Burada CRISPR/Cas9 genom nakavt elektrikli balık üretimi ve arkası için bir protokol sunulmuştur. Ayrıntılı olarak özetlenen bir gymnotiform ve mormyrid hem de gerekli moleküler biyoloji, Üreme ve hayvancılık gereksinimleri ve cas9 indel F0 larvaları üretmek için enjeksiyon teknikleri vardır.
Omurgalıların evrimsel tarihinde elektroresepsiyon ve elektrogenez değişmiştir. Ortak bir genetik mimariyi paylaşan bu bağımsız olarak elde edilen fenotiplerde çarpıcı bir yakınsama derecesi vardır. Bu belki de en iyi gymnotiforms ve mormyrids, üretmek ve zayıf elektrik alanları tespit ve zayıf elektrikli balık denir iki tür zengin teleost clades sayısız yakınsak özellikleri ile örneklenir. Zayıf elektrikli balıkların çevrelerini algılamak ve iletişim kurmak için elektriği kullandıklarının keşfinden bu yana geçen 50 yıl içinde, büyüyen bir bilim adamı topluluğu, gelişim, sistem ve devrelerin nörolojisinin evrimi hakkında muazzam bir içgörü kazandı. hücresel fizyoloji, ekoloji, evrimsel biyoloji ve davranış. Daha yakın zamanlarda, elektrikli balıklar için genomik kaynakların çoğalması olmuştur. Bu kaynakların kullanımı zaten bu türlerde genotip ve fenotip arasındaki bağlantı ile ilgili önemli anlayışlar kolaylaştırmıştır. Genomik verilerin zayıf elektrikli balıkların henotik verileriyle bütünleştirilmesinin önündeki en büyük engel, mevcut fonksiyonel genomik araçlarının eksikliğidir. Burada zayıf elektrikli balıklarda endojen DNA onarım mekanizmaları kullanan CRISPR/Cas9 mutagenezinin icrası için tam bir protokol sunacağız. Bu protokolün hem mormyrid türü Brienomyrus brachyistius hem de gymnotiform Brakihypopomus gauderio’da CRISPR/Cas9 kullanarak indels ve nokta mutasyonlarını hedef alarak eşit derecede etkili olduğunu gösteriyoruz. sodyum kanal gen scn4aa. Bu protokol kullanılarak, her iki türden de embriyolar elde edildi ve scn4aa sodyum kanalının ilk eksonlarında öngörülen mutasyonların mevcut olduğunu doğrulamak için genotiplendi. Nakavt başarı fenotip enjekte edilmemiş boyut eşleşen kontroller ile karşılaştırıldığında azaltılmış elektrik organı deşarj genlikleri gösteren kayıtları ile doğrulandı.
Omurgalıların evrimsel tarihinde elektroresepsiyon ve elektrogenez değişmiştir. Teleost balık iki soy, osteoglossiformes ve siluriformes, paralel olarak elektroresepsiyon gelişti, ve teleostların beş lineages (gymnotiformes, mormyrids, ve cins Astroscopus, Malapterurus, ve Synodontis) paralel olarak gelişen elektrogenez. Ortak bir genetik mimari1,2,3paylaşan bu bağımsız olarak türetilmiş fenotipler, yakınsama çarpıcı bir derecesi vardır.
Bu belki de en iyi gymnotiforms ve mormyrids, üretmek ve zayıf elektrik alanları tespit ve zayıf elektrikli balık denir iki tür zengin teleost clades, sayısız yakınsak özellikleri ile örneklenir. 50 yıl içinde zayıf elektrik balık çevrelerini algılamak ve iletişim kurmak için elektrik kullanımı keşfinden bu yana4, bilim adamlarının büyüyen bir toplulukgelişme1,5 evrimi içine muazzam anlayışlar kazanmıştır ,6, sistemleri ve devrelerinörolojik 7,8,9,10, hücresel fizyoloji11,12, ekoloji ve enerji13 ,14,15,16,17, davranış18,19, ve makroevrim3,20,21 .
Daha yakın zamanda, elektrik balıkları için genomik, transkripsiyonik ve proteomik kaynakların çoğalması olmuştur1,22,23,24,25,26, 27,28. Bu kaynakların kullanımı zaten bu türlerde genotip ve fenotip arasındaki bağlantı ile ilgili önemli anlayışlar üretti1,2,3,28,29 ,30. Zayıf elektrikli balıkların henotik verileri ile genomik verilerin entegre edilmesinin önündeki en büyük engel, fonksiyonel genomik aletlerin mevcut eksikliğidir31.
Bu araçlardan biri, Cas9 endondüraz (CRISPR/Cas9, CRISPR) tekniği ile eşleştirilmiş son zamanlarda geliştirilen Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar’dır. CRISPR/Cas9 hem model32,33,34 hem de model olmayanorganizmalarda 35,36,37 hem de yaygın kullanıma girmiş bir genom düzenleme aracıdır. CRISPR/Cas9 teknolojisi, temel moleküler biyoloji yeteneğine sahip bir laboratuvarın klonlamayan bir yöntemi kullanarak düşük maliyetle kısa kılavuz RNA (sgRNA) adı verilen genlere özgü probları kolayca üretebileceği bir noktaya gelmiştir38. CRISPR morpholinos39,40, transkripsiyon aktivatör benzeri efektör nükleazlar (TALENs) ve çinko parmak çekirdekleri (ZFNs) gibi diğer nakavt / nakavt stratejileri, üzerinde avantajları vardır ve pahalı ve her hedef gen için üretmek için zaman alıcı.
CRISPR/Cas9 sistemi, genomun belirli bir bölgesini hedef alarak, sgRNA dizisi tarafından yönlendirilerek ve çift iplikli bir kopmaya neden olarak gen nakavtları oluşturmak için işlev görür. Çift iplikli kopma hücre tarafından tespit edilir ve homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) yolu kullanılarak tercihen endojen DNA onarım mekanizmalarını tetikler. Bu yol son derece hata yatkındır: onarım işlemi sırasında, DNA molekülü genellikle çift iplikli mola yerinde eklemeler veya silmeler (indels) dahil edecektir. Bu indels ya (1) açık okuma çerçevesi vardiya, (2) erken stop codon ekleme veya (3) gen ürünün kritik birincil yapısında vardiya nedeniyle fonksiyon kaybına neden olabilir. Bu protokolde, zayıf elektrikli balık türlerinde NHEJ’yi kullanarak hedef genlerdeki nokta mutasyonlarını hedeflemek için CRISPR/Cas9 düzenlemesini kullanıyoruz. Diğer tekniklere göre daha basit ve daha verimli olsa da, bu mutagenez yönteminin genetik mozaisizme atfedilen F0’dabir dizi fenotipik şiddeti ile sonuçlanması beklenmektedir, bu da genetik mozailiğe atfedilir41,42,43 ,44.
Organizmaların Seçimi
Zayıf elektrikli balıkların karşılaştırmalı genomikleri üzerinde gelecekteki çalışmaları kolaylaştırmak amacıyla, protokol gelişimi için hem gymnotiforms hem de mormyrids için temsili bir tür seçilmelidir. Uruguay’ın Montevideo kentinde düzenlenen 2016 Elektrikli Balık toplantısı nın ardından, laboratuvarda yetiştirilebilecek ve genomik kaynaklara sahip türleri kullanmak için topluluk konusunda fikir birliği sağlandı. Gymnotiform Brakihipopomus gauderio ve mormyrid Brienomyrus brachyistius bu kriterlere uygun türler olarak seçildi. Her iki türde de üreme koşullarını tetiklemek ve sürdürmek için doğal ipuçları esaret altında taklit etmek kolaydır. B. gauderio, Güney Amerika’dan bir gymnotiform türler, düşük hayvancılık gereksinimleri avantajı vardır: balık nispeten küçük (4 L) tanklarda nispeten yüksek yoğunlukta tutulabilir. B. gauderio da esir koşullar altında hızlı nesil cirosuvardır. Laboratuvar koşullarında, B. gauderio yaklaşık 4 ay içinde yumurtadan yetişkine gelişebilir.
B. Brachyistius, Batı-Orta Afrika mormyrid balık bir tür, kolayca esaret içinde ürerler. B. brachyistius akvaryum ticareti yoluyla kolayca kullanılabilir, yaygın birçok çalışmada kullanılmıştır, ve şimdi genomik kaynakların bir dizi mevcuttur. Yaşam döngüleri laboratuvar koşullarına bağlı olarak 1−3 yıl sürer. Hayvancılık gereksinimleri bu tür için biraz daha yoğundur ve üreme sırasındaki saldırganlıkları nedeniyle orta büyüklükte tanklara (50−100 L) ihtiyaç vardır.
Diğer elektrikli balık türlerini inceleyen laboratuvarlar, türler yetiştirilebildiği ve tek hücreli embriyoların toplanıp yetişkinliğe kadar yetiştirilebildiği sürece bu protokolü kolayca uyarlayabilmeli. Konut, larva yetiştiriciliği ve in vitro fertilizasyon (IVF) oranları diğer türler ile birlikte büyük olasılıkla değişecektir; ancak, bu protokol diğer zayıf elektrikli balıkların üreme girişimleri için bir başlangıç noktası olarak kullanılabilir.
Kavram Kanıtı için İdeal Bir Gen Hedefi: scn4aa
Zayıf elektrikli mormyrid ve gymnotiform balık elektrik organı olarak adlandırılan özel bir organ, boşaltarak elektrik alanları (elektrogenez) oluşturmak. Elektrik organ deşarjları (EODs) elektrosit adı verilen elektrik organ hücrelerinde eylem potansiyellerinin eşzamanlı üretimi sonucu. EOD’ler, balığın çevresinin yüksek çözünürlüklü elektriksel görüntülerini oluşturmak için derideki bir dizi elektroreseptör tarafından tespit edilir45. Zayıf elektrikli balıklar da kendi conspecifics ‘EOD dalga formları özellikleri tespit yeteneğine sahiptir18 yanı sıra deşarj oranları46, EODs kuş şarkısı veya kurbağa benzer bir sosyal iletişim sinyali olarak ek olarak çalışmasına izin vokalizasyon47.
Hem mormyrid ve gymnotiform zayıf elektrikli balık elektrositlerde eylem potansiyel nesil bir ana bileşeni voltaj kapılı sodyum kanalı NaV1.42. Elektrik olmayan teleosts iki paralogus gen kopyaları ifade, scn4aa ve scn4ab, voltaj kapılı sodyum kanalı NaV1.430için kodlama . Hem gymnotiform ve mormyrid zayıf elektrikli balık soyları, scn4aa hızla gelişti ve kinetik özelliklerini etkileyen çok sayıda amino asit ikameleri uğramıştır48. En önemlisi, scn4aa elektrik organı2,3her iki soy da bölümlere ayrılmıştır . Elektrik organına scn4aa nispeten sınırlı ifade, yanı sıra EODs üretiminde ki kilit rolü, CRISPR / Cas9 nakavt deneyleri için ideal bir hedef yapar, minimal zararlı pleiotropic etkileri olduğu gibi. Zayıf elektrikli balıklar larva elektrik organlarını 6−8 gün sonra döllenme (DPF) boşaltmaya başladıklarından, scn4aa’nın hedeflenmesi embriyo mikroenjeksiyonunu takiben hızlı fenotipleme için idealdir.
Zayıf elektrikli balıkların fenotipik zenginliği, genomik kaynakların yakın zamanda çoğalması ile birlikte, zayıf elektrikli balık modelinde fonksiyonel genomik araçlara yönelik güçlü bir ihtiyacı motive eder. Bu sistem, laboratuvarda kolayca tutulan paralel balık soylarında çok sayıda fenotipik özelliğin yakınsak evrimi nedeniyle özellikle çekicidir.
Burada açıklanan protokol, CRISPR/Cas9 tekniğinin elektrogenez ve elektroalımı paralel olarak evrimleşen zayıf …
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud ve Hope Healey’in balık yetiştiriciliği, veri toplama ve erken protokol geliştirme konusunda yardımcı olmak için gösterdiği kahramanca çabaları kabul etmektedirler. Ayrıca üç yorumcuya da makaleye verdikleri öneriler için teşekkür ederiz. Biz nihai ürün yorumlarını ele sonra daha kaliteli olduğuna inanıyoruz. Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı #1644965 ve JRG #1455405 ve Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi DG hibe VLS desteği ile finanse edilmiştir.
20 mg/mL RNA grade Glycogen | Thermo Scientific | R0551 | |
50 bp DNA ladder | NEB | N3236L | |
borosilicate glass capillary with filament | Sutter Instrument | BF100-58-10 | (O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length) |
Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL | PNA Biology | CP01 | |
Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector | Fisher Scientific | E5252000021 | |
Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | 10289651 | |
Hamilton syringe | Fisher Scientific | 14-824-654 | referred to as "precision glass syringe" in the protocol |
Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666 | referred to as "delicate task wipe" in the protocol |
MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
NEBuffer 3 | NEB | B7003S | used for in vitro cleavage assay |
OneTaq DNA kit | NEB | M0480L | |
Ovaprim | Syndel USA | https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html | referred to as "spawning agent" in the protocol |
Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | referred to as "thermoplastic" in the protocol |
Pipette puller | WPI | SU-P97 | sutter brand |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
Reusable needle- requires customization | Fisher Scientific | 7803-02 | Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25 |
T4 DNA polymerase | NEB | M0203L | Use with the 10X NEB buffer that is included |
Teflon coated tools | bonefolder.com | T-SPATULA4PIECE | referred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol |