Her præsenterer vi en metode til at vælge for nye varianter af E. coli biotin-protein Ubiquitinligase BirA at biotinylates et specifikt mål peptid. Protokollen beskriver opførelsen af en plasmid for bakteriel visning af målet peptid, generation af en BirA bibliotek, udvælgelse og karakterisering af BirA varianter.
Biotin er en attraktiv post-translationel modifikation af proteiner, der giver en kraftfuld tag til isolering og påvisning af protein. Enzymatisk biotinylering af E. coli biotin-protein Ubiquitinligase BirA er meget specifik og giver mulighed for biotinylering af målproteiner i deres oprindelige miljø; Men, den nuværende brug af BirA medieret biotinylering kræver tilstedeværelsen af en syntetisk acceptor peptid (AP) i målet protein. Derfor er dens anvendelse begrænset til proteiner, der er blevet konstrueret til at indeholde AP. Formålet med denne protokol er at anvende bakterie visningen af et peptid afledt af et ikke-modificeret målprotein til at udvælge de varianter af BirA, som biotinylerer peptid. Systemet er baseret på en enkelt plasmid, der giver mulighed for Co-ekspression af BirA varianter sammen med et stillads for peptid displayet på den bakterielle overflade. Protokollen beskriver en detaljeret procedure for inkorporering af målet peptid i displayet stillads, oprettelse af BirA bibliotek, udvælgelse af aktive BirA varianter og indledende karakterisering af de isolerede BirA varianter. Metoden giver et meget effektivt udvælgelsessystem til isolering af nye BirA varianter, der kan bruges til yderligere rettet udvikling af biotin-protein ligaser, der biotinylate et indfødt protein i komplekse opløsninger.
Biotinylering af et protein skaber en kraftfuld tag for sin affinitet isolation og detektion. Enzymatisk protein biotinylering er en meget specifik post-translationel modifikation katalyseret af biotin-protein-ligaser. E. coli biotin-protein Ubiquitinligase BirA er yderst specifik og kovalent biotinylater kun et begrænset antal naturligt forekommende proteiner ved specifikke lysinrester1. Fordelene ved BirA katalyseret biotinylering udnyttes i øjeblikket ved at fusing målproteinet med en lille syntetisk 15-aminosyre biotin acceptor peptid (AP), der effektivt er biotinyleret2 og giver mulighed for den meget specifikke og effektiv in vivo-og in vitro-biotinylering ved co-ekspression eller tilsætning af BirA3,4,5. Selvom in vivo og in vitro-katalyseret biotin-protein ligering er en attraktiv mærknings strategi, er dens anvendelse begrænset til prøver, der indeholder AP-smeltet proteiner. Formålet med denne metode er at udvikle nye mutanter af biotin-protein-ligaser, der selektivt biotinylerer indfødte umodificerede proteiner og derved udvider antallet af anvendelser, hvor den enzymatiske biotinyleringstrategi kan anvendes.
Protein funktionen kan udvikles gennem iterativ runder af genmutationen, udvælgelsen og amplificeringen af genvarianter med den ønskede funktion. En stærk og effektiv udvælgelses strategi er afgørende for den instruerede evolution og biotin-protein ubiquitinligase aktivitet er let udvalgt på grund af den stærke binding mellem biotin og streptavidin og dens homologer6. Phage display Technologies giver mulighed for udvælgelse af fager, der viser biotinylerede peptider7,8. Da forstærkning af isolerede fager kræver infektion af en bakteriel vært, men fagtypning udvælgelse med streptavidin skaber en flaskehals i, at den høje affinitet binding af biotin til streptavidin er næsten irreversibel under ikke-denaturering Betingelser. For at sikre reversibel binding af biotinylerede fager blev der anvendt monomeriske avidiner med lavere affinitet, hvilket resulterede i en beskeden ~ 10-fold berigelse7. Vi har for nylig udviklet en bakteriel visningsmetode til isolering af nye BirA varianter, der eliminerer behovet for eluering fra Affinity matrix og dermed fjerner en flaskehals fra tidligere BirA udvælgelsessystemer9. Faktisk giver vores bakterielle display system mulighed for en > 1, 000, 000-fold berigelse af aktive kloner i et enkelt valg trin9, hvilket giver et effektivt udvælgelsessystem for den rettede udvikling af nye BirA varianter.
Vores bakterielle display system består af to komponenter, BirA med en C-Terminal 6xHis tag og et stillads protein, der giver mulighed for overfladen visning af et mål peptid. Vi brugte stilladset protein forbedret cirkulært permuteret ydre membran protein X (eCPX), da den effektive visning af peptider kan observeres på både N-og C-Termini10,11. Den fusion af Target peptid sekvens til C-endestation af eCPX sikrer biotinylering af bakterier, som udtrykker aktive BirA varianter. Bakterierne giver mulighed for et effektivt streptavidin-valg, da det biotinylerede peptid nu vises på overfladen (figur 1a).
Formålet med denne metode er at udvælge nye varianter af BirA, som biotinylater peptidsekvenser til stede i indfødte proteiner. Systemet er kodet af gener, der findes på plasmid pBAD-BirA-eCPX-AP, som indeholder en Arabinose-inducerbar promotor, som kontrollerer BirA (araBAD), og en T7-promotor, som styrer eCPX9 (figur 1b). Denne protokol beskriver den detaljerede procedure for 1) inkorporering af et peptid afledt af et målprotein i C-terminalen af ecpx, 2) oprettelse af et Mutations Library of BirA med fejlbehæftet PCR, 3) udvælgelse af streptavidin-binding bakterier ved magnetisk-aktiveret celle sortering (MACS), 4) kvantificering af bakterie berigelse, og 5) indledende karakterisering af isolerede kloner.
Som for alle udvælgelsesmetoder er stringens af vaske trinene af allerstørste vigtighed. Da bakterier ikke behøver at blive elueret fra perlerne før amplificeringen af de valgte kloner, kan den høje affinitets binding mellem biotin og streptavidin anvendes i stedet for at bruge lavere affinitet avidiner, som tidligere gjort med fagtypning display system, for udvælgelsen af BirA varianter7,8. Dette sikrer, at sjældne kloner udvælges, og at ikke-biotinylere…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Mohamed Abdullahi Ahmed for ekspert teknikeren assistance. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Lundbeck fonden, Novo Nordisk Fonden, den danske nyre forening, Aase og Ejnar Danielsen Foundation, A.P. Møller fonden til fremme af lægevidenskaben, og Knud og Edith Eriksen Memorial Foundation.
10% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561033 | |
Ampicilin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
ApE – A plasmid editor v2.0 | NA | NA | downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ |
Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DPBS (10X), no calcium, no magnesium | ThermoFischer Scientific | 14200083 | |
DpnI restriction enzyme | New England BioLabs | R0176 | |
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFischer Scientific | 65001 | |
GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | PLN350 | |
GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit | Agilent Technologies | 200552 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
Immobilon-P PVDF Membrane | Millipore | IPVH15150 | |
IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
NEB 5-alpha Competent E. coli | New England BioLabs | C2987 | |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFischer Scientific | NP0007 | |
NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | ThermoFischer Scientific | NP0009 | |
pBAD-BirA-eCPX-AP | Addgene | 121907 | Used a template and positive control |
pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) | Addgene | 121908 | negative control |
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491 | For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
Skim Milk Powder | Sigma-Aldrich | 70166 | |
Streptavidin-HRP | Agilent Technologies | P0397 | |
T7 Express lysY/Iq Competent E. coli | New England BioLabs | C3013 | |
Tryptone | Millipore | T9410 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL103001EA | |
Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |