Summary
Her presenterer vi en protokoll for å vurdere dynamikken i spindel dannelse og mitotisk progresjon. Vår anvendelse av time-lapse Imaging gjør det mulig for brukeren å identifisere celler på ulike stadier av mitose, spore og identifisere mitotisk defekter, og analysere spindel dynamikk og mitotisk celle skjebne ved eksponering for anti-mitotisk narkotika.
Abstract
Live celle time-lapse Imaging er et viktig verktøy i cellebiologi som gir innsikt i cellulære prosesser som ellers kan bli oversett, misforstått, eller misforstått av fast celle analyse. Mens den faste celle bilde og analyse er robust og tilstrekkelig til å observere mobilnettet steady-state, kan det være begrenset i å definere en timelig rekkefølge av hendelser på cellenivå og er dårlig rustet til å vurdere forbigående natur dynamiske prosesser inkludert mitotisk progresjon. I kontrast er live celle Imaging en veltalende verktøy som kan brukes til å observere cellulære prosesser på single-cellenivå over tid og har kapasitet til å fange dynamikken i prosesser som ellers ville være dårlig representert i fast celle Imaging. Her beskriver vi en tilnærming for å generere celler bærer fluorescensmerkete merket markører for kromatin og mikrotubuli og deres bruk i live celle Imaging tilnærminger til å overvåke metafase kromosom justering og mitotisk exit. Vi beskriver Imaging-baserte teknikker for å vurdere dynamikken i spindel dannelse og mitotisk progresjon, inkludert identifisering av celler på ulike stadier i mitose, identifisering og sporing av mitotisk defekter, og analyse av spindel dynamikk og mitotisk celle skjebne etter behandling med mitotisk hemmere.
Introduction
Bildebasert analyse av faste celler brukes vanligvis til å vurdere celle befolkningsnivå endringer som svar på ulike forstyrrelser. Når det kombineres med celle synkronisering, etterfulgt av innsamling og bildebehandling av serielle tids punkt, kan slike tilnærminger brukes til å foreslå en mobil sekvens av hendelser. Likevel er fast celle bilde begrenset i at timelige forhold er underforstått for en befolkning og ikke demonstrert på nivå med individuelle celler. På denne måten, mens fast celle bilde og analyse er tilstrekkelig til å observere robuste fenotyper og steady-state endringer, evnen til å oppdage forbigående endringer over tid og endringer som påvirker bare en pasientpopulasjonen av cellene er ufullkommen. I kontrast er live celle Imaging en veltalende verktøy som kan brukes til å observere cellulære og subcellulære prosesser innenfor en enkelt celle, eller mobilnettet befolkning, over tid og uten hjelp av synkronisering tilnærminger som kan selv påvirke cellulære atferd 1 den andre , 2 andre priser , 3 andre priser , 4 andre priser , 5 andre priser , 6i den.
Dannelsen av en bipolar mitotisk spindel er avgjørende for riktig kromosom segregering under celledeling, noe som resulterer i to genetisk identiske datter celler. Defekter i mitotisk spindel struktur som korrupte mitotisk progresjon og kompromiss troskap av kromosom segregering kan føre til katastrofale celle divisjoner og redusert celle levedyktighet. Av denne grunn er mitotisk gifter som endrer spindel formasjon lovende legemiddel selskap for å begrense den raske spredning av kreftceller7,8,9. Likevel er fast celle analyse av spindel struktur etter tilsetning av mitotisk gifter begrenset i sin evne til å vurdere den dynamiske prosessen med spindel formasjon og kan ikke indikere om observerte endringer i spindel strukturen er permanent eller er stedet forbigående og kan overvinnes for å tillate vellykket celledeling.
I denne protokollen, beskriver vi en tilnærming for å vurdere dynamikken i mitose etter spindel forstyrrelser av Live celle Imaging. Bruke hTERT udødeliggjort RPE-1 cellelinje konstruert for å uttrykke en RFP-Tagged histone 2B å visualisere kromatin, sammen med en EGFP-Tagged α-tubulin å visualisere mikrotubuli, tidspunktet for metafase kromosom justering, anaphase utbruddet, og til slutt mitotisk celle skjebne er vurdert ved hjelp av visuelle signaler av kromosom bevegelse, komprimering og kjernefysisk morfologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generering av hTERT-RPE-1 celler stabilt uttrykker RFP-histone 2B (RFP-H2B) og α-tubulin-EGFP (tub-EGFP)
Merk: alle trinnene følger aseptisk teknikk og finner sted i et biosafety nivå II + (BSL2 +) sikkerhetskabinett.
- Generer retrovirus som frakter genene av interesse (α-tubulin-EGFP og RFP-H2B) av transfeksjoner av 293T celler med riktig lentiviral plasmider i henhold til produsentens instruksjoner av lipid-baserte transfeksjoner leveringssystem.
- Dag 1: Bruk en gangs glass Pasteur pipette å aspirer cellen kulturen medium fra en tallerken med sub-confluent 293T celler og vask av restoljen medium med fosfat bufret saltvann (PBS) ved å legge til 5 mL av PBS. Virvel å distribuere PBS over platen bunnen, deretter aspirer PBS med en steril disponibel glass Pasteur pipette.
- Tilsett 2 mL 0,05% Trypsin som har blitt forvarmet til 37 ° c og returner platen til en fuktet inkubator ved 37 ° c med 5% CO2 for 2 til 5 min slik at tilhenger celler kan frigjøres fra cellekultur parabolen.
- Tilsett 8 mL fersk Dulbecco ' s modifisert Eagle medium (DMEM) supplert med 10% fosterets storfe serum (FBS) og 1% penicillin/Streptomycin til platen som inneholder Trypsin.
- Resuspend cellene ved å forsiktig pipettering og overføre suspensjonen til et sterilt 15 mL konisk rør. Plasser konisk rør i en balansert sentrifuge og snurr på 161 x g i 5 min ved romtemperatur for å forsiktig pellet cellene.
- Aspirer medium/Trypsin-løsningen fra pelleted celler og resuspend celler i 10 mL DMEM supplert med 10% FBS og 1% penicillin/Streptomycin. Bruk en hemocytometer til å telle 293T celle fjæring og plate 2 x 106 293T celler per brønn av en 6 brønn plate.
- Kultur celler i et samlet volum på 2 mL Dulbecco ' s modifisert Eagle medium (DMEM) supplert med 10% fosterets storfe serum (FBS) og 1% penicillin/Streptomycin og vedlikeholde i en fuktet inkubator på 37 ° c med 5% CO2.
- Dag 2: pipette 7 μL av lipid-basert transfeksjoner levering reagens og 100 μL av redusert serum medium i et 1,5 mL mikrosentrifugen rør og la det ruge ved romtemperatur i 5 min (tube #1).
- I et separat 1,5 mL mikrosentrifugen rør, pipette 1 mikrogram av RFP-H2B uttrykks vektor (eller 1 μg av α-tubulin-EGFP uttrykks vektor), sammen med 5 μL Enhancer reagens (som påkrevd per produsentens retningslinjer), 0,5 μg pMD2. G og 1 μg psPAX2 og 100 μL av reduserte serum medium (tube #2).
- Kombiner innholdet i trinn 1.1.7 og trinn 1.1.8 ved nøye pipettering tube #2 i rør #1 og ruge i 20 min ved romtemperatur.
Merk: reaksjonen kan skaleres etter behov for transfeksjoner av celler i flere brønner. - Pipetter transfeksjoner reaksjonen dråpevis til ønsket brønn som inneholder 293T celler i 2 mL medium og returnere parabolen til fuktet inkubator ved 37 ° c med 5% CO2.
Merk: for å generere celler som uttrykker både RFP-H2B og α-tubulin-EGFP, generere separate virus for hvert uttrykk konstruere (trinn 1.1.7-1.1.9). - Dag 3: aspirer og erstatt mediet med 2 mL fersk DMEM supplert med 10% FBS og 1% penicillin/Streptomycin. Returner parabolen til fuktet inkubator ved 37 ° c med 5% CO2.
- Dag 4: samle mediet inneholder uttrykt virus partikler, å være forsiktig for ikke å forstyrre eller fjerne 293T celler. Filtrer mediet som inneholder virus partikler, ved å sende det gjennom et 0,45 μM-filterfestet til en 5 mL sprøyte. Alikvot virus for korttidslagring ved 4 ° c, eller langtidslagring ved-80 ° c.
Merk: virale partikler innhentet på denne måten vil være til stede i en rekke ~ 1 x 107 til 1 x 108 Transducing enheter/ml. Som viral-produserende celler og celler til å bli smittet er både kultivert i samme medium, viral konsentrasjon for å erstatte mediet er ikke nødvendig og filtrert viral partikler kan brukes direkte til å infisere celler. - Seed 2 x 105 HTERT-RPE-1 celler per brønn av en 6-godt parabolen i forberedelsene til viral infeksjon. Kultur celler i 2 mL DMEM supplert med 10% FBS og 1% penicillin/Streptomycin og vedlikeholde i en fuktet inkubator på 37 ° c med 5% CO2.
- Dag 5: Legg til hexadimethrine bromide (f.eks. polybrene) i hTERT-RPE-1-cellene til en endelig konsentrasjon på 8 μg/mL. Infisere celler med en blanding av 500 μL av virus fortynnet i 500 μL av cellekultur medium.
Merk: Hexadimethrine bromide lagerløsning er klargjort i sterilt destillert vann, deretter filtrert gjennom et 0,45 μm filter. - Dag 6: ved hjelp av en gangs glass Pasteur pipette, aspirer mediet fra brønner som inneholder viruset infiserte celler. Erstatt cellekultur mediet med 2 mL DMEM inneholdende 10% FBS, 1% penicillin/Streptomycin og egnede konsentrasjoner av antibiotika for å velge for plasmider integrasjon og uttrykk.
Merk: α-tubulin-EGFP-uttrykket plasmider som brukes i de beskrevne forsøkene bærer et puromycin-gen og RFP-H2B-uttrykket plasmider bærer et blasticidin motstands gen. Derfor brukes 10 μg/mL puromycin og 2 μg/mL blasticidin til valg av α-tubulin-EGFP, RFP-H2B som uttrykker hTERT RPE-1-celler. Konsentrasjoner av antibiotika som brukes for valget kan variere for ulike cellelinjer som brukes. - Oppretthold celler under antibiotika valg for 5-7 dager, erstatte mediet hver 3 dager med friskt medium som inneholder egnede valg reagenser.
Merk: celler bør opprettholdes ved sub-samløpet under valget og bør utvides etter behov, som beskrevet i trinn 1.1.1 til 1.1.4. - Bruk immunofluorescence avbildning til å bekrefte uttrykk for kodede konstruksjoner.
Merk: Hvis ønskelig, kan enkelt celle kloner utledes for å oppnå ensartede uttrykks nivåer i celle populasjonen. Når stabile kloner er bekreftet, kan celler opprettholdes under standard kultur forhold i fravær av antibiotika utvalg.
2. utarbeidelse av celler for levende celle bilde etter mitotisk spindel forstyrrelser
Merk: Bruk aseptisk teknikk og Utfør trinnene i et BSL2 sikkerhetskabinett.
- Ved hjelp av en steril disponibel glass Pasteur pipette, aspirer mediet fra kultur platen som inneholder cellelinjen som bærer uttrykket konstruere (s) (fra trinn 1,7). Vask raskt cellene med 10 mL sterilt PBS. Virvel å distribuere PBS over platen bunnen, deretter aspirer PBS med en steril disponibel glass Pasteur pipette.
- Tilsett 2 mL 0,05% Trypsin til 10 cm plate. Ruge platen ved 37 ° c for 2-5 min eller til cellene har løsnet fra plateoverflaten.
- Tilsett 8 mL friskt medium til platen som inneholder Trypsin. Resuspend cellene ved å forsiktig pipettering og overføre suspensjonen til et sterilt 15 mL konisk rør. Plasser konisk rør i en balansert sentrifuge og snurr på 161 x g i 5 min ved romtemperatur for å forsiktig pellet cellene.
- Forsiktig aspirer supernatanten og resuspend i 10 mL PBS ved pipettering forsiktig med en 10 mL serologisk pipette. Plasser konisk rør i en balansert sentrifuge og snurr på 161 x g i 5 min ved romtemperatur for å forsiktig pellet cellene.
- Forsiktig aspirer supernatanten og resuspend i 10 mL av det friske mediet ved pipettering forsiktig med en 10 mL serologisk pipette.
- Count celler, deretter beregne celle nummeret ved hjelp av en hemacytometer og fortynne til en konsentrasjon av 1-2 x 105 celler/ml i cellen kultur medium. Seed 500 μL av celle suspensjonen til hver brønn av en steril 12-brønn tenkelig bunnplate. Plasser platen i cellen kultur inkubator og la cellene til å følge plateoverflaten.
Merk: Live celle avbildning krever at cellene er godt overholdt slik at de forblir knyttet til bildebehandlings flyet under bilde anskaffelsen. Varigheten av tiden som er nødvendig for at cellene skal følge etter plating kan avvike fra en cellelinje til den neste og bør optimaliseres for cellelinjen under studien. - Opp til 30 min før initiering av tid-lapse Imaging, legge til en relevant konsentrasjon av et mitotisk stoff til en eller flere av brønnene seeded med celler. Å gjøre rede for den potensielle virkningen av organiske løsemiddel på mobilnettet atferd, legge til et lik volum av hemmer fortynningsmiddel til celler som kontroller. For eksempel, sørg for at tillegg av 100 nM for den spesifikke inhibitor av mitotisk kinase Aurora A (f. eks, alisertib) er parallelle med lik volum av DMSO, fortynningsmiddel for dette stoffet, i en kontroll brønn av celler.
Merk: komparativ analyse av dynamiske endringer i mitotisk progresjon krever brønner av celler som skal tilberedes i fravær av forstyrrelser for å muliggjøre avbildning av normal mitoses parallelt med eksperimentelle forhold.
3. mikroskop satt opp for time-lapse Imaging av RFP-H2B, α-tubulin-GFP uttrykke celler (figur 1, figur 2)
- Plasser cellekultur platen som inneholder RFP-H2B, α-tubulin-GFP som uttrykker hTERT RPE-1-celler for å bli avbildet til et passende etappe sett på et invertert epifluorescence-mikroskop som er utstyrt med et kamera med høy oppløsning (pikselstørrelse på 0,67 μm ved 20x), en til 37 ° c, og et leveringssystem for fuktet 5% CO2.
Merk: enten lukkede miljø kamre eller temperaturkontrollerte scenen inserts kan være hensiktsmessig forutsatt fuktet 5% CO2 kan leveres og stabil temperaturkontroll innhentet. - Bruk en 20x luft objektiv med en numerisk blenderåpning på 0,5 og utstyrt for høy kontrast fluorescens og fase kontrast eller brightfield bildebehandling. Vis celler med fase kontrasten eller brightfield, og Juster løypen og fokuser på mikroskopet for å få cellene i fokus.
- Identifisere og sette det optimal avsøring timene for brightfield, GFP, og RFP image oppkjøpet av velger det respekt filterene terningen med passende eksitasjon og utstråling for fluorophores det vill være avbilde. Alternativt kan du klikke på knappen for automatisk eksponering for å angi en forhåndsbestemt eksponeringstid. Hvis signalet ikke er tilstrekkelig intenst, velger du piksel binning for å aktivere kortere eksponeringstider ved å klikke på binning -fanen og velge 2 x 2 piksel binning fra rullegardinmenyen.
Merk: Phototoksisitet kan svekke mitotisk progresjon og celle levedyktighet. Svikt i mitotisk celler i kontroll populasjoner for å fullføre normal mitoses kan være en indikasjon på at eksponeringstider og/eller bildebehandlings varighet må optimaliseres ytterligere. - Bruk en anskaffelse og analyseprogramvare som gjør det mulig for multi-koordinat, multi-brønn avbildning som skal anskaffes samtidig og definere parametrene for bilde oppkjøpet.
- Velg og Kalibrer mikroskop trinnet til en fler brønn rett, i henhold til produsentens anvisninger. Bruk bilde oppkjøpet programvare for å markere eller på annen måte velge brønnene som vil bli avbildet ved å klikke på de aktuelle brønnene i diagrammet av plateformatet som brukes.
- Under kontrollpanelet for GeneratedPoints (figur 2) definerer du koordinatene i hver brønn som vil bli avbildet ved å klikke på fanen punkt plassering og velge forhåndsdefinert eller tilfeldig koordinat plassering fra rullegardinmenyen. Velg arbeidsområde fanen og velg begrenset fra rullegardinmenyen for å begrense koordinat området for å utelukke grensene for brønnen. Klikk på antall og distribusjon -fanene for å velge antall og fordeling av poeng som skal registreres per brønn, henholdsvis.
Merk: antall koordinater som kan bli avbildet per brønn innenfor 5 min timepoint økning vil være begrenset av antall brønner som skal avbildet, samt eksponeringstid for hver kanal. Vanligvis er 5-8 koordinater per brønn tilstrekkelig til å observere minst 50 celler i hver tilstand fremgang gjennom mitose innen 4 timer. - Velg og skriv inn tidsintervallet og varigheten for å samle inn bilder ved å klikke på og legge inn verdiene i kontrollpanelet for TimeSequence .
Merk: anskaffelse av bilder hver 1 til 5 minutter er hensiktsmessig å overvåke dynamikken i mitotisk progresjon. Den totale varigheten av bildebehandling bør gjenspeile ønsket endepunkt og sprednings hastighet for cellelinjen. For eksempel er 4 timer tilstrekkelig til å se mange celler fremdrift gjennom mitose, er 16 timer tilstrekkelig til å se de fleste RPE-1-celler i en asynkron populasjon fremdrift gjennom mitose.
4. tidsforløp bildeanalyse for å bestemme metafase timing og mitotisk celle skjebne etter mitotisk spindel forstyrrelser
Merk: Utfør bildeanalyse ved hjelp av et bilde oppkjøpet programvare (tabell av materialer), ImageJ, eller sammenlignbare bildeanalyse programvare.
- Visualiser RFP-H2B merket kromatin ved å velge bilder tatt med RFP filteret kuben på plass. Identifisere en celle som angir mitose som indikert av innledende kromatin komprimering (figur 2C, blå pilspissen) og kjernefysisk konvolutt brytes ned (når α-tubulin-EGFP ikke lenger utelukkes av den kjernefysiske grensen).
- Bestem mitotisk timing av metafase justering og anaphase debut i individuelle celler: spor cellen gjennom påfølgende tidspunkter i den kjøpte filmen for å bestemme antall tidspunkter/minutter fra mitotisk oppføring til RFP-H2B-merket kromatin fullføre justeringen ved celle ekvator under metafase (figur 2C, gul pil spiss).
- Hvis du vil overvåke mitotisk timing, mitotisk gjengivelse og celle skjebne, fortsetter du å spore cellen gjennom påfølgende tidspunkter for å identifisere tids koordinaten der anaphase kromosom segregering er åpenbar (figur 2C, hvit pilspissen) og/eller hvor kromatin decompaction og kjernefysisk konvolutt reformasjonen (som indikert av tubulin eksklusjon fra kjernen) har skjedd.
Merk: forstyrrelser i spindel montering eller mitotisk progresjon kan vurderes som en funksjon av tiden som kreves for å oppnå en bipolar mitotisk spindel og oppnå komplett kromosom justering, eller for å fullføre anaphase kromosom segregering. - Visualiser RFP-H2B for å identifisere celler i hver populasjon som viser mitotisk defekter, inkludert isolering kromosomer og kromatin broer under anaphase kromosom segregering.
Merk: kompromittert mitotisk troskap kan også føre til multinucleated eller micronucleated datter celler og kan bli bilde i celler etter mitotisk exit, som i Figur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vurdering av mitotisk progresjon i nærvær av spindel forstyrrelser
Regulering av spindel stang fokusering er et viktig skritt i riktig bipolar spindel formasjon. Avbrudd i denne prosessen gjennom protein depletions, narkotika hemming, eller endringer i centrosome nummer korrupt spindel struktur og forsinke eller stanse mitotisk progresjon10,11,12,13. Likevel, noen forstyrrelser bare midlertidig forsinkelse spindel formasjon med celler til slutt fortsetter gjennom mitose å fullføre anaphase kromosom segregering14. I fravær av celle synkronisering tilnærminger, som selv kan indirekte påvirke mitotisk prosesser1,2, celler fremgang gjennom mitose asynkront (figur 2C). Ved hjelp av RFP-H2B å identifisere kromatin, mitotisk celler med kompakte kromatin kan bli iscenesatt som i prometaphase (de før fullføre metafase justering: figur 2C, blå pilspisser), metafase (komplett kromosom justering: Figur 2 C, gule pilspisser) og anaphase (kromosomer blir adskilt mot spindel stolper: figur 2C, hvit pilspisser). Fangst av 5-8 koordinater over 4 h er tilstrekkelig til å følge utviklingen av minst 50 celler gjennom mitose i en gitt tilstand. For å undersøke dynamikken i spindel forsamlingen etter endringer i centrosome nummer og/eller hemming av Aurora en kinase, en viktig regulator av spindel stang fokusering14,15,16, 17, vi brukte Live Cell time-lapse Imaging av menneskelige celler med 2 centrosomes, eller de som inneholder statist centrosomes. Celler ble kultivert i nærvær eller fravær av Aurora A kinase inhibitor før starten av Imaging. Celler med 2 centrosomes opplever avbrudd i mitotisk progresjon når behandlet med Aurora en kinase inhibitor, men er til syvende og sist i stand til å oppnå metafase kromosom justering (figur 2C, gul pil spiss). I kontrast er celler med > 2 centrosomes utsøkt følsomme for Aurora A hemming og viser en økning i prometaphase celler og et fravær av metafase celler, noe som indikerer en forsinkelse i spindelen montering og mitotisk progresjon.
Figur 3 viser at slike tidsforløp Imaging tilnærminger er tilstrekkelig til å overvåke både spindel forsamlingen og mitotisk troskap. Ved å visualisere α-tubulin-EGFP, ble det observert at celler som opplever spindel forstyrrelser (vist her på grunn av centrosome overduplication) gjennomgår dynamiske endringer som spindel Pol fokusering oppnås og en bipolar mitotisk spindel dannes i forberedelsene til celledeling. Samtidige med spindel montering, kromosom bevegelse kan bli visualisere med RFP-H2B å vurdere kromosom justering og segregering troskap. Mitotisk celler som opplever transient spindel flerpolaritet er mottakelige for vedlegg feil som resulterer i henger kromosomer under anaphase og danner mikronuklei i den påfølgende G1 fasen av cellesyklusen. Slike defekter er åpenbare med disse Live Cell Imaging tilnærminger.
Endringer i dynamisk progresjon av mitose endre mitotisk timing og innvirkning mitotisk celle skjebne
Etter den kjernefysiske konvolutten sammenbrudd, kan spindel dannelse og kromosom bevegelse spores gjennom stadier av mitose å vurdere mitotisk progresjon, varighet, og skjebnen til celler som går inn i anaphase. Centrosome forsterkning, en funksjon som er vanlig i mange typer kreft, er preget av tilstedeværelsen av ekstra centrosomes og multipolar spindel formasjon18,19,20. Som multipolar divisjoner resultere i svært aneuploid og sannsynlige unviable datter celler, kreftceller aktivt Cluster ekstra centrosomes å danne en bipolar spindel og gjennomgå en bipolar divisjon5,20,21, 22,23,24. Ved hjelp av Live Cell Imaging tilnærminger, viser våre representative resultater at celler med et normalt centrosome innhold er i stand til å gå fra kjernefysisk konvolutt sammenbrudd gjennom metafase justering og anaphase utbruddet for å oppnå en bipolar divisjon på under 30 minutter ( Figur 4 A, D, E). I nærvær av ekstra centrosomes, nesten 50% av cellene er i stand til å overvinne en forbigående multipolar mitotisk spindel og å danne en bipolar spindel og komplett celledeling (Figur 4C, D). De resterende cellene er ikke i stand til å oppnå en bipolar spindel og som et resultat exit mitose gjennom en multipolar divisjon (Figur 4B, D). Uansett om det oppnås spindel bipolaritet, vil celler med ekstra centrosomes vise en signifikant økt varighet av mitose sammenlignet med celler med 2 centrosomes, noe som indikerer at dynamikken i mitotisk progresjon kan endres selv om endringer i mitotisk utfallet er ikke åpenbare (Figur 4E).
Figur 1: valg av mikroskop og kamera parametre. (A) representasjon av vinduet for å velge ønsket objektiv og passende filter kube ved hjelp av et bilde oppkjøpet programvare. Vist er valget av det 20x forstørrelsen mål og det brightfield filterene terningen. (B) celler i prøveplaten er funnet og brakt i fokus ved hjelp av brightfield eller fase kontrast mikroskopi. (C) representasjon av vinduet for å angi eksponerings parametre for hvert bildeopptak. Pixel binning kan brukes, om nødvendig, for å oppnå redusere eksponeringstid per fangst og minimere Foto-skade på celler. Scale bar er 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Image Capture og analyse av time-lapse mikroskopi. (A og B) representasjon av vinduet som angir hvordan bilde anskaffelses parametere angis ved hjelp av NIS Elements HCA jobber Image Acquisition Software. Denne programvaren tillater multi-koordinat, multi-godt bildebehandling over tid. Hver jobb kan endres for å angi brønner og koordinater som skal fanges opp. (C) enkelt tidsrammer fra fire betingelser i ett eksperiment. RFP-H2B brukes til å spore kromatin. Kromatin komprimering og posisjonering brukes til å identifisere ulike stadier av mitose: Prometaphase (komprimering i fravær av kromosom justering, blå pil spiss), Metafase (komplett kromosom justering ved celle ekvator, gul pil spiss), og Anaphase (etter initiering av synkron kromosom segregering, hvit pil spiss). Scale bar er 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: tidsforløp Imaging visualiserer defekter i mitotisk troskap. Celler som inneholder ekstra centrosomes form multipolar aksling og ofte klynge dem inn i en bipolar spindel før fullføre celledeling. Her kommer en celle mitose med syv distinkte spindel stolper (hvite stjerner) som over tid er gruppert i to viktigste spindel stolper. På dette punktet, kromosomer er i stand til å justere langs spindelen ekvator, og cellen fortsetter å anaphase. Den forbigående flerpolaritet har tillatt et mal feste av et enkelt kromosom. Denne uløste feilen resulterer i et henger kromosom under anaphase som blir innlemmet i en mikronukleus i en datter celle (merket med en pil). Kromatin er en visualisere med RFP-histone 2B og mikrotubuli er i en visualisere med α-tubulin-EGFP. Tidsstempler i hvert panel indikerer minutter med hensyn til tilsynelatende kjernefysisk konvolutt sammenbrudd som bedømt av påvisning av tubulin innenfor den kjernefysiske grensen. Scale bar er 5 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: endringer i dynamisk progresjon av mitose endre mitotisk timing og innvirkning mitotisk celle skjebne. RFP-H2B, vist i rødt, brukes til å spore kromatin bevegelse og α-tubulin-GFP, vist i grønt, brukes til å overvåke centrosome/spindel Pole nummer og organisasjon. Tap av GFP-tubulin eksklusjon fra kjernen, samtidig med tidlig kromatin komprimering er en indikasjon på at den kjernefysiske konvolutten har brutt ned (NEB) i forberedelsene til mitotisk celledeling. Kjernefysisk utelukkelse av GFP-tubulin er tydelig ved mitotisk exit og reformasjonen av kjernefysisk konvolutt. (A) en celle med to centrosomes danner en bipolar spindel og utvikler seg gjennom anaphase for å danne to datter celler. (B og C) Celler med ekstra centrosomes inn mitose for å danne en multipolar spindel. (B) noen av disse cellene med ekstra centrosomes forsinkelse i mitose uten å oppnå en bipolar spindel og fremgang å fullføre multipolar anaphase. (C) andre celler med ekstra centrosomes viser en forbigående forsinkelse i mitotisk progresjon, mens de klynger ekstra centrosomes for å muliggjøre bipolar anaphase. (D) celler med Extra centrosomes er i stand til å gjennomgå en bipolar divisjon ca 50% av tiden, mens de resterende cellene med ekstra centrosomes gjennomgår en multipolar divisjon. (E) celler med ekstra centrosomes har økt mitotisk timing uavhengig av eventuell mitotisk skjebne (bipolar eller multipolar anaphase). Scale bar er 5 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den timelige oppløsningen gitt av tidsforløp Imaging tillater visualisering og vurdering av sekvensielle cellulære hendelser i enkeltceller. Tilnærminger som gjør bruk av mobilnettet synkronisering etterfulgt av innsamling og fiksering av celler på sekvensielle tids punkt er begrenset i at sammenligninger er til syvende og sist gjort mellom populasjoner av celler. I sammenhenger der mobilnettet respons på forstyrrelser kan være ikke-uniform, eller hvor prosessen blir visualisere er dynamisk, er live celle time-lapse Imaging bedre rustet til å følge og analysere både dynamikken i enkeltceller, så vel som heterogenitet innenfor en celle befolkning. På denne måten er time-lapse Imaging spesielt nyttig for overvåking celle progresjon gjennom dynamiske stadier av mitose og vurdere hvordan forstyrrelser til denne progresjon slutt påvirke troskap av mitotisk celledeling og påfølgende celle skjebne.
Mens det er en rekke fordeler med å leve celle bildebehandling, betydelige utfordringer er forbundet som må vurderes og reduseres når det er mulig. En utfordring er å opprettholde hensiktsmessige miljøforhold for å sikre celle levedyktighet og spredning under bildebehandling. For å oppnå dette, må bildeoppsett oppsettet inneholde et miljøkammer som regulerer både temperatur og CO2. Alternativt kan celler bli avbildet for en kortsiktig med bare temperaturregulering hvis det gjøres i et lukket kammer. I begge tilfeller bør bruk av en vibrasjonshindrende bord og/eller hardware-baserte tilnærminger for å redusere aksial fokus svingninger (f. eks, Nikon ' s Perfect Focus) brukes for å opprettholde plate fokus gjennom hele varigheten av eksperimentet. En annen betydelig bekymring med levende celle bilde er potensialet for photoskade og photobleaching. Photobleaching er et problem der fluoroforen blir avbildet gradvis avtar i fluorescens intensitet som Imaging utvikler seg. Men, eksponering for høy intensitet eksitasjon lys som resulterer i photobleaching er også giftig for celler og omsorg må gjøres for å minimere celle eksponering ved å redusere eksponeringstider, bilde oppkjøpet intervaller, og den totale varigheten av bildeserie sekvens 25. konsekvenser av ikke å optimalisere tenkelig forhold for å minimere Phototoksisitet kan inkludere GENERERING av DNA-skade og andre cellulære endringer som i sin tur kompromiss tolkning og forståelse av eksperimentet. Skulle celle levedyktighet bli en bekymring med langsiktig bildebehandling, bør innsatsen gjøres for å utnytte pixel binning (for å muliggjøre kortere eksponeringer) og øke varigheten mellom påfølgende bildeopptak. En ekstra bekymring er at fluorescerende koden kan endre atferden til proteinet som det er smeltet, eller at integreringen av viral uttrykk konstruere inn i Genova kan selv påvirke cellulære atferd. For å gjøre rede for muligheten for at tilsetning av et fluorescerende merke kan påvirke protein funksjon, en vurdering av protein funksjon etter tilsetning av en N eller C terminal fluorescerende Tag og sammenligning med ikke-merket protein funksjon er nødvendig. Å avgjøre om bivirkninger på celle atferden oppstår på grunn av forstyrrelsene av genomisk geometriske der viral konstruere er integrert, flere enkelt celle kloner bør utledes, sammenlignet med celler som mangler merket protein, og testet for å overvåke at cellulær kondisjon og mitotisk progresjon ikke er perturbed. Alternativt, av målet effekter av tilfeldig integrering av viral uttrykket konstruere kan begrenses gjennom målrettet integrering av Fusion protein i endogene geometrisk, eller andre kjente regioner av Genova, ved hjelp av CRISPR-baserte tilnærminger.
Tilnærminger for å identifisere og karakterisere store regulatorer av mitotisk progresjon har støttet seg tungt på fast celle Imaging. Mitotisk regulatorer som er identifisert på denne måten har senere blitt utnyttet i legemiddel målretting raskt voksende kreftceller7,8,9. Men antimitotic narkotika ikke alltid utføre jevnt i ulike kreftformer og i mange tilfeller innsikt i mitotisk fenotyper som foran enten vellykket eller mislykket kjemoterapeutiske tilnærminger forblir uklart. Live celle time-lapse Imaging å spore mitotisk celler i nærvær og fravær av spindel-perturbing medikamenter har potensial til å gi den innsikten som er nødvendig for å identifisere de modulatorer mest sannsynlig vil føre til katastrofale mitoses og kompromittert levedyktighet av kreftceller med minimal innvirkning på normale celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
DLM støttes av en NSF GRFP. ALM er støttet av finansiering fra Smith Family Award for Excellence in Biomedical Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | A serine protease used to release adherent cells from culture dishes |
| 15ml centrifuge tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objective | Nikon | For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | For use in retroviral transfection; used in step 1.1 |
| a-tubulin-EGFP | Addgene | various numbers | Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells |
| C02 | Airgas | For use in cell culture and live cell imaging | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin |
| disposable glass Pastuer pipets, sterilized | Fisher Scientific | 13-678-6A | For use in aspirating cells |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Cell culture medium supplement |
| Lipofectamine 3000 and p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4 |
| Multi well Tissue Culture dishes | Corning | various | for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotic used in cell culture medium |
| phosphate bufferred saline (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | sterile saline solution for use with cell culture |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells |
| RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | various numbers | Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs |
| RPE-1 cells | ATCC | CRL-4000 | Human retinal pigment epithelial cell line |
| Tissue culture dish 100x20mm | Corning | 353003 | for use in culturing adherent cells |
| Zyla sCMOS camera | Nikon | Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells |
References
- Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
- Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis. PLoS One. 11, e0157491 (2016).
- Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint. The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).
- Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells. Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).
- van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M.
- Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death and Diseases. 3, 411 (2012).
- Martin, M., Akhmanova, A. Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization. Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).
- Vitre, B. D., Cleveland, D. W. Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy. Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).
- Godinho, S. A., Pellman, D. Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).
- Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes. Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).
- Conte, N., et al. TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer. Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).
- Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 125, 4391-4402 (1998).
- Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces. Molecular Cancer. 10, 131 (2011).
- Chan, J. Y. A clinical overview of centrosome amplification in human cancers. International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).
- Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death. Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4, e6564 (2009).
- Nigg, E. A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression? Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).
- Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).
- Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering. Science. 307, 127-129 (2005).
- Magidson, V., Khodjakov, A.
