Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הדמיה של תא חי כדי להעריך את הדינמיקה של תזמון מטאמפאזה ואת הגורל התאים בעקבות Mitotic צירים רטבאליות

Published: September 20, 2019 doi: 10.3791/60255
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute
* These authors contributed equally

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול להערכת הדינמיקה של היווצרות צירים והתקדמות mitotic. היישום שלנו של הדמיה זמן לפקיעה מאפשר למשתמש לזהות תאים בשלבים שונים של mitosis, לעקוב ולזהות פגמים mitotic, ולנתח את הדינמיקה הציר ואת הגורל mitotic cell בעת חשיפה לתרופות נגד mitotic.

Abstract

לחיות הדמיה בזמן התמונה התמונה הוא כלי חשוב בביולוגיה התא המספק תובנה תהליכים סלולריים שעלולים להתעלם אחרת, לא מובנת, או שלא כהלכה על ידי ניתוח תא קבוע. בעוד הדמיה תא קבוע ניתוח הוא חזק ומספיק כדי להתבונן הסלולר המצב הנייד, זה יכול להיות מוגבל בהגדרת סדר הזמן של אירועים ברמה התאית והוא חולה להעריך את האופי הארעי של תהליכים דינמיים כולל התקדמות mitotic. לעומת זאת, הדמיה של תא חי היא כלי רהוט שניתן להשתמש בו כדי להתבונן בתהליכים סלולריים ברמה של תא בודד לאורך זמן ויש לו את היכולת ללכוד את הדינמיקה של תהליכים שאחרת היו מיוצגים בצורה גרועה בהדמיית תא קבוע. כאן אנו מתארים גישה כדי ליצור תאים הנושאים מסמנים התווית של כרומטין ו microtubules ואת השימוש שלהם בגישות הדמיה של תא חי כדי לפקח על יישור כרומוזום מטאפיפאסיים ויציאה mitotic. אנו מתארים טכניקות מבוססות הדמיה כדי להעריך את הדינמיקה של היווצרות ציר והתקדמות mitotic, כולל זיהוי של תאים בשלבים שונים מיטוזיס, זיהוי ומעקב של פגמים mitotic, ניתוח הדינמיקה ציר ו mitotic הגורל התא בעקבות הטיפול עם מעכבי mitotic.

Introduction

ניתוח מבוסס תמונה של תאים קבועים משמש בדרך כלל להערכת השינויים ברמת האוכלוסייה התאית בתגובה לרטבאליות שונות. בשילוב עם סנכרון תאים, ואחריו אוסף והדמיה של נקודות זמן טוריות, ניתן להשתמש בגישות כאלה כדי להציע רצף אירועים תאי. עם זאת, הדמיה סלולרית קבועה מוגבלת ביחסים הזמני משתמעת לאוכלוסיה ולא הפגינו ברמה של תאים בודדים. בדרך זו, בעוד הדמיה תא קבוע ניתוח מספיק כדי לבחון פנוטיפים חזקים ושינויים במצב יציב, היכולת לזהות שינויים זמניים לאורך זמן ושינויים המשפיעים רק על אוכלוסיית התאים הוא לא מושלם. לעומת זאת, הדמיה של תאים חיים היא כלי רהוט שניתן להשתמש בו כדי להתבונן בתהליכים סלולריים ומשניים בתוך תא אחד, או באוכלוסיית הסלולר, לאורך זמן וללא סיוע של גישות סנכרון העלולות להשפיע על עצמם על התנהגות תאית מיכל בן , מיכל השני , מיכל שלוש , ד , מיכל 5 , . שישה מטרים

היווצרות של ציר דו קוטבית mitotic הוא חיוני עבור ההפרדה כרומוזום הנכון במהלך חלוקת התא, וכתוצאה מכך שתי תאים מבחינה גנטית ביתי. פגמים במבנה mitotic ציר כי מושחתים mitotic התקדמות ולהתפשר על נאמנות של הפרדה כרומוזום יכול לגרום לדיוויזיות תאים קטסטרופלי ויכולת הכדאיות של תאים מופחתת. מסיבה זו, mitotic רעלים שמשנים את היווצרות הצירים מבטיחים therapeutics להגביל את ההתפשטות המהירה של תאים סרטניים7,8,9. עם זאת, ניתוח תאים קבוע של מבנה הצירים בעקבות הוספת רעלים mitotic מוגבל ביכולתה להעריך את התהליך הדינמי של היווצרות צירים ואינו יכול לציין אם שינויים שנצפו במבנה הצירים הם קבועים או מ במקום ארעי וניתן להתגבר על מנת לאפשר חלוקת תאים מוצלחת.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים גישה כדי להעריך את הדינמיקה של מיטוזיס רטבאליות בעקבות הדמיה של תאים חיים. שימוש בשורה hTERT מונצח-1 קו התא ההונדסים לבטא RPE-מתויג Histone 2B כדי להמחיש כרומטין, יחד עם EGFP-מתויג α-טובולין כדי להמחיש microtubules, את העיתוי של יישור כרומוזום מטאפיאט, אנאפיום התחלתה, ובסופו של דבר mitotic הגורל התאים מוערך באמצעות רמזים חזותיים של תנועת כרומוזום, compaction, מורפולוגיה גרעינית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הדור של hTERT-RPE-1 תאים באופן בלתי נשכח RPE-Histone 2B (RPE-H2B) ו-α-טובולין-EGFP (אמבטיה-EGFP)

הערה: כל השלבים לעקוב אחר טכניקות אספטי ולהתקיים ברמת בטיחות II + (BSL2 +) בטיחות ארון.

  1. ליצור רטרו וירוס נושאת את הגנים של עניין (α-טובולין-EGFP ו-RFP-H2B) על ידי העברת הקשר של תאים 293T עם הפלסטיק המתאים הפלגידים על פי הוראות היצרן של המערכת המבוססת על מערכת העברת שומנים.
    1. יום 1: השימוש זכוכית חד פעמית פסטר הצינורות כדי לטפי את המדיום תרבות התא מלוח של תת-confluent 293T תאים ולשטוף את המדיום שיורית עם מלוחים באגירה פוספט (PBS) על ידי הוספת 5 מ ל של PBS. מערבולת כדי לפזר את ה-PBS בתחתית הצלחת, ולאחר מכן לבשל את ה-PBS עם משקה מזכוכית סטרילי חד פעמית של פסטר.
    2. להוסיף 2 מ ל 0.05% טריפסין שכבר מחומם מראש ל 37 ° c ולהחזיר את הצלחת לתוך החממה מחולל לחות ב 37 ° צ' עם 5% CO2 עבור 2 כדי 5 דקות כדי לאפשר לתאים חסיד להשתחרר ממשטח הכלים של התרבות התא.
    3. הוסף 8 מ ל של מדיום הנשר החדש של Dulbecco (DMEM) שיושלם עם 10% סרום בפרה העובר (FBS) ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין לצלחת המכילה טריפסין.
    4. השהה את התאים מחדש על ידי ליטוף בעדינות והעבר את ההשעיה לצינורית חרועה בעלת 15 מ"ל. מניחים את צינור חרוט בצנטריפוגה מאוזנת ספין ב 161 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לנקז בעדינות את התאים.
    5. משלחים את התמיסה המדיום/טריפסין מתאי הפלטד ומשהה מחדש את התאים ב-10 מ ל בתוספת של 10% FBS ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין. השתמש הומוציטוטומטר כדי לספור את ההשעיה של התא 293T ואת צלחת 2 x 106 293t תאים לכל באר של 6 צלחת הבאר.
    6. תאים התרבות בנפח כולל של 2 מ ל של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) שיושלם עם 10% סרום העובר העוברי (FBS) ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין ולתחזק החממה לחות בתוך 37 ° c עם 5% CO2.
    7. יום 2: פיפטה 7 μL של משלוח השומנים המבוסס על מסירה מגיב ו-100 μL של בינוני סרום מופחת לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL ולאפשר את זה כדי דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות (צינור #1).
    8. במבחנה נפרדת 1.5 mL, פיפטה 1 μg של RFP-H2B ביטוי וקטור (או 1 μg של α-טובולין-EGFP ביטוי וקטור), יחד עם 5 משפר μL מגיב (כנדרש לכל יצרן של הנחיות), 0.5 μg pMD2. G, ו 1 μg psPAX2 ו 100 μL של מופחת סרום בינוני (צינור #2).
    9. לשלב את התוכן של צעד 1.1.7 ו1.1.8 צעד על ידי שפופרת ליטוף בזהירות #2 לתוך צינור ה#1 ו-דגירה עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: ניתן לשנות את התגובה בהתאם לצורך העברה של תאים בבארות נוספות.
    10. פיפטה התגובה הטרנספופית לתוך הטוב הרצוי המכיל תאים 293T 2 מ ל של בינוני ולהחזיר את הצלחת לתוך החממה לחות ב 37 ° c עם 5% CO2.
      הערה: כדי ליצור תאים המבטאים הן RFP-H2B ו-α-טובולין-EGFP, ליצור וירוס נפרד עבור כל ביטוי לבנות (שלבים 1.1.7-1.1.9).
    11. יום 3: מנושף ומחליף את המדיום עם 2 מ ל של Dמאמ טרי שיושלם עם 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין. להחזיר את הצלחת לתוך החממה לחות ב 37 ° c עם 5% CO2.
  2. יום 4: לאסוף את המדיום המכיל חלקיקי וירוס ביטא, להיות זהירים לא לשבש או להסיר תאים 293T. סנן את המדיום המכיל חלקיקי וירוס על-ידי העברתו דרך מסנן μM 0.45 מוצמד למזרק של 5 מ"ל. וירוס הורדה לאחסון לטווח קצר ב 4 ° c, או אחסון לטווח ארוך ב-80 ° c.
    הערה: חלקיקים ויראליים המתקבלים באופן זה יהיו נוכחים בטווח של ~ 1 x 107 כדי 1 x 108 התמרה יחידות/mL. כמו התאים המייצרים ויראלי תאים להיות נגועים הן מתרבות באותו בינוני, ריכוז נגיפי להחליף את המדיום הוא לא נדרש חלקיקים ויראלי מסוננים ניתן להשתמש ישירות כדי להדביק תאים.
  3. הזרע 2 x 105 htert-rpe-1 תאים לכל טוב של מאכל 6-טוב לקראת הזיהום ויראלי. התאים התרבותיים ב 2 מ ל של DMEM שיושלם עם 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין ולתחזק בחממה לחות ב 37 ° c עם 5% CO2.
  4. יום 5: הוספת הקסאדימראן ברומיד (לדוגמה, polybrene) אל hTERT-RPE-1 תאים לריכוז הסופי של 8 μg/mL. להדביק תאים עם תערובת של 500 μL של וירוס מדולל ב 500 μL של תרבות התא בינונית.
    הערה: מניות הקסאדיהמרין מוכנות לפתרון מלאי סטרילי במים מזוקקים סטריליים, ולאחר מכן מסוננים באמצעות פילטר 0.45 יקרומטר.
  5. יום 6: באמצעות משקה זכוכית חד פעמית פסטר, מרוב המדיום מבארות המכילות את התאים הנגועים בווירוס. החלף את מדיום תרבות התא עם 2 מ ל של DMEM המכיל 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, וריכוזים המתאים של אנטיביוטיקה כדי לבחור עבור שילוב וביטוי פלסמיד.
    הערה: הביטוי α-טובולין-EGFP משמש בניסויים המתוארים נושאת גן ההתנגדות הpuromycin וביטוי RFP-H2B באמצעות פלסמיד נושאת גן התנגדות בלאסיניפין. לכן, 10 μg/mL של puromycin ו 2 μg/mL של בלטות משמשים עבור הבחירה של α-טובולין-EGFP, RFP-H2B ביטוי hTERT RFP-1 תאים. ריכוזי אנטיביוטיקה המשמשים לבחירה עשויות להיות שונות עבור קווי תאים שונים המשמשים.
  6. לשמור על תאים תחת בחירה אנטיביוטי עבור 5-7 ימים, החלפת המדיום כל 3 ימים עם בינוני טרי המכיל ריאגנטים בחירה מתאים.
    הערה: יש לשמור על התאים במפגש המשנה במהלך הבחירה ויש להרחיב אותם לפי הצורך, כפי שמתואר בשלבים 1.1.1 to 1.1.4.
  7. השתמש בדימות immunofluorescence כדי לאשר את הביטוי של מבנים מתויגים.
    הערה: אם רצונך בכך, ניתן לגזור שיבוטים של תא בודד כדי לקבל רמות ביטוי אחיד בתוך אוכלוסיית התא. לאחר שיבוטים יציבים מאושרות, התאים יכולים להישמר תחת תנאי התרבות הסטנדרטיים בהעדר בחירה אנטיביוטי.

2. הכנת תאים לדימות תאים חיים בעקבות mitotic ציר רטבאליות

הערה: השתמש בטכניקות אספטי ולבצע את השלבים בארון בטיחות BSL2.

  1. באמצעות מכשיר זכוכית סטרילי חד פעמי, מתכלה את המדיום מלוחית התרבות המכילה את קו התא הנושא את בניית הביטויים (משלב 1.7). שוטפים בקצרה את התאים עם 10 מ ל של הערוץ הסטרילי. , מערבולת כדי לפזר את הערוץ התחתון. ולאחר מכן לבשל את הערוץ החדש
  2. הוסף 2 מ ל של 0.05% טריפסין לצלחת 10 ס מ. מודדת את הצלחת ב 37 ° c עבור 2-5 דקות או עד תאים מנותקים ממשטח הצלחת.
  3. הוסיפו 8 מ ל של בינוני טרי לצלחת המכילה טריפסין. השהה את התאים מחדש על ידי ליטוף בעדינות והעבר את ההשעיה לצינורית חרועה בעלת 15 מ"ל. מניחים את צינור חרוט בצנטריפוגה מאוזנת ספין ב 161 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לנקז בעדינות את התאים.
  4. שימו לב בזהירות על הסופרנטנט והשעיה מחדש ב-10 מ ל של PBS על ידי ליטוף בעדינות עם פיפטה בגוון של 10 מ ל. מניחים את צינור חרוט בצנטריפוגה מאוזנת ספין ב 161 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לנקז בעדינות את התאים.
  5. שימו לב בזהירות על הסופרנטאנט והשעיה מחדש ב-10 מ ל של המדיום הטרי על ידי ליטוף בעדינות עם פיפטה בגודל 10 מ ל.
  6. ספירת תאים, לאחר מכן לחשב את מספר התא באמצעות hemacytometer ולדלל לריכוז של 1-2 x 105 תאים/mL במדיום תרבות התא. Seed 500 μL של התא הבולם כל טוב של לוחית סטרילי 12-היטב הדמיה התמונה. מניחים את הצלחת בחממה תרבות התא ולאפשר לתאים לדבוק משטח הצלחת.
    הערה: הדמיה של תאים בשידור חי מחייבת הדבקה של תאים כך שיישארו משויכים למישור ההדמיה במהלך רכישת תמונה. משך הזמן הדרוש עבור תאים לדבוק בציפוי הבאה יכול להיות שונה מקו תא אחד למשנהו וצריך להיות ממוטב עבור קו התא תחת לימוד.
  7. עד 30 דקות לפני התחלת הדמיה זמן לפקיעה, להוסיף ריכוז רלוונטי של תרופה mitotic לאחת או יותר של הבארות הנזרע עם תאים. כדי להסביר את ההשפעה הפוטנציאלית של הממס האורגני על התנהגות תאית, להוסיף נפח שווה של דילול של מעכב את התאים כפקדים. לדוגמה, ודא כי התוספת של 100 ננומטר של המעכב הספציפי של mitotic קינאז אורורה A (למשל, דליארטיב) הוא וקרב עם נפח שווה של DMSO, הדילול עבור הסם הזה, בשליטה היטב של תאים.
    הערה: ניתוח השוואתי של שינויים דינאמיים בהתקדמות mitotic דורשים בארות של תאים להיות מוכנים בהעדר רטבאליות כדי לאפשר הדמיה של מיטוסים נורמליים במקביל לתנאים ניסיוניים.

3. מיקרוסקופ להגדיר לפקיעה זמן הדמיה של RFP-H2B, α-טובולין-GFP לבטא תאים (איור 1, איור 2)

  1. מקום צלחת תרבות התא המכיל rfp-H2B, α-טובולין-gfp המבטא htert rfp-1 תאים להיות מצולם לתוך שלב מתאים להוסיף על מיקרוסקופ אפידלנטית הפוכה המצויד עם מצלמה ברזולוציה גבוהה (גודל פיקסל של 0.67 יקרומטר ב 20x), מ חדר הסביבה מחומם עד 37 ° c, ומערכת משלוח עבור מחולל לחות 5% CO2.
    הערה: תאי הסביבה הסגורים או מוסיף טמפרטורה מבוקרת הבמה עשוי להיות מתאים סיפק מחולל שיתוף 5% CO2 ניתן להעביר ויציבה בקרת טמפרטורה שהתקבלו.
  2. השתמש במטרה האוויר 20x עם מפתח מספרי של 0.5 ומצויד בחדות גבוהה לעומת קרינה וניגודיות פאזה או הדמיה ברייטפילד. הצגת תאים עם הניגודיות פאזה או ברייטפילד וכוונן את הקורס ואת המיקוד העדין על המיקרוסקופ כדי להביא תאים לפוקוס.
  3. לזהות ולהגדיר את זמני החשיפה האופטימלי עבור ברייטפילד, GFP, ו RFP רכישת תמונה על ידי בחירת קוביית מסנן בהתאמה עם עירור המתאים ופליטה עבור fluorophores כי יהיה לדימות. לחילופין, לחץ על לחצן החשיפה האוטומטית כדי להזין זמן חשיפה שנקבע מראש. אם האות אינו אינטנסיבי במידה מספקת, בחר באפשרות פיקסלים לאפשר זמני חשיפה קצרים יותר על-ידי לחיצה על הכרטיסייה binning ובחירה באפשרות 2 x 2 פיקסלים מהתפריט הנפתח.
    הערה: הפוטורעילות יכול לפגוע mitotic התקדמות והכדאיות של התא. כישלון של תאים mitotic באוכלוסיות בקרה כדי להשלים mitoses נורמלי עשוי להיות אינדיקציה כי פעמים חשיפה ו/או משך הדמיה צריך להיות אופטימיזציה נוספת.
  4. השתמש בתוכנת רכישה וניתוח המאפשרת ריבוי קואורדינטות, הדמיה מרובת-היטב לרכישה בו ולהגדרת הפרמטרים עבור רכישת התמונה.
    1. בחרו וכיילו את שלב המיקרוסקופ לצלחת הרב, בהתאם להוראות היצרן. השתמש בתוכנה לרכישת תמונות כדי להדגיש או לבחור בצורה אחרת את הבארות כי יהיה לצלם על ידי לחיצה על הבארות הרלוונטיות בדיאגרמה של תבנית הלוח הנמצא בשימוש.
    2. בלוח הבקרה של נקודות הסימון (איור 2), הגדר את נקודות הציון בתוך כל באר שיוצבע על-ידי לחיצה על הכרטיסיה מיקום נקודה ובחירת מיקום קואורדינטות מוגדר מראש או אקראי מ תפריט הנפתח. בחר בכרטיסיה אזור עבודה ובחר באפשרות מוגבלת מהתפריט הנפתח כדי להגביל את אזור בחירת הקואורדינטות כדי לשלול את גבולות הבאר. לחץ על לשוניות הספירה וההפצה כדי לבחור את המספר וההתפלגות של נקודות שיילכדו בו, בהתאמה.
      הערה: מספר נקודות הציון שניתן להגבאם בתוך התוספת 5 דקות של נקודת הזמן הקבועה מוגבלת על-ידי מספר הבארות לדימות, כמו גם את זמן החשיפה עבור כל ערוץ. בדרך כלל, 5-8 קואורדינטות לכל טוב הם מספיק כדי להתבונן לפחות 50 תאים בכל התקדמות תנאי דרך מיטוזה בתוך 4 h.
    3. בחר והקלט את מרווח הזמן והמשך לאיסוף תמונות על-ידי לחיצה על והזנת הערכים בלוח הבקרה של Timesequence .
      הערה: רכישת תמונות כל 1 עד 5 דקות מתאימה לנטר את הדינמיקה של התקדמות mitotic. משך הדימות הכולל אמור לשקף את נקודת הקצה הרצויה ואת קצב ההפצה של קו התא. לדוגמה, 4 שעות מספיק כדי לראות תאים רבים התקדמות דרך mitosis, 16 שעות מספיק כדי לראות את רוב RPE-1 תאים בהתקדמות האוכלוסייה אסינכרוני דרך mitosis.

4. זמן התמונה ניתוח לטעות כדי לקבוע את העיתוי מטאמפאזה ואת הגורל mitotic cell בעקבות mitotic ציר רטבאליות

הערה: בצע את ניתוח התמונה באמצעות תוכנת רכישת תמונה (טבלת חומרים), imagej, או תוכנת ניתוח תמונה דומה.

  1. המחש RFP-H2B שכותרתו כרומטין על ידי בחירת תמונות שנתפסו עם קוביית מסנן RFP במקום. זיהוי תא הזנת מיטוזיס כפי שמצוין על-ידי דחיסת כרומטין ראשונית (איור 2C, ראש חץ כחול) ומעטפה גרעינית להישבר (כאשר α-טובולין-egfp אינו נכלל עוד על ידי הגבול הגרעיני).
  2. לקבוע את העיתוי mitotic של יישור מטא-פאזה והתפתחות בתאים בודדים: מעקב אחר התא באמצעות נקודות זמן רצופות בסרט הנרכש כדי לקבוע את מספר נקודות הזמן/דקות מהזנת mitotic עד RFP-H2B-כרומטין מתויג משלים את היישור בתא המשווה במהלך מטא-פאזה (איור 2ג, ראש חץ צהוב).
  3. כדי לפקח על mitotic עיתוי, mitotic אמינות וגורל התאים, המשך לעקוב אחר התא באמצעות נקודות זמן רצופות כדי לזהות את קואורדינטת הזמן שבה הפרדה בין כרומוזום אנבית ברורה (איור 2ג, ראש חץ לבן) ו/או שם התרחש הרפורמציה של כרומטין ומעטפת גרעינית (כפי שמצוין על ידי טובולין הדרה מהגרעין).
    הערה: רטבאליות בעצרת ציר או התקדמות mitotic יכול להיות מוערך כפונקציה של הזמן הנדרש כדי להשיג ציר mitotic דו-קוטבית ולהשיג יישור כרומוזום מלא, או כדי להשלים את ההפרדה של כרומוזום אנאפיום.
  4. המחש RFP-H2B לזהות תאים בכל אוכלוסייה המוצגים פגמים mitotic כולל כרומוזומים בפיגור וגשרים כרומטין במהלך הפרדה של כרומוזום אנאפא.
    הערה: mitotic בסכנה עלולה גם לגרום לתאים בעלי מיקרו או בתאי מיקרורוקליום וניתן לדמיין בתאים שלאחר mitotic יציאה, כמו באיור 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הערכת ההתקדמות הmitotic בנוכחות ציר רטבאליות
הוויסות של קוטב הציר התמקדות הוא צעד חיוני במערך הציר הדו המתאים. הפרעה בתהליך זה באמצעות מרוקן חלבונים, עיכוב התרופה, או שינויים ב-centrosome מבנה הציר מושחתים ועיכוב או לעצור mitoticהתקדמות 10,11,12,13. עם זאת, כמה רטבאליות רק עיכוב היווצרות הצירים עם תאים בסופו של דבר ממשיך מיטוזיס כדי להשלים את כרומוזום אנאפיום ההפרדה14. בהיעדר גישות לסנכרון תאים, שעלולות להשפיע בעקיפין על mitotic תהליכים1,2, תאים מתקדמים דרך מיטוזיס באופן אסינכרוני (איור 2ג). באמצעות rfp-H2B כדי לזהות כרומטין, mitotic תאים עם כרומטין קומפקטי יכול להיות מבוים כמו להיות בprometaphase (אלה לפני יישור מתכת להשלים: איור 2ג, ראשי חץ כחול), מטא-שלב (יישור כרומוזום מלא: איור 2 C, ראשי חץ צהובים) ואנאפא (כרומוזומים הנמצאים בצורת הפרדה לקטבים של צירים: איור 2C, ראשי חץ לבנים). לכידת 5-8 קואורדינטות מעל 4 שעות מספיק כדי לעקוב אחר ההתקדמות של לפחות 50 תאים דרך מיטוזה במצב נתון. לחקור את הדינמיקה של מכלול הצירים בעקבות שינויים במספר הסנטרואני ו/או בעיכוב של אורורה א-קינאז, מווסת חשוב של ציר צירים המתמקד14,15,16, 17, השתמשנו התמונה החיה לשגות בזמן הדמיה של תאים אנושיים עם 2 סנטרוזומים, או אלה המכילים מבני סופר מונה. התאים היו מתורבתים בנוכחות או העדר מעכב אורורה א קינאז לפני תחילת ההדמיה. תאים עם 2 סנטרוזומים לחוות את ההפרעה בהתקדמות mitotic כאשר מטופלים עם אורורה מעכב קינאז, אבל הם בסופו של דבר מסוגלים להשיג יישור כרומוזום מטסוף (איור 2C, ראש חץ צהוב). לעומת זאת, תאים עם > 2 סנטרוזומים רגישים להפליא לאורורה עיכוב והתצוגה עלייה בתאי prometaphase והעדר תאים מטאמפאזה, המציינים עיכוב בהרכבת צירים והתקדמות mitotic.

איור 3 ממחיש כי כגון גישות הדמיה זמן מספיק כדי לפקח על ההרכבה ציר הצירים ואת mitotic נאמנות. על-ידי המחשה α-טובולין-egfp, זה נצפה כי תאים החווים שיבוש הצירים (המוצג כאן בשל השכפול overroa) עוברים שינויים דינמיים כמו קוטב ציר התמקדות מושגת וציר mitotic דו-קוטבית נוצרת כהכנה ל . מחלקת תאים במקביל עם הרכבה ציר, התנועה כרומוזום יכול להיות מדמיין עם RFP-H2B כדי להעריך את היישור כרומוזום ונאמנות ההפרדה. Mitotic תאים החווים מרובת קוטביות הציר הארעי רגישים לשגיאות קבצים מצורפים הנובעים כרומוזומים בפיגור במהלך אנאפה וטופס micronuclei בשלב הבא G1 של מחזור התא. פגמים כאלה ברור עם גישות אלה הדמיה תא חי.

שינויים בהתקדמות דינמית של העיתוי מיטוזה אלטר mitotic וההשפעה mitotic הגורל התא
בעקבות התמוטטות המעטפה הגרעינית, היווצרות ציר ותנועה כרומוזום ניתן לעקוב אחר בשלבים של מיטוזה כדי להעריך mitotic התקדמות, משך, ואת גורלם של תאים ההתקדמות לתוך אנאפיום. Centrosome הגברה, תכונה נפוצה בסוגים רבים של סרטן, מאופיין על ידי נוכחות של מסנטזומים נוספים ו ציר מרובה קוטבי היווצרות18,19,20. כמו מחלקות קוטביות מרובת התוצאה ב aneuploid מאוד, סביר להניח בתאי הילדה, תאים סרטניים באופן פעיל אשכול סנטרוזומים נוספים כדי ליצור ציר דו-קוטבית ולעבור חלוקה דו-קוטבית5,20,21, 22,23,24. שימוש בגישות הדמיה של תאים חיים, התוצאות הנציג שלנו מראים כי תאים עם מרחב מסוים רגיל מסוגלים להמשיך מתוך התמוטטות מעטפת גרעינית דרך יישור מטא-שלב ו אנאפה התפרצות להשיג חלוקה דו-קוטבית 30 דקות ( איור 4 A, D, E). בנוכחות של מסנטזומים נוספים, כמעט 50% מהתאים מסוגלים להתגבר על ציר מרובה הmitotic הארעי וליצור ציר דו-קוטבי וחלוקת תאים מלאה (איור 4ג, ד). התאים הנותרים אינם מסוגלים להשיג ציר דו קוטבי וכתוצאה מכך יציאה באמצעות חלוקה מרובת קטבים (איור 4B, D). לא משנה אם הקוטביות הציר מושגת, תאים עם התצוגה המרכזית הנוספת מוגברת משך משמעותי של מיטוזיס לעומת תאים עם 2 סנטרוזומים, המציין כי הדינמיקה של התקדמות mitotic עשוי להשתנות גם כאשר שינויים ב mitotic תוצאה לא ניכרת (איור 4E).

Figure 1
איור 1: בחירת פרמטרי מיקרוסקופ ומצלמה. (א) ייצוג החלון לבחירת המטרה הרצויה וקוביית המסננים המתאימה באמצעות תוכנה לרכישת תמונות. מוצג הוא הבחירה של מטרת ההגדלה של 20x וקוביית המסנן של ברייטפילד. (ב) תאים בצלחת לדוגמה נמצאים והביא לפוקוס באמצעות ברייטפילד או ניגודיות הפאזה מיקרוסקופ. (ג) ייצוג החלון כדי לקבוע פרמטרים לחשיפה עבור כל לכידת תמונה. ביננינג פיקסל ניתן להשתמש, במידת הצורך, כדי להשיג להפחית את זמן החשיפה לכל לכידה ולמזער את הנזק צילום לתאים. סרגל קנה מידה הוא 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: לכידת תמונה וניתוח של מיקרוסקופ זמן לפקיעה. (A ו- B) ייצוג של החלון המציין כיצד פרמטרים של רכישת תמונות מוגדרים באמצעות רכיבי hca משימות של רכישת תמונות בתוכנה. תוכנה זו מאפשרת ריבוי קואורדינטות, הדמיה מרובת היטב לאורך זמן. ניתן לשנות כל משימה כדי לציין בארות וקואורדינטות להילכד. (ג) מסגרות בפעם אחת מארבעה תנאים של ניסוי אחד. RFP-H2B משמש כדי לעקוב אחר כרומטין. דוחס כרומטין ומיצוב משמשים כדי לזהות שלבים שונים של mitosis: Prometaphase (דחיסה בהעדר יישור כרומוזום, ראש חץ כחול), מטא-פאזה (יישור כרומוזום מלא בתא המשווה, ראש חץ צהוב), ו אנאפיום (בעקבות הפרדה של כרומוזום סינכרוני, ראש חץ לבן). סרגל בקנה מידה הוא 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הדמיה של הזמן מעידה על פגמים בmitotic הנאמנות. תאים המכילים מסנטזומים נוספים בצורת צירים מרובים ולעתים קרובות מצרר אותם לתוך ציר דו-קוטבי לפני השלמת חלוקת התא. כאן, תא נכנס מיטוזיס עם שבעה עמודי ציר שונים (כוכביות לבנות) אשר, לאורך זמן, מקובצים לשני קטבים עיקריים ציר. בשלב זה, כרומוזומים מסוגלים להתיישר לאורך המשווה ציר, ואת התא ממשיך אנאפיום. הקוטביות הארעית התירה החזקה של mal בכרומוזום יחיד. שגיאה לא פתורה זו גורמת לכרומוזום בפיגור במהלך אנאפה אשר הופך להיות משולב בתוך תא אחד של הבת (המסומן באמצעות חץ). כרומטין הוא דמיינו עם RFP-Histone 2B ו microtubules הם דמיינו עם α-טובולין-EGFP. חותמות זמן בכל פאנל לציין דקות ביחס התמוטטות המעטפה הגרעינית לכאורה כפי שנשפט על ידי זיהוי של טובולין בתוך הגבול הגרעיני. סרגל בקנה מידה הוא 5 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: שינויים ההתקדמות הדינמית של העיתוי מיטוזיס mitotic וההשפעה mitotic הגורל התא. RFP-H2B, המוצג באדום, משמש למעקב אחר תנועת כרומטין ו-α-טובולין-GFP, המוצג בירוק, משמש לניטור מספר מרחב העמוד/ציר צירים וארגון. אובדן של gfp-טובולין הדרה מן הגרעין, במקביל עם דחיסה כרומטין מוקדם הוא אינדיקציה כי המעטפה הגרעינית יש התפרקה (neb) לקראת חלוקת התא mitotic. הוצאה גרעינית של GFP-טובולין ניכרת על היציאה mitotic והרפורמציה של המעטפה הגרעינית. (א) תא עם שני מרחבי טפסים ציר דו קוטבית ומתקדם באמצעות אנאפא לטופס שני תאים ביתי. (B ו- C) תאים עם מסנטזומים נוספים נכנסים מיטוזיס ליצירת ציר קוטבי מרובה. (ב) חלק מהתאים האלה עם השהיה מסנטרוזומים נוספים ב מיטוזה מבלי להשיג ציר דו קוטבית והתקדמות להשלמת אנאפפולאר מרובה. (ג) תאים אחרים עם סנטרוזומים נוספים מוצג עיכוב חולף ב mitotic התקדמות בעוד הם אשכול סנטרוזומים נוספים כדי לאפשר אנאפאנבית דו קוטבית. (ד) תאים עם סנטרוזומים נוספים מסוגלים לעבור חלוקה דו-קוטבית כ 50% מהזמן, ואילו התאים הנותרים עם הסנטזומים הנוספים עוברים חלוקה מרובת-קוטביות. (E) תאים עם סנטרוזומים נוספים הגדילו את התזמון mitotic ללא קשר לגורל הmitotic בסופו של דבר (דו קוטבית או אנאפפולאני מרובה). סרגל בקנה מידה הוא 5 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הרזולוציה הטמפורלית המסופקת על ידי הדמיה בזמן מאפשר להדמיה והערכה של אירועים סלולריים רציפים בתוך תאים בודדים. גישות העושות שימוש בסנכרון הסלולר ולאחריה האיסוף והקיבעון של תאים בנקודות זמן רציפות מוגבלות בהשוואות שבוצעו בסופו של דבר בין אוכלוסיות של תאים. בהקשרים שבהם התגובה התאית רטבאליות עשוי להיות לא אחיד, או כאשר התהליך להיות מדמיין הוא דינמי, לחיות הדמיה של זמן התמונה הוא מצויד טוב יותר לעקוב ולנתח הן את הדינמיקה של תאים בודדים, כמו גם את הטרוגניות בתוך אוכלוסיה תאית. בדרך זו, הדמיה זמן לפקיעה שימושי במיוחד בניטור התקדמות התא דרך שלבים דינמיים של מיטוזה והערכה כיצד רטבאליות התקדמות זו בסופו של דבר להשפיע על נאמנות של חלוקת התא mitotic ואת הגורל התאים הבאים.

למרות שקיימים מספר יתרונות לדימות תאים חיים, משויכים אתגרים משמעותיים שיש להתייחס אליהם במידת האפשר. אתגר אחד הוא לשמור על תנאי הסביבה המתאימים כדי להבטיח הכדאיות התאים והתפשטות במהלך הדמיה. כדי להשיג זאת, הגדרת ההדמיה חייב לכלול תא סביבתי המסדיר הן טמפרטורה ו-CO 2. לחילופין, תאים עשויים להיות בתמונה לטווח קצר עם התקנת טמפרטורה בלבד אם נעשה כך בחדר סגור. בשני המקרים, שימוש בטבלת אנטי רטט ו/או גישות מבוססות-חומרה להפחתת תנודות המיקוד בציר הזמן (לדוגמה, המיקוד המושלם של ניקון) צריך להיות מועסק כדי לשמור על מוקד הצלחת לאורך כל הניסוי. הדאגה השנייה משמעותית עם הדמיה תא חי הוא הפוטנציאל פוטונזק ופוטוהלהלבנת. הלבנה היא דאגה שבה fluorophore להיות הדמיה בהדרגה פוחתת בעוצמת הזריחה כמו הדמיה מתקדמת. עם זאת, החשיפה בעוצמה גבוהה עירור אור כי התוצאה הלבנה היא גם רעילים לתאים וטיפול חייב להיות בכדי למזער את חשיפת התאים על ידי ירידה זמני חשיפה, התמונה מרווחי זמן הרכישה, ואת המשך הכולל של רצף ההדמיה 25. ההשלכות של לא אופטימיזציה של תנאי הדמיה כדי למזער את הרעילות יכול לכלול את הדור של נזק DNA ושינויים סלולריים אחרים שיכולים להפוך פרשנות הפשרה והבנה של הניסוי. יש להפוך את הכדאיות התאית לדאגה עם הדמיה ארוכת טווח, מאמץ יש לעשות כדי לנצל את הפיקסל binning (כדי לאפשר חשיפות קצרות) ולהגדיל את המשך בין לכידות התמונה הבאה. דאגה נוספת היא כי תג פלורסנט עשוי לשנות את התנהגותו של החלבון שאליו הוא מותך, או ששילוב של הביטוי הנגיפי לבנות לתוך הגנום עלול להשפיע על התנהגות תאית. כדי להסביר את האפשרות כי תוספת של תג פלורסנט עשוי להשפיע על תפקוד החלבון, הערכה של פונקציית החלבון בעקבות הוספת תג פלורסנט מסוף N או C והשוואה עם פונקציית חלבון לא מתויג הוא הכרחי. כדי לקבוע אם תופעות לוואי על התנהגות התא מתעוררות בשל הנטייה של הוקוס גנומית שבה המבנה הנגיפי כבר משולב, מספר שיבוטים תא יחיד צריך להיות נגזר, לעומת תאים שחסרים חלבון מתויג, נבדק כדי לפקח כי כושר סלולרי והתקדמות mitotic לא מודאג. לחילופין, ביטול השפעות היעד של שילוב אקראי של בניית הביטוי נגיפי ניתן לטפל באמצעות שילוב ממוקד של חלבון היתוך לתוך לוקוס אנדוגניים, או אזורים ידועים אחרים של הגנום, באמצעות הגישות CRISPR מבוססי.

גישות לזהות ולאפיין הרגולטורים העיקריים של התקדמות mitotic הסתמך בכבדות על הדמיה תא קבוע. Mitotic הרגולטורים שזוהו בדרך זו שנוצלו לאחר מכן ב therapeutics המיקוד במהירות תאים סרטנייםמתרבים 7,8,9. עם זאת, תרופות antimitotic לא תמיד לבצע אחיד בסוגי סרטן שונים, במקרים רבים תובנה לתוך פנוטיפים mitotic הקודמים או מוצלחת או מוצלח גישות כימותרפיות לא ברור. לחיות בזמן התמונה לשגות הדמיה כדי לעקוב אחר תאים mitotic בנוכחות והעדר של perturbing התרופות הציר יש את הפוטנציאל לספק את התובנה הנחוצה כדי לזהות את המודולרות הסבירות ביותר לגרום מיטוסים קטסטרופלי הכדאיות הפרוצים של תאים סרטניים עם השפעה מינימלית על תאים נורמליים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

DLM נתמך על-ידי NSF GRFP. ALM נתמך על ידי מימון פרס משפחת סמית ' למצוינות במחקר ביו-רפואי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin Gibo-Life sciences 25-510 A serine protease used to release adherent cells from culture dishes
15ml centrifuge tubes Olympus Plastics 28-101
20x CFI Plan Fluor objective  Nikon For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence
293T Cells ATCC CRL-3216 For use in retroviral transfection; used in step 1.1
a-tubulin-EGFP  Addgene various numbers Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors
Alisertib Selleckchem S1133 Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM.
Blasticidin Invitrogen A11139-03 Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells
C02 Airgas For use in cell culture and live cell imaging
Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) Chroma 49005 Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP
Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) Chroma 49002 Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin
disposable glass Pastuer pipets, sterilized  Fisher Scientific 13-678-6A For use in aspirating cells 
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibo-Life sciences 11965-084 Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibo-Life sciences 10438-026 Cell culture medium supplement
Lipofectamine 3000 and p3000 Invitrogen L3000-015 Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4
Multi well Tissue Culture dishes Corning various for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging
Nikon Ti-E microscope Nikon Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging
NIS Elements HC  Nikon Version 4.51 Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4
OPTI-MEM Gibo-Life sciences 31985-070 Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3
Penicillin/Streptomycin  Gibo-Life sciences 15140-122 antibiotic used in cell culture medium
phosphate bufferred saline (PBS) Caisson labs PBP06-10X1LT sterile saline solution for use with cell culture
pMD2.G Addgene 12259 Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4
Polybrene Sigma-Aldrich H9268 Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10
psPAX Addgene 12260 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4
Puromycin Invitrogen ant-pr-1 Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells
RFP- Histone 2B (H2B) Addgene various numbers Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors
RNAi Max Invitrogen 13778-150 Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs
RPE-1 cells ATCC CRL-4000 Human retinal pigment epithelial cell line
Tissue culture dish 100x20mm Corning  353003 for use in culturing adherent cells
Zyla sCMOS camera  Nikon Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
  2. Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis. PLoS One. 11, e0157491 (2016).
  3. Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint. The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).
  4. Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells. Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).
  5. Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).
  6. Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
  7. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).
  8. van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).
  9. Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death and Diseases. 3, 411 (2012).
  10. Martin, M., Akhmanova, A. Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization. Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).
  11. Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).
  12. Vitre, B. D., Cleveland, D. W. Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy. Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).
  13. Godinho, S. A., Pellman, D. Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).
  14. Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes. Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).
  15. Conte, N., et al. TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer. Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).
  16. Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 125, 4391-4402 (1998).
  17. Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces. Molecular Cancer. 10, 131 (2011).
  18. Chan, J. Y. A clinical overview of centrosome amplification in human cancers. International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).
  19. Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death. Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).
  20. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
  21. Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4, e6564 (2009).
  22. Nigg, E. A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression? Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).
  23. Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).
  24. Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering. Science. 307, 127-129 (2005).
  25. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).

Tags

ביולוגיה סוגיה 151 מיטוזיס ציר כרומטין הדמיה פלואורסצנטית מיקרוסקופ זמן צניחה
הדמיה של תא חי כדי להעריך את הדינמיקה של תזמון מטאמפאזה ואת הגורל התאים בעקבות Mitotic צירים רטבאליות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mercadante, D. L., Crowley, E. A.,… More

Mercadante, D. L., Crowley, E. A., Manning, A. L. Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations. J. Vis. Exp. (151), e60255, doi:10.3791/60255 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter