Summary
ここでは、スピンドル形成と人工的進行のダイナミクスを評価するプロトコルを提示する。当社のタイムラプスイメージングの応用により、ユーザーは、人芽細胞の様々な段階で細胞を同定し、人芽細胞の欠陥を追跡および同定し、抗マイト薬への曝露時にスピンドルダイナミクスと人工細胞の運命を分析することができます。
Abstract
ライブセルタイムラプスイメージングは、固定細胞分析によって見落とされたり、誤解されたり、誤解されたりする細胞プロセスに関する洞察を提供する細胞生物学における重要なツールです。固定細胞イメージングと解析は堅牢で、細胞の定常状態を観察するのに十分ですが、細胞レベルでイベントの時間的順序を定義する際に制限され、動的プロセスの一時的な性質を評価する能力が不十分です。水和性の進行。対照的に、ライブセルイメージングは、時間の経過とともに単一細胞レベルで細胞プロセスを観察するために使用できる雄弁なツールであり、固定細胞イメージングでは不十分に表現されるプロセスのダイナミクスをキャプチャする能力を有する。ここでは、クロマチンと微小管の蛍光標識マーカーを運ぶ細胞を生成するアプローチと、メタフェイズ染色体の整列と有形出口を監視するライブ細胞イメージングアプローチでの使用について説明する。人工的な様々な段階での細胞の同定、ミトシス欠陥の同定と追跡、紡錘のダイナミクスの解析など、スピンドル形成と人力の進行のダイナミクスを評価するイメージングベースの技術を説明し、人芽細胞の運命は、人工阻害剤による治療に続く。
Introduction
固定細胞の画像ベースの分析は、一般的に様々な摂動に応じて細胞集団レベルの変化を評価するために使用されます。細胞同期と組み合わせると、シリアルタイムポイントの収集とイメージングが続き、このようなアプローチを使用して、細胞配列のイベントを示唆することができます。それにもかかわらず、固定細胞イメージングは、時間的関係が集団に対して暗示され、個々の細胞のレベルで実証されないという限られたものである。このように、固定細胞イメージングと解析は、堅牢な型と定常状態の変化を観察するのに十分ですが、時間の経過に伴う一時的な変化や細胞の亜集団のみに影響を与える変化を検出する能力は不完全です。対照的に、ライブ細胞イメージングは、単一の細胞内の細胞および細胞集団内の細胞および細胞内のプロセスを、時間の経過とともに、それ自体が細胞行動に影響を与える可能性のある同期アプローチの助けを借りずに観察するために使用できる雄弁なツールです。1,2,3,4,5,6.
双極性人型のスピンドルの形成は、細胞分裂中の適切な染色体分離に不可欠であり、その結果、2つの遺伝的に同一の娘細胞が生じる。有人性スピンドル構造の欠陥は、有人性の進行を破壊し、染色体分離の忠実性を損なう可能性があり、壊滅的な細胞分裂と細胞生存率の低下をもたらす可能性があります。このため、スピンドル形成を変化させる有人毒は、癌細胞7、8、9の急速な増殖を制限する有望な治療法である。それにもかかわらず、有毒毒の添加後の紡錘構造の固定細胞分析は、スピンドル形成の動的過程を評価する能力に限られており、スピンドル構造の観察された変化が永続的であるか、またはあるかを示さないかもしれない代わりに一時的であり、成功した細胞分裂を可能にするために克服することができる。
このプロトコルでは、生細胞イメージングによるスピンドル摂動後のミトシスのダイナミクスを評価するアプローチについて述べた。RFPタグ付きヒストン2Bを発現するように設計されたhTERT不死化RPE-1細胞株を使用してクロマチンを可視化し、EGFPタグ付きαチューブリンと共に微小管、メタフェーズ染色体アライメントのタイミング、アナセ相発症、そして最終的には人体細胞の運命は、染色体の動き、圧縮、および核形態の視覚的手がかりを使用して評価される。
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Protocol
1. RFP-ヒストン2B(RFP-H2B)およびα-チューブリン-EGFP(浴槽-EGFP)を安定して発現するhTERT-RPE-1細胞の生成
注:すべてのステップは無菌技術に従い、バイオセーフティレベルII+(BSL2+)安全キャビネットで行われます。
- 脂質ベースのトランスフェクション送達システムのメーカーの指示に従って、適切なレンチウイルスプラスミドを有する293T細胞のトランスフェクションにより、目的の遺伝子(α-チューブリン-EGFPおよびRFP-H2B)を運ぶレトロウイルスを生成する。
- 1日目:使い捨てガラスパスツールピペットを使用して、サブコンフルエント293T細胞のプレートから細胞培地を吸引し、PBSの5 mLを加えることによってリン酸緩衝生理食生(PBS)で残留培地を洗い流します。プレート底部にPBSを分配するために旋回し、その後、無菌使い捨てガラスパスツールピペットでPBSを吸引します。
- 予め温めた0.05%トリプシンの2mLを37°Cに加温し、37°Cの加湿インキュベーターに2~5分間CO2を入れ、細胞培養皿表面から付着細胞を放出できるようにします。
- トリプシンを含むプレートに10%の胎児ウシ血清(FBS)と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加した新鮮なダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)の8 mLを追加します。
- 穏やかにピペッティングして細胞を再懸濁し、無菌の15 mL円錐形チューブに懸濁液を移します。円錐形のチューブをバランスのとれた遠心分離機に入れ、室温で5分間161 x gで回転させ、細胞を穏やかにペレットします。
- ペレット細胞から培地/トリプシン溶液を吸引し、10%のFBSと1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEMの10 mLで細胞を再中断する。ヘモサイトメーターを使用して、293T細胞懸濁液を数え、6ウェルプレートのウェルあたり2 x 106 293T細胞を数えます。
- ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)の総体積2mLの培養細胞は、10%のウシ血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充し、5%CO2で37°Cの加湿インキュベーターで維持する。
- 2日目:脂質系トランスフェクション送達試薬のピペット7μLと100μLの減らされた血清培地を1.5mLマイクロ遠心分離管に入れ、室温で5分間インキュベート(チューブ#1)。
- 別の1.5 mLマイクロ遠心分離管では、RFP-H2B発現ベクターのピペット1 μg(またはα-チューブリン-EGFP発現ベクターの1 μg)と、5 μLエンハンサー試薬(メーカーのガイドラインに応じて必要)、0.5 μg pMD2.G、および1μg psPAX2および100 μLの減少血清媒体(チューブ#2)。
- ステップ1.1.7とステップ1.1.8の内容物を慎重にチューブ#1にチューブ#2を配管し、室温で20分間インキュベートします。
注:反応は、追加のウェル内の細胞のトランスフェクションのために必要に応じてスケーリングすることができます。 - 2mLの培地に293T細胞を含む所望のウェルに対するトランスフェクション反応を滴下し、5%CO2で37°Cで加湿インキュベーターに皿を戻す。
注:RFP-H2Bとα-チューブリン-EGFPの両方を発現する細胞を生成するには、発現構築物ごとに別々のウイルスを生成する(ステップ1.1.7- 1.1.9)。 - 3日目:10%FBSと1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した新鮮なDMEMの2 mLで培地を吸引し、置き換えます。5%CO2で37 °Cで加湿インキュベーターに皿を戻します。
- 4日目:発現したウイルス粒子を含む培地を回収し、293T細胞を破壊または除去しないように注意する。5 mLシリンジに取り付けられた0.45 μMフィルターを通してウイルス粒子を含む培地をフィルタリングします。アリコウイルスは、4°Cでの短期保存、または-80°Cでの長期保存用です。
注:この方法で得られたウイルス粒子は、~1 x 10 7〜1x108トランスデュース単位/mLの範囲で存在する。感染するウイルス産生細胞と細胞はいずれも同じ培地で培養されているので、培地を置き換えるウイルス濃度は不要であり、濾過されたウイルス粒子を細胞に直接感染させるために使用することができる。 - 種子2 x 105 hTERT-RPE-1細胞は、ウイルス感染に備えて6ウェル皿の井戸当たり。DMEMの2mLの培養細胞を10%FBSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンで補充し、5%CO2で37°Cで加湿インキュベーターで維持する。
- 5日目:ヘキサジメトリン臭化物(例えば、ポリブレン)をhTERT-RPE-1細胞に8μg/mLの最終濃度に加える。500μLの細胞培養培地で希釈したウイルスの混合物で細胞に感染する。
注:ヘキサジメトリン臭化物ストック溶液は、無菌蒸留水で調製され、0.45 μmフィルターを通して濾過される。 - 6日目:使い捨てガラスパスツールピペットを使用して、ウイルス感染細胞を含むウェルから培地を吸引する。細胞培養培地を10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEMの2mL、プラスミドの統合および発現のために選択する抗生物質の適切な濃度に置き換える。
注:記載の実験で使用されるα-チューブリン-EGFP発現プラスミドは、ピューロマイシン耐性遺伝子を運び、RFP-H2B発現プラスミドはブラシシジン耐性遺伝子を運ぶ。従って、10 μg/mLのピューロマイシンと2μg/mLのブラスチシジンが、hTERT RPE-1細胞を発現するα-チューブリン-EGFP、RFP-H2Bの選択に用いられる。選択に使用される抗生物質の濃度は、使用される様々な細胞株について異なる場合がある。 - 5〜7日間抗生物質選択の下で細胞を維持し、適切な選択試薬を含む新鮮な培地で3日ごとに培地を置き換える。
注: セルは選択中にサブコンフルエンスで維持し、手順 1.1.1 から 1.1.4 に従って、必要に応じて展開する必要があります。 - タグ付き構成物の発現を確認するには、免疫蛍光イメージングを使用します。
注: 必要に応じて、単一細胞クローンを導出して、細胞集団内で均一な発現レベルを得ることができます。安定したクローンが確認されると、抗生物質の選択がない場合に標準的な培養条件下で細胞を維持することができる。
2. 人工スピンドル摂動後の生細胞イメージング用細胞の調製
注: 無菌技術を使用し、BSL2 安全キャビネットで手順を実行します。
- 無菌使い捨てガラスパスツールピペットを用いて、発現物組を運ぶ細胞株を含む培養板から培地を吸引する(ステップ1.7から)。無菌PBSの10 mLで細胞を簡単に洗浄します。プレート底部にPBSを分配するために旋回し、その後、無菌使い捨てガラスパスツールピペットでPBSを吸引します。
- 10cmプレートに0.05%トリプシンの2 mLを加えます。2~5分間、または細胞がプレート表面から切り離されるまで、37°Cでプレートをインキュベートします。
- トリプシンを含むプレートに8mLの新鮮な培地を加えます。穏やかにピペッティングして細胞を再懸濁し、無菌の15 mL円錐形チューブに懸濁液を移します。円錐形のチューブをバランスのとれた遠心分離機に入れ、室温で5分間161 x gで回転させ、細胞を穏やかにペレットします。
- 慎重に上清を吸引し、10 mLの血清ピペットで穏やかにピペッティングすることにより、PBSの10 mLで再中断します。円錐形のチューブをバランスのとれた遠心分離機に入れ、室温で5分間161 x gで回転させ、細胞を穏やかにペレットします。
- 慎重に上清を吸引し、10 mLの血清ピペットで穏やかにピペッティングすることにより、新鮮な媒体の10 mLで再中断します。
- 細胞をカウントし、次いで血球計を用いて細胞数を計算し、細胞培養培地中の1-2 x 105細胞/mLの濃度に希釈する。無菌12ウェルイメージング底板の各ウェルに細胞懸濁液の種子500μL。細胞培養インキュベーターにプレートを入れ、細胞がプレート表面に付着できるようにします。
注:ライブセルイメージングでは、画像集録中にイメージングプレーンに関連付けられたままにしておく必要があります。細胞が次のめっきに付着するのに必要な時間の持続時間は、ある細胞株から次の細胞株に異なる場合があり、研究対象の細胞株に最適化する必要があります。 - タイムラプスイメージングを始める前に最大30分、細胞を播種した1つ以上のウェルに有する有価有量の有価濃度を加える。有機溶媒が細胞行動に及ぼす潜在的な影響を考慮に入れるため、阻害剤の希釈剤の量を対照として細胞に加えます。例えば、糸くずキナーゼオーロラAの特異的阻害剤の100nMの添加が、同量のDMSOと平行していることを確認し、この薬剤の希釈剤は、細胞のコントロールウェル内にある。
注:水動性進行における動的変化の比較分析では、実験条件と並行して正常なツトースのイメージングを可能にするために、摂動がない場合に細胞の井戸を調製する必要があります。
3. RFP-H2B、α-チューブリン-GFP発現細胞のタイムラプスイメージング用に設置された顕微鏡(図1、図2)
- RFP-H2Bを含む細胞培養プレートを配置し、hTERT RPE-1細胞を発現するα-チューブリン-GFPを、高解像度カメラ(20xで0.67μmのピクセルサイズ)を搭載した反転上蛍光顕微鏡上に適切なステージインサートに画像化し、環境室は37°Cに予熱し、加湿された5%CO2のための配達システム。
注:密閉された環境室または温度制御段階の挿入物は、加湿5%CO2を提供し、得られる安定した温度制御を提供することができる場合に適していてもよい。 - 0.5の数値絞りを持つ20倍の空気目的を使用し、高コントラスト蛍光と位相コントラストまたはブライトフィールドイメージング用に装備されています。位相コントラストまたは明るいフィールドを持つ細胞を表示し、顕微鏡のコースと細かい焦点を調整して細胞に焦点を合わせます。
- 画像化される蛍光色素に対して適切な励起と発光を持つそれぞれのフィルタキューブを選択して、ブライトフィールド、GFP、RFP画像集録に最適な露光時間を特定して設定します。または、自動露出ボタンをクリックして、所定の露光時間を入力します。信号が十分に強くない場合は、[ピクセルビニング] を選択して、[ビン分割]タブをクリックし、ドロップダウン メニューから2 x 2 ピクセルのビニングを選択して、露出時間を短縮します。
注:光毒性は、有線の進行および細胞の生存率を損なう可能性がある。コントロール集団における配合細胞の障害は、通常のマイトスを完了するために、露光時間および/またはイメージング期間をさらに最適化する必要があることを示している可能性があります。 - マルチ座標、マルチウェルイメージングを同時に取得し、画像取得のパラメータを定義する集録および解析ソフトウェアを使用します。
- メーカーの指示に従って、顕微鏡ステージをマルチウェル皿に選択して校正します。画像取得ソフトウェアを使用して、使用されているプレート形式の図の関連する井戸をクリックして、画像化されるウェルを強調表示または選択します。
- [生成ポイント]コントロール パネル (図 2)の下で、[ポイント配置]タブをクリックし、[ポイント配置]タブをクリックし、定義済みまたはランダムな座標の配置を選択してイメージされる各ウェル内の座標を定義します。ドロップダウンメニュー。[作業領域]タブを選択し、[ドロップダウン] メニューから[制限]を選択して、ウェルの境界を除外する座標選択領域を制限します。[カウントと分布]タブをクリックして、それぞれウェルごとにキャプチャするポイントの数と分布を選択します。
注: 5 分のタイムポイントの増分内でウェルごとにイメージできる座標の数は、イメージするウェルの数と各チャンネルの露出時間によって制限されます。典型的には、ウェル当たり5〜8座標は、4時間以内に人芽細胞を介して進行する各条件で少なくとも50個の細胞を観察するのに十分である。 - TimeSequenceコントロール パネルで値をクリックして入力して画像を収集するには、時間間隔と期間を選択して入力します。
注:1~5分ごとに画像を取得することは、水動語の進行のダイナミクスを監視するのに適しています。イメージングの全体的な持続時間は、細胞株の所望のエンドポイントおよび増殖速度を反映する必要があります。例えば、4時間は多くの細胞が人芽細胞を通して進行するのを見るのに十分であり、16時間は、人芽細胞を介して非同期集団の進行におけるほとんどのRPE-1細胞を見るのに十分である。
4. 経位相タイミングと、ツチメスピンドル摂動後の水位細胞の運命を決定するタイムラプス画像解析
注:画像集録ソフトウェア(材料表)、ImageJ、または同等の画像解析ソフトウェアを使用して画像解析を実行します。
- RFPフィルタキューブで撮影した画像を選択して、RFP-H2Bラベルのクロマチンを可視化します。初期クロマチン圧縮(図2C、青い矢印)と核エンベロープ分解(α-tubulin-EGFPが核境界によって除外されなくなった場合)によって示される、人芽細胞に入る細胞を特定する。
- 個々の細胞におけるメタフェイズアライメントとアナセズ発症の点数タイミングを決定する:取得したムービーの連続したタイムポイントを通してセルを追跡し、RFP-H2B標識クロマチンまでの点数/分数を決定するメタフェーズ中のセル赤道での位置合わせを完了します(図 2C、黄色の矢印)。
- 有線のタイミング、有線忠実度、および細胞の運命を監視するには、連続したタイムポイントを通じて細胞を追跡し続け、アナフェイズ染色体の分離が明らかな時間座標を特定します(図2C、白い矢印)。クロマチンの非コンパクションと核封筒の改変(核からのチューブリン排除によって示される)が起こった場所。
注:スピンドルアセンブリまたはミトチック進行における摂動は、双極性点線スピンドルを得て完全な染色体アライメントを達成するか、またはアナフェーズ染色体分離を完了するために必要な時間の関数として評価することができる。 - RFP-H2Bを可視化し、アナフェイズ染色体分離中に遅れ染色体やクロマチン橋などのミトチック欠陥を示す各集団の細胞を同定する。
注:妥協された人工的な忠実度はまた、多核または微核化された娘細胞をもたらし、図3のように、細胞ポストの細胞で視覚化することができる。
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Representative Results
紡錘摂動の存在下での水疱性進行の評価
スピンドル極集の調節は、適切な双極スピンドル形成に不可欠なステップです。タンパク質枯渇、薬物阻害、またはセントロソーム数の変化を介したこのプロセスにおける破壊は、紡錘構造を破壊し、有人進行を遅延または停止させる10、11、12、13。それにもかかわらず、一部の摂動は、最終的にアナフェイズ染色体分離14を完了するために人体を介して進行する細胞とのスピンドル形成を一時的に遅らせるだけである。細胞同期アプローチが存在しない場合、その過程自体が間接的に有人プロセス1、2に影響を与える可能性があり、細胞は非同期的に有人化を経て進行する(図2C)。RFP-H2Bを使用してクロマチンを同定し、コンパクトなクロマチンを持つツメタセ細胞をプロメタフェイズ(完全なメタフェイズアライメント:図2C、青い矢印)、メタフェイズ(完全な染色体アライメント):プロメタフェイズ中のものとしてステージングすることができます。図 2C、黄色の矢印)およびアナフェイズ(スピンドル極に向かって分離されている染色体:図2C、白い矢印)。4時間にわたる5〜8座標の捕捉は、所定の条件での人芽細胞を介して少なくとも50細胞の進行に従うのに十分である。オーロラAキナーゼのセントロソーム数および/または阻害の変更に続くスピンドルアセンブリのダイナミクスを調べるために、スピンドルポールフォーカス14、15、16の重要なレギュレータ、 17,我々は、2セントロソーム、または超分子中心ソームを含むヒト細胞の生細胞タイムラプスイメージングを使用した。細胞は、画像化開始前にオーロラAキナーゼ阻害剤の有無において培養した。2セントロソームを持つ細胞は、オーロラAキナーゼ阻害剤で処理した場合、糸体進行の破壊を経験するが、最終的にはメタフェイズ染色体アライメントを達成することができる(図2C、黄色の矢印)。対照的に、>2セントロソームを持つ細胞はオーロラA阻害に絶妙に敏感であり、プロメタ相細胞の増加とメタセ相細胞の不在を示し、スピンドルアセンブリおよびミトソーム進行の遅延を示す。
図 3は、このようなタイムラプス イメージングアプローチが、スピンドル アセンブリとミトチック忠実度の両方を監視するのに十分であることを示しています。α-チューブリン-EGFPを可視化することにより、スピンドル破壊を経験する細胞(セントロソーム過剰重複による)は、スピンドル極の焦点が達成され、双極性ミトスティックスピンドルが形成されるにつれて動的変化を起こすことが観察された。細胞分割。スピンドルアセンブリと同時に、染色体の動きをRFP-H2Bで可視化し、染色体の位置合わせと分離忠実度を評価することができます。一過性スピンドル多極性を経験するミトチック細胞は、アナフェーズ中に染色体の遅れを引き起こし、その後のG1相で微小核を形成する付着エラーの影響を受けやすい。このような欠陥は、これらの生細胞イメージングアプローチで明らかである。
人芽細胞の動的進行の変化は、ツイトーのタイミングを変化させ、ツトティック細胞の運命に影響を与える
核のエンベロープの分解に続いて、紡錘の形成と染色体の動きを、人芽細胞の進行、持続時間、およびアナフェーズに進行する細胞の運命を評価するために、人芽細胞の段階を通して追跡することができる。セントロソーム増幅は、多くのタイプの癌に共通する特徴であり、余分なセントロソームおよび多極スピンドル形成18、19、20の存在によって特徴付けられる。多極分裂は、非常に無気力で生存不可能な娘細胞をもたらすので、癌細胞は積極的に双極性スピンドルを形成し、双極分裂5、20、21を受ける余分なセントロソームをクラスター化し、 22、23、24.生細胞イメージングアプローチを用いて、我々の代表的な結果は、正常なセントロソーム含有量を有する細胞が、30分以内に双極分裂を達成するために、メタフェイズアライメントおよびアナ相発症を通じて核エンベロープの分解から進行できることを示している(図 4A,D,E)。余分なセントロソームの存在下で、細胞のほぼ50%は、一過性の多極性人型ツムリティックスピンドルを克服し、双極スピンドルと完全な細胞分裂を形成することができる(図4C,D)。残りの細胞は双極スピンドルを達成することができず、その結果、多極分裂を通じて出口人芽細胞症が発生する(図4B,D)。スピンドル双極性が達成されるかどうかにかかわらず、余分なセントロソームを持つ細胞は、2セントロソームを持つ細胞と比較して有意に増加したツトーシスの持続時間を示し、微小進行のダイナミクスが変化した場合でも、微小細胞の進行のダイナミクスが変化する可能性があることを示す。水和性の結果は明らかではない(図4E)。
図1:顕微鏡とカメラパラメータの選択(A)画像取得ソフトウェアを使用して目的の目的と適切なフィルタキューブを選択するウィンドウの表現。20倍倍倍率目標とブライトフィールドフィルタキューブの選択を示します。(B)サンプルプレート内の細胞が見つかり、明視野または位相コントラスト顕微鏡を用いて焦点を合わせます。(C)各画像キャプチャの露出パラメータを設定するウィンドウの表現。必要に応じてピクセルビニングを使用して、キャプチャあたりの露出時間を短縮し、セルへの写真の損傷を最小限に抑えることができます。スケールバーは10 μmです。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:タイムラプス顕微鏡の画像キャプチャと分析(AおよびB)NISエレメントHCAジョブ画像取得ソフトウェアを用いて画像集録パラメータがどのように設定されるかを示すウィンドウの表現。このソフトウェアは、時間をかけてマルチ座標、マルチウェルイメージングを可能にします。各ジョブを変更して、キャプチャするウェルと座標を指定できます。(C)1回の実験の4つの条件から1つの時間枠。RFP-H2Bはクロマチンの追跡に使用されます。クロマチンの圧縮と位置決めは、人芽細胞の異なる段階を識別するために使用されます:プロメタフェイズ(染色体の整列がない場合の圧縮、青い矢印)、メタフェイズ(細胞赤道での完全な染色体の位置合わせ、黄色の矢印)、およびアナフェイズ(同期染色体分離の開始後、白い矢印)。スケールバーは10μmです。
図 3: タイムラプス イメージングは、ミトチック忠実度の欠陥を視覚化します。余分なセントロソームを含む細胞は多極性スピンドルを形成し、多くの場合、細胞分裂を完了する前に双極スピンドルにそれらをクラスター化します。ここでは、細胞は7つの異なるスピンドル極(白いアスタリスク)で有人化し、時間の経過とともに2つの主要なスピンドル極にクラスタ化されます。この時点で、染色体はスピンドル赤道に沿って整列することができ、細胞はアナフェイズに進みます。一過性多極性は、単一染色体の男性の付着を可能にした。この未解決の誤差は、アナフェーズ中に遅れた染色体を引き起こし、1つの娘細胞の微小核に組み込まれる(矢印で標識)。クロマチンはRFP-ヒストン2Bで可視化され、微小管はα-チューブリン-EGFPで可視化される。各パネルのタイムスタンプは、核境界内のチューブリンの検出によって判断された明らかな核封筒の内訳に関して分を示す。スケールバーは5 μmですこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:人芽細胞の動的進行の変化は、ツトチックタイミングを変化させ、ツトティック細胞の運命に影響を与える。赤色で示すRFP-H2Bは、クロマチンの動きを追跡するために使用され、緑色で示されるα-チューブリン-GFPは、セントロソーム/スピンドル極数および組織を監視するために使用されます。核からのGFP-チューブリン排除の喪失は、初期クロマチン圧縮と並行して、有分裂細胞分裂に備えて核エンベロープ(NEB)が分解されたことを示す。GFP-tubulinの核排除は、核封筒の水抜き出口と改革に明らかである。(A)2つのセントロソームを持つ細胞は、双極性スピンドルを形成し、アナフェーズを経て2つの娘細胞を形成する。(BおよびC)余分なセントロソームを持つ細胞は、多極性スピンドルを形成するために人芽細胞に入る。(B)双極性スピンドルを達成せずに人芽細胞に余分なセントロソームを持つ細胞の一部は、多極アナフェイズを完了するために進行する。(C)余分なセントロソームを持つ他の細胞は、二極アナフェイズを可能にするために余分なセントロソームをクラスター化しながら、二極性進行の一時的な遅延を示す。(D)余分なセントロソームを持つ細胞は、約50%の時間の双極分裂を受けることができ、余分なセントロソームを持つ残りの細胞は多極分裂を受ける。(E)余分なセントロソームを持つ細胞は、最終的なツオテスの運命(双極または多極アナフェイズ)に関係なく、ツトティックタイミングを増加させた。スケールバーは5 μmですこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
タイムラプスイメージングによって提供される時間分解能は単一細胞内の連続した細胞事象の視覚化および評価を可能にする。細胞同期を利用したアプローチは、連続した時点での細胞の収集と固定に続くアプローチは、最終的に細胞の集団間で比較が行われるために制限される。摂動に対する細胞応答が不均一であるか、または視覚化されるプロセスが動的である状況では、生細胞のタイムラプスイメージングは、単一細胞のダイナミクスと不均一性の両方を追って分析する能力が優れています。細胞集団内で。このように、タイムラプスイメージングは、有人化の動的段階を通じて細胞の進行を監視し、この進行に対する摂動が最終的に有分裂細胞分裂およびその後の細胞運命の忠実性にどのように影響するかを評価するのに特に有用である。
生細胞イメージングには多くの利点がありますが、可能な限り考慮して軽減する必要がある重要な課題が関連しています。1つの課題は、イメージング中に細胞の生存率と増殖を確保するために、適切な環境条件を維持することです。これを達成するために、イメージングセットアップには、温度とCO2の両方を調節する環境室を含める必要があります。あるいは、細胞は、閉じたチャンバ内で行う場合にのみ温度調節を伴う短期的に画像化されてもよい。いずれの場合も、軸方向の焦点の変動を軽減するための防振テーブルおよび/またはハードウェアベースのアプローチ(例えば、ニコンのパーフェクトフォーカス)を使用して、実験の期間中プレートフォーカスを維持する必要があります。生細胞イメージングに関する第2の重要な懸念は、光損傷および光漂白の可能性である。光漂白は、画像化される蛍光が徐々に減少する蛍光強度が、イメージングが進行するにつれて懸念される。しかし、光漂白をもたらす高強度励起光への曝露は細胞にも有毒であり、露光時間、画像集録間隔、およびイメージング配列の全持続時間を減少させることにより、細胞への曝露を最小限に抑える必要があります。25.光毒性を最小限に抑えるために画像化条件を最適化しない結果には、DNA損傷の生成および実験の解釈と理解を損なう可能性のあるその他の細胞変化が含まれる可能性があります。細胞の生存率が長期的なイメージングの懸念となる場合は、ピクセルビニングを利用する(露出を短くするために)、後続の画像キャプチャ間の持続時間を長くする努力が必要です。さらに懸念されるのは、蛍光タグが融合したタンパク質の挙動を変えたり、ウイルス発現物体質をゲノムに組み込むことが細胞の挙動に影響を与える可能性があることです。蛍光タグの添加がタンパク質機能に影響を与える可能性を考慮して、NまたはC末端蛍光タグの添加後のタンパク質機能の評価と非タグ付きタンパク質機能との比較が必要である。ウイルス構造が統合されたゲノム遺伝子座の摂動によって細胞行動に悪影響が生じるかどうかを判断するには、タグ付けされたタンパク質を欠いている細胞と比較して、複数の単一細胞クローンを導き出し、モニタリングするためにテストする必要があります。細胞のフィットネスと人芽細胞の進行が乱れていないことを。あるいは、ウイルス発現構造のランダムな統合の標的的な影響は、CRISPRベースのアプローチを用いて、内因性遺伝子座またはゲノムの他の既知の領域への融合タンパク質の標的的な統合を通じて緩和することができる。
人工的な進行の主要な調節剤を同定し、特徴付けるアプローチは、固定細胞イメージングに大きく依存しています。このようにして同定されたミトティックレギュレータは、その後、急速に増殖する癌細胞7,8,9を標的とする治療薬に利用されている。しかし、抗溶解薬は、常に異なる癌で均一に実行するとは限らず、多くの場合、化学療法の成功または失敗に先立つ有動語型に関する洞察は不明のままである。スピンドル摂動薬の有無において有人細胞を追跡する生細胞タイムラプスイメージングは、致命的な有人種および侵害された生存率をもたらす可能性が最も高いモジュレーターを同定するために必要な洞察を提供する可能性を有する正常な細胞への影響を最小限に抑えた癌細胞。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
DLM は NSF GRFP によってサポートされます。ALMは、生物医学研究の卓越性のためのスミス家族賞からの資金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | A serine protease used to release adherent cells from culture dishes |
| 15ml centrifuge tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objective | Nikon | For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | For use in retroviral transfection; used in step 1.1 |
| a-tubulin-EGFP | Addgene | various numbers | Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells |
| C02 | Airgas | For use in cell culture and live cell imaging | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin |
| disposable glass Pastuer pipets, sterilized | Fisher Scientific | 13-678-6A | For use in aspirating cells |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Cell culture medium supplement |
| Lipofectamine 3000 and p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4 |
| Multi well Tissue Culture dishes | Corning | various | for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotic used in cell culture medium |
| phosphate bufferred saline (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | sterile saline solution for use with cell culture |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells |
| RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | various numbers | Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs |
| RPE-1 cells | ATCC | CRL-4000 | Human retinal pigment epithelial cell line |
| Tissue culture dish 100x20mm | Corning | 353003 | for use in culturing adherent cells |
| Zyla sCMOS camera | Nikon | Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells |
References
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