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Neuroscience

मल्टी-फाइबर फोटोमेट्री फ्रीली-मोविंग जानवरों में तंत्रिका गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए

Published: October 20, 2019 doi: 10.3791/60278
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1CERVO Brain Research Center, Department of Psychiatry and Neurosciences, Université Laval, 2Center for Neural Circuits and Behavior, Department of Neuroscience and Section of Neurobiology, Division of Biology, University of California at San Diego, 3Neurophotometrics Ltd.

Summary

इस प्रोटोकॉल विवरण कैसे लागू करने के लिए और बहु फाइबर photometry रिकॉर्डिंग प्रदर्शन, कैसे कैल्शियम स्वतंत्र कलाकृतियों के लिए सही करने के लिए, और दोहरी रंग photometry इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण विचार.

Abstract

एक स्वतंत्र रूप से चलती जानवर में न्यूरॉन्स के एक समूह की गतिविधि रिकॉर्डिंग एक चुनौतीपूर्ण उपक्रम है. इसके अलावा, के रूप में मस्तिष्क छोटे और छोटे कार्यात्मक उपसमूहों में विभाजित है, यह अनुमानों से रिकॉर्ड करने के लिए सर्वोपरि हो जाता है और / फाइबर फोटोमेट्री एक सुलभ और शक्तिशाली दृष्टिकोण है जो इन चुनौतियों को दूर कर सकता है। ऑप्टिकल और आनुवंशिक तरीकों के संयोजन से, तंत्रिका गतिविधि आनुवंशिक रूप से encoded कैल्शियम संकेतक है, जो एक ऑप्टिकल संकेत है कि आसानी से मापा जा सकता है में तंत्रिका गतिविधि अनुवाद व्यक्त करके गहरे मस्तिष्क संरचनाओं में मापा जा सकता है. वर्तमान प्रोटोकॉल एक बहु फाइबर photometry प्रणाली के घटकों का विवरण, कैसे गहरी मस्तिष्क संरचनाओं का उपयोग करने के लिए उद्धार और प्रकाश इकट्ठा, गति कलाकृतियों के लिए खाते में एक विधि, और कैसे प्रक्रिया और फ्लोरोसेंट संकेतों का विश्लेषण करने के लिए. प्रोटोकॉल विवरण प्रयोगात्मक विचार जब एकल और दोहरी रंग इमेजिंग प्रदर्शन, या तो एक या एकाधिक प्रत्यारोपित ऑप्टिक फाइबर से.

Introduction

एक जानवर के व्यवहार के विशिष्ट पहलुओं के साथ तंत्रिका प्रतिक्रियाओं सहसंबंधित करने की क्षमता भूमिका न्यूरॉन्स के एक विशेष समूह को निर्देशित करने या एक कार्रवाई या उत्तेजना के जवाब में खेलता है समझने के लिए महत्वपूर्ण है. पशु व्यवहार की जटिलता को देखते हुए, आंतरिक राज्यों और बाहरी उत्तेजनाओं के असंख्य है कि कार्यों का भी सरलतम को प्रभावित कर सकते हैं के साथ, एकल परीक्षण संकल्प के साथ एक संकेत रिकॉर्डिंग इन पर काबू पाने के लिए आवश्यक उपकरणों के साथ शोधकर्ताओं से लैस सीमाओं.

फाइबर photometry क्योंकि विवो रिकॉर्डिंग तकनीक में अन्य की तुलना में अपनी रिश्तेदार सादगी के सिस्टम तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में कई शोधकर्ताओं के लिए पसंद की तकनीक बन गया है, अपने उच्च संकेत करने के लिए शोर अनुपात, और की एक किस्म में रिकॉर्ड करने की क्षमता व्यवहार प्रतिमान1,2,3,4,5,6,7,8. पारंपरिक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल तरीकों के विपरीत, photometry ऑप्टिकल दृष्टिकोण सबसे अधिक आनुवंशिक रूप से encoded कैल्शियम संकेतक (GECIs, GCaMP श्रृंखला)9के साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है. जीईसी के आधार पर फ्लोरेसिस की अपनी क्षमता में परिवर्तन होता है कि वे कैल्शियम से बंधे हैं या नहीं। क्योंकि न्यूरॉन्स में कैल्शियम की आंतरिक एकाग्रता बहुत कसकर विनियमित है और वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल खुला जब एक न्यूरॉन एक कार्रवाई की क्षमता आग, क्षणिक आंतरिक कैल्शियम एकाग्रता में वृद्धि, जो क्षणिक में वृद्धि में परिणाम फ्लोरोसेंट के लिए एक जीसीआई की क्षमता, न्यूरॉन फायरिंग9के लिए एक अच्छा प्रॉक्सी हो सकता है।

फाइबर photometry के साथ, उत्तेजना प्रकाश मस्तिष्क में एक पतली, multimode ऑप्टिक फाइबर नीचे निर्देशित है, और एक उत्सर्जन संकेत वापस एक ही फाइबर के माध्यम से एकत्र की है. क्योंकि इन ऑप्टिक फाइबर हल्के और bendable हैं, एक जानवर काफी हद तक unhindered स्थानांतरित कर सकते हैं, इस तकनीक व्यवहार परीक्षण और शर्तों की एक विस्तृत सरणी के साथ संगत बना रही है. कुछ शर्तों, जैसे तेजी से आंदोलनों या त्रिज्या जिस पर यह कुल आंतरिक प्रतिबिंब बनाए रख सकते हैं परे फाइबर ऑप्टिक पैच कॉर्ड के झुकने, संकेत कलाकृतियों परिचय कर सकते हैं. शोर से संकेत disambiguate करने के लिए, हम GCaMP के एक गुण का दोहन कर सकते हैं के रूप में जाना जाता है "isosbestic बिंदु." संक्षेप में, GCaMP के साथ, के रूप में उत्तेजना प्रकाश की तरंगदैर्ध्य बाईं ओर स्थानांतरित कर दिया है, कैल्शियम बाध्य राज्य में अपने उत्सर्जन कम हो जाती है और कैल्शियम असीमित राज्य में उत्सर्जन मामूली बढ़ जाती है. वह बिंदु जिस पर इन दो उत्सर्जनों की सापेक्ष तीव्रता बराबर है, उसे समस्थाक बिंदु कहते हैं। जब GCaMP इस बिंदु पर उत्साहित है, अपने उत्सर्जन आंतरिक कैल्शियम सांद्रता में परिवर्तन से अप्रभावित है, और संकेत में विचरण सबसे अक्सर फाइबर ऑप्टिक पैच कॉर्ड या तंत्रिका ऊतक के आंदोलन के overbending से संकेत के क्षीणन के कारण है प्रत्यारोपित फाइबर के सापेक्ष.

एकल इकाई इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अभी भी अपने एकल सेल और एकल स्पाइक स्तर संकल्प के कारण विवो रिकॉर्डिंग में स्वतंत्र रूप से आगे बढ़ने के लिए सोने के मानक है। हालांकि, यह दर्ज की जा रही कोशिकाओं की आणविक पहचान इंगित करने के लिए मुश्किल हो सकता है, और पोस्ट-हॉक विश्लेषण काफी कठिन हो सकता है। जबकि फाइबर photometry एकल सेल संकल्प नहीं है, यह शोधकर्ताओं पारंपरिक तकनीकों के साथ पता करने के लिए असंभव सवाल पूछने के लिए अनुमति देता है. ट्रांसजेनिक जानवरों के साथ वायरल रणनीतियों के संयोजन, GECIs की अभिव्यक्ति जनसंख्या दर्ज करने के लिए आनुवंशिक रूप से परिभाषित न्यूरॉन प्रकार के लिए निर्देशित किया जा सकता है- या प्रक्षेपण परिभाषित तंत्रिका गतिविधि, जो एक्सॉन में सीधे कैल्शियम संकेत की निगरानी द्वारा किया जा सकता है टर्मिनल10,11. इसके अलावा, कई फाइबर ऑप्टिक cannulas प्रत्यारोपण द्वारा, यह एक ही जानवर12,13में कई मस्तिष्क क्षेत्रों और रास्ते से तंत्रिका गतिविधि पर नजर रखने के लिए संभव है.

इस पांडुलिपि में, हम एकल और बहु फाइबर photometry के लिए एक तकनीक का वर्णन, कैसे कैल्शियम स्वतंत्र कलाकृतियों के लिए सही करने के लिए, और विस्तार कैसे मोनो प्रदर्शन करने के लिए- और दोहरे रंग रिकॉर्डिंग. हम उन प्रश्नों के प्रकारों के उदाहरण भी प्रदान करते हैं जो यह किसी को पूछने में सक्षम बनाता है और उनके जटिलता के बढ़ते स्तर (चित्र 1देखें)। इस प्रोटोकॉल में विस्तृत बहु फाइबर रिकॉर्डिंग के लिए फाइबर photometry सेटअप https://sites.google.com/view/multifp/hardware में पाया सामग्री की एक सूची का उपयोग कर बनाया जा सकता है (चित्र 2).

यह आवश्यक है कि प्रणाली दोनों के लिए सुसज्जित किया जाना 410 एनएम और 470 एनएम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य कैल्शियम स्वतंत्र और कैल्शियम पर निर्भर fluorscence उत्सर्जन के लिए GCaMP6 या इसके वेरिएंट से. कस्टम निर्मित setups के लिए या यदि सिस्टम को चलाने के लिए कोई उपलब्ध सॉफ़्टवेयर नहीं है, तो मुक्त, खुला स्रोत प्रोग्राम Bonsai (http://www.open-ephys.org/bonsai/) का उपयोग किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, फाइबर photometry MATLAB के माध्यम से चलाया जा सकता है (उदा. https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)12 या अन्य प्रोग्रामिंग भाषा14. सॉफ्टवेयर और प्रणाली के हार्डवेयर दोनों 410 एनएम और 470 एनएम एल ई डी और कैमरा, छवियों की निकासी के हेरफेर की अनुमति चाहिए (चित्र 2), और ब्याज के क्षेत्रों में मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता की गणना (आरओआई) पर फाइबर के आसपास तैयार छवियों. उत्पादन मतलब तीव्रता मूल्यों की एक मेज होना चाहिए 470 एनएम और पैच कॉर्ड में प्रत्येक फाइबर से 410 एनएम एल ई डी के साथ दर्ज की गई. बहु फाइबर प्रयोगों प्रदर्शन करते समय, 400 डिग्री मीटर बंडल फाइबर चूहों के आंदोलन को सीमित कर सकते हैं. ऐसे मामलों में, हम 200 डिग्री पैच डोरियों का उपयोग करने की सलाह देते हैं, जो अधिक लचीलापन प्रदान करते हैं। यह भी चूहों के प्रशिक्षण के दौरान छोटे डमी केबल का उपयोग करने के लिए संभव हो सकता है.

यह फाइबर photometry अधिग्रहण के दौरान ब्याज की घटनाओं के लिए समय अंक निकालने के लिए सक्षम होने के लिए महत्वपूर्ण है. यदि सिस्टम विशिष्ट ईवेंट के लिए टीटीएल को एकीकृत करने के लिए आसानी से अंतर्निहित सिस्टम प्रदान नहीं करता है, तो प्रयोग के दौरान विशिष्ट समय और ईवेंट के साथ संरेखित करने के लिए रिकॉर्ड किए गए अलग-अलग समय बिंदुओं को एक समय मोहर असाइन करने के लिए एक वैकल्पिक रणनीति है. समय मुद्रांकन कंप्यूटर घड़ी का उपयोग किया जा सकता है.

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Protocol

सभी प्रयोगों संस्थागत पशु देखभाल और कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, सैन डिएगो, और देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए कनाडा गाइड के उपयोग के अनुसार किया गया था और Universit ] Laval पशु संरक्षण द्वारा अनुमोदित किया गया समिति.

1. CMOS (पूरक धातु ऑक्साइड अर्धचालक) कैमरा और व्यक्ति या शाखा पैच कॉर्ड के बीच ऑप्टिकल पथ के संरेखण

  1. 5-अक्ष अनुवादक पर सभी शिकंजा ढीला (11, चित्र 2ठ)।
  2. पैच कॉर्ड में पेंच (12, चित्रा 2बी) एडेप्टर [SMA (उप-न्यूनतम ए) या एफसी (फाइबर ऑप्टिक कनेक्टर)] जो 5-अक्ष अनुवादक से चिपका हुआ है।
  3. कम शक्ति (100 डिग्री सेल्सियस) पर 470 एनएम उत्तेजना प्रकाश (1, चित्रा 2B) को चालू करें, और पैचकॉर्ड की नोक को एक ऑटोफ्लोरेसेंट प्लास्टिक स्लाइड की ओर इंगित करते हुए रखें। यह भविष्य रिकॉर्डिंग पर कोई असर नहीं है, लेकिन संरेखण प्रक्रिया visualizing के लिए पूरी तरह से है.
  4. लाइव मोड में CMOS कैमरा (13, चित्र 2B) से रिकॉर्ड। लाभ बढ़ाएँ या लुकअप तालिका (LUT) को समायोजित करें जब तक कि छवि पूरी तरह से काली नहीं है. यह बिंदु अभिदृश्यक के केन्द्रबिन्दु पर प्रतिबिंब को देखने में सक्षम होना है (10, चित्र 2ख)।
  5. उद्देश्य की ओर 5-अक्ष अनुवादक अग्रिम, यह सुनिश्चित करना है कि 470 एनएम प्रकाश पैच कॉर्ड के SMA या एफसी अंत में फाइबर पर केंद्रित है, जब तक एक छवि कैमरे पर हल किया जा सकता है.
  6. X और Y अक्षों को तब तक समायोजित करें जब तक कि छवि केंद्रित और सुसंकल्प न हो जाए.
  7. पैच कॉर्ड के फेरूल-एंड से उत्सर्जित प्रकाश को विज़ुअलाइज़ करें। यह एक समस्थानिक चक्र के रूप में प्रकट होना चाहिए. यदि एक शाखा पैच कॉर्ड का उपयोग किया जाता है, तो प्रत्येक पैच कॉर्ड के फेरूल-एंड्स पर उत्सर्जित प्रकाश की मात्रा समान होनी चाहिए। यदि वृत्त समस्थानिक नहीं है या उत्सर्जित प्रकाश असमान है, तो X-Y अक्ष में 5-अक्ष अनुवादक को समायोजित करें।

2. मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता की माप के लिए फाइबर के आसपास ROIs का सेटअप

  1. बेहतर फाइबर कल्पना करने के लिए सभी उत्तेजना रोशनी चालू करें. कैमरा लाभ को इस तरह समायोजित करें कि कोई पिक्सेल संतृप्त नहीं है और फाइबर की एक स्पष्ट छवि मौजूद हैं।
  2. लाइव रिकॉर्ड या एक प्रारंभिक छवि ले लो।
  3. रेशों के चारों ओर आरओआई बनाएँ और उन्हें रिकॉर्डिंग के दौरान माध्य तीव्रता मानों की माप के लिए रखें (चित्र 2क)।
  4. कई फाइबर रिकॉर्डिंग के लिए, संकेतों में स्वतंत्रता के लिए परीक्षण.
    1. सभी फाइबर से लाइव रिकॉर्ड.
    2. एक प्रकाश स्रोत की ओर एक फाइबर बिंदु और एक उंगली से नल. बहुत बड़े उतार चढ़ाव पूरी तरह से उस चैनल में होना चाहिए (स्वीकार्य रिसाव 1:1000).
    3. यदि सिग्नल स्वतंत्र नहीं हैं, तो अधिक रूढ़िवादी ROIs को फिर से तैयार करें और स्वतंत्रता परीक्षण को दोहराएँ.
  5. लेबल और जो रॉय का ट्रैक रखने के लिए जो फाइबर से मेल खाती है, रंगीन टेप या नेल पॉलिश फाइबर के अंत करने के लिए लागू किया जा सकता है. किसी भी प्रयोग के प्रारंभ से पहले कोई चित्र द्वितीयक अनुस्मारक के रूप में लें.

3. रिकॉर्डिंग क्षेत्र का सेटअप

  1. खड़ा है, clamps, या धारकों का उपयोग कर क्षेत्र के ऊपर पैच कॉर्ड लटका.
  2. सुनिश्चित करें कि जानवर स्वतंत्र रूप से पूरे क्षेत्र में स्थानांतरित कर सकते हैं, फाइबर की लंबाई से uninhibited.
  3. चाहे एक operant बॉक्स या खुले क्षेत्र का उपयोग किया जाता है, सुनिश्चित करें कि पैच कॉर्ड कम से कम झुकने के साथ जानवर तक पहुँचने में सक्षम हो जाएगा. यदि यह एक नाक प्रहार की आवश्यकता है, सुनिश्चित करें कि वहाँ पर्याप्त कमरे के ऊपर फाइबर के झुकने को रोकने के लिए है. पैच कॉर्ड के किसी भी अत्यधिक झुकने या घुमा से बचें।

4. विवो रिकॉर्डिंग में

नोट: फाइबर photometry प्रयोगों के लिए ऑप्टिक फाइबर cannula प्रत्यारोपण की प्रक्रिया के रूप में स्पार्टा एट अल15में वर्णित optogenetics के लिए प्रक्रिया के समान है. हम दंत सीमेंट का उपयोग करने की सलाह देते हैं (सामग्री की तालिकादेखें), जो खोपड़ी की हड्डी के लिए हेडकैप की मजबूत एंकरिंग प्रदान करता है। दंत सीमेंट उन मामलों में विशेष रूप से उपयोगी होगा जहां एंकरिंग शिकंजा का उपयोग नहीं किया जा सकता है।

  1. नेत्रहीन आंख से और एक minifiber माइक्रोस्कोप के साथ पैच कॉर्ड के फाइबर के दूर अंत का निरीक्षण. यदि फाइबर की सतह खरोंच है, फाइबर चमकाने का उपयोग कर फाइबर repolishs / ठीक धैर्य के साथ फिल्म lapping (1 $m और 0.3 $m).
  2. 70% इथेनॉल और एक कपास टिप applicator के साथ पैच कॉर्ड के distal समाप्त होता है साफ.
  3. 70% इथेनॉल और एक कपास टिप applicator का उपयोग कर फाइबर ऑप्टिक cannulas साफ करें.
  4. एक काले हटना ट्यूब के साथ कवर एक सिरेमिक विभाजन-स्लीव का उपयोग कर प्रत्यारोपित फाइबर के लिए पैच कॉर्ड के फेरूल अंत कनेक्ट करें। कनेक्शन के दौरान, सुनिश्चित करें कि आस्तीन तंग है, अन्यथा एक नई आस्तीन का उपयोग करें.
    नोट: वहाँ संकेत हानि की एक बड़ी राशि अगर वहाँ पैच कॉर्ड ferrule और प्रत्यारोपण के बीच कोई जगह है, और रिकॉर्डिंग काम नहीं करेगा.
  5. व्यवहार परीक्षण की शुरुआत से पहले कुछ मिनट के लिए ठीक करने के लिए पशु की अनुमति दें.
  6. ऑप्टिकल संकेत रिकॉर्डिंग शुरू और प्रयोग चलाते हैं.
  7. रिकॉर्डिंग करते समय, गुणवत्ता रिकॉर्डिंग सुनिश्चित करने के लिए लाइव-ट्रेस पर सावधानी से नजर रखें। संकेत रिकॉर्डिंग के पहले 2 मिनट में समय के एक समारोह के रूप में तेजी से कम होने की उम्मीद है. यह प्रभाव गर्मी मध्यस्थता एलईडी क्षय के कारण होता है, जिससे गर्मी में वृद्धि ऑप्टिकल तत्व के प्रतिरोध बढ़ जाती है.
  8. यदि संकेत है कि पर से अधिक से अधिक / बंद GCaMP की गतिजता होती है, यह अक्सर एक संकेत है कि आस्तीन काफी तंग नहीं है और पैच कॉर्ड और प्रत्यारोपण के बीच की जगह बदल रहा है. इस मामले में, प्रयोग बंद करो और एक नई आस्तीन का उपयोग कर जानवर को फिर से कनेक्ट.

5. फाइबर फोटोमेट्री डेटा विश्लेषण

नोट: यह सबसे रिकॉर्डिंग के लिए अच्छी तरह से काम करता है जो डेटा विश्लेषण के लिए एक विधि है। हालांकि, वैकल्पिक दृष्टिकोण लागू किया जा सकता है. डेटा विश्लेषण के लिए उदाहरण कोड यहाँ पाया जा सकता है: https://github.com/katemartian/Photometry_data_processing.

  1. निकालें मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता मूल्यों से दर्ज की गई 470 एनएम(Int470) और 410 एनएम(Int410) एल ई डी, प्रत्येक व्यक्ति फाइबर के लिए इसी.
  2. मूवचल माध्य कलन विधि का उपयोग करके प्रत्येक संकेत को चिकना करें (चित्र 3ए)
  3. ढलान और कम आवृत्ति को दूर करने के लिए अनुकूली पुनरावर्ती पुनरुत्तर रूप से दंडित किए गए न्यूनतम चौकोर (एयरपीएलएस) एल्गोरिथ्म (https://github.com/zmzhang/airPLS) का उपयोग करते हुए प्रत्येक संकेत का आधारभूत सुधार करें (चित्र 3ए और 3 बी) संकेतों में उतार-चढ़ाव।
  4. माध्य मान और मानक विचलन का उपयोग करके प्रत्येक संकेत का मानकीकरण करें (चित्र 3ग):
    Equation 1
  5. गैर-ऋणात्मक मजबूत रैखिक प्रतिगमन का उपयोग करना, फिट मानकीकृत zInt410 करने के लिए zInt470 संकेत (चित्र 3डी) प्रतिगमन समारोह के लिए:
    Equation 2
    1. रैखिक प्रतिगमन के मापदंडों का उपयोग करें (एक, ख) zInt 410 के नए मूल्यों को खोजने के लिए zInt410 करने के लिए फिट(fitIn410, चित्रा 3डी, ई)
      Equation 3
  6. सामान्यीकृत डी एफ/एफ की गणना करना (z dF/F)(चित्र ा)ा
    Equation 4

6. एक साथ दोहरे रंग रिकॉर्डिंग

  1. फोटोमेट्री प्रणाली में जोड़ें एक 560 एनएम एलईडी लाल फ्लोरोसेंट कैल्शियम सेंसर और उपयुक्त dichroic दर्पण और फिल्टर उत्तेजित करने के लिए (देखें किम एट अल., विवरण के लिए 2016 विस्तृत)12.
  2. हरे और लाल उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य को अलग करने के लिए उद्देश्य और CMOS कैमरा के बीच एक छवि विभाजक जोड़ें (चित्र 5देखें)। छवि विभाजक कैमरा सेंसर पर दो प्रतिबिंबित छवियों के रूप में होगा, लाल और हरे संकेतों के लिए इसी (उदा., 3 शाखाओं के साथ एक पैच कॉर्ड 6 फाइबर के साथ एक छवि पैदा करेगा).
  3. ऊपर विस्तृत के रूप में दोनों रंगों में सभी फाइबर के आसपास ROIs ड्रा. संबंधित फाइबर और चैनल (हरा और लाल)(चित्र 4क)के साथ प्रत्येक ROI को स्पष्ट रूप से पहचानना सुनिश्चित करें ।
  4. ट्रिगर 470 एनएम और 560 एनएम एल ई डी के साथ एक साथ उत्तेजना और उन्हें 410 एनएम एलईडी के साथ वैकल्पिक (चित्र 5एक) .

7. दोहरी रंग डेटा विश्लेषण

  1. Int470 संकेत के लिए fitInt410 खोजने के लिए अनुभाग 5 में दिए गए चरणों का पालन करें और z dF/Fकी गणना करें।
  2. क्योंकि लाल-स्थानांतरित GECIs के लिए isosbestic बिंदु आम तौर पर अज्ञात है, संकेत के साथ दर्ज की गई 410 एनएम हरी चैनल में एलईडी दोनों चैनलों में आंदोलन सुधार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Int560 संकेत के लिए fitInt410 खोजने के लिए अनुभाग 5 में दिए गए चरणों का पालन करें और z dF/Fकी गणना करें।

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Representative Results

व्यवहार प्रतिक्रियाओं के तंत्रिका सहसंबंध कारकों की एक किस्म के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. इस उदाहरण में, हम विवो फाइबर photometry में इस्तेमाल पार्श्व hypothalamic क्षेत्र से एक्सॉन टर्मिनलों की गतिविधि को मापने के लिए (LHA) कि पार्श्व habenula (LHb) में समाप्त. जंगली प्रकार चूहों एक एडेनो संबद्ध वायरस के साथ इंजेक्ट किया गया (एएवी) एन्कोडिंग GCaMP6s (AAV-hSyn-GCaMP6s) LHA में और एक ऑप्टिक फाइबर तुरंत LHb के ऊपर टिप के साथ प्रत्यारोपित किया गया था (चित्र 4ए). GCaMP6s अभिव्यक्ति LHA के सेल निकायों में पाया जाता है और उनके एक्सॉन टर्मिनलों LHb, जहां कैल्शियम संकेत दर्ज किया जा सकता है के लिए पेश. LHA-LHb मार्ग के सक्रियण वास्तविक समय वरीयता परीक्षण में निष्क्रिय परिहार को बढ़ावा देता है सुझाव है कि इस मार्ग versive संकेतपहुंचाता 16. चूहे तो फाइबर photometry प्रणाली से जुड़े थे, 6 मिनट के लिए एक खुले मैदान में रखा, और 1 सेकंड versive airpuffs हर 60 सेकंड के संपर्क में. मापित फ्लोरोसेंट एयरपफ्स के प्रशासन के साथ समवर्ती रूप से काफी बढ़ गया (चित्र 4ब्-ब्)। हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) को व्यक्त करने वाले चूहों में, एयरफफ्स के प्रशासन के दौरान सिग्नल में कोई परिवर्तन नहीं पाया गया (चित्र 4ग)। व्यवहार परीक्षण के बाद, LHB ऊपर LHA और फाइबर प्लेसमेंट में इंजेक्शन की साइट हिस्टोलॉजिकल की पुष्टि की गई (चित्र 4ए)।

Figure 1
चित्र 1: शारीरिक और सेल-प्रकार विशिष्टता के साथ GECI अभिव्यक्ति के लिए रणनीतियाँ और पहुँच। (ए) एक वायरल वेक्टर एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) एन्कोडिंग GCaMP6 (AAV-GCaMP6) ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र में इंजेक्ट किया जाता है। ऑप्टिक फाइबर लंबे समय से कोशिका निकायों पर रखा टिप के साथ प्रत्यारोपित किया जा सकता है (1) या एक्सॉन टर्मिनलों पर (2). एक आनुवंशिक रूप से परिभाषित न्यूरॉन आबादी में चयनात्मक अभिव्यक्ति के लिए, एक cre-निर्भर AAV (उदाहरण के लिए, AAV-DIO-GCaMP6) ट्रांसजेनिक चूहों में इंजेक्शन किया जा सकता है एक विशिष्ट न्यूरॉन आबादी में cre recombinase व्यक्त. (बी)दोहरे रंग के कैल्शियम इमेजिंग के लिए, इस उदाहरण में एक एएवी-GCaMP6s ब्याज के एक मस्तिष्क क्षेत्र में इंजेक्शन है, और एक cre-निर्भर AAV एक लाल-स्थानांतरित जीसीआई एन्कोडिंग (उदाहरण के लिए, JrGECO1a; एएवी-DIO-JrGECO1a) एक लक्ष्य मस्तिष्क क्षेत्र में एक आनुवंशिक रूप से परिभाषित न्यूरॉन आबादी में इंजेक्शन है. ऑप्टिक फाइबर एक्सॉन टर्मिनलों (हरी फ्लोरोसेंट) और सेल निकायों (लाल फ्लोरोसेंट) के एक साथ कैल्शियम संकेत इमेजिंग के लिए प्रत्यारोपित किया जाता है। (सी) एक intersectional वायरल रणनीति के लिए, प्रतिगामी परिवहन गुणों के साथ एक वायरल वेक्टर (जैसे retroAAV17) cre recombinase एन्कोडिंग (retroAAV-cre) लक्ष्य मस्तिष्क क्षेत्र में एक साथ एक AAV-DIO-GCaMP6s इंजेक्शन के साथ इंजेक्शन है एक ही माउस में मस्तिष्क क्षेत्र पेश. ऑप्टिक फाइबर cannulas मजबूत कैल्शियम पर निर्भर संकेत रिकॉर्डिंग के लिए सेल निकायों पर प्रत्यारोपित कर रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: फाइबर फोटोमेट्री योजनाबद्ध। (ए) दो एल ई डी (410 एनएम और 470 एनएम) से उत्तेजना प्रकाश फिल्टर और द्विवर्णीय दर्पणों की एक श्रृंखला से गुजरता है और 20x उद्देश्य की कार्य दूरी पर एक उत्तेजना स्थल उत्पन्न करता है। प्रकाश या तो एक पैच कॉर्ड या बंडल फाइबर के माध्यम से गुजरता है (कई साइट रिकॉर्डिंग के लिए) कि प्रत्यारोपित cannulas से जुड़े हुए हैं. उत्सर्जित फ्लोरोसेंट एक ही फाइबर द्वारा एकत्र की है, फ़िल्टर्ड, और एक CMOS कैमरा सेंसर पर पेश किया. कब्जा कर लिया छवियों पर, मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता प्रत्येक फाइबर के ROIs पर दर्ज की गई है. एक साथ दोनों 410 एनएम और 470 एनएम एल ई डी से संकेत प्राप्त करने के लिए, एक समय विभाजन मल्टीप्लेक्सिंग (कम सही आरेख) लागू किया जाता है। (बी)हमारे कस्टम-निर्मित फोटोमेट्री सिस्टम और इसके घटकों की छवि: (1) 465 एनएम एलईडी करने के लिए फाइबर, (2) फाइबर 405 एनएम एलईडी करने के लिए, (3) Collimators, (4) 470 nm bandpass फिल्टर, (5) 410 एनएम bandpass फिल्टर, (6) 535 एनएम बैंडपास फिल्टर, (7) ट्यूब लेंस, (8) लंबे समय के साथ घनपास 425 dichroic दर्पण, (9) longpass 495 dichroic दर्पण के साथ घन, (10) 20x उद्देश्य, (11) 5-अक्ष अनुवादक, (12) मोनो- या बंडल फाइबर पैच कॉर्ड, (13) CMOS कैमरा. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: फाइबर प्रकाशमिति डेटा का विश्लेषण। (ए) चिकना माध्य फ्लोरोसेंट तीव्रता (Int) 470 एनएम (शीर्ष नीली रेखा) और 410 एनएम (नीचे बैंगनी रेखा) उत् उत्तेजना तरंगदैर्ध्य से दर्ज की गई। काली रेखाएँ एयरपीएल्स एल्गोरिथ्म का उपयोग करके आधारभूत पाए जाती हैं। (ख) आधारभूत सुधार के बाद संकेतों में सापेक्ष तीव्रता में परिवर्तन होता है। (सी) मानकीकृत 470 एनएम और 410 एनएम संकेतों (zInt470, शीर्ष; zInt410, नीचे). (घ)470 दउ तथा 410 दउ संकेतों का गैर-नकारात्मक मजबूत रैखिक फिट। (ई) फिट के आधार पर ट्रेस Int410 से Int470 के संरेखण। (च) फ्लोरोसेंट में कैल्शियम पर निर्भर परिवर्तन को सही और सामान्यीकृत किया गया है (ज डीएफ/ कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: प्रतिनिधि परिणाम. (क)प्रायोगिक प्रक्रिया का आरेख। एक AAV-GCaMP6s चूहों के LHA में इंजेक्शन है और 4 सप्ताह बाद, एक ऑप्टिक फाइबर cannula एक्सॉन टर्मिनल संकेत रिकॉर्डिंग के लिए LHb पर प्रत्यारोपित है. इनसेट LHA न्यूरॉन्स (बाएं) के सेल निकायों में GCaMP6s अभिव्यक्ति के प्रतिनिधि confocal छवियों और उनके एक्सॉन टर्मिनलों LHb (दाएं) को पेश कर रहे हैं. (बी)प्रतिनिधि कैल्शियम संकेत ट्रेस airpuffs के लिए (डैश्ड ऊर्ध्वाधर सलाखों) LHb-प्रोजेक्टिंग LHA एक्सॉन टर्मिनलों से मापा एक GCaMP6s-एक्साइजिंग माउस से मापा. (ग)एयरपफ घटनाओं के लिए औसत कैल्शियम प्रतिक्रिया की पेरि-इवेंट साजिश। मोटी हरी रेखा औसत का प्रतिनिधित्व करता है और हरे रंग का शेड क्षेत्रों मतलब के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व (SEM, बाएँ पैनल), और संकेत से पहले और एक airpuff के बाद मापा (3 चूहों, 15 घटनाओं). (डी, ई) GFP-expressing चूहों के लिए(बी, सी) के रूप में एक ही माप (2 चूहों, 10 घटनाओं). स्केल बार्स 200 डिग्री हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: दोहरे रंग फाइबर photometry के Schematic. (ए)एक अतिरिक्त 560 एनएम एलईडी, उपयुक्त फिल्टर और dichroic दर्पण, और कैमरा सेंसर से पहले एक छवि विभाजक मूल सेटअप करने के लिए जोड़ा गया. (बी)फोटोमेट्री सिस्टम घटक: (1) 560 एनएम एलईडी करने के लिए फाइबर, (2) 465 एनएम एलईडी करने के लिए फाइबर, (3) फाइबर 405 एनएम एलईडी करने के लिए, (4) Collimators, (5) 560 एनएम पास फिल्टर, (6) 470 एनएम bandpass फिल्टर, (7) 410 एनएम बैंडपास फिल्टर, (8) लंबे 495 d.sithech के साथ घन , (9) longpass 425 dichroic दर्पण के साथ घन, (10) घन 493/574 dichroic दर्पण के साथ, (11) 20x उद्देश्य, (12) 5-अक्ष अनुवादक, (13) मोनो या बंडल फाइबर पैच कॉर्ड, (14) छवि विपाटक, (15) CMOS कैमरा. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

फाइबर फोटोमेट्री एक सुलभ दृष्टिकोण है जो शोधकर्ताओं को स्वतंत्र रूप से चलने वाले जानवरों में परिभाषित न्यूरोनल आबादी से थोक-कैल्शियम गतिशीलता रिकॉर्ड करने की अनुमति देता है। इस विधि व्यवहार परीक्षण की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ जोड़ा जा सकता है, इस तरह के मजबूर तैरना परीक्षण2के रूप में "आंदोलन भारी" कार्यों सहित, भय कंडीशनिंग18, सामाजिक बातचीत1,4, और अन्य7, 8,19,20. यह शोधकर्ताओं का निरीक्षण करने के लिए क्या व्यवहार या उत्तेजनाओं ड्राइव गतिविधि एक विशेष तंत्रिका आबादी या इसके विपरीत में अनुमति देता है.

अपनी प्रथम दृष्ट्या सादगी के बावजूद, फाइबर photometry को लागू करने जब महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैं, और इस प्रोटोकॉल में विस्तृत प्रणाली आम नुकसान दरकिनार कई फायदे प्रदान करता है. सबसे पहले, यह इस तथ्य का लाभ उठाता है कि जीकेएमपी वेरिएंट में 410 एनएम21 के आसपास कैल्शियम-स्वतंत्र आइसोबेस्टिक उत्तेजना बिंदु होता है और संकेतों में कैल्शियम-निर्भर परिवर्तनों को लगभग एक साथ12में सुधारने के लिए समय-विभाजन बहुसंकेतन होता है। जब जीCAMP व्यक्त न्यूरॉन्स 410 एनएम तरंगदैर्ध्य के साथ उत्साहित हैं, GCaMP से उत्सर्जन तीव्रता कैल्शियम के लिए अपनी बाध्यकारी से स्वतंत्र है और अनिवार्य रूप से एक कम दक्षता GFP की तरह व्यवहार करता है. समय-विभाजन बहुसंकेतन एक ही रिकॉर्डिंग में 410 एनएम कैल्शियम-स्वतंत्र और 470 एनएम कैल्शियम-निर्भर उत्तेजना तरंगदैर्ध्य दोनों का उपयोग करता है। 410 एनएम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के साथ दर्ज संकेत कैल्शियम स्वतंत्र आंदोलन और फ्लोरोसेंट तीव्रता में कलाकृति परिवर्तन के लिए एक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है। GCaMP के isosbestic उत्तेजना के एक साथ उपयोग शामिल नहीं है कि वैकल्पिक रणनीतियों कल्पना की जा सकती है. उदाहरण के लिए, यह दो जानवरों के सहगण तैयार करने के लिए संभव है, एक GFP व्यक्त और अन्य GCaMP2व्यक्त . हालांकि, यह एक सही नियंत्रण नहीं है, क्योंकि यह जानवरों के पार है और यह अधिक की पहचान करने के लिए अगर किसी दिए गए जानवर में एक दिया प्रतिक्रिया एक कलाकृति थी मुश्किल है. दूसरा, वर्णित फाइबर photometry सेटअप शोधकर्ताओं को एक साथ कई रास्ते में गतिविधि को मापने के लिए अनुमति देता है, मस्तिष्क भर में संकेत प्रचार के बारे में सवालों के लिए दरवाजा खोलने. तीसरा, दोहरे रंग रिकॉर्डिंग अतिरिक्त लचीलापन एक ही मस्तिष्क क्षेत्र में विभिन्न रास्ते विभाजित करने के लिए हरे और लाल-बदली GECIs के संयोजन की अनुमति देता है (चित्र 1).

फाइबर photometry रिकॉर्डिंग के साथ, बहुत कम उत्सर्जन फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि शोर के माध्यम से दर्ज की जरूरत है. इसलिए, यह जीईसी से उत्सर्जित फ्लोरोसेंट का अधिकतम संग्रह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। सबसे पहले, जब एक वायरल रणनीति के विकास पर विचार करना चाहिए कि टर्मिनलों से रिकॉर्डिंग चुनौतीपूर्ण हो सकता है, क्योंकि रिकॉर्डिंग क्षेत्र में एक्सॉन टर्मिनलों विरल हो सकता है. इस समस्या को हल करने के लिए, एक वैकल्पिक intersectional वायरल रणनीति ब्याज और ऑप्टिक फाइबर cannulas सेल निकायों, जहां अधिक मजबूत फ्लोरोसेंट हो सकता है ऊपर प्रत्यारोपित के एक लक्ष्य परियोजना क्षेत्र में GCaMP की अभिव्यक्ति की अनुमति कल्पना की जा सकती है मापा22,23,24. एक और पहलू है कि नकारात्मक संकेत करने के लिए शोर अनुपात प्रभाव हो सकता है ऑप्टिक फाइबर cannula और पैच कॉर्ड की गुणवत्ता है. प्रत्यारोपण के लिए, स्टेनलेस स्टील ferrule बेहतर है, क्योंकि zirconia अत्यधिक autofluorescent है और पृष्ठभूमि संकेत में वृद्धि होगी. यह अच्छी तरह से पॉलिश टर्मिनल कनेक्टर्स और उच्च संचरण दरों के साथ उच्चतम गुणवत्ता ऑप्टिक फाइबर cannulas का उपयोग करने के लिए आवश्यक है (gt; 85% संचरण). फाइबर में किसी भी दोष संकेत करने के लिए शोर अनुपात में कमी करने के लिए नेतृत्व करेंगे. ऑप्टिक फाइबर पैच कॉर्ड के रूप में अच्छी तरह से उच्च गुणवत्ता का होना चाहिए. प्रदाता फाइबर विशेष रूप से फाइबर photometry के लिए डिज़ाइन किया गया है, जिसमें autofluorscence के रूप में संभव के रूप में ज्यादा कम से कम है का उत्पादन. कस्टम निर्मित पैच डोरियों अक्सर अपेक्षित दक्षता तक नहीं पहुंचते हैं। यह भी ऑप्टिकल पथ के संरेखण का अनुकूलन करने के लिए सभी फाइबर के साथ एक तस्वीर प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है अच्छी तरह से उद्देश्य के केन्द्र बिन्दु पर हल. इसके अलावा, फाइबर के संख्यात्मक एपर्चर (एनए) पैच कॉर्ड के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उद्देश्य प्रणाली के साथ प्रयोग किया जाता है कि मैच चाहिए. किसी भी एनए बेमेल या तो उत्तेजना या उत्सर्जन प्रकाश हानि में परिणाम होगा. सभी पिछले कदम स्पष्ट कैल्शियम पर निर्भर संकेत प्रदान करेगा. हालांकि, एक संकेत सुधार अभी भी आवश्यक है। अधिकांश रिकॉर्डिंग फाइबर में autofluorscence की वजह से फ्लोरोसेंट में एक घातीय कमी है, गर्मी मध्यस्थता एलईडी क्षय, और photobleaching. यह कमी विभिन्न फाइबर और चैनलों के साथ भिन्न होती है, और प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित airPLS एल्गोरिथ्म का उपयोग करके अलग-अलग प्रत्येक चैनल में इसे निकालना महत्वपूर्ण है। दूसरा, आंदोलन सुधार को ध्यान में रखा जाना चाहिए। यहां तक कि अगर GCaMP संकेत उच्च लग रहे हैं, जहां किसी भी कलाकृति परिवर्तन अर्थहीन लग रहे हैं, यह कैल्शियम स्वतंत्र संकेत के साथ इसे सही करने के लिए महत्वपूर्ण है. गठबंधन 410 एनएम और 470 एनएम संकेतों के साथ ग्राफ एक संदर्भ दिखा रहा है जो तीव्रता में परिवर्तन GCaMP और नहीं कलाकृतियों की वजह से कर रहे हैं.

एक 560 एनएम उत्तेजना एलईडी जोड़ने, उचित dichroic लेंस, और एक बीमस्प्प्टर हरे और लाल फ्लोरोसेंट के एक साथ रिकॉर्डिंग सक्षम बनाता है. यह दो आनुवंशिक रूप से अलग न्यूरॉन आबादी से तंत्रिका गतिविधि पर नजर रखने के लिए या एक्सॉन टर्मिनलों से presynaptic गतिविधि की निगरानी करने के लिए संभावना को खोलता है (उदाहरण के लिए, GCaMP6 व्यक्त), और postsynaptic न्यूरॉन गतिविधि (उदाहरण के लिए, जेआरजीईसीओ1a व्यक्त). जब दोहरे रंग रिकॉर्डिंग को लागू करने, महत्वपूर्ण विचारों को ध्यान में रखा जाना चाहिए. कई लाल-स्थानांतरित जीईसी के लिए महत्वपूर्ण फोटोकन्वर्जन और फोटोसक्रियण की सूचना मिली है, जहां 405 एनएम, 488 एनएम और 560 एनएम के साथ रोशनी कैल्शियम-स्वतंत्र फ्लोरोसेंट25को बढ़ा सकती है। JrGECO1a और RCaMP1b का उपयोग इस समस्या को कम कर सकते हैं26. दोहरी रंग इमेजिंग के दौरान एक और चिंता का विषय हरी संकेत है कि लाल चैनल में लीक है. इस समस्या से बचने के लिए कई रणनीतियों की कल्पना की जा सकती है। उदाहरण के लिए, यह तीन उत्तेजना तरंगदैर्ध्य interweave करने के लिए हरी कैल्शियम सेंसर (410 एनएम), हरी कैल्शियम सेंसर (470 एनएम) से कैल्शियम पर निर्भर संकेत के isosbestic बिंदु उत्तेजित करने के लिए संभव है, और लाल कैल्शियम सेंसर (560 एनएम) अनुक्रम में. उस मामले में, यह आंदोलन सुधार के लिए हरी सेंसर के isosbestic बिंदु पर भरोसा करने के लिए संभव है. अंत में, जब दोहरी रंग इमेजिंग प्रदर्शन, यह सबसे अच्छा है लाल कैल्शियम सेंसर से मजबूत संकेत प्राप्त करने के लिए (जैसे, सेल somas से) क्योंकि इन हरे सेंसर की तुलना में कमजोर फ्लोरोसेंट उत्सर्जन है.

न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज22,23,24के विवो का पता लगाने में तेजी से और विशिष्ट के लिए आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट सेंसर विकसित किया गया है . इन सेंसरों हरी फ्लोरोसेंट का उत्सर्जन जब उनके संबंधित अंतर्जात लिगंड के साथ बाध्य और लाल के साथ जोड़ा जा सकता है-बदली GECIs, जैसे JrGECO1a, न्यूरोट्रांसमीटर के एक साथ पता लगाने के लिए से न्यूरॉन गतिविधि में परिवर्तन के साथ समवर्ती रिलीज एकल एकाधिक ऑप्टिक फाइबर5,27.

फाइबर photometry लचीला और हल्के ऑप्टिक फाइबर पैच डोरियों के माध्यम से स्वतंत्र रूप से चलती जानवरों में तंत्रिका गतिविधि की निगरानी करने के लिए उत्तम लचीलापन प्रदान करता है। हालांकि, यह इस तरह के प्रकाश अंधेरे कक्ष परीक्षण के रूप में डिब्बों के बीच आंदोलन की आवश्यकता स्थितियों के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं है। यह वायरलेस फोटोमेट्री सिस्टम28में आगे की घटनाओं के साथ संभव होगा। अंत में, जबकि यह महान लाभ प्रदान करता है जब कई मस्तिष्क क्षेत्रों से तंत्रिका गतिशीलता की निगरानी, या अलग तंत्रिका आबादी से, फाइबर photometry में प्राप्त संकेत कई न्यूरॉन्स कि एक ही अस्थायी गतिशीलता के साथ आग नहीं हो सकता है की एक कुल है और हल नहीं किया जाएगा. हालांकि, यह vivo microendoscopic कैल्शियम इमेजिंग में एक पूरक दृष्टिकोण प्रदान करता है दसियों से व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के सैकड़ों करने के लिए दैहिक कैल्शियम संकेत को हल29. अंत में, जब एक ही जानवर में कई फाइबर से रिकॉर्डिंग, यह संकेत टर्मिनलों से या सेल somas से आ रहा है कि क्या अंतर करने के लिए मुश्किल हो सकता है. सावधानी से डिजाइन प्रयोगों इन सीमाओं के अधिकांश दूर कर सकते हैं. हालांकि, सेल सोमास में विशेष रूप से स्थानीयकृत नए जीईसीआई के विकास बहु फाइबर कैल्शियम इमेजिंग प्रयोगों के दौरान अधिक संकल्प प्रदान करेगा।

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Disclosures

ऋषि Aronson सीईओ और Neurophotometrics लिमिटेड, जो बहु फाइबर photometry सिस्टम बेचता है के संस्थापक है.

Acknowledgments

यह काम कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC: RGPIN-2017-06131) से सी.पी.सी. हम भी इस अध्ययन में इस्तेमाल वायरल वैक्टर के उत्पादन के लिए Plateforme d'Outils मोलिकलेयर्स (https://www.neurophotonics.ca/fr/pom) धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1" Long Thorlabs SH25S100
1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1/2" Long Thorlabs SH25S050
1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 3/8" Long Thorlabs SH25S038
1000 µm, 0.50 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable Thorlabs M59L01
12.7 mm Optical Post Thorlabs TR30/M
12.7 mm Pedestal Post Holder Thorlabs PH20EM
15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for T-Cube Thorlabs KPS101
20x objective Thorlabs RMS20X #10 in Figure 2, #11 in Figure 5
30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount Thorlabs CM1-DCH/M #8-9 in Figure 2, #8-10 in Figure 5
405 nm LED Doric Lenses CLED_405 #2 in Figure 2
410 nm bandpass filter Thorlabs FB410-10 #5 in Figure 2; #7 in Figure 5
465 nm. LED Doric Lenses CLED_465 #1 in Figure 2
470 nm bandpass filter Thorlabs FB470-10 #4 in Figure 2; #6 in Figure 5
560 nm bandpass filter Semrock FF01-560/14-25 #5 in Figure 5
560 nm LED Doric Lenses CLED_560 #1 in Figure 3
5-axis kinematic Mount Thorlabs K5X1 #11 in Figure 2, #12 in Figure 5
Achromatic Doublet Thorlabs AC254-035-A-ML #7 in Figure 2
Adaptor for 405 collimator Thorlabs AD11F #3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Adaptor for ajustable collimator Thorlabs AD127-F #3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Aluminum Breadboard Thorlabs MB1824
Clamping Fork Thorlabs CF125
Cube connector Thorlabs CM1-CC
Dual 493/574 dichroic Semrock FF493/574-Di01-25x36 #10 in Figure 5
Emission filter for GCaMP6 Semrock FF01-535/22-25 #6 in Figure 2
Enclosure with Black Hardboard Panels Thorlabs XE25C9
Externally SM1-Threaded End Cap for Machining Thorlabs SM1CP2M
Fast-change SM1 Lens Tube Filter Holder Thorlabs SM1QP #4-6 in Figure 2, #5-7 in Figure 5
Fixed Collimator for 405 nm light Thorlabs F671SMA-405 #3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Fixed collimator for 470 and 560 nm light Thorlabs F240SMA-532 #3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Green emission filter Semrock FF01-520/35-25 In light beam splitter
High-Resolution USB 3.0 CMOS Camera Thorlabs DCC3260M #13 in Figure 2, #15 in Figure 5
Light beam splitter Neurophotometrics SPLIT #14 in Figure 5
Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff Thorlabs DMLP425R #8 in Figure 2, #9 in Figure 5
Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff Semrock FF495-Di03 #9 in Figure 2, #8 in Figure 5
Metabond dental cement C&B
M8 - M8 cable Doric Lenses Cable_M8-M8
Optic fiber cannulas Doric Lenses Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence
Optic fiber Patchcords Doric Lenses Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence
Red emission filter Semrock FF01-600/37-25 In light beam splitter
T7 LabJack LabJack
T-cube LED Driver Thorlabs LEDD1B
USB 3.0 I/O Cable, Hirose 25, for DCC3240 Thorlabs CAB-DCU-T3

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References

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Martianova, E., Aronson, S., Proulx, C. D. Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals. J. Vis. Exp. (152), e60278, doi:10.3791/60278 (2019).

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