Summary
Burada mil oluşumu ve mitotik progresyon dinamiklerini değerlendirmek için bir protokol sıyoruz. Hızlandırılmış görüntüleme uygulamamız, kullanıcının mitozbölünmenin çeşitli aşamalarındaki hücreleri belirlemesini, mitotik defektleri izlemesini ve tanımlamasını ve anti-mitotik ilaçlara maruz kalındığında mil dinamiği ve mitotik hücre kaderini analiz etmesini sağlar.
Abstract
Canlı hücre zaman atlamalı görüntüleme, hücre biyolojisinde, sabit hücre analizi yle gözden kaçmış, yanlış anlaşılabilecek veya yanlış yorumlanabilecek hücresel süreçler hakkında bilgi sağlayan önemli bir araçtır. Sabit hücre görüntüleme ve analizi sağlam ve hücresel sabit durumu gözlemlemek için yeterli olmakla birlikte, hücresel düzeyde olayların zamansal bir sıratanımlayan sınırlı olabilir ve dahil olmak üzere dinamik süreçlerin geçici doğasını değerlendirmek için yetersiz donanımlı mitotik ilerleme. Buna karşılık, canlı hücre görüntüleme zaman içinde tek hücre düzeyinde hücresel süreçleri gözlemlemek için kullanılabilir ve aksi takdirde sabit hücre görüntüleme kötü temsil edilecek süreçlerin dinamiklerini yakalamak için kapasiteye sahip anlamlı bir araçtır. Burada, kromatin ve mikrotübüllerin floresan etiketli belirteçlerini taşıyan hücreler ve bunların metafaz kromozom hizasını ve mitotik çıkışı izlemek için canlı hücre görüntüleme yaklaşımlarında kullanılmasına yönelik bir yaklaşım açıklıyoruz. Mitoz bölünmede çeşitli evrelerde hücrelerin tanımlanması, mitotik defektlerin tanımlanması ve izlenmesi, mil dinamiğinin analizi ve mitotik inhibitörleri ile tedavi sonrasında mitotik hücre kaderi.
Introduction
Sabit hücrelerin görüntü tabanlı analizi genellikle çeşitli tedirginliklere yanıt olarak hücre popülasyon düzeyi değişikliklerini değerlendirmek için kullanılır. Hücre senkronizasyonu ile birleştirildiğinde, seri zaman noktalarının toplanması ve görüntülenmesi takip edildiğinde, bu tür yaklaşımlar olayların hücresel bir dizi önermek için kullanılabilir. Bununla birlikte, sabit hücre görüntüleme zamansal ilişkiler bir nüfus için ima ve bireysel hücrelerin düzeyinde gösterilmiştir sınırlıdır. Bu şekilde, sabit hücre görüntüleme ve analizi sağlam fenotipleri ve sabit durum değişikliklerini gözlemlemek için yeterli olmakla birlikte, zaman içinde geçici değişiklikleri algılama ve hücrelerin sadece bir alt popülasyonunu etkileyen değişiklikleri algılama yeteneği kusurludur. Buna karşılık, canlı hücre görüntüleme tek bir hücre içinde hücresel ve hücre altı süreçleri gözlemlemek için kullanılabilecek anlamlı bir araçtır, ya da hücresel nüfus, zaman içinde ve kendilerini hücresel davranışı etkileyebilir senkronizasyon yaklaşımları yardımı olmadan 1.1.2 , 2.000 , 3.2.2 , 4.2.2 , 5.000 , 6 .
Bipolar mitotik mil oluşumu hücre bölünmesi sırasında uygun kromozom ayrımı için gereklidir, iki genetik olarak özdeş kız hücreleri sonuçlanan. Mitotik mil yapısındaki, mitotik progresyonun bozulmasıve kromozom ayrımının doğruluğunu tehlikeye sokan kusurlar, hücre bölünmelerinin azalmasına ve hücre canlılığının azalmasına neden olabilir. Bu nedenle, mil oluşumunu değiştirmek mitotik zehirler kanser hücrelerinin hızlı çoğalmasını sınırlamak için umut verici terapötik ler vardır7,8,9. Bununla birlikte, mitotik zehirlerin eklenmesinden sonra mil yapısının sabit hücre analizi, mil oluşumunun dinamik sürecini değerlendirme yeteneği ile sınırlıdır ve mil yapısında gözlenen değişikliklerin kalıcı olup olmadığını veya bunun yerine geçici ve başarılı hücre bölünmesi izin üstesinden gelebilir.
Bu protokolde, canlı hücre görüntüleme ile mil pertürbasyonlarını takiben mitoz dinamiklerini değerlendirmek için bir yaklaşım açıklıyoruz. Mikrotübülleri görselleştirmek için EGFP etiketli α-tubulin ile birlikte, mikrotübülleri görselleştirmek için RFP etiketli Histon 2B'yi ifade etmek üzere tasarlanmış hTERT ölümsüzleştirilmiş RPE-1 hücre hattını kullanarak metafaz kromozom hizalamasının zamanlaması, anafaz başlangıcı ve nihayetinde mitotik hücre kaderi kromozom hareketi, sıkıştırma ve nükleer morfolojigörsel ipuçları kullanılarak değerlendirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. RFP-Histon 2B (RFP-H2B) ve α-tubulin-EGFP (tub-EGFP) ifade eden hTERT-RPE-1 hücrelerinin üretimi
NOT: Tüm adımlar aseptik teknikleri takip eder ve biyogüvenlik seviyesi II+ (BSL2+) güvenlik kabininde gerçekleşir.
- 293T hücrelerinin uygun lentiviral plazmidlerle lipid bazlı transfeksiyon dağıtım sisteminin üretici talimatlarına göre transfeksiyonu ile ilgi genlerini (α-tubulin-EGFP ve RFP-H2B) taşıyan retrovirüs üretin.
- 1. Gün: Hücre kültürünün orta sını alt-confluent 293T hücrelerinden aspire etmek için tek kullanımlık cam Pasteur pipetkullanın ve 5 mL PBS ekleyerek artık orta sıyrıklı salin (PBS) ile artık ortayı yıkayın. PBS'yi plaka alt kısmında dağıtmak için girdap, ardından PBS'yi steril tek kullanımlık cam Pasteur pipetiyle aspire edin.
- 37 °C'ye önceden ısıtılmış 2 mL 0,05 tripsin ekleyin ve kabı 37 °C'de %5 CO2 ile 2 ila 5 dk boyunca nemlendirilmiş bir kuluçka makinesine geri getirin ve yapışık hücrelerin hücre kültürü yüzeyinden salınmasını bekleyin.
- Tripsin içeren tabağa %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin/streptomisin ile desteklenen 8 mL taze Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortası (DMEM) ekleyin.
- Hücreleri hafifçe boruhaline vererek yeniden askıya alın ve süspansiyonu steril 15 mL konik bir tüpe aktarın. Konik tüpü dengeli bir santrifüje yerleştirin ve hücreleri yavaşça peletlemek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 161 x g'de döndürün.
- DMEM'in 10 mL'sinde peletli hücrelerden orta/tripsin çözeltisini aspire edin ve %10 FBS ve %1 penisilin/streptomisin ile desteklendi. 293T hücre süspansiyonu ve 6 kuyu plakasının kuyusu başına 2 x 106 293T hücreleri saymak için hemositometre kullanın.
- Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) toplam hacmi 2 mL kültür hücreleri% 10 fetal sığır serum (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye ve% 5 CO2ile 37 °C nemlendirilmiş bir kuvöz de korumak .
- 2. Gün: Pipet 7 μL lipid bazlı transfeksiyon dağıtım reaktifi ve 100 μL azaltılmış serum ortamı 1,5 mL mikrosantrifüj tüpiçine ve oda sıcaklığında 5 dakika (tüp #1) kuluçkaya yatmaktadır.
- Ayrı bir 1,5 mL mikrosentrifüge tüpte, pipet 1 μg RFP-H2B ifade vektörü (veya 1 μg α-tubulin-EGFP ifade vektörü), 5 μL arttırıcı reaktifi (üreticinin yönergelerine göre gerekli olduğu gibi), 0,5 μg pMD2.G ve 1 μg psPAX2 ve 100 μL azaltılmış serum orta (tüp #2).
- Adım 1.1.7 ve adım 1.1.8 içeriğini dikkatlice tüp #1 içine tüp #2 boru ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka boru ile birleştirin.
NOT: Reaksiyon ek kuyularda hücrelerin transfeksiyonu için gerektiği gibi ölçeklenebilir. - Pipet transfeksiyon reaksiyonu istenilen kuyuya 2 mL orta 293T hücreleri içeren damla ve 37 °C'de % 5 CO2ile nemlendirilmiş kuvöze çanak geri dönün.
NOT: Hem RFP-H2B hem de α-tubulin-EGFP ifade eden hücreler oluşturmak için her ifade yapısı için ayrı virüs oluşturur (adım 1.1.7- 1.1.9). - 3. Gün: Orta yı %10 FBS ve %1 penisilin/streptomisin ile takviye edilmiş 2 mL taze DMEM ile değiştirin. Yemeği %5 CO2ile 37 °C'de nemlendirilmiş kuluçka makinesine geri döndürün.
- 4. Gün: 293T hücrelerini bozmamak veya çıkarmamak için dikkatli davranarak ifade edilen virüs parçacıklarını içeren ortamı toplayın. Virüs partikülleri içeren ortamı, 5 mL'lik bir şırıngaya bağlı 0,45 μM'lik bir filtreden geçirerek filtreleyin. Aliquot virüsü 4 °C'de kısa süreli depolama için veya -80 °C'de uzun süreli depolama için.
NOT: Bu şekilde elde edilen viral parçacıklar ~1 x 107 ila 1 x 108 Transducing Birimleri/mL aralığında bulunacaktır. Enfekte edilecek viral üreten hücreler ve hücreler aynı ortamda kültürlendirildik, ortamın yerini almak için viral konsantrasyon gerekli değildir ve filtrelenmiş viral partiküller doğrudan hücreleri enfekte etmek için kullanılabilir. - Tohum 2 x 105 hTERT-RPE-1 hücreleri viral enfeksiyon için hazırlık 6-iyi çanak iyi başına. DMEM'in 2 mL'lik kültür hücreleri %10 FBS ve %1 penisilin/streptomisin ile desteklenir ve %5 CO2ile 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde muhafaza edilir.
- 5. Gün: HTERT-RPE-1 hücrelerine hexadimethrine bromür (örn. polibren) ekleyin ve 8 μg/mL'lik son konsantrasyona ekleyin. Hücre kültürü ortamının 500 μL'sinde seyreltilmiş 500 μL'lik bir virüs karışımı ile hücreleri enfekte edin.
NOT: Hexadimethrine bromür çözeltisi steril distile suda hazırlanır ve 0,45 μm filtreden geçirilir. - 6. Gün: Tek kullanımlık cam pasteur pipet kullanarak, virüs enfekte hücreleri içeren kuyulardan orta aspire. Hücre kültürü ortamını %10 FBS, %1 penisilin/streptomisin içeren 2 mL DMEM ve plazmid entegrasyonu ve ekspresyonu için uygun antibiyotik konsantrasyonları ile değiştirin.
NOT: Açıklanan deneylerde kullanılan α-tubulin-EGFP ekspresyonu plazmidpuromisin direnci geni, RFP-H2B ekspresyonu plazmid ise blastisdin direnci geni taşır. Bu nedenle α-tubulin-EGFP, RFP-H2B ve hTERT RPE-1 hücrelerinin seçiminde 10 μg/mL puromisin ve 2 μg/mL blasticidin kullanılır. Seçim için kullanılan antibiyotik konsantrasyonları kullanılan çeşitli hücre hatları için farklı olabilir. - 5-7 gün antibiyotik seçimi altında hücreleri korumak, uygun seçim reaktifler içeren taze orta ile her 3 günde bir orta değiştirerek.
NOT: Hücreler seçim sırasında alt kesişme noktasında tutulmalıdır ve 1.1.1 ile 1.1.4 adımlarında açıklandığı gibi gerektiğinde genişletilmelidir. - Etiketli yapılar ifade onaylamak için immünofloresan görüntüleme kullanın.
NOT: İstenirse, hücre popülasyonu içinde tek tip ifade düzeylerini elde etmek için tek hücreli klonlar türetilebilir. Bir kez istikrarlı klonlar teyit edilir, hücreler antibiyotik seçimi yokluğunda standart kültür koşulları altında muhafaza edilebilir.
2. Mitotik mil tedirginlikleri sonrasında canlı hücre görüntülemesi için hücrelerin hazırlanması
NOT: Aseptik teknikleri kullanın ve bir BSL2 güvenlik kabininde adımları gerçekleştirin.
- Steril tek kullanımlık cam Pasteur pipeti kullanarak, yapı(lar) ifadesini taşıyan hücre hattını içeren kültür plakasından ortayı aspire edin (adım 1.7'den). Hücreleri 10 mL steril PBS ile kısaca yıkayın. PBS'yi plaka alt kısmında dağıtmak için girdap, ardından pbs'yi steril tek kullanımlık cam Pasteur pipetiyle aspire edin.
- 10 cm plakaya %0,05 tripsin 2 mL ekleyin. Plakayı 37 °C'de 2-5 dakika veya hücreler plaka yüzeyinden ayrılana kadar kuluçkaya yatırın.
- Tripsin içeren tabağa 8 mL taze orta ekleyin. Hücreleri hafifçe boruhaline vererek yeniden askıya alın ve süspansiyonu steril 15 mL konik bir tüpe aktarın. Konik tüpü dengeli bir santrifüje yerleştirin ve hücreleri yavaşça peletlemek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 161 x g'de döndürün.
- 10 mL serolojik pipetle hafifçe boru haline vererek 10 mL PBS'de süpernatantı dikkatlice aspire edin ve yeniden askıya alın. Konik tüpü dengeli bir santrifüje yerleştirin ve hücreleri yavaşça peletlemek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 161 x g'de döndürün.
- Supernatant'ı dikkatlice aspire edin ve 10 mL serolojik pipetle hafifçe boru haline vererek taze ortamın 10 mL'inde yeniden askıya alın.
- Hücreleri sayın, daha sonra bir hemacytometer kullanarak hücre numarasını hesaplayın ve hücre kültürü ortamda 1-2 x 105 hücre/mL konsantrasyonuna seyreltin. Steril 12 kuyulu bir alt plakanın her kuyuya hücre süspansiyonunun 500°L'sini tohumlayın. Plakayı hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin ve hücrelerin plaka yüzeyine yapışmasını bekleyin.
NOT: Canlı hücre görüntüleme, hücrelerin görüntü edinimi sırasında görüntüleme düzlemi ile ilişkili kalması için iyi yapışmasını gerektirir. Kaplamayı takiben hücrelerin yapışması için gereken süre bir hücre hattından diğerine farklılık görebilir ve çalışılan hücre hattı için optimize edilmelidir. - Hızlandırılmış görüntülemeyi başlatmadan önce 30 dakikaya kadar, hücrelerle tohumlanan kuyulardan birine veya daha fazlasına ilgili bir mitotik ilaç konsantrasyonu ekleyin. Organik çözücünün hücresel davranış üzerindeki potansiyel etkisini hesaba katmak için, inhibitörün dilüentinin eşit hacimli liğini kontrol olarak hücrelere ekleyin. Örneğin, mitotik kiaz Aurora A'nın spesifik inhibitörüolan 100 nM'nin eklenmesinin hücrelerin kontrol kuyusu olan bu ilacın dilüenti olan DMSO'nun eşit hacmiyle paralel olduğundan emin olun.
NOT: Mitotik progresyondaki dinamik değişikliklerin karşılaştırmalı analizi, deneysel koşullara paralel olarak normal mitozların görüntülenebilmesi için pertürbasyonların yokluğunda hazırlanacak hücre kuyularının hazırlanmasını gerektirir.
3. Mikroskop, RFP-H2B, α-tubulin-GFP ifade eden hücrelerin hızlandırılmış görüntülemesi için ayarlanmıştır (Şekil 1, Şekil 2)
- RFP-H2B, α-tubulin-GFP içeren hücre kültür plakasını, hTERT RPE-1 hücrelerini ifade eden hücre kültür plakasını, yüksek çözünürlüklü bir kamera (piksel boyutu 20x) ile donatılmış ters epifloresan mikroskopüzerinde uygun bir aşama kesici uçta görüntülenecek şekilde yerleştirin. 37 °C'ye kadar önceden ısıtılmış çevre odası ve nemlendirilmiş %5 CO2için bir dağıtım sistemi.
NOT: Kapalı çevre odaları veya sıcaklık kontrollü sahne uçları, nemlendirilmiş %5 CO2'nin teslim edilmesi ve stabil sıcaklık kontrolü sağlanması koşuluyla uygun olabilir. - 0,5 sayısal diyafram açıklığı ile 20x hava hedefi kullanın ve yüksek kontrastfloresan ve faz kontrastı veya brightfield görüntüleme için donatılmıştır. Faz kontrastı veya parlaklık alanı ile hücreleri görüntüleyin ve hücreleri odak haline getirmek için rotayı ve mikroskobu ince odak ayarlayın.
- Brightfield, GFP ve RFP görüntü edinimi için en uygun pozlama sürelerini, görüntülenecek floroforlar için uygun uyarma ve emisyonla ilgili filtre küpünü seçerek belirleyin ve ayarlayın. Alternatif olarak, önceden belirlenmiş bir pozlama süresi girdirmek için otomatik pozlama düğmesini tıklatın. Sinyal yeterince yoğun değilse, binning sekmesine tıklayarak ve açılan menüden 2 x 2 piksel binning seçerek daha kısa pozlama sürelerini etkinleştirmek için piksel binning'i seçin.
NOT: Fototoksisite mitotik progresyon ve hücre canlılığını bozabilir. Kontrol popülasyonlarında bulunan mitotik hücrelerin normal mitozları tamamlayamamaları, maruz kalma sürelerinin ve/veya görüntüleme süresinin daha da optimize edilmesi gerektiğinin bir göstergesi olabilir. - Çok eşgüdümlü, çok iyi görüntülemenin aynı anda elde edilmesini sağlayan ve görüntü edinimi parametrelerini tanımlayan bir satın alma ve analiz yazılımı kullanın.
- Üreticinin talimatlarına göre mikroskop aşamasını çok kuyulu çanağa seçin ve kalibre edin. Kullanılan plaka biçiminin diyagramındaki ilgili kuyulara tıklayarak görüntülenecek kuyuları vurgulamak veya başka bir şekilde seçmek için görüntü edinme yazılımını kullanın.
- Oluşturulan Puanlar kontrol paneli altında(Şekil 2), Nokta Yerleştirme sekmesine tıklayarak ve önceden tanımlanmış veya rasgele koordinat yerleşimi seçerek görüntülenecek her kuyunun içindeki koordinatları tanımlar açılan menü. Çalışma Alanı sekmesini seçin ve kuyunun sınırlarını dışlamak için koordinat seçim alanını kısıtlamak için açılır menüden sınırlı seçeneğini belirleyin. Her kuyuda yakalanacak noktaların sayısını ve dağıtımını seçmek için Sayım ve Dağıtım sekmelerini tıklatın.
NOT: 5 dk'lık zaman dilimi içinde her kuyu da görüntülenebilen koordinat sayısı, görüntülenecek kuyu sayısı ve her kanalın pozlama süresiyle sınırlı olacaktır. Tipik olarak, kuyu başına 5-8 koordinatlar 4 saat içinde mitoz bölünme yoluyla her durumda en az 50 hücre gözlemlemek için yeterlidir. - Zaman Sırası kontrol paneline tıklayıp içeri sokarak görüntüleri toplamak için zaman aralığını ve süresini seçin ve girdi.
NOT: Görüntülerin her 1 ila 5 dakikada bir elde edilmesi mitotik ilerleme dinamiklerini izlemek için uygundur. Görüntülemenin toplam süresi, hücre hattının istenilen uç nokta ve çoğalma oranını yansıtmalıdır. Örneğin, 4 saat mitoz bölünme yoluyla birçok hücre ilerleme görmek için yeterli, 16 saat mitoz yoluyla bir asynchronous popülasyon ilerleme en RPE-1 hücreleri görmek için yeterlidir.
4. Mitotik mil tedirginlikleri sonrasında metafaz zamanlaması ve mitotik hücre kaderini belirlemek için hızlandırılmış görüntü analizi
NOT: Görüntü analizini bir görüntü edinme yazılımı(Tablo Malzemeler), ImageJ veya karşılaştırılabilir görüntü analizi yazılımı kullanarak gerçekleştirin.
- RFP filtre küpü yle çekilen görüntüleri yerinde seçerek RFP-H2B etiketli kromatini görselleştirin. Mitoz girilen bir hücreyi ilk kromatin sıkıştırmasında belirtildiği gibi(Şekil 2C, mavi ok ucu) ve nükleer zarf ın parçalanması (α-tubulin-EGFP artık nükleer sınır tarafından dışlanmadığında) tanımlayın.
- Tek tek hücrelerde metafaz hizalama ve anafaz başlangıcının mitotik zamanlamasını belirleyin: RFP-H2B etiketli kromatine kadar mitotik girişten zaman puanlarını/dakika sayısını belirlemek için edinilmiş filmde ardışık zaman noktaları üzerinden hücreyi izleyin metafaz sırasında hücre ekvatorundaki hizalamayı tamamlar(Şekil 2C, sarı ok ucu).
- Mitotik zamanlamayı, mitotik sadakati ve hücre kaderini izlemek için, anafaz kromozom ayrımının belirgin olduğu zaman koordinatını belirlemek için hücreyi ardışık zaman noktalarından izlemeye devam edin(Şekil 2C, beyaz ok ucu) ve/veya kromatin decompaction ve nükleer zarf reformasyon (çekirdekten tubulin dışlanması ile belirtildiği gibi) meydana gelmiştir.
NOT: Mil montajı veya mitotik progresyonpertasyonları, bipolar mitotik mil elde etmek ve tam kromozom hizalaması veya anafaz kromozom segregasyonunu tamamlamak için gereken zamanın bir fonksiyonu olarak değerlendirilebilir. - Anafaz kromozom ayrımı sırasında gecikmeli kromozomlar ve kromatin köprüleri de dahil olmak üzere mitotik bozukluklar sergileyen her popülasyondaki hücreleri tanımlamak için RFP-H2B'yi görselleştirin.
NOT: Tehlikeye mitotik sadakat de multinucleated veya mikronükleli kız hücreleri neden olabilir ve hücrelerde mitotik çıkış sonrası görselleştirilmiş olabilir, Şekil 3'teolduğu gibi .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mil pertürbasyonları varlığında mitotik progresyonun değerlendirilmesi
Mil direk odaklama nın düzenlenmesi uygun bipolar mil oluşumunda önemli bir adımdır. Protein tükenmeleri yoluyla bu süreçte bozulma, ilaç inhibisyonu, veya centrozom numarası bozuk mil yapısı nda değişiklikler ve gecikme veya mitotik ilerlemesini durdurmak10,11,12,13. Bununla birlikte, bazı tedirginlikler sadece geçici olarak hücreler sonuçta anafaz kromozom segregasyon14tamamlamak için mitoz yoluyla ilerleyen ile mil oluşumunu geciktirmek . Hücre senkronizasyonu yaklaşımlarının yokluğunda, dolaylı olarak mitotik süreçleri etkileyebilir1,2, hücreler eşit olarak mitoz yoluyla ilerleme (Şekil 2C). Kromatini tanımlamak için RFP-H2B kullanılarak, kompakt kromatinli mitotik hücreler prometafaz (metafaz hizalamadan öncekiler: Şekil 2C, mavi ok uçları), metafaz (tam kromozom hizalaması: Şekil 2 C, sarı ok başları) ve anafaz (kromozomlar mil kutuplarına doğru ayrılmış olan: Şekil 2C, beyaz ok başları). 4 saat üzerinde 5-8 koordinatların yakalanması belirli bir durumda mitoz yoluyla en az 50 hücrenin ilerlemesini takip etmek için yeterlidir. Centrozom sayısındaki değişiklikler ve/veya Aurora A kigazınin inhibisyonu sonrasında mil montajDinatdinamiklerini araştırmak için,14,15,16, 17, biz 2 centrosomes ile insan hücrelerinin canlı hücre zaman atlamalı görüntüleme kullanılan, ya da bu supernumerary yüzdürme içeren. Hücreler, görüntülemebaşlamadan önce Aurora A kiyaz inhibitörü varlığında veya yokluğunda kültürlendi. 2 sentrozomlu hücreler aurora A kinaz inhibitörü ile tedavi edildiğinde mitotik progresyonda bozulma yaşarlar, ancak sonuçta metafaz kromozom hizalaması elde edilebilirler(Şekil 2C, sarı ok ucu). Buna karşılık, >2 sentrozomlu hücreler Aurora A inhibisyonuna karşı son derece duyarlıdır ve prometafaz hücrelerinde artış ve metafaz hücrelerinin yokluğuna neden olarak iğ de bir gecikme ve mitotik progresyon gösterir.
Şekil 3, bu tür hızlandırılmış görüntüleme yaklaşımlarının hem mil montajLarını hem de mitotik sadakati izlemek için yeterli olduğunu göstermektedir. α-tubulin-EGFP görselleştirilerek, iğ bozulması yaşayan hücrelerin (centrozom overduplikasyonu nedeniyle burada gösterilmiştir) iğ direği odaklama sağlandığı ve bipolar mitotik milin hazırlandığı gözlenmiştir. hücre bölünmesi. Mil montajı ile eşzamanlı olarak kromozom hareketi RFP-H2B ile görüntülenarak kromozom hizalamasını ve ayırma doğrulmasını değerlendirebilir. Geçici mil çok kutupluluğu deneyimmitotik hücreler, anafaz sırasında kromozomların gecikmesine neden olan bağlanma hatalarına karşı hassastırlar ve hücre döngüsünün sonraki G1 evresinde mikronüklei oluştururlar. Bu tür defektler bu canlı hücre görüntüleme yaklaşımları ile belirgindir.
Mitoz bölünmenin dinamik ilerlemesindeki değişiklikler mitotik zamanlamayı değiştirir ve mitotik hücre kaderini etkiler
Nükleer zarf ın parçalanmasının ardından mitotik ilerlemeyi, süreyi ve anafaza doğru ilerleyen hücrelerin akıbetini değerlendirmek için mitoz un evrelerinde mil oluşumu ve kromozom hareketi izlenebilir. Centrozsome amplifikasyon, kanser birçok türde yaygın bir özellik, ekstra centrosomes ve multipolar mil oluşumu varlığı ile karakterizedir18,19,20. Multipolar bölünmeler son derece aneuploid ve muhtemelen unviable kızı hücreleri neden olarak, kanser hücreleri aktif bir bipolar iğ oluşturmak için ekstra centrozomlar küme ve bipolar bölünme geçmesi5,20,21, 22,23,24. Canlı hücre görüntüleme yaklaşımlarını kullanarak, temsili sonuçlarımız normal centrozom içeriğine sahip hücrelerin 30 dakikanın altında bir bipolar bölünme elde etmek için metafaz hizalaması ve anafaz başlangıcı ile nükleer zarf dökümünden ilerleyebildiğini göstermektedir ( Şekil 4 A,D,E). Ekstra sentrozomların varlığında, hücrelerin yaklaşık %50'si geçici çok kutuplu mitotik milin üstesinden gelebilmekte ve bipolar iğ ve tam hücre bölünmesi oluşturabilmiştir(Şekil 4C,D). Kalan hücreler bipolar iğelde edemezler ve sonuç olarak çok kutuplu bir bölünme yoluyla mitoz bölünmeden çıkarlar (Şekil 4B,D). Mili bipolarite sağlanıp sağlanmadığına bakılmaksızın, ekstra sentrozomlu hücreler 2 sentrozomlu hücrelere göre önemli ölçüde artmış mitoz süresi sergiler, bu da mitotik progresyon dinamiğinin mitotik sonuç belirgin değildir (Şekil 4E).
Şekil 1: Mikroskop ve kamera parametrelerinin seçimi. (A) Görüntü edinme yazılımı kullanarak istenilen nesnel ve uygun filtre küpünü seçmek için pencerenin gösterimi. Gösterilen 20x büyütme hedefi ve brightfield filtre küpseçimidir. (B) Örnek plakadaki hücreler parlak alan veya faz kontrast mikroskopisi kullanılarak bulunur ve odak noktası haline getirilir. (C) Her görüntü yakalama için pozlama parametrelerini ayarlamak için pencerenin gösterimi. Piksel binning, gerekirse, yakalama başına pozlama süresini azaltmak ve hücrelere verilen fotoğraf hasarını en aza indirmek için kullanılabilir. Ölçek çubuğu 10 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Görüntü yakalama ve hızlandırılmış mikroskopi analizi. (A ve B) Görüntü edinme parametrelerinin NIS Elements HCA iş görüntü edinme yazılımı kullanılarak nasıl ayarlanır belirten pencerenin gösterimi. Bu yazılım zaman içinde çok eşgüdümlü, çok iyi görüntüleme sağlar. Her iş, yakalanacak kuyuları ve koordinatları belirtmek için değiştirilebilir. (C) Bir denemenin dört koşulundan tek zaman dilimleri. RFP-H2B kromatini izlemek için kullanılır. Kromatin sıkıştırma ve konumlandırma mitoz farklı aşamalarını tanımlamak için kullanılır: Prometafaz (kromozom hizalama yokluğunda sıkıştırma, mavi ok başı), Metafaz (hücre ekvatorda tam kromozom hizalaması, sarı ok başı) ve Anafaz (senkron kromozom ayrımının başlatılmasından sonra, beyaz ok ucu). Ölçek çubuğu 10 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Hızlandırılmış görüntüleme, mitotik vefadaki kusurları görselleştirir. Ekstra centrozomlar içeren hücreler çok kutuplu iğler oluşturur lar ve hücre bölünmesini tamamlamadan önce genellikle onları bipolar iğde kümelerler. Burada, bir hücre mitoz girer yedi farklı iğ kutupları (beyaz yıldız) olan, zaman içinde, iki ana mil kutupları kümelenmiş. Bu noktada, kromozomlar iğ ekvatoru boyunca hizalanabilir ler ve hücre anafaza doğru ilerler. Geçici çok kutupluluk tek bir kromozomun mal ekine izin verdi. Bu çözülmemiş hata, anafaz sırasında bir kız hücresindeki mikronükleusa dahil olan (okla etiketlenmiş) bir gecikmekromozomu yla sonuçlanır. Kromatin RFP-Histon 2B ile, mikrotübüller α-tubulin-EGFP ile görselleştirilmiştir. Her paneldeki zaman damgaları, nükleer sınır içinde tubulin tespiti ile değerlendirilen görünen nükleer zarf dökümüne ilişkin dakikaları gösterir. Ölçek çubuğu 5 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Mitozbölünmenin dinamik ilerlemesindeki değişiklikler mitotik zamanlamayı değiştirir ve mitotik hücre kaderini etkiler. Kırmızı renkle gösterilen RFP-H2B kromatin hareketini izlemek için kullanılır ve yeşil renkte gösterilen α-tubulin-GFP, sentrozom/mil kutup numarasını ve organizasyonunu izlemek için kullanılır. GFP-tubulin inçekten dışlanması, erken kromatin sıkıştırma ile eşzamanlı olarak kaybolması, nükleer zarfın mitotik hücre bölünmesine hazırlık olarak bozulduğunun (NEB) bir göstergesidir. GFP-tubulin nükleer dışlama mitotik çıkış ve nükleer zarf ın reform ile belirgindir. (A) İki centrozomlu bir hücre bipolar iğ oluşturur ve anafaz boyunca ilerleyerek iki kız hücresi oluşturur. (B ve C) Ekstra centrozomlu hücreler çok kutuplu bir iğ oluşturmak için mitoz girerler. (B) Ekstra centrozomları olan bu hücrelerin bazıları bipolar iğe ulaşmadan mitoz bölünmeyi geciktirir ve multipolar anafazı tamamlamak için ilerleme kaydeder. (C) Ekstra centrozomları olan diğer hücreler, bipolar anafazı etkinleştirmek için ekstra centrozomları kümelerken mitotik progresyonda geçici bir gecikme sergilerler. (D) Ekstra centrozomlu hücreler zaman yaklaşık %50'si bipolar bölünmeye uğrarken, ekstra centrozomlu kalan hücreler çok kutuplu bir bölünmeye uğrar. (E) Ekstra centrozomlu hücreler, nihai mitotik kadere (bipolar veya çok kutuplu anafaz) bakılmaksızın mitotik zamanlamayı artırmıştır. Ölçek çubuğu 5 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zaman atlamalı görüntüleme tarafından sağlanan zamansal çözünürlük, tek hücre içindeki ardışık hücresel olayların görselleştirilmesini ve değerlendirilmesini sağlar. Hücre senkronizasyonunu ve ardından hücrelerin ardışık zaman noktalarında toplanması ve fiksasyonundan yararlanan yaklaşımlar, sonuçta hücre popülasyonları arasında karşılaştırmalar yapılmasıyla sınırlıdır. Pertürbasyonlara hücresel yanıtın tekdüze olmadığı veya görselleştirilen sürecin dinamik olduğu bağlamlarda, canlı hücre zaman atlamalı görüntüleme, hem tek hücrenin dinamiklerini hem de heterojenliği takip etmek ve analiz etmek için daha iyi donatılmıştır. hücresel bir popülasyon içinde. Bu şekilde, hızlandırılmış görüntüleme mitoz dinamik aşamalarında hücre ilerlemesini izleme ve bu ilerleme için pertürbations sonuçta mitotik hücre bölünmesi ve sonraki hücre kaderi sadakat nasıl etkilediğini değerlendirilmesinde özellikle yararlıdır.
Canlı hücre görüntülemenin bir takım avantajları olmakla birlikte, mümkün olduğunda göz önünde bulundurulması ve hafifletilmesi gereken önemli zorluklar ilişkilidir. Bir sorun görüntüleme sırasında hücre canlılığı ve çoğalması sağlamak için uygun çevre koşulları korumaktır. Bunu başarmak için, görüntüleme kurulumu hem sıcaklığı hem de CO2'yi düzenleyen bir çevre odası içermelidir. Alternatif olarak, hücreler kapalı bir odada yapılırsa sadece sıcaklık regülasyonu ile kısa vadeli görüntülenebilir. Her iki durumda da, eksenel odak dalgalanmalarını azaltmak için titreşim önleyici tablo ve/veya donanım tabanlı yaklaşımlar (örneğin, Nikon'un Mükemmel Odaklama) deney boyunca plaka odağı sağlamak için kullanılmalıdır. Canlı hücre görüntüleme ile ikinci önemli endişe fotohasar ve fotobeyazrlama potansiyelidir. Fotobeyaztma, görüntülenmenin, görüntüleme ilerledikçe floresan şiddetinde giderek azaldığı bir konudur. Ancak, fotobeyazrlama ile sonuçlanan yüksek yoğunluklu uyarma ışığına maruz kalma da hücreler için toksiktir ve maruz kalma sürelerini, görüntü edinme aralıklarını ve görüntüleme dizisinin toplam süresini azaltarak hücre maruziyetini en aza indirmek için dikkatli olunmalıdır. 25. Fototoksisiteyi en aza indirmek için görüntüleme koşullarını optimize etmemenin sonuçları, DNA hasarının ve deneyin yorumlanması ve anlaşılmasını tehlikeye atabilecek diğer hücresel değişikliklerin oluşumunu içerebilir. Hücre canlılığı uzun süreli görüntüleme ile ilgili bir sorun haline gelirse, piksel binning (daha kısa pozlama sağlamak için) kullanmak ve sonraki görüntü yakalamalar arasındaki süreyi artırmak için çaba gösterilmelidir. Bir diğer endişe, floresan etiketinin erimiş olduğu proteinin davranışını değiştirebileceği ya da viral ekspresyonun genoma entegrasyonunun hücresel davranışı etkileyebileceğidir. Floresan etiket eklenmesinin protein fonksiyonunu etkileyebilme olasılığını hesaba katmak için, N veya C terminalfloresan etiketinin eklenmesinden sonra protein fonksiyonunun değerlendirilmesi ve etiketlenmemiş protein fonksiyonu ile karşılaştırılması gereklidir. Viral yapının entegre edildiği genomik lokusun tedirginliği nedeniyle hücre davranışı üzerinde olumsuz etkilerin ortaya çıkıp çıkmadığını belirlemek için, etiketli proteinden yoksun hücrelerle karşılaştırıldığında birden fazla tek hücreklisi elde edilmeli ve monitörtest edilmelidir. hücresel fitness ve mitotik ilerleme tedirgin değildir. Alternatif olarak, viral ekspresyon yapısının rastgele entegrasyonunun hedef dışı etkileri, CRISPR tabanlı yaklaşımlar kullanılarak füzyon proteininin endojen çekirgeye veya genomun diğer bilinen bölgelerine hedefli entegrasyonu ile azaltılabilir.
Mitotik progresyonun başlıca düzenleyicilerini belirlemek ve karakterize etmek için yaklaşımlar ağır şekilde sabit hücre görüntülemesine dayanmaktadır. Bu şekilde tanımlanan mitotik regülatörler daha sonra hızla çoğalan kanser hücrelerini hedefleyen terapötik istismar edilmiştir7,8,9. Ancak, antimitotik ilaçlar her zaman farklı kanserlerde düzgün bir performans sergilemez ve birçok durumda başarılı ya da başarısız kemoterapötik yaklaşımlardan önce gelen mitotik fenotiplerin içgörüsü belirsizliğini korumaktadır. Mil-pertürbing ilaçların varlığı ve yokluğunda mitotik hücreleri izlemek için canlı hücre zaman atlamalı görüntüleme felaket mitozlar ve tehlikeye canlılık neden olma olasılığı en yüksek olan modülatörleri tanımlamak için gerekli içgörü sağlamak için potansiyele sahiptir normal hücreler üzerinde en az etkisi ile kanser hücreleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
DLM bir NSF GRFP tarafından desteklenir. ALM, Smith Aile Biyomedikal Araştırmada Mükemmellik Ödülü'nden gelen fonla desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | A serine protease used to release adherent cells from culture dishes |
| 15ml centrifuge tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objective | Nikon | For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | For use in retroviral transfection; used in step 1.1 |
| a-tubulin-EGFP | Addgene | various numbers | Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells |
| C02 | Airgas | For use in cell culture and live cell imaging | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin |
| disposable glass Pastuer pipets, sterilized | Fisher Scientific | 13-678-6A | For use in aspirating cells |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Cell culture medium supplement |
| Lipofectamine 3000 and p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4 |
| Multi well Tissue Culture dishes | Corning | various | for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotic used in cell culture medium |
| phosphate bufferred saline (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | sterile saline solution for use with cell culture |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells |
| RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | various numbers | Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs |
| RPE-1 cells | ATCC | CRL-4000 | Human retinal pigment epithelial cell line |
| Tissue culture dish 100x20mm | Corning | 353003 | for use in culturing adherent cells |
| Zyla sCMOS camera | Nikon | Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells |
References
- Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
- Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis. PLoS One. 11, e0157491 (2016).
- Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint. The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).
- Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells. Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).
- van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M.
- Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death and Diseases. 3, 411 (2012).
- Martin, M., Akhmanova, A. Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization. Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).
- Vitre, B. D., Cleveland, D. W. Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy. Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).
- Godinho, S. A., Pellman, D. Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).
- Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes. Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).
- Conte, N., et al. TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer. Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).
- Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 125, 4391-4402 (1998).
- Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces. Molecular Cancer. 10, 131 (2011).
- Chan, J. Y. A clinical overview of centrosome amplification in human cancers. International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).
- Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death. Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4, e6564 (2009).
- Nigg, E. A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression? Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).
- Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).
- Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering. Science. 307, 127-129 (2005).
- Magidson, V., Khodjakov, A.
