Visualización y análisis del transporte intracelular de organelos y otros Cargos en astrocitos

Summary

Aquí describimos un método in vitro de imágenes en vivo para visualizar el transporte intracelular de orgánulos y el tráfico de proteínas de membrana plasmática en astrocitos murinos. Este protocolo también presenta una metodología de análisis de imágenes para determinar los itinerarios de transporte de carga y la cinética.

Abstract

Los astrocitos se encuentran entre los tipos de células más abundantes en el cerebro adulto, donde desempeñan un papel clave en una multiplicidad de funciones. Como un jugador central en homeostasis cerebral, los astrocitos suministran a las neuronas metabolitos vitales y amortiguan el agua extracelular, los iones y el glutamato. Un componente integral de la sinapsis "tri-partito", los astrocitos también son críticos en la formación, poda, mantenimiento y modulación de las sinapsis. Para permitir estas funciones altamente interactivas, los astrocitos se comunican entre sí y con otras células gliales, neuronas, la vasculatura cerebral y el entorno extracelular a través de una multitud de proteínas de membrana especializadas que incluyen moléculas de adhesión, aquaporinas, canales iónionales, transportadores de neurotransmisores y moléculas de unión de separación. Para apoyar este flujo dinámico, los astrocitos, como las neuronas, dependen del transporte intracelular estrechamente coordinado y eficiente. A diferencia de las neuronas, donde el tráfico intracelular se ha delineado ampliamente, el transporte basado en microtúbulos en astrocitos ha sido menos estudiado. No obstante, el tráfico exo y endocítico de proteínas de membrana celular y transporte intracelular de orgáyos organiza la biología normal de los astrocitos, y estos procesos a menudo se ven afectados por enfermedades o en respuesta a lesiones. Aquí presentamos un protocolo sencillo para el cultivo de astrocitos murinas de alta calidad, para etiquetar fluorescentemente proteínas astrocíticas y orgánulos de interés, y para registrar su dinámica de transporte intracelular utilizando microscopía confocal de lapso de tiempo. También demostramos cómo extraer y cuantificar los parámetros de transporte relevantes de las películas adquiridas utilizando plugins de software de análisis de imágenes disponibles (es decir, ImageJ/FIJI).

Introduction

Los astrocitos son las células más abundantes en el sistema nervioso central adulto, donde realizan funciones únicas de desarrollo y homeostáticos¹. Los astrocitos modulan el desarrollo sináptico a través del contacto directo con terminales pre y postsinápticos como parte de la sinapsis tripartito, que contiene receptores de neurotransmisores, transportadores y moléculas de adhesión celular que facilitan la formación de sinapsis y comunicación neurona-astrocito². Además, los astrocitos controlan activamente la transmisión sináptica y previenen la excitotoxicidad neuronal eliminando rápidamente los neurotransmisores excitatorios de la hendidura sináptica, los neurotransmisores de reciclaje, y participando en la poda sináptica^{3 , 4 , 5 , 6}. Para permitir estas funciones altamente interactivas, los astrocitos se comunican entre sí, con otras células gliales, y con las neuronas a través de proteínas de membrana especializadas, incluyendo moléculas de adhesión celular, acuporinas, canales ióniales, transportadores de neurotransmisores, y moléculas de unión de brecha. Los astrocitos cambian activamente los niveles superficiales de estas proteínas en respuesta a las fluctuaciones en su entorno intra y extracelular⁷. Además, los cambios en los niveles y la distribución de las mitocondrias, las gotas lipídicas y los orgánulos dedegradadores y reciclados modulan el suministro de energía, la disponibilidad de metabolitos y los procesos de limpieza celular que son esenciales para la función astrocitos y Supervivencia.

Los cambios dinámicos en el tráfico y posicionamiento de proteínas de membrana y orgánulos en astrocitos seven facilitados por la función concertada de las proteínas motoras y adaptadores que promueven la motilidad de carga 8,^9. Del mismo modo, los niveles superficiales de proteínas de membrana se modulan a través de eventos de internalización y reciclaje¹⁰. Estas cargas se transportan a través de una intrincada red de actina, microtúbulos y, posiblemente, filamentos intermedios^delas pistas 8. Los estudios basados en la tinción de inmunofluorescencia de la proteína de unión final 1 (EB1), que se acumula en los extremos del microtúbulo más, sugieren que en los haces de los astrocitos de microtúbulos irradian desde el perinúcleo y extienden su extremo más hacia el periferia¹¹. Sin embargo, todavía falta un examen exhaustivo de la organización y polaridad de los microtúbulos y otros elementos citoesqueléticos mediante imágenes de células vivas. Mientras que muchos de los mecanismos subyacentes a la dinámica de los orgánulos y proteínas de membrana se han estudiado ampliamente en las neuronas y otros tipos de células, la motilidad de carga en los astrocitos es menos bien entendida. La mayor parte de nuestro conocimiento actual sobre los cambios en la distribución de proteínas y orgánulos en los astrocitos se basa en el etiquetado tradicional basado en anticuerpos de preparación fija, que impide el examen espacial y temporal preciso de la dinámica de carga^{7, 12}.

Aquí, describimos un método para etiquetar proteínas de membrana y orgánulos para imágenes en vivo en cultivos primarios de astrocitos de ratón de alta pureza. Usando este protocolo, proporcionamos ejemplos en los que rastreamos la localización dinámica de proteínas de membrana etiquetadas con proteína fluorescente verde (GFP) en astrocitos transinfectados, incluyendo la proteína de unión gap connexin 43 (Cx43-GFP) y el aminoácido excitatorio transportador 1 (EAAT1-GFP). También describimos el uso de una sonda acidotrópica fluorescente para visualizar orgánulos ácidos y seguir su dinámica de tráfico en astrocitos vivos. Por último, demostramos cómo analizar los datos de lapso de tiempo para extraer y evaluar los parámetros de transporte para cargas individuales.

Protocol

Todos los procedimientos de animales se realizaron con la aprobación de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Disección cerebral y cultura de los astrocitos primarios del ratón

NOTA: El siguiente protocolo se adaptó a partir de métodos publicados, que sigue el procedimiento original desarrollado por McCarthy y deVellis^13,14,15. Los cultivos celulares mixtos de los astrocitos McCarthy/deVellis (MD) se preparan a partir de los córticos de ratón del día 2-4 (P2-P4) postnatal, tratados con un factor antimitótico, y purificados para producir el cultivo de astrocitos enriquecidos finales. Cuatro cortices de cachorros de ratón de ambos sexos son suficientes para generar un cultivo de matraz de cultivo de tejido T75.

1. Recubrir la parte inferior de los matraces T75 (100% de acceso al cuello en ángulo, tapa de filtro ventilado hidrofóbico de 0,22 m) con poli-D-lisina (1 mg/ml en tampón Tris de 0,1 M, pH 8,5) e incubar a 37 oC durante 24 h antes del inicio de la disección.
2. Antes de comenzar el procedimiento de disección, caliente 30 mL de medios de cultivo astrocitos (cañonó el medio de Eagle de Dulbecco [DMEM] de glucosa alta, 10% suero bovino fetal inactivado por calor, 1% penicilina/estreptomicina) a 37 oC y descongelar una alícuota de 5 ml de 2,5% de trippsina en hielo. Preparar dos platos de disección (60 mm de diámetro) sobre hielo relleno sin 6 ml de la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) sin Ca²⁺ o Mg^2+.
3. Desinfectar todas las herramientas quirúrgicas (pinzas finas de punta, tijeras de disección, tijeras Vannas rectas, fórceps Graefe con puntas curvas) en 70% etanol antes y entre cada disección.
4. Rocíe la cabeza y el cuello de los cachorros de ratón P2-P4 con 70% de etanol antes de eutanasiarlos rápidamente por decapitación con tijeras quirúrgicas. Realice una incisión de línea media posterior a anterior a lo largo del cuero cabelludo para exponer el cráneo. Corte cuidadosamente el cráneo desde el cuello hasta la nariz.
5. Realice dos incisiones laterales adicionales superiores a los ojos. Usando pinzas de punta fina, voltea suavemente las aletas del cráneo hacia un lado. Retire el cerebro y colóquelo en la primera placa de diseción llena de HBSS helado sin Ca²⁺ o Mg^2+. Mantenga el plato en hielo y continúe cosechando el resto de los cerebros.
   NOTA: Realice el resto del procedimiento de disección bajo un ámbito de disección.
6. Retire las bombillas olfativas con tijeras Vannas o pinzas finas (Figura1Ai). Con los fórceps de punta curvados en la intersección de las fisuras transversales e interhemisféricas, inserte suavemente un segundo par de fórceps de punta curvada entre la corteza y el diencéfalo, abriendo lentamente los fórceps para separar los hemisferios cerebrales del resto de el cerebro (Figura1Aii,Aiii). Retire el tejido no deseado (Figura1Aiv).
7. Para cada hemisferio cortical, retire cuidadosamente las meninges con pinzas finas. Opcionalmente, retire el hipocampo de los cortices. Transfiera los cortices de ratón diseccionados en un segundo plato lleno de HBSS helado sin Ca²⁺ o Mg²⁺ y manténgalo en hielo mientras disecciona el cerebro restante.
   NOTA: Realice los siguientes pasos en condiciones asépticas en una campana de flujo laminar.
8. Corta los cortices diseccionados en trozos pequeños (aproximadamente 2 x 4 mm) usando tijeras quirúrgicas afiladas estériles o un bisturí. Transfiera el tejido diseccionado a un tubo cónico de 50 ml que contenga solución enzimática (22,5 ml de HBSS sin Ca²⁺ o Mg²⁺, 2,5 ml de trippsina al 2,5 ml). Incubar a 37oC durante 30 min con una suave inversión cada 10 min.
9. Recoger el tejido digerido por centrifugación a 300 x g durante 5 min y eliminar la solución enzimática por decantación (no utilice un aspirador de vacío). Añadir 10 ml de medios de cultivo astrocito y disociar el tejido en células individuales pipeteando la solución de 20 a 30 veces utilizando una pipeta serológica de 10 ml.
10. Filtrar la suspensión celular a través de un colador celular de 70 m para minimizar los grumos celulares y el tejido no digerido. Recoger el filtrado en un tubo cónico limpio de 50 ml y ajustar el volumen total a 20 ml con medios de cultivo astrocitos. En este punto, evaluar la eficiencia de la disociación cortical mezclando 10 l de la suspensión celular con 10 s de color azul de trippan y contando células con un hemocitómetro.
    NOTA: Una preparación de cuatro cortices de ratón P2-P4 produce 10 x 15 x 10⁶ celdas individuales.
11. Aspirar la solución de recubrimiento de poli-D-lisina de los matraces de cultivo T75 y lavar dos veces con agua estéril. Placar la suspensión celular de 20 ml e incubar a 37oC y 5% CO2.

2. Purificación y mantenimiento de las culturas astrocítas

NOTA: Realice todos los cambios de medios en condiciones asépticas en una campana de flujo laminar utilizando medios de astrocito sellos filtrados estériles (membrana de filtro de 0,22 m) calentados a 37 oC.

1. Sustituya el soporte celular 48 h después del enchapado (día in vitro 2, DIV2).
2. En DIV5, sustituya los medios de comunicación por medios de cultivo de astrocitos frescos complementados con 10 m de citosina arabinósido (AraC).
   NOTA: Este paso facilita la eliminación de células contaminantes, incluyendo fibroblastos y otras células gliales. Es importante tratar las culturas con AraC no más de 48 h ya que los tiempos de incubación más largos reduciránla viabilidad de los astrocitos.
3. En DIV7, cambie los medios de comunicación a los medios de cultura astrocitos sin AraC y comience a comprobar la confluencia cultural todos los días. Una vez que las células hayan alcanzado el 80% de confluencia, cubra los matraces de dos T75 para cada matraz de cultivo de astrocitos no purificados con poli-D-lisina e incubar a 37 oC durante al menos 8 h a la noche.
4. Al día siguiente, comience la purificación de los astrocitos agitando los matraces de cultivo a 180 rpm durante 30 minutos en una incubadora de temblor orbital de 37 oC. Retire los medios y reemplácelos por medios de cultivo de astrocitos frescos. Agitar las células a 240 rpm durante 6 horas en una incubadora de temblor orbital de 37 oC. Prewarm 1x solución salina con fosfato (PBS), medios de cultivo de astrocitos, y 0.25% trypsin-EDTA a 37 oC 20-30 min antes del final del período de agitación.
   NOTA: La incubación de CO₂no es necesaria durantelos pasos de agitación. Si se desea, los medios recogidos después de los pasos de agitación de 30 minutos y 6 h se pueden utilizar para el cultivo de microglia y oligodendrocitos, respectivamente. El tratamiento de AraC del cultivo mixto, sin embargo, reducirá la abundancia de las otras células gliales.
5. Retire los matraces de cultivo de la coctelera y sustituya inmediatamente el medio por 10 ml de PBS caliente 1x por matraz. Retire el PBS y agregue 3 mL de 0.25% trypsin-EDTA por matraz. Incubar a 37oC y5% CO2, comprobando cada 5 min para el desprendimiento.
6. Una vez que las células se hayan separado del matraz, detenga la trippsinización añadiendo 10 ml de medios de cultivo de astrocitos. Transfiera los astrocitos separados a un tubo cónico de 50 ml y células de pellets por centrifugación a 300 x g durante 5 min. Aspirar sobrenadante y volver a suspender las células en 40 ml de medios de cultivo de astrocitos.
7. Lave dos dos veces los matraces T75 recubiertos de poli-d-lisina con agua estéril y la placa 20 ml de la suspensión de astrocitos purificados. Volver a la incubadora de 37oC y 5% de CO2. Cambia los medios de cultivo astrocitos cada dos días durante 10 días adicionales hasta que los astrocitos maduren.
   NOTA: Cada matraz T75 de astrocitos purificados debe ser suficiente para producir 2 matraces Nuevos T75 con 3 x 10⁵ celdas cada uno en chapado.
8. Repita los pasos 2.5-2.7 para pasadas posteriores o astrocitos de placa para microscopía.
   NOTA: La pureza de los cultivos astrocitos después de la adición de AraC y después de la purificación se puede evaluar cualitativamente a través de la microscopía de campo brillante, o más precisamente mediante la cuantificación del porcentaje de proteína de ácido fibrilar glial (GFAP) positivo células por campo de visión en imágenes fluorescentes (Figura1B,C).

3. Transfección de plásmidos marcados fluorescentes

1. El día antes de la transfección o el etiquetado, las semillas astrocitos a la densidad deseada para la toma de imágenes 24-48 h después de la transfección. Una densidad recomendada para placas de 24 pocillos o pozos inferiores de vidrio de 14 mm es 2 x 10⁴ células/pozo.
   NOTA: Este protocolo está optimizado para la transfección de astrocitos chapados en cubiertas de vidrio de 12 mm en placas de 24 pocillos o pozos inferiores de vidrio de 14 mm utilizando un método basado en lipofecciones. Los reactivos deben escalarse dependiendo del tamaño del plato de cultivo en el que los astrocitos están creciendo.
2. Diluir el reactivo de lipofección (Tablade materiales)en medios de suero reducido (Tablade materiales). Para optimizar la relación entre el reactivo de lipofección y el ADN, pruebe una serie de diluciones adecuadas. Por ejemplo, si se utiliza el reactivo empleado en este protocolo (Tablade materiales), diluir 2, 3, 4 y 5 l del reactivo de lipofección en 50 ml de medios de suero reducido.
3. Diluir 5 g de ADN de alta pureza en 250 ml de medios séricos reducidos. Añadir 5 l de reactivo potenciador de lipofección (Tablade materiales). Combine el tubo que contiene el reactivo de lipofección con un volumen igual de la mezcla del potenciador de la lipofección de ADN. Mezclar en pipeteo e incubar a temperatura ambiente (RT) durante 15 min.
4. Elimine los medios de cultivo de astrocitos y agregue la mezcla de transfección (paso 3.3) a las celdas con gota. Después de una incubación de 6 horasa 37oC y 5% de CO2, sustituya el complejo de transfección por un volumen adecuado de medios de cultivo de astrocitos (2 ml para platos inferiores de vidrio de 14 mm). Incubar durante 24 a 72 h adicionales antes de proceder a la adquisición de la imagen. Monitorear de cerca la duración del paso de incubación para lograr el mejor equilibrio entre la expresión de proteínas y la viabilidad celular.

4. Etiquetado de endosomas tardíos/lisosomas utilizando sondas fluorescentes

NOTA: Algunas cargas se pueden etiquetar con colorantes fluorescentes con alta afinidad por las proteínas específicas de la carga. El siguiente ejemplo permite el etiquetado de endosomas/lisosomas tardíos con una sonda acidotrópica fluorescente.

1. Diluir la sonda de etiquetado lisosomal (Tablade materiales) en 200 s de medios de cultivo de astrocitos a una concentración de trabajo de 1 M y aplicar a los astrocitos del paso 3.1 a una densidad de 2 x 10⁴ células/pozo. Incubar durante 30 min a 37oC.
2. Lave las celdas una vez con medios de cultivo de astrocitos calientes y sustitúyalas por medios de imagen (Tablade materiales). Proceda a las imágenes en vivo inmediatamente.

5. Adquisición de imágenes mediante un sistema de imágenes de lapso de tiempo

NOTA: Las imágenes en vivo de lapso de tiempo deben realizarse utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara de alta velocidad, enfoque definido, cámara de incubación y un objetivo de aceite 40x con una apertura numérica alta (por ejemplo, Plan-Apochromat 1.4NA). Una variedad de software de adquisición está disponible para imágenes de lapso de tiempo. La selección del sistema de microscopía y el software de adquisición deben basarse en su disponibilidad e idoneidad para los objetivos del estudio en particular. A continuación se proporcionan algunas directrices generales.

1. Coloque la cámara de cultivo o el plato en el adaptador adecuado en el escenario del microscopio. Usando la luz de epifluorescencia, seleccione las células que expresan proteínas fluorescentes o sonda para registrar. Ajuste la iluminación de la muestra fluorescente para visualizar las celdas seleccionadas con la cámara digital. Evite el uso de iluminación alta que podría causar fotoblanqueo y fototoxicidad. Ajuste el enfoque y el zoom.
2. Adquiera una sola serie de lapso de tiempo de pila Z a una frecuencia de 1 fotograma cada 2 s para intervalos de tiempo que oscilan entre 300 s y 500 s utilizando las funciones de zoom y enfoque definido.
   NOTA: La dinámica de tráfico (velocidad, frecuencia de movimiento, etc.) variará dependiendo de la proteína de interés, por lo tanto, el tiempo de adquisición puede requerir ajuste. Por ejemplo, las mitocondrias son menos motiles que los lisosomas y presentan pausas frecuentes. En este caso, es más apropiado ajustar los parámetros de adquisición a 1 fotograma cada 5 s para 800 s.
3. Guarde imágenes de lapso de tiempo y expórtelas como archivos de pila AVI o TIFF.

6. Análisis de imágenes

NOTA: El análisis de imágenes se realizó utilizando el plugin KymoToolBox para ImageJ/Fiji¹⁶. Las instrucciones detalladas por escrito paso a paso están disponibles en línea¹⁷. Los siguientes pasos abreviados deben ser suficientes para crear los kymographs y extraer los parámetros de transporte de partículas.

1. Secuencia de imágenes de lapso de tiempo abierto en el software ImageJ/Fiji. Importe imágenes desde el menú Archivo como archivos de pila AVI o TIFF. Convierta las imágenes a 8 bits o 16 bits seleccionando uno de estos tipos de imagen mediante la herramienta Texto del menú Imagen. Si trabaja con archivos RGB, divida los canales con la herramienta Dividir canal disponible en la función Color del menú Imagen.
2. Para generar un kymograph (representación en posición y tiempo de trayectorias de partículas), dibuje cada pista en la que se mueven las partículas trazando una línea a lo largo de las trayectorias de las partículas utilizando la herramienta de línea segmentada. Para asignar correctamente la direccionalidad del movimiento, dibuje la polilínea utilizando la misma convención direccional deseada para todas las películas de modo que la polaridad sea coherente dentro y entre todas las celdas que se están estudiando. Por ejemplo, dibuje la polilínea desde el centro de la celda hacia la periferia o viceversa. Ajuste el ancho de línea para que coincida con el grosor de la pista haciendo doble clic en la herramienta Línea.
3. Ejecute la macro Draw Kymo del plugin KymoToolBox usando un ancho de línea de 10. Aparecerá un mensaje que pide calibrar la imagen en el tiempo (número de fotogramas, velocidad de fotogramas) y espacio (resolución x,y). Una vez calibrados, los kymographs se generan y se pueden guardar como archivos TIFF para la presentación de datos o el análisis de partículas posterior.
4. Asigne trayectorias de partículas rastreando manualmente cada partícula en el kymograph utilizando la herramienta de línea segmentada durante toda la duración de la adquisición. Registre cada trayectoria de partículas como una región de interés (ROI) utilizando la herramienta administrador de ROI que se encuentra en el menú Analizar/Herramientas. Guarde todos los ROI por cada vídeo de lapso de tiempo para su posterior análisis.
   NOTA: Es fundamental asignar la trayectoria correcta para partículas individuales en el kymograph para lograr el cálculo más preciso de los parámetros de transporte.
   1. Ejecute la macro Analyze Kymo del plugin KymoToolBox. Se abrirá una ventana que pide definir la dirección "hacia afuera" del movimiento de partículas (de izquierda a derecha o viceversa) en el menú desplegable. Esta selección depende de la posición de las cargas fluorescentes que se muestren en relación con el núcleo o la periferia celular, como se establece en el paso 6.2. Por ejemplo, si el núcleo está situado a la izquierda de las cargas, y la polilínea en el paso 6.2 se alejó del núcleo, defina el movimiento de la partícula externa como "de izquierda a derecha".
   2. Defina la velocidad límite (velocidad mínima a la que una carga se considera móvil) en la ventana Analizar Kymo. Para las cargas que se mueven a velocidades de transporte intracelulares rápidas, 0,1 m/segundo es una opción adecuada. Modifique este valor para ajustar la sensibilidad del software a cada carga de interés. Ajuste el ancho de línea para que coincida con el grosor de cada trayectoria de partícula.
   3. Seleccione las opciones Registrar todos los datos y Registrar coordenadas extrapoladas en la ventana Analizar kymo. Esto calculará varios parámetros de transporte de carga, incluyendo la velocidad media, la velocidad de entrada, la velocidad exterior, la distancia acumulada recorrida, la distancia recorrida en la dirección de entrada o exterior, el número de interruptores para cada partícula, el porcentaje de tiempo moviéndose en cada dirección o en pausa, etc. Los datos calculados para pistas individuales se agrupan por kymograph y se guardan en archivos de texto específicos de cada imagen.
      NOTA: La opción Mostrar Kymo de color de la macro Analizar Kymo genera una superposición codificada por colores de la ruta sobre el kymograph original. Las partículas que viajan hacia afuera están coloreadas en verde, hacia adentro en rojo y partículas estacionarias en azul. La opción Coordenadas de informe en la pila original de la macro Analizar Kymo genera una superposición codificada por colores de la posición del objeto extrapolado en el vídeo y el kymograph originales de lapso de tiempo.

Representative Results

El protocolo para establecer astrocitos MD de ratón primario descrito anteriormente debería producir cultivos reproducibles y de alta calidad. Aunque los cultivos inicialmente contienen una mezcla de astrocitos, fibroblastos y otras células gliales, incluyendo microglia y oligodendrocitos (Figura1Bi,Biv;puntas de flecha rojas), la adición de AraC al cultivo mixto entre DIV5-DIV7 minimiza la proliferación de estas células contaminantes. El tratamiento combinado de AraC y la estrategia de purificación basada en el temblor enriquecen la pureza de los cultivos de astrocitos (Figura1Bii)sobre los protocolos tradicionales que sólo incluyen los pasos de purificación (Figura1Bv;azul puntas de flecha)¹³. La morfología y composición esperadas (evaluadas por GFAP y 4',6-diamidino-2-phenylindole [DAPI] tinción) de los cultivos de astrocitos purificados tratados con AraC o no tratadas se muestra en la Figura 1Biii,Bvi. La cuantificación del porcentaje de las celdas GFAP⁺ por campo de visión (relación entre el número de células con tinción GFAP y el número total de células identificadas por la tinción DAPI) muestra un aumento de más del 27% en pureza con la suplementación con AraC (Figura1 C).Este cultivo de astrocitos de ratón de alta pureza es adecuado para la evaluación del ARN y la expresión de proteínas, morfología celular y otros ensayos funcionales.

Utilizamos la transfección basada en lipofección para expresar versiones etiquetadas con GFP de la proteína de unión gap Cx43 y el transportador EAAT1 en astrocitos murinos. Esta metodología permite la expresión transitoria de proteínas a niveles que son óptimos para la toma de imágenes de células vivas sin causar toxicidad o afectar a la viabilidad de los astrocitos (Figura2A,E). Del mismo modo, el uso de una sonda fluorescente permitió un etiquetado rápido y eficiente de los orgánulos endo-lisosomales ácidos (Figura2I)para realizar un seguimiento de su dinámica en los astrocitos.

La Figura 2 muestra resultados representativos de los análisis de la dinámica de carga en astrocitos transfectó transitoriamente con EAAT1-GFP, Cx43-GFP, o etiquetados con un tinte selectivo que reconoce vesículas endolysosomales ácidas. Cada uno de estos cargos apareció como un punctum fluorescente que decora la región perinuclear, citosol, y los procesos de los astrocitos (Figura2A,E,I, paneles izquierdos). Los datos de lapso de tiempo se utilizaron para generar kymographs que rastrean el movimiento de la carga en tiempo y espacio (Figura2A,E,I, panelesderecho). En estos kymographs, el movimiento anterogrado y retrógrado de la carga indicada se representa mediante trayectorias con pendientes negativas (líneas verdes) y positivas (líneas rojas), respectivamente. Las vesículas estacionarias se muestran como trayectorias verticales (líneas azules). El análisis de Kymograph reveló que los tres tipos de carga analizados se someten a transporte bidireccional con carreras ocasionales rápidas y procesivas en ambas direcciones. Además, la cuantificación del flujo de una carga a través de un área de la astrocito (caja roja) reveló diferencias en el porcentaje de partículas móviles entre las cargas. Por ejemplo, mientras que el 70% de la puncta EAAT1-GFP están estacionarias (Figura2B), menos del 20% de Cx43-GFP (Figura2F) y el 45% de las cargas endolysosomales etiquetadas con sonda (Figura2J) no son móviles. Estas diferencias en la motilidad entre los cargos son probablemente representativas de su motilidad normal de referencia en la región del astrocito donde se adquirieron las películas.

El mapeo preciso del cambio en la posición X-Y a lo largo de la escala de tiempo completo para cada partícula obtenida del kymograph también se puede utilizar para evaluar otros parámetros de movimiento, como la velocidad de carga (Figura2C, G,K)y la longitud de carrera (distancia (Figura2D,H,L). Los parámetros de movimiento se pueden analizar más a fondo para cargas individuales para determinar los cambios en la direccionalidad del movimiento (movimiento anterogrado vs retrógrado), así como las reversiones en la dirección de las partículas de movimiento, el número de pausas, etc. Los resultados de estos tipos de análisis pueden proporcionar información cuantitativa significativa sobre los cambios en la distribución celular de orgánulos y proteínas de membrana en astrocitos en condiciones basales o anormales en el intra- y extracelular Ambiente.

Figura 1: Establecimiento de culturas primarias de astrocitos de ratón.
(A) Pasos necesarios para la disección de los cerebros de ratón P2-P4. (B) (i,iv) Imágenes de Brightfield de cultivos gliales mixtos tratados (i) y no tratados (iv) con AraC. Las puntas de flecha rojas indican microglia contaminante. (ii,v) Imágenes de cultivos astrocitos purificados tratados (ii) y no tratados (v) con AraC. Las puntas de flecha azules indican oligodendrocitos contaminantes. (iii,vi) Imágenes confocales de cultivos astrocitos purificados tratados (iii) y no tratados (vi) con AraC. El verde muestra la tinción GFAP y las etiquetas DAPI (azul) todos los núcleos. (C) Porcentaje de células GFAP positivas. Los datos representan la media de sem. ***p < 0,001, prueba t sin emparejar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Análisis cuantitativos de la dinámica de carga en astrocitos.
(A,E,I) Paneles izquierdos: Astrocitos que expresan EAAT1-GFP (A), Cx43-GFP (E) o tratados con una sonda que etiqueta endosomas tardíos y lisosomas (I). Las casillas rojas indican las regiones utilizadas para analizar la dinámica de partículas. Paneles derecho: Kymographs originales y codificados por colores que muestran trayectorias para las cargas indicadas. Las líneas rojas representan cargas retrógradas, cargas de movimiento anterogrado de líneas verdes y cargas azules no móviles. (B, F, J) Porcentaje de partículas estacionarias y móviles. (C, G, K) Cuantificación de la velocidad anterograda y retrógrada y (D,H,L) longitud de carrera. Los datos representan la media de SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Aquí, describimos un enfoque experimental para expresar, visualizar y rastrear orgánulos y proteínas de membrana etiquetados fluorescentemente de interés utilizando microscopía de vídeo de lapso de tiempo en astrocitos corticales MD de ratón primariode mayor pureza. También delineamos una metodología para medir la dinámica de partículas. La visualización directa de la dinámica de proteínas y orgáulos en astrocitos primarios proporciona una poderosa herramienta para estudiar la regulación del transporte intracelular en estas células in vitro.

La metodología para establecer las culturas astrocitos MD de ratón descritas anteriormente combina pasos de otros protocolos publicados^13,14,15, lo que resulta en un método más simple y en mayor pureza y calidad Culturas. La combinación del tratamiento de AraC¹⁵ y la purificación a base de agitación^13,14 puede producir cultivos de astrocitos con una pureza tan alta como 98% (evaluado por la relación de GFAP⁺ células totales), lo que en nuestro ejemplo resulta en un aumento del 27% en la pureza sobre los cultivos sometidos únicamente a los pasos de purificación (Figura1B,C). Los cultivos de alta pureza de los astrocitos de ratón obtenidos con este método son similares a los valores reportados para los cultivos de astrocitos de rata (evaluados por ensayos enzimáticos y microscopía electrónica) por McCarthy y deVellis¹⁴. Sin embargo, el método McCarthy/deVellis, que no incluye el tratamiento con AraC, requiere un paso de agitación más largo (15-18 h) y dos rondas adicionales de purificación¹⁴.

En nuestro ejemplo, demostramos que este protocolo es lo suficientemente sensible para capturar diferencias en la motilidad entre varias proteínas de membrana y orgánulos en astrocitos, que son probablemente representativos de sus itinerarios intracelulares individuales y celulares Función. Aunque nuestro ejemplo demuestra la utilidad de este protocolo en condiciones basales, esta metodología se puede adaptar fácilmente para medir los parámetros de transporte dentro de una amplia gama de preguntas de investigación. Por ejemplo, se podrían utilizar protocolos similares con modificaciones menores para caracterizar los eventos de transporte en astrocitos in vitro en respuesta al entorno intraoo celular, como daño celular, toxicidad, mutaciones patógenas, actividad sináptica (en cultivos mixtos de neuronas y astrocitos), etc. Del mismo modo, la co-expresión y visualización de múltiples cargas u orgánulos, cada uno etiquetado individualmente con diferentes fluoróforos, también se puede utilizar para evaluar los cambios dinámicos en la colocalización y la formación compleja, interacciones transitorias entre orgánulos , y eventos de transporte endolítico y de reciclaje de membranas.

El éxito de la metodología presentada aquí se basa principalmente en la capacidad de obtener cultivos astrocitos de alta calidad y en el etiquetado eficiente de la(s) carga(s) de interés. Al utilizar este procedimiento para imágenes en vivo, es importante vigilar de cerca la expresión fluorescente para determinar el tiempo óptimo de incubación posterior a la transfección. En promedio, encontramos que para las cargas analizadas un período de incubación de 24 horas resulta en una buena intensidad de la señal para la adquisición de imágenes en vivo. La incubación prolongada de astrocitos transinfectados puede dar lugar a una alta expresión de proteínas etiquetadas fluorescentes, lo que puede inducir la agregación de proteínas, cambiando así la localización y la dinámica de la carga, y disminuyendo la salud de los cultivos. Los astrocitos son muy vulnerables a los daños físicos y los cambios en el entorno cultural, que pueden conducir a la inducción de las respuestas transcripcionales y celulares, incluida la reactividad. Por lo tanto, es fundamental reducir los intervalos de tiempo entre los pasos de lavado, y minimizar la exposición de los cultivos al aire y a cambios significativos en la temperatura o la intensidad de la luz durante los períodos de incubación y adquisición.

En resumen, los métodos presentados aquí se pueden utilizar para evaluar y cuantificar los cambios dinámicos en la localización de proteínas y orgánulos en astrocitos. Proporcionan herramientas valiosas que permiten el examen de los cambios en las respuestas astrocíticas en condiciones fisiológicas y patológicas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.5% Trypsin (10x)	Gibco	15090-046
Benchtop Centrifuge	Thermo Scientific	75-203-637	Sorvall ST8 Centrifuge
Cell Culture Grade Water	Gen Clone	25-511
Cell Culture Microscope	Zeiss	WSN-AXIOVERT A1	Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities
Cytosine Arabinoside	Sigma	C1768-100MG	(AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage
DAPI	Sigma	D9542-5MG	Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.
Dissecting Microscope	Zeiss		Stemi 305
Dissecting Scissors	F.S.T	14558-09
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gen Clone	25-500
Fetal Bovine Serum	Gemini	100-106	Heat-Inactivated
FIJI (Fiji is Just Image J)	NIH	Version 1.52i
Fine Tip Tweezers	F.S.T	11254-20	Style #5
Fluorescence light source	Excelitas	012-63000	X-Cite 120Q
GFAP antibody	Cell Signaling	3670S	GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody
Glass Bottom Dishes	Mattek corporation	P35G-1.5-14-C	35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated
Graefe Forceps	F.S.T	11054-10	Graefe Iris Forceps with curved tips
Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes)	Life Technologies	L7526	LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.
Hank's Balanced Salt Solution (10x)	Gibco	14065-056	Magnesium and calcium free
Imaging Media	Life Technologies	A14291DJ	Live Cell Imaging Solution
Inverted Confocal Microscope	Zeiss		LSM 780
KymoToolBox			https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Lipofection Enhancer Reagent	Life Technologies	11514015	Plus Reagent
Lipofection Reagent	Life Technologies	15338100	Lipofectamine LTX reagent
Orbital shaking incubator	New Brunswick Scientific	8261-30-1008	Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control
Penicillin/Strepomycin solution (100x)	Gen Clone	25-512
Phosphate Buffered Saline (10x)	Gen Clone	25-507x
Poly-D-Lysine Hydrobromide	Sigma	P7405	Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing
Reduced serum medium	Gibco	31985-062	OPTI-MEM
Tissue Culture Flasks	Olympus Plastics	25-209	75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap
Tissue culture incubator	Thermo Scientific	51030285	HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control
Tris-Base	Sigma	T1503	8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Tris-HCl	Sigma	T3253	4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200072
Vacuum-Driven Filter Systems	Olympus Plastics	25-227	500 ml, PES membrane, 0.22 µm
Vannas scissors straight	Roboz	RS-5620