצד לחלץ ולכמת את פרמטרי התחבורה הרלוונטיים מהסרטים הנרכשים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה זמינה (כגון, ImageJ/פיג'י) תוספים.

Introduction

Astrocytes הם התאים השופעים ביותר במערכת העצבים המרכזית למבוגרים, שם הם מבצעים ייחודי התפתחותית פונקציות הומסטטיות1. Astrocytes לווסת את ההתפתחות הסינפטית באמצעות מגע ישיר עם מסופים טרום ו פוסט סינפטית במסגרת סינפטה משולש, אשר מכיל קולטני הנוירוטרנסמיטר, מובילים, תא מולקולות הדבקה המקלים על היווצרות סינפסה והתקשורת האסטרוציטותא2. בנוסף, האסטרוציטים באופן פעיל לשלוט שידור סינפטית ולמנוע מפני הזדקנות העצבים העצבית על ידי הסרה מהירה של נוירוטרנסמיטרים מתוך שסוע סינפטית, מיחזור נוירוטרנסמיטורים, והשתתפות בגיזום סינפטית3 , ד , מיכל 5 , 6. כדי לאפשר אלה פונקציות אינטראקטיביות מאוד, האסטרוציטים לתקשר בינם לבין עצמם, עם תאים גליה אחרים, עם נוירונים באמצעות חלבונים ממברנה מיוחדים, כולל מולקולות הדבקה התא, aquפורטל, ערוצי יונים, מובילי הנוירוטרנסמיטר ומולקולות של צומת הפער. Astrocytes פעיל לשנות את רמות פני השטח של חלבונים אלה בתגובה תנודות בסביבה הפנים והחילוץ שלהם7. יתר על כן, שינויים ברמות והפצה של המיטו, טיפות ליפיד, ו degradative ומיחזור אורגלים לווסת את אספקת האנרגיה, זמינות מטבוליט, ותהליכי סליקה סלולריים החיוניים לפונקציה אסטרוציט ו ישרדות.

השינויים הדינאמיים בחלבון ממברנה ובסחר בנשים ומיצוב באסטרוציטים מקדמים את הפונקציה מתואמת של חלבונים ומתאמים מוטוריים המעודדים תנועתיות מטענים8,9. באופן דומה, רמות פני השטח של חלבונים ממברנה מאופנן דרך הפנמה ומיחזור אירועים10. אלה מטענים מועברים באמצעות רשת מורכבת של actin, microtubules, ואולי ביניים רצועות שירים8. מחקרים המבוססים על כתמים immunofluorescence של הקצה מחייב חלבון 1 (EB1), אשר מצטבר על מיקרוכדורית הגוברת ומסתיים, מציע כי בצרורות אסטרוציטים של microtubules מקרין החוצה מתוך החוצה ולהאריך את קצה הפלוס שלהם לכיוון מפריפריה11. עם זאת, בדיקה מקיפה של הארגון וקוטביות של microtubules ואלמנטים ציטולדים אחרים באמצעות הדמיה תא חי עדיין חסר. בעוד רבים של המנגנונים המשמשים את הדינמיקה של אורגלים וחלבונים ממברנה נחקרו בהרחבה בנוירונים וסוגי תאים אחרים, תנועתיות מטענים ב אסטרוציטים הוא פחות טוב מובן. רוב הידע הנוכחי שלנו על שינויים חלבון ו אורגונל התפלגות ב אסטרוציטים מבוסס על מסורתי נוגדן מבוסס תיוג של הכנה קבועה, אשר מונע בדיקה מרחבית וזמני מדויק של דינמיקה מטענים7, . שתיים עשרה

כאן, אנו מתארים שיטה לתייג חלבונים הממברנה ואורגלים עבור הדמיה חיה בתרבויות גבוהה העכבר הראשי אסטרוציט הטוהר. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מספקים דוגמאות שבו אנו מעקב אחר הלוקליזציה הדינמי של חלבון פלורסנט ירוק (GFP)-מתויגים חלבונים ממברנה ב astrocytes הטרנסתאי, כולל הפער הפערים חלבון קונשין 43 (Cx43-GFP) ואת חומצת האמינו המתומנת טרנספורטר 1 (EAAT1-GFP). אנו גם לתאר את השימוש של החללית הניאון ac, בדיקה כדי להמחיש אורגלות חומצי ולעקוב אחר הדינמיקה שלהם הסחר בחיים astrocytes. בסופו של דבר, אנו להדגים כיצד לנתח את הנתונים לשגות זמן כדי לחלץ ולהעריך את הפרמטרים התחבורה עבור cargos בודדים.

Protocol

כל ההליכים בעלי החיים בוצעו עם אישור של אוניברסיטת צפון קרוליינה בבית התפילה לטיפול בעלי חיים ועדת השימוש (IACUC).

1. המוח ניתוח ותרבות של אסטרוציטים העכבר הראשי

הערה: הפרוטוקול הבא הותאם משיטות שפורסמו, אשר בעקבות ההליך המקורי שפותחה על ידי מקארתי ו devellis13,14,15. תרביות תאים מעורבים של מקארתי/דאליס (MD) אסטרוציטים מוכנות מיום פוסט לידה 2 על 4 (P2-P4) עכבר מערבולות, מטופלים עם גורם אנטי mitotic, ומטוהרים כדי להניב את התרבות האסטרוציט הסופי המועשרת. ארבע מערבולות מגורי העכבר של שני הצדדים מספיקים כדי לייצר אחד T75 התרבות רקמה בקבוקון תרבות.

  1. המעיל התחתון של T75 מבחנות (100% הצוואר זווית גישה, 0.22 יקרומטר הידרופובי מסנן הידרו כובע) עם פולי-D-ליזין (1 מ"ג/mL ב 0.1 M מאגר טריס, pH 8.5) ו דגירה ב 37 ° c עבור 24 h לפני תחילת הניתוח.
  2. לפני תחילת הליך הניתוח, חם 30 מ ל של מדיה התרבות אסטרוציט (בינונית שונה של הנשר של העיט [dמאמ] גלוקוז גבוה, 10% חום בלתי מופעל העובר סרום, 1% פניצילין/סטרפטומיצין) ב 37 ° c ו להפשיר 5 mL סדרת מחלקים של 2.5% טריפסין על קרח. הכינו שתי מנות לניתוח (קוטר 60 מ"מ) על קרח מלא 6 מ ל של פתרון המלח המאוזן של האנק (HBSS) ללא Ca2 + או Mg2 +.
  3. לחטא את כל כלי הניתוח (מלקחיים טיפ דק, מבתר מספריים, Vannas מספריים ישר, Graefe מלקחיים עם טיפים מעוקלים) ב 70% אתנול לפני ו בין כל ניתוח.
  4. רסס את הראש והצוואר של גורי העכבר P2-P4 עם 70% אתנול לפני במהירות המתת אותם על ידי עריפת ראש עם מספריים כירורגית. לבצע את האחורי לחתך באמצע הקו הקדמי לאורך הקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת. חותכים בזהירות את הגולגולת מהצוואר אל האף.
  5. לבצע שני חתכים לרוחב נוספים מעולה לעיניים. באמצעות פינצטה עצה עדין להפוך בעדינות את מדפים הגולגולת בצד. להסיר את המוח ולמקם אותו בצלחת מבתר הראשון מלא קרח קר HBSS ללא Ca2 + או Mg2 +. לשמור את הצלחת על הקרח ולהמשיך לקצור את שאר המוח.
    הערה: בצע את שאר שגרת הניתוח תחת היקף מבתר.
  6. הסר את הנורות ריח באמצעות מספריים Vannas או מלקחיים עדינים (איור 1Ai). עם מלקחיים טיפ מעוקל בהצטלבות של סדקים רוחבי ומשני, בעדינות להכניס זוג נוסף של מלקחיים קצה מעוקל בין קליפת המוח והדינצאלון, לאט לפתוח את מלקחיים כדי להפריד את האונות המוח משאר המוח (באיור 1, aiii). הסר את הרקמה הלא רצויה (איור 1aiv).
  7. עבור כל האונה הקורטיקלית, בזהירות להסיר את קרום המוח עם פינצטה טיפים עדינים. באופן אופציונלי, להסיר את ההיפוקמפוס מן הקורמטה. להעביר את מערבולות העכבר לתוך הצלחת השנייה ממולא HBSS קר קרח ללא Ca2 + או Mg2 + ולשמור אותו על הקרח תוך מבתר את המוח הנותרים.
    הערה: בצע את השלבים הבאים תחת תנאים אספטי במכסה זרם למינארי.
  8. חותכים את מגזרת הגזור לחתיכות קטנות (כ 2-4 מ"מ) באמצעות מספריים ניתוח חד וסטרילי או אזמל. להעביר את רקמת לגזור 50 mL שפופרת חרוט המכיל פתרון אנזים (22.5 mL HBSS ללא Ca2 + או Mg2 +, 2.5 ml 2.5% טריפסין). דגירה ב 37 ° c עבור 30 דקות עם היפוך עדין כל 10 דקות.
  9. לאסוף את הרקמה מתעכל ידי צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ולהסיר את פתרון האנזים על ידי שאיפה (לא להשתמש שואב אבק). הוסף 10 מ ל של מדיה תרבות אסטרוציט ו הנתק את הרקמה לתוך תאים בודדים על ידי ליטוף את הפתרון 20-30x באמצעות צינורות 10 mL סרולוגית.
  10. לסנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 יקרומטר כדי למזער את הגושים תאים ורקמות לא מתעכל. לאסוף את פילטרט שפופרת נקי 50 mL ולהתאים את נפח הכולל ל 20 מ ל עם מדיה התרבות אסטרוציט. בשלב זה, להעריך את היעילות של הדיסוציאציה הקורטיקלית על ידי ערבוב 10 μL של השעיית התא עם 10 μL של טריקון כחול וספירת תאים עם הומוציטומטר.
    הערה: הכנה אחת מארבע P2-P4 העכבר התשואות מניב 10 עד 15 x 106 תאים בודדים.
  11. מT75 את תמיסת הציפוי פולי-ליזין מתוך מבחנות תרבות ומכבסת פעמיים עם מים סטריליים. צלחת 20 מ ל הבולם התא ו הדגירה ב 37 ° צ' ו 5% CO2.

2. טיהור ואחזקה של תרביות אסטרוציט

הערה: לבצע את כל שינויי המדיה תחת תנאים אספטי בתוך כיפה זרם למינארי באמצעות מסוננים סטרילי (0.22 יקרומטר מסנן ממברנה) מדיה אסטרוציט מחומם ל 37 ° c.

  1. החלף את התא מדיה 48 h לאחר ציפוי (היום בתוך מבחנה 2, DIV2).
  2. ב DIV5, להחליף את המדיה עם מדיה התרבות אסטרוציט טריים בתוספת עם 10 μm ציטוסין הסינוסייד (arac).
    הערה: שלב זה מאפשר הסרה של תאי זיהום, כולל פיברוהכדורים ותאי גליה אחרים. חשוב לטפל בתרבויות עם arac לא יותר מ 48 h כמו הדגירה זמן רב יותר תפחית הכדאיות אסטרוציט.
  3. ב-DIV7, שינוי מדיה לתקשורת התרבות אסטרוציט ללא arac ולהתחיל לבדוק את התרבות היומיומית היומית. לאחר התאים הגיעו 80% המפגש, המעיל two-T75 מבחנות עבור כל בקבוקון התרבות אסטרוציט לא מטוהרים עם פולי-D-ליזין ו-דגירה ב 37 ° c עבור לפחות 8 h ללילה.
  4. למחרת, להתחיל לטיהור אסטרוציט על ידי טלטול מבחנות התרבות ב 180 rpm עבור 30 דקות ב 37 ° c מסלולית לרעוד החממה. הסר את המדיה והחלף אותו במדיית תרבות אסטרוציט טרייה. לנער את התאים ב 240 סל ד עבור 6 h ב 37 ° c מסלולית לרעוד החממה. מחממים באגירה של 1 x פוספט מלוחים (PBS), מדיית תרבות אסטרוציט ו-0.25% טריפסין-edta ל-37 ° c 20 עד 30 דקות לפני סיום תקופת הטלטול.
    הערה: שיתוף2דגירה אינו נדרש במהלך השלבים לרעוד. במקרה הצורך, התקשורת שנאסף לאחר הצעדים 30 דקות ו 6-h לרעוד יכול לשמש התרבות מיקרוגלייה ו oligodendrocytes הפוך, בהתאמה. הטיפול arac של התרבות המעורבת יהיה, עם זאת, להפחית את השפע של התאים האחרים גליה.
  5. הסר את מבחנות התרבות מן השייקר ומיד להחליף את המדיה עם 10 מ ל של חם 1x PBS לכל בקבוקון. הסר את PBS והוסף 3 מ ל של 0.25% טריפסין-EDTA לכל בקבוקון. מודקון ב 37 ° צ' ו 5% CO2, בדיקה כל 5 דקות לניתוק.
  6. לאחר תאים התנתק מן הבקבוקון, להפסיק טריסינוניזציה על ידי הוספת 10 מ ל של מדיה תרבות אסטרוציט. העברת האסטרוציטים מנותקים לתוך 50 mL בתאי כדור וכלה על ידי צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות. מרוקן supernatant ו-להשעות מחדש את התאים ב 40 mL של מדיה תרבות אסטרוציט.
  7. לשטוף את פולי-D-ליזין מצופה T75 מבחנות פעמיים עם מים סטריליים צלחת 20 מ ל של ההשעיה אסטרוציט מטוהרים. חזור אל 37 ° צ' ו-5% חממה2 . לשנות את מדיה התרבות אסטרוציט כל יומיים במשך 10 ימים נוספים עד האסטרוציטים בוגרת.
    הערה: כל T75 בקבוקון של אסטרוציטים מטוהרים צריך להיות מספיק כדי לייצר 2 T75 מבחנות חדש עם 3 x 105 תאים כל אחד בציפוי.
  8. חזור על שלבים 2.5-2.7 לקבלת מעברים עוקבים או ללוח אסטרוציטים למיקרוסקופיה.
    הערה: טוהר התרבויות אסטרוציט לאחר תוספת של arac ובעקבות טיהור ניתן להעריך באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד, או ליתר דיוק על ידי כימות אחוז חלבון החומצה glibrillary (gfap)-חיובי תאים לשדה תצוגה בתמונות פלורסנט (איור 1ב, ג).

3. העברה של פלואור מתויג בעזרת פלמידים

  1. היום שלפני מעבר החצייה או התיוג, הזרע האסטרוציטים בצפיפות הרצויה עבור הדמיה 24-48 h לאחר ההעברה. צפיפות מומלצת עבור צלחות 24-היטב או 14 מ"מ זכוכית בארות התחתון הוא 2 x 104 תאים/טוב.
    הערה: פרוטוקול זה ממוטב עבור העברה של מצופה אסטרוציטים על 12 מ"מ שמיכות זכוכית על הצלחות 24-טוב או 14 מ"מ זכוכית בארות התחתון באמצעות שיטה מבוססת ליפוע. ריאגנטים צריך להיות מוקטן בהתאם לגודל של התבשיל תרבות שבה האסטרוציטים גדלים.
  2. דלל את החומר המגיב (טבלת חומרים) באמצעי מדיה לסרום מופחת (טבלת חומרים). כדי למטב את היחס של מגיב ליפואת הזיהום ל-DNA, לבדוק מגוון של מדלל הולם. לדוגמה, אם שימוש בחומרים מגיב בפרוטוקול זה (טבלה של חומרים), לדלל 2, 3, 4, ו-5 μl של הזיהום ליפוגל ב 50 μl של מדיה סרום מופחת.
  3. לדלל 5 μg של DNA טוהר גבוהה ב 250 μL של מדיה סרום מופחת. הוסף 5 μL של שיפור ליפואת הזיהום (טבלת חומרים). מערבבים את הצינורית המכילה את הליפסיית השילוב עם נפח שווה של ערבוב ליפואת ה-DNA. מערבבים על ידי ליטוף ו דגירה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 15 דקות.
  4. להסיר מדיה התרבות אסטרוציט ולהוסיף תמהיל הזיהום (שלב 3.3) כדי התאים dropwise. לאחר דגירה של 6-h ב 37 ° צ' ו 5% CO2, להחליף את מתחם החצייה עם נפח מתאים של מדיית תרבות אסטרוציט (2 מ"ל עבור 14 מ"מ מנות זכוכית בתחתית). המשך 24 שעות לפני שתמשיך ברכישת התמונה. עקוב מקרוב את משך שלב הדגירה כדי להשיג את האיזון הטוב ביותר בין ביטוי החלבון ואת הכדאיות התא.

4. תיוג של אנזומים מאוחרים/ליסוזומים באמצעות בדיקה פלואורסצנטית

הערה: ניתן לתייג כמה מטענים באמצעות צבעי פלורסנט עם זיקה גבוהה לחלבונים ספציפיים למטען. הדוגמה הבאה מאפשרת את התוויות של האנדוזומים מאוחרים/ליסוזומים עם בדיקה פלואורסצנטית פלורסנט.

  1. לדלל את בדיקת תיוג lysoזומבית (הטבלה של חומרים) ב 200 μl של מדיה תרבות אסטרוציט לריכוז עבודה של 1 μm ולהחיל על אסטרוציטים משלב 3.1 בצפיפות של 2 x 104 תאים/טוב. דגירה של 30 דקות ב 37 ° c.
  2. לשטוף את התאים פעם אחת עם מדיה התרבות אסטרוציט חם ולהחליף עם מדיה הדמיה (טבלת חומרים). . המשך להדמיה חיה מיד

5. רכישת תמונה באמצעות מערכת הדמיה בזמן הקפיצה

הערה: זמן הדמיה בשידור חי צריך להיעשות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית מצויד במצלמה במהירות גבוהה, מיקוד מובהק, הדגירה קאמרית, ו-40x מטרת הנפט עם צמצם מספרי גבוה (g., תוכנית-Apochromat 1.4 NA). מגוון תוכנות רכישה זמינות להדמיה בזמן הדמיה. בחירת מערכת המיקרוסקופיה ותוכנת הרכישה צריכה להתבסס על זמינותם והתאמתו למטרות המחקר המסוים. כמה מהנחיות כלליות מסופקות להלן.

  1. מניחים את חדר התרבות או את המנה במתאם הנכון על במת המיקרוסקופ. באמצעות אור אפיסנטי, בחר את התא (ים) המבטאים חלבונים פלורסנט או בדיקה להקלטה. כוונן את התאורה של דגימת הפלורסנט כדי להמחיש את התא (ים) שנבחר באמצעות המצלמה הדיגיטלית. הימנע משימוש בתאורה גבוהה העלולה לגרום לפוטוהלהלבנת ולפוטורעילות. כוונן את המיקוד ואת הזום.
  2. לרכוש בודד Z-מחסנית זמן לשגות סדרה בתדר של 1 מסגרת כל 2 s עבור מרווחי זמן הנע בין 300 s ו 500 s באמצעות מרחק מתצוגה פונקציות מיקוד מובהק.
    הערה: הדינמיקה של סחר בסמים (מהירות, תדירות תנועה וכו ') תשתנה בהתאם לחלבון הריבית, ולכן מהלך הזמן של הרכישה עשוי לדרוש כוונון. למשל, המיטו, הם פחות מוזים מאשר ליסטזומים ומציגים הפסקות תכופות. במקרה זה, מתאים יותר להתאים את פרמטרי הרכישה ל 1 מסגרת כל 5 s עבור 800 s.
  3. שמור תמונות בזמן הקפיצה ולייצא אותם כקבצי AVI או TIFF מחסנית.

6. ניתוח תמונה

הערה: ניתוח תמונה בוצע באמצעות תוסף KymoToolBox עבור ImageJ/פיג'י16. מפורט הוראות צעד אחר צעד בכתב זמינים באינטרנט17. השלבים המקוצרים הבאים צריכים להספיק כדי ליצור את הקימוגרפים ולחלץ את הפרמטרים של העברת החלקיקים.

  1. פתח רצף תמונות בזמן צילום בתוכנת ImageJ/פיג'י. יבא תמונות מתפריט קובץ כקבצי AVI או TIFF סטאק. המירו את התמונות ל-8 סיביות או ל-16 סיביות על-ידי בחירת אחד מסוגי התמונות האלה באמצעות הכלי אות מתפריט התמונה. בשעת עבודה עם קובצי RGB, יש לפצל ערוצים בעזרת הכלי המפוצל Channel הזמין תחת תכונת הצבע בתפריט תמונה .
  2. כדי ליצור kymograph (ייצוג במיקום ובזמן של מסלולי חלקיקים), לצייר כל רצועה שבה החלקיקים זזים על ידי מעקב אחר קו לאורך מסלולי החלקיקים באמצעות כלי קו מקוטע . כדי להקצות בצורה נכונה את הכיווניות של התנועה, לצייר ריבוי קווים באמצעות האמנה הרצויה זהה עבור כל הסרטים, כך קוטביות עקבית בתוך ומעבר לכל התאים שנחקרו. למשל, ציירו את הפוליקו ממרכז התא לכיוון הפריפריה או להיפך. כוונן את רוחב הקו כך שיתאים לעובי הרצועה על-ידי לחיצה כפולה על כלי הקו .
  3. הפעל את המאקרו לצייר Kymo של תוסף KymoToolBox באמצעות רוחב קו של 10. תופיע הודעה המבקשת לכייל את התמונה בזמן (מספר המסגרות, קצב המסגרות) והרווח (x, רזולוציית y). לאחר כיול, הקימוגרפים נוצרים וניתן לשמור אותם כקובצי TIFF עבור מצגת נתונים או ניתוח חלקיקים נוסף.
  4. הקצאת מסלולי חלקיקים על-ידי מעקב ידני אחר כל חלקיק ב-kymograph באמצעות הכלי קו מקוטע למשך הזמן המלא של הרכישה. הקלט כל מסלול חלקיקים כאזור מעניין (ROI) באמצעות הכלי מנהל ROI הנמצא בתפריט ניתוח/כלים . שמור את כל ROIs לכל וידאו פקיעה זמן לניתוח נוסף.
    הערה: חשוב להקצות את הנתיב הנכון לחלקיקים בודדים על kymograph כדי להשיג את החישוב המדויק ביותר של פרמטרי תעבורה.
    1. הפעל את המאקרו ניתוח Kymo של תוסף KymoToolBox. חלון יפתח המבקשת להגדיר את הכיוון "כלפי חוץ" של תנועת החלקיקים (משמאל לימין או להיפך) מהתפריט הנפתח. בחירה זו תלויה במיקום של התמונה של מטענים הפלורסנט ביחס לגרעין או לפריפריה של התא, כפי שנקבע בשלב 6.2. למשל, אם הגרעין ממוקם משמאל הקרגוס, והפוליקו בשלב 6.2 נלקח מהגרעין, הגדר את תנועת החלקיקים כלפי חוץ "משמאל לימין".
    2. הגדר את מהירות המגבלה (מהירות מינימלית שבה מטען נחשב motile) בחלון לנתח Kymo . עבור מטענים כי לנוע במהירות הובלה תאיים מהירות, 0.1 μm/שנייה היא בחירה מתאימה. שנה ערך זה כדי לכוונן את רגישות התוכנה לכל מטען של ריבית. כוונן את רוחב הקו כך שיתאים לעובי של כל מסלול חלקיקים.
    3. בחר ביומן הרישום את כל הנתונים ורשום אפשרויות קואורדינטות מסוימות בחלון הניתוח kymo . פעולה זו תחשב פרמטרים שונים של הובלה מטענים, כולל מהירות ממוצע, מהירות פנימה, מהירות כלפי חוץ, מרחק מצטבר שנסע, מרחק שנסע בכיוון הפנימי או כלפי חוץ, מספר מתגים עבור כל חלקיק, אחוז הזמן מעבר לכל כיוון או מושהה וכו '. נתונים המחושבים עבור רצועות בודדות מושקים לאחר מכן לפי kymograph ונשמרים בקבצי טקסט ספציפיים לכל תמונה.
      הערה: האפשרות הצבעונית של kymo לנתח מאקרו של kymo יוצרת כיסוי מקודד בצבע של הנתיב מעל kymograph המקורי. חלקיקים הנוסעים כלפי חוץ צבעוניים בירוק, פנימה באדום, חלקיקים נייחים בכחול. האפשרות ' קואורדינטות ' של הדוח על מחסנית מקורית של מאקרו ה- kymo מפיקה כיסוי מקודד בצבע של מיקומו של האובייקט המבצע על הווידאו המקורי של הזמן וידאו ו-kymograph.

Representative Results

הפרוטוקול להקמת העכבר הראשי MD אסטרוציטים המתואר לעיל צריך להניב התשואה, תרבויות באיכות גבוהה. למרות שתרבויות מכילות בתחילה שילוב של אסטרוציטים, פיברותקיעות, ותאים גליאל אחרים, כולל מיקרוגלייה ו oligodendrocytes הפוך (איור 1Bi,בוולוף; ראשי חץ אדומים), תוספת arac אל התרבות המעורבת בין DIV5-DIV7 ממזער התפשטות תאי הזיהום הללו. הטיפול המשולב arac ולרעוד מבוסס האסטרטגיה טיהור מעשיר את הטוהר של התרבויות אסטרוציט (איור 1bii) על פרוטוקולים מסורתיים כי רק כוללים את שלבי הטיהור (איור 1Bv; כחול ראשי חץ)13. מורפולוגיה וקומפוזיציה צפויים (המוערך על ידי gfap ו-4 ', 6-diamidino-2-פניינילינדול [dapi] כתמים) של תרבויות אסטרוציט מטוהרים מטופלים עם arac או שמאל מטופל מוצג באיור 1biii, bvi. הכמת של אחוז GFAP+ תאים לשדה של תצוגה (יחס של מספר תאים עם כתמים gfap למספר הכולל של תאים המזוהים על ידי כתמים dapi) מראה עלייה של מעל 27% בטוהר עם תוספי arac (איור 1 C). זו תרבות גבוהה של העכבר אסטרוציט מתאים להערכה של RNA וביטוי חלבון, מורפולוגיה של התא, ועוד מספר שימושי.

השתמשנו בשיטת העברה המבוססת על ליפוגת כדי לבטא גרסאות GFP מתויגות של הCx43 החלבון של צומת הפער והטרנספורטר הEAAT1 באסטרוציטים מוראין. מתודולוגיה זו מאפשרת ביטוי ארעי של חלבונים ברמות האופטימליות עבור הדמיה תא חי מבלי לגרום לרעילות או להשפיע על הכדאיות אסטרוציט (איור 2א, ה). באופן דומה, השימוש בחללית פלורסנט התיר תיוג מהיר ויעיל של באנדו חומצי-ליסוזומאים (איור 2I) כדי לעקוב אחר הדינמיקה שלהם ב astrocytes.

איור 2 מציג את התוצאות הייצוגיות של הניתוחים של דינמיקה מטענים ב אסטרוציטים מנוכר עם EAAT1-gfp, Cx43-gfp, או מתויג עם צבע סלקטיבי המכיר שלפוחיות חומציים חומצי. כל אחד מאותם מטענים הופיע כמו פלורסנט לקשט את האזור הצלול, ציטוסול, ותהליכים של אסטרוציטים (איור 2a, E, I, לוחות שמאל). הנתונים בזמן הפקיעה שימשו כדי ליצור kymographs לעקוב אחר תנועת מטענים בזמן ובמרחב (איור 2A, E, I, לוחות זכות). בקימוגרפים אלה, התנועה המועלת והנסיגה של המטען המצוין מיוצגת באמצעות מסלולים עם שלילי (קווים ירוקים) ומדרונות חיוביים (קווים אדומים), בהתאמה. שלפוחיות נייחות מוצגות כנתיבים אנכיים (קווים כחולים). בניתוח kymograph התגלה כי שלושת סוגי המטענים שנותחו עוברים הובלה דו-כיוונית עם מהירות מזדמנת, פועל בשני הכיוונים. יתר על כן, קוונפיקציה של שטף של מטען באמצעות אזור של אסטרוציט (התיבה האדומה) חשף הבדלים באחוז של חלקיקים נעים בין cargos. לדוגמה, בעוד 70% של EAAT1-GFP הם נייחים (איור 2B), פחות מ 20% של Cx43-gfp (איור 2F) ו 45% של בדיקה מתויג endolysosomal (איור 2J) הם לא מורצפת. הבדלים אלה בתנועתיות בקרב מטענים צפויים להיות נציגים של התנועתיות הרגילה שלהם באזור של האסטרוציט שבו הסרטים הוכנסו.

המיפוי המדויק של השינוי במיקום X-Y לאורך קנה המידה המלא עבור כל חלקיק שהושג מ-kymograph יכול לשמש גם כדי להעריך פרמטרים תנועה אחרים, כגון מהירות המטען (איור 2ג, G, K) ולרוץ אורך (מרחק נסע) (איור 2D, H, L). פרמטרים תנועה ניתן לנתח נוסף עבור מטענים בודדים כדי לקבוע שינויים הכיווניות של התנועה (בתגובה לעומת תנועה נסיגה) כמו גם ביטולי כיוון החלקיקים של תנועה, מספר הפסקות, וכו '. התוצאות מסוגים אלה של ניתוחים יכולים לספק מידע כמותי משמעותי לגבי שינויים התפלגות הסלולר של אורגלים וחלבונים קרום ב אסטרוציטים תחת תנאים בסיס או חריגים בפנים ובחילוץ סביבה.

Figure 1
איור 1: הקמת תרבויות אסטרוציט של העכבר הראשי.
(א) צעדים הנדרשים לחיתוך של מוחות העכבר P2-P4. (ב) (i, iv) ברייטפילד תמונות של תרבויות גליאל מעורבות שטופלו (i) ולא מטופלים (iv) עם arac. ראשי חץ אדומים מצביעים על מיקרוגליה מזהם. (ii, v) תמונות של תרבויות אסטרוציט מטוהרים שטופלו (ii) ו שאינם מטופלים (v) עם arac. ראשי חץ כחולים מצביעים על oligodendrocytes הפוך מזהם. (iii, vi) תמונות קונטומיות של תרביות אסטרוציט מטוהרים (iii) ושאינן מטופלות (Vi) עם arac. ירוק מראה כתמים GFAP ו DAPI (כחול) תוויות כל גרעיני. (ג) אחוזי תאים של GFAP-חיוביים. הנתונים מייצגים את הממוצע ± SEM. * * * p < 0.001, לא מזווג t-test. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ניתוחים כמותיים של הדינמיקה המטען ב astrocytes.
(A, E, I) לוחות שמאל: Astrocytes המבטא EAAT1-GFP (A), Cx43-GFP (E) או מטופלים עם בדיקה כי תוויות שורש מאוחר ו Lysosomes (I). תיבות אדומות מציינות אזורים המשמשים לניתוח דינמיקת חלקיקים. חלוניות מימין: מקורי ומקודד בצבעים מוצגים מסלולים עבור cargos שצוין. הקווים האדומים לייצג cargos הזזת נסיגה, קווים ירוקים באים cargos הזזת כיתה, וקווים כחולים ללא motile cargos. (B, F, J) אחוז החלקיקים הנייחים והמורעפים. (ג, G, K) הכמת של מהירות האנטרואודית ו-(D, H, L) אורך. הנתונים מייצגים את הממוצע ± SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

כאן, אנו מתארים גישה ניסיונית לבטא, להמחיש, ולעקוב אחר מתויג fluorescently וחלבונים ממברנה של עניין באמצעות מיקרוסקופ וידאו זמן לשגות ב-high-טוהר העכבר הראשי בקליפת המין הראשונית MD. אנו גם מתווה מתודולוגיה למדידת דינמיקת חלקיקים. ויזואליזציה ישירה של חלבון ו אורגונל דינמיקה ב אסטרוציטים הראשי מספק כלי רב עוצמה כדי ללמוד את הרגולציה של הובלה תאיים בתאים אלה בתוך מבחנה.

המתודולוגיה להקמת העכבר MD התרבויות אסטרוציט שתוארו לעיל משלבת צעדים מפרוטוקולים אחרים שפורסמו13,14,15, אשר תוצאות הן שיטה פשוטה יותר טוהר ואיכות גבוהה יותר תרבויות. השילוב של arac15 טיפול וטלטול מבוססי טיהור13,14 יכול להניב תרבויות אסטרוציט עם טוהר גבוה כמו 98% (המוערך על ידי היחס של gfap+ תאים הכולל תאים), אשר בדוגמה שלנו התוצאות עליה של 27% בטוהר על פני תרבויות הנתונה לשלבי הטיהור בלבד (איור 1ב, ג). תרבויות טוהר גבוהה של העכבר אסטרוציטים שהתקבלו עם שיטה זו דומה לערכים שדווחו על תרבויות אסטרוציט עכברוש (המוערך על ידי אנזימטי מיקרוסקופיה ואלקטרון מיקרוסקופ) על ידי מקארתי ו devellis14. עם זאת, שיטת מקארתי/דבליס, שאינה כוללת טיפול AraC, דורשת צעד ארוך יותר (15-18 שעות) ושני סיבובים נוספים של טיהור14.

בדוגמה שלנו, אנו מראים כי פרוטוקול זה הוא רגיש מספיק כדי ללכוד את ההבדלים בתנועתיות בין חלבונים ממברנה שונים ואורגלים ב astrocytes, אשר צפויים לייצג את המסלולים האישיים שלהם תאיים וסלולר פונקציה. למרות הדוגמה שלנו מדגים את כלי השירות של פרוטוקול זה בתנאים בסיס, מתודולוגיה זו ניתן להתאים בקלות כדי למדוד פרמטרים הובלה בתוך מגוון רחב של שאלות מחקר. לדוגמה, פרוטוקולים דומים עם שינויים משניים יכול לשמש כדי לאפיין את אירועי התחבורה ב-אסטרוציטים באופן מתורבת בתגובה לסביבה פנימית או מינתאית, כגון נזק לסלולר, רעילות, מוטציות פתוגניים, פעילות סינפטית (ב תרבויות מעורבות של נוירונים ו astrocytes), וכו '. כמו כן, שיתוף ביטוי ויזואליזציה של מטענים מרובים או אורגלים, כל אחד מתויג בנפרד עם fluorophores שונים, יכול לשמש גם כדי להעריך שינויים דינמיים ב לוקליזציה שיתוף והיווצרות מורכבים, אינטראקציות חולף בין אורגלים , ומיחזור ממברנה אירועים הובלה.

הצלחת המתודולוגיה המוצגת כאן מסתמכת בעיקר על היכולת להשיג תרבויות אסטרוציטים באיכות גבוהה ובתיוג יעיל של מטענים (ים). בעת שימוש בהליך זה להדמיה חיה, חשוב לעקוב באופן הדוק אחר ביטוי הפלורסנט כדי לקבוע את זמן הדגירה האופטימלי לאחר הניתוח. בממוצע, מצאנו כי עבור מטענים ניתח תקופת דגירה של 24 שעות התוצאות בעוצמת אות טובה עבור רכישת הדמיה חיה. דגירה ממושכת של האסטרוציטים ממושך יכול לגרום לביטוי גבוה של חלבונים מתויגים fluorescently אשר יכול לגרום לצבירת חלבון, ובכך לשנות מטענים לוקליזציה ודינמיקה, והפחיתה את בריאות התרבויות. Astrocytes פגיעים מאוד לנזק פיזי ושינויים בסביבת התרבות, אשר יכול להוביל האינדוקציה של תגובות הסלולר הנייד, כולל הפעילות מחדש. לפיכך, חשוב להקטין את מרווחי הזמן בין שטיפת כביסה, ולמזער את החשיפה של התרבויות לאוויר ולשינויים משמעותיים בטמפרטורה או בעוצמת האור על פני תקופות הדגירה והרכישה.

לסיכום, השיטות המוצגות כאן ניתן להשתמש כדי להעריך ולכמת שינויים דינמיים חלבון ו אורגונל לוקליזציה ב astrocytes. הם מספקים כלים יקרי ערך המאפשרים בחינת שינויים בתגובות אסטרוציטיות בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

DNL נתמך על ידי אוניברסיטת צפון קרוליינה בבית הספר לרפואה בצ היל (UNC) בתור מלומד סימונס. TWR נתמך על ידי UNC הכנה גרנט ראשי 25 GM089569. העבודה באמצעות מרכז מיקרוסקופ הליבה UNC המרכז היה נתמך, בין השאר, על ידי מימון של NIH-NINDS מרכז המחקר תמיכה מענק P30 NS045892 ו NIH-מוגבלות התפתחותית מרכז מחקר התפתחותי תמיכה מענק U54 HD079124.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5% Trypsin (10x) Gibco 15090-046
Benchtop Centrifuge Thermo Scientific 75-203-637 Sorvall ST8 Centrifuge
Cell Culture Grade Water Gen Clone 25-511
Cell Culture Microscope Zeiss WSN-AXIOVERT A1 Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities
Cytosine Arabinoside Sigma C1768-100MG (AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage
DAPI Sigma D9542-5MG Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.
Dissecting Microscope Zeiss Stemi 305
Dissecting Scissors F.S.T 14558-09
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gen Clone 25-500
Fetal Bovine Serum Gemini 100-106 Heat-Inactivated
FIJI (Fiji is Just Image J) NIH Version 1.52i
Fine Tip Tweezers F.S.T 11254-20 Style #5
Fluorescence light source Excelitas 012-63000 X-Cite 120Q
GFAP antibody Cell Signaling 3670S GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody
Glass Bottom Dishes Mattek corporation P35G-1.5-14-C 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated
Graefe Forceps F.S.T 11054-10 Graefe Iris Forceps with curved tips
Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes) Life Technologies L7526 LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.
Hank's Balanced Salt Solution (10x) Gibco 14065-056 Magnesium and calcium free
Imaging Media Life Technologies A14291DJ Live Cell Imaging Solution
Inverted Confocal Microscope Zeiss LSM 780
KymoToolBox https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Lipofection Enhancer Reagent Life Technologies 11514015 Plus Reagent
Lipofection Reagent Life Technologies 15338100 Lipofectamine LTX reagent
Orbital shaking incubator New Brunswick Scientific 8261-30-1008 Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control
Penicillin/Strepomycin solution (100x) Gen Clone 25-512
Phosphate Buffered Saline (10x) Gen Clone 25-507x
Poly-D-Lysine Hydrobromide Sigma P7405 Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing
Reduced serum medium Gibco 31985-062 OPTI-MEM
Tissue Culture Flasks Olympus Plastics 25-209 75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap
Tissue culture incubator Thermo Scientific 51030285 HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control
Tris-Base Sigma T1503 8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Tris-HCl Sigma T3253 4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25200072
Vacuum-Driven Filter Systems Olympus Plastics 25-227 500 ml, PES membrane, 0.22 µm
Vannas scissors straight Roboz RS-5620

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, (3), 430-440 (2008).
  2. Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends in Neurosciences. 22, (5), 208-215 (1999).
  3. Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142, (22), 3805-3809 (2015).
  4. Allaman, I., Bélanger, M., Magistretti, P. J. Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse. Trends in Neurosciences. 34, (2), 76-87 (2011).
  5. Chung, W. S., Barres, B. A. The role of glial cells in synapse elimination. Current Opinion in Neurobiology. 22, (3), 438-445 (2012).
  6. Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (9), 020370 (2015).
  7. Shin, J. W., et al. Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP. Neurochemistry Research. 34, (10), 1758-1766 (2009).
  8. Potokar, M., et al. Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes. Traffic. 8, (1), 12-20 (2007).
  9. Potokar, M., et al. Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes. Glia. 61, (6), 917-928 (2013).
  10. Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes. Glia. 60, (4), 594-604 (2012).
  11. Chiu, C. T., et al. HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway. PLoS ONE. 10, (5), 0126217 (2015).
  12. Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection. Journal of Biological Chemistry. 292, (36), 14747-14763 (2017).
  13. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visual Experiments. (71), e50079 (2013).
  14. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85, (3), 890-902 (1980).
  15. Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells. The Journal of Cell Biology. 102, (6), 2244-2253 (1986).
  16. Zala, D., et al. Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport. Cell. 152, (3), 479-491 (2013).
  17. Cordelières, F. P. IJ KymoToolBox. Available from: https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox (2016).
המחשה וניתוח של תחבורה תאיים של אורגלים וcargos אחרים באסטרוציטים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Creighton, B. A., Ruffins, T. W., Lorenzo, D. N. Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes. J. Vis. Exp. (150), e60230, doi:10.3791/60230 (2019).More

Creighton, B. A., Ruffins, T. W., Lorenzo, D. N. Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes. J. Vis. Exp. (150), e60230, doi:10.3791/60230 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter