Summary
Denne protokollen detaljer hvordan å implementere og utføre multi-fiber fotometri innspillinger, hvordan å korrigere for kalsium-uavhengige gjenstander, og viktige hensyn for dual-Color fotometri Imaging.
Abstract
Registrering av aktiviteten til en gruppe neurons i et fritt bevegelig dyr er en utfordrende oppgave. Videre, ettersom hjernen er dissekert i mindre og mindre funksjonelle undergrupper, blir det avgjørende å ta opp fra anslag og/eller genetisk definerte subpopulasjoner av neurons. Fiber fotometri er en tilgjengelig og kraftfull tilnærming som kan overvinne disse utfordringene. Ved å kombinere optiske og genetiske metoder, kan neural aktivitet måles i dype hjernens strukturer ved å uttrykke genetisk kodet kalsium indikatorer, som oversetter nevrale aktivitet til et optisk signal som lett kan måles. Den nåværende protokollen detaljer komponentene i en multi-fiber fotometri system, hvordan få tilgang til dype hjernens strukturer for å levere og samle lys, en metode for å ta høyde for bevegelse artefakter, og hvordan å behandle og analysere fluorescerende signaler. Protokollen detaljer eksperimentelle betraktninger når du utfører enkel og dobbel farge Imaging, fra enten én eller flere implantert optiske fibre.
Introduction
Evnen til å koordinere nevrale reaksjoner med spesifikke aspekter av et dyrs atferd er avgjørende for å forstå rollen en bestemt gruppe neurons spiller i regi eller svare på en handling eller stimulans. Gitt kompleksiteten av animalsk atferd, med myriade av interne stater og eksterne stimuli som kan påvirke selv de enkleste av handlinger, innspilling et signal med én prøve oppløsning utstyrer forskere med de nødvendige verktøy for å overvinne disse Begrensninger.
Fiber fotometri har blitt den teknikken for valg for mange forskere innen systemer nevrovitenskap på grunn av sin relative enkelhet i forhold til andre in vivo opptaks teknikker, den høye signal-til-støy-forhold, og evnen til å spille inn i en rekke Behavioral paradigmer1,2,3,4,5,6,7,8. I motsetning til tradisjonelle elektrofysiologisk metoder, er fotometri den optiske tilnærmingen som oftest brukes sammen med genetisk kodede kalsium indikatorer (GECIs, GCaMP-serien)9. GECIs endre deres evne til å fluorescerer basert på om de er bundet til kalsium eller ikke. Fordi den interne konsentrasjonen av kalsium i neurons er svært tett regulert og spenning-gated kalsiumkanaler åpne når en Nevron branner en handling potensial, forbigående økning i indre kalsium konsentrasjon, noe som resulterer i forbigående økninger i evne til en GECI til fluorescens, kan være en god proxy for neuronal avfyring9.
Med fiber fotometri, eksitasjon lys er rettet ned en tynn, multimode optisk fiber inn i hjernen, og et utslipps signal er samlet tilbake opp gjennom samme fiber. Fordi disse optiske fibrene er lette og bøyelig, kan et dyr bevege seg stort sett uhindret, noe som gjør denne teknikken kompatibel med et bredt spekter av atferds tester og forhold. Noen forhold, for eksempel raske bevegelser eller bøying av fiberoptisk patch ledningen utover radius der den kan opprettholde total intern refleksjon, kan innføre signal artefakter. For å entydighetsoperatoren signal fra støy, kan vi utnytte en egenskap av GCaMP kjent som "isosbestic punkt." Kort, med GCaMP, som Bølgelengden av eksitasjon lyset er forskjøvet til venstre, dens utslipp i kalsium-bundet tilstand avtar og utslipp i kalsium-ubundet tilstand marginalt øker. Poenget der den relative intensiteten av disse to utslippene er likeverdige kalles isosbestic punktet. Når GCaMP er spent på dette punktet, er dens utslipp upåvirket av endringer i interne kalsium konsentrasjoner, og variasjonen i signalet er oftest på grunn av demping av signalet fra overbending av fiberoptisk patch ledningen eller bevegelse av nevrale vev i forhold til implantert fiber.
Single enhet elektrofysiologi er fortsatt gullstandarden for fritt-bevegelige in vivo innspillinger på grunn av sin single-celle og Single-Spike nivå oppløsning. Imidlertid, den kan vanskelig å finne det molekylær sammenfalle av cellene tilværelse registrert, og det stolpe-hoc analyse kan helt arbeidskrevende. Mens fiber fotometri ikke har en enkelt celle oppløsning, gjør det at forskerne å stille spørsmål umulig å ta opp med tradisjonelle teknikker. Kombinere viral strategier med transgene dyr, kan uttrykket av GECIs rettes til genetisk definerte neuronal typer til posten befolkning-eller projeksjon-definert neural aktivitet, som kan utføres ved å overvåke kalsium signal direkte på axon terminaler10,11. Videre, ved å implanting flere fiberoptiske kanyler, er det mulig å samtidig overvåke neural aktivitet fra flere hjerneregioner og stier i samme dyr12,13.
I dette manuskriptet beskriver vi en teknikk for single og multi-fiber fotometri, hvordan du korrigerer for kalsium-uavhengige artefakter, og detalj hvordan du utfører mono-og dual-Color innspillinger. Vi gir også eksempler på spørsmål som gjør det mulig for en å spørre og deres økende grad av kompleksitet (se figur 1). Fiber fotometri oppsett for multi-fiber innspillinger beskrevet i denne protokollen kan bygges ved hjelp av en liste over materialer som finnes på https://sites.google.com/view/multifp/hardware (figur 2).
Det er viktig at systemet er utstyrt for både 410 NM og 470 NM eksitasjon bølgelengder for kalsium-uavhengige og kalsium-avhengige fluorescens utslipp fra GCaMP6 eller dens varianter. For Custom-bygget oppsett eller hvis det ikke er tilgjengelig programvare for å kjøre systemet, gratis, åpen kildekode-program Bonsai (http://www.open-ephys.org/bonsai/) kan brukes. Alternativt kan fiber fotometri kjøres gjennom MATLAB (f. eks https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)12 eller andre programmeringsspråk14. Programvaren og maskinvaren i systemet bør tillate manipulering av både 410 NM og 470 NM lysdioder og kameraet, utvinning av bilder (figur 2), og beregning av gjennomsnittlig fluorescerende intensitet i regionene av interesse (ROIs) trukket rundt fibrene på bildene. Utdataene bør være en tabell med gjennomsnittlig intensitet verdier registrert med 470 NM og 410 NM lysdioder fra hver fiber i patch ledningen. Når du utfører multi-fiber eksperimenter, kan 400 μm med følgende fibre begrense bevegelsen av mus. I slike tilfeller anbefaler vi å bruke 200 μm patch ledninger, som gir mer fleksibilitet. Det kan også være mulig å bruke mindre dummy kabler under trening av mus.
Det er avgjørende å kunne trekke ut tid poeng for hendelser av interesse under fiber fotometri oppkjøp. Hvis systemet ikke lett gir et innebygd system for å integrere TTLs for spesifikke hendelser, er en alternativ strategi å tildele en tidsangivelse til individuelle tidspunkt som er registrert for å samsvare med bestemte tider og hendelser under eksperimentet. Time stempling kan gjøres ved hjelp av datamaskinen klokken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter ble gjort i samsvar med den institusjonelle Animal Care og bruk komiteer ved University of California, San Diego, og den kanadiske guide for omsorg og bruk av laboratorium dyr og ble godkjent av Université Laval Animal Protection Komiteen.
1. justering av den optiske banen mellom CMOS (komplementær metalloksid halvleder) kamera og den enkelte eller forgrening patch ledningen
- Løsne alle skruene på den 5-akse oversetteren (11, figur 2B).
- Skru i patch ledningen (12, figur 2B) til adapter [sma (sub-MINIATURE A) eller FC (fiberoptisk kontakt)] som er festet til 5-akse oversetter.
- Slå på 470 NM eksitasjon lys (1, figur 2b) ved lavt strømforbruk (100 μW), og plasser spissen av patchcord som peker til en autofluorescent plast lysbilde. Dette har ingen betydning for fremtidige innspillinger, men er kun for å visualisere Justeringsprosessen.
- Ta opp fra CMOS-kameraet (13, figur 2b) i live-modus. Øk forsterkningen eller Juster oppslagstabellen (LUT) til bildet ikke er helt svart. Poenget er å kunne se et bilde på det sentrale punktet i målet (10, figur 2b).
- Advance 5-aksen oversetter mot målet, slik at 470 NM lyset er sentrert på fiber på SMA eller FC enden av patch ledningen, til et bilde kan løses på kameraet.
- Juster X-og Y-aksene til bildet er sentrert og godt løst.
- Visualiser lyset som slippes ut fra dobbsko-enden av patch ledningen. Det skal vises som en isotropic sirkel. Hvis en forgrening patch ledningen er brukt, bør mengden av lys som slippes ut på dobbsko av hver patch ledningen være lik. Hvis sirkelen ikke er isotropic eller det utsendte lyset er ulikt, justerer du oversetteren med 5 akser i X-Y-aksen.
2. oppsett av ROIs rundt fibre for måling av gjennomsnittlig fluorescerende intensitet
- Slå på alle eksitasjon lysene for å bedre visualisere fibrene. Juster kamera forsterkningen slik at ingen piksler er mettet og et klart bilde av fibrene er til stede.
- Live posten eller ta et foreløpig bilde.
- Tegn ROIs rundt fibrene og holde dem for måling av gjennomsnittlig intensitet verdier under opptak (figur 2A).
- For flere fiber innspillinger, test for uavhengighet i signaler.
- Live rekord fra alle fibre.
- Pek en fiber mot en lyskilde og trykk med en finger. Svært store svingninger bør forekomme utelukkende i den kanalen (akseptabel lekkasje 1:1000).
- Hvis signalene ikke er uavhengige, trekke mer konservative ROIs og gjenta uavhengighet test.
- Å merke og holde rede på hvilke AVKASTNINGEN tilsvarer hvilken fiber, farget tape eller neglelakk kan påføres på slutten av fibrene. Ta et bilde før starten av et eksperiment som en sekundær påminnelse.
3. oppsett av opptaks Arena
- Heng patch ledningen over arenaen ved hjelp av stands, klemmer, eller holdere.
- Pass på at dyret kan fritt bevege seg gjennom hele arenaen, uhemmet av lengden på fiber.
- Hvorvidt en operant bokse med eller åpen åker er anvendt, sikre det det patch ledningen ville være i stand til rekkevidde dyret med minimal bøying. Hvis dette krever en nese poke, sikre at det er nok plass overhead for å hindre bøying av fiber. Unngå overdreven bøying eller vridning av patch ledningen.
4. in vivo innspillinger
Merk: prosedyren for optisk fiber kanyle implantation for fiber fotometri eksperimenter er identisk med prosedyren for optogenetics som beskrevet i Sparta et al15. Vi anbefaler bruk av Dental sement (se tabell over materialer), som gir robust forankring av slitagetrykket til skallen bein. Dental sement vil være spesielt nyttig i tilfeller der forankrings skruer ikke kan brukes.
- Inspiser visuelt den andre enden av fibrene i lappe ledningen for øye og med et minifiber mikroskop. Hvis overflaten av fibrene er riper, repolish fibrene ved hjelp av fiber polering/slipe film med fin grus (1 μm og 0,3 μm).
- Rengjør de fjerne endene på patch ledningen med 70% etanol og en bomulls tupp applikator.
- Rengjør fiberoptisk kanyler med 70% etanol og en bomulls tupp applikator.
- Koble den dobbsko enden av patch ledningen til implantert fiber ved hjelp av en keramisk Split-ermet dekket med en svart krympe tube. Under tilkoblingen må du sørge for at hylsen er stram, ellers kan du bruke et nytt erme.
Merk: det vil være en stor mengde signaltap hvis det er noen plass mellom patch ledningen dobbsko og implantatet, og opptakene vil ikke fungere. - Tillate det dyr å komme seg for et par minuttene tidligere å starten av opptreden tester.
- Start innspillingen av det optiske signalet og Kjør eksperimentet.
- Mens innspillingen, holde et forsiktig øye på Live-Trace for å sikre kvalitet innspillinger. Signalet forventes å raskt avta som en funksjon av tid i de første 2 min av innspillingen. Denne effekten er forårsaket av varme-mediert LED forfall, hvorved økningen i varmen øker motstanden i det optiske elementet.
- Hvis et hopp i signalet som overstiger på/av Kinetics av GCaMP oppstår, er dette ofte en indikasjon på at ermet ikke er stramt nok og mellomrommet mellom patch ledningen og implantatet er i endring. I dette tilfellet, stoppe eksperimentet og koble dyret ved hjelp av en ny ermet.
5. fiber fotometri dataanalyse
Merk: Dette er en metode for dataanalyse som fungerer bra for de fleste innspillinger. Alternative tilnærminger kan imidlertid implementeres. Eksempelkode for dataanalyse kan bli funnet her: https://github.com/katemartian/Photometry_data_processing.
- Extract bety fluorescens intensitet verdier innspilt fra 470 NM (int470) og 410 NM (int410) lysdioder, tilsvarende hver enkelt fiber.
- Glatt hvert signal ved hjelp av en bevegelig gjennomsnittlig algoritme (Figur 3a).
- Utfør Baseline korreksjon av hvert signal (Figur 3A og 3b) ved hjelp av adaptive iteratively reweighted straffet minst firkanter (airPLS) algoritme (https://GitHub.com/zmzhang/airPLS) for å fjerne skråningen og lav frekvens svingninger i signalene.
- Standardisere hvert signal med middelverdien og standardavviket (Figur 3C):
- Ved hjelp av ikke-negativ robust lineær regresjon, Fit standardisert zInt410 til zint470 signaler (Figur 3D) til regresjon funksjon:
- Bruk parametrene til lineær regresjon (a, b) for å finne nye verdier av zInt410 montert på zInt470 (fitInt410, Figur 3D, E):
- Bruk parametrene til lineær regresjon (a, b) for å finne nye verdier av zInt410 montert på zInt470 (fitInt410, Figur 3D, E):
- Beregn normalisert dF/f (z DF/f) (Figur 3F):
6. samtidige dual-Color innspillinger
- Legg til fotometri systemet en 560 NM LED å opphisse den røde fluorescerende kalsium sensor og hensiktsmessig dichroic speil og filtre (se Kim et al., 2016 for detaljert beskrivelse)12.
- Legg til en bilde oppdeling mellom målsettingen og CMOS-kameraet for å skille de grønne og røde utslipps bølgelengdene (se figur 5). Bildet splitter vil danne to speilet bilder på kameraet sensor, tilsvarende de røde og grønne signaler (for eksempel en patch ledningen med 3 grener vil skape et bilde med 6 fibre).
- Tegn ROIs rundt alle fibrene i begge farger som beskrevet ovenfor. Sørg for å tydelig identifisere hver avkastning med tilsvarende fiber og kanal (grønn og rød) (Figur 4A).
- Trigger samtidige eksitasjon med 470 NM og 560 NM lysdioder og vekselvis dem med 410 NM LED (figur 5A).
7. dual fargedata analyse
- Følg trinnene i del 5 for å finne fitInt410 for int470-signalet og Beregn z dF/F.
- Fordi isosbestic punktet for rød-forskjøvet GECIs er generelt ukjent, kan signalet innspilt med 410 NM LED i den grønne kanalen brukes for bevegelse korreksjon på tvers av begge kanaler. Følg trinnene i del 5 for å finne fitInt410 for int560-signalet og Beregn z dF/F.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neural relaterer av atferdsmessige responser kan variere avhengig av en rekke faktorer. I dette eksempelet, vi brukte in vivo fiber fotometri å måle aktiviteten av axon terminaler fra lateral hypothalamus området (LHA) som opphører i lateral habenula (LHb). Wild type mus ble injisert med en adeno-assosiert virus (AAV) koding GCaMP6s (AAV-hSyn-GCaMP6s) i LHA og en optisk fiber ble implantert med spissen umiddelbart over LHb (Figur 4A). GCaMP6s uttrykket er funnet i cellen likene av LHA og deres axon terminaler projisere til LHb, der kalsium signal kan registreres. Aktivering av LHA-LHb veien fremmer passiv unngåelse i sanntids preferanse test som tyder på at denne veien overfører aversive signaler16. Mus ble deretter koblet til fiber fotometri systemet, plassert i en åpen arena for 6 min, og utsatt for 1 sek aversive airpuffs hver 60 sek. Den målte fluorescens betydelig økt samtidig med administrering av airpuffs (fig. 4B-C). I mus uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP), ingen endring i signalet ble oppdaget under administrering av airpuffs (Figur 4C). Etter atferds testing, injeksjonsstedet i LHA og fiber plassering over LHb ble bekreftet histologisk (Figur 4A).
Figur 1: strategier og tilnærminger for GECI uttrykk med anatomiske og celle-type spesifisitet. (A) en viral vektor adeno-assosiert virus (AAV) koding GCAMP6 (AAV-GCaMP6) injiseres i en hjerne region av interesse. Den optiske fiber kan kronisk implantert med spissen plassert over cellen organer (1) eller over axon terminaler (2). For selektiv uttrykk i en genetisk definert neuronal populasjon kan en grobunn-avhengig AAV (f.eks. AAV-DIO-GCaMP6) injiseres i transgene mus som uttrykker den grobunn recombinase i en bestemt neuronal befolkning. (B) for dual-Color kalsium Imaging, i dette EKSEMPELET en AAV-GCaMP6s injiseres i en hjerne regionen av interesse, og en grobunn-avhengige AAV koding en rød-forskjøvet GECI (f. eks jrGECO1a; AAV-DIO-jrGECO1a) injiseres i en genetisk definert neuronal befolkning i en mål hjerne region. Den optiske fiber er implantert for samtidig kalsium signal Imaging av axon terminaler (grønn fluorescens) og celle organer (rød fluorescens). (C) for en intersectional viral strategi, en viral vektor med retrograd transport egenskaper (som retroAAV17) koding av grobunn recombinase (retroAAV-grobunn) injiseres i målet hjernen regionen sammen med en AAV-DIO-GCaMP6s injisert i den projiserer hjernen regionen i samme mus. Optiske fiber kanyler er implantert over celle organene for robust kalsium-avhengig signal opptak. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: fiber fotometri skjematisk. (A) eksitasjon lys fra to lysdioder (410 nm og 470 NM) passerer gjennom en rekke filtre og dichroic speil og produserer en eksitasjon flekk på arbeidsavstand av den 20x mål. Lyset passerer enten en enkelt patch ledning eller med følgende fibre (for flere område innspillinger) som er koblet til implantert kanyler. Den slippes ut fluorescens er samlet av de samme fibrene, filtrert, og projisert på en CMOS kamera sensor. På fanget bilder, den gjennomsnittlige fluorescens intensitet er registrert på ROIs av hver fiber. For å samtidig skaffe signaler fra både 410 NM og 470 NM lysdioder, en tid-divisjon multipleksing er implementert (nederst til høyre diagram). (B) bilde av vårt skreddersydde fotometri system og dets komponenter: (1) fiber til 465 NM LED, (2) fiber til 405 NM LED, (3) Collimators, (4) 470 NM båndpassfilter, (5) 410 NM båndpassfilter, (6) 535 NM båndpassfilter, (7) tube linse, (8) Cube med longpass 425 dichroic speil, (9) Cube med longpass 495 dichroic speil, (10) 20x objektiv, (11) 5-akse oversetter, (12) mono-eller buntet-fiber patch Cord, (13) CMOS-kamera. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: analyse av fiber fotometri data. (A) glattet bety fluorescerende intensitet (int) innspilt fra 470 NM (topp blå linje) og 410 NM (nederst lilla linje) eksitasjon bølgelengder. Svarte linjer er opprinnelige planer som ble funnet ved hjelp av airPLS-algoritmen. (B) endringer i relativ intensitet i signaler etter grunnlinje korrigering. (C) standardisert 470 nm og 410 NM signaler (zInt470, topp; zInt410, bunn). (D) ikke-negativ robust lineær tilpasning av 470 nm og 410 NM signaler. (E) justering av spor Int410 til Int470 basert på passform. (F) korrigert og normalisert kalsium-avhengig endring i fluorescens (z DF/F). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representative resultater. (A) diagram av eksperimentell prosedyre. En AAV-GCaMP6s injiseres i LHA av mus og 4 uker senere, en optisk fiber kanyle er implantert over LHb for axon Terminal signal opptak. Innfelt er representative konfokalmikroskopi bilder av GCaMP6s uttrykk i cellen organer av LHA neurons (venstre) og deres axon terminaler prosjektering til LHb (høyre). (B) representative kalsium signal spor til airpuffs (stiplede vertikale striper) målt fra LHb-prosjektering LHA axon terminaler målt fra en GCaMP6s-uttrykker mus. (C) Peri-hendelse tomten av gjennomsnittlig kalsium respons på airpuff hendelser. Den tykke grønne linjen representerer gjennomsnittet og den grønne skyggelagte regionene representerer standard feil av gjennomsnittet (SEM, venstre panel), og signalet målt før og etter en airpuff (3 mus, 15 hendelser). (D, E) Samme mål som (B, C) for GFP-uttrykker mus (2 mus, 10 hendelser). Skala barer er 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: skjematisk av dual-Color fiber fotometri. (A) ytterligere 560 NM LED, passende filtre og dichroic speil, og en bilde splitter før kamera sensor ble lagt til det opprinnelige oppsettet. (B) fotometri systemkomponenter: (1) fiber til 560 NM LED, (2) fiber til 465 NM LED, (3) fiber til 405 NM LED, (4) Collimators, (5) 560 NM båndpassfilter, (6) 470 NM båndpassfilter, (7) 410 NM båndpassfilter, (8) Cube med longpass 495 dichroic speil , (9) Cube med longpass 425 dichroic speil, (10) Cube med 493/574 dichroic speil, (11) 20x objektiv, (12) 5-akse oversetter, (13) mono-eller buntet-fiber patch Cord, (14) image splitter, (15) CMOS-kamera. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fiber fotometri er en tilgjengelig tilnærming som gjør at forskerne kan registrere bulk-kalsium dynamikk fra definerte neuronal populasjoner i fritt bevegelige dyr. Denne metoden kan kombineres med et bredt spekter av atferds tester, inkludert "Movement Heavy" oppgaver som tvang svømme tester2, frykt-condition18, sosiale interaksjoner1,4, og andre7, 8,19,20. Dette gjør forskerne til å observere hva atferd eller stimuli drive aktivitet i en bestemt neural befolkning eller vice versa.
Til tross for sin prima facie enkelhet, er det viktige hensyn når implementere fiber fotometri, og systemet detaljert i denne protokollen gir flere fordeler omgå vanlige fallgruver. Først, det tar nytte av det faktum at GCaMP varianter har en kalsium-uavhengig isosbestic eksitasjon punkt rundt 410 NM21 og tid-divisjon multipleksing å korrigere kalsium-avhengige endringer i signaler nesten samtidig12. Når neurons uttrykker GCaMP er spent med 410 NM bølgelengde, er utslipps intensiteten fra GCaMP uavhengig av sin binding til kalsium og oppfører seg i hovedsak som en lav-effektivitet GFP. Time-Division multipleksing bruker både 410 NM kalsium-uavhengig og 470 NM kalsium-avhengige eksitasjon bølgelengder i samme opptaket. Signalet innspilt med 410 NM eksitasjon bølgelengde brukes som en kontroll for kalsium-uavhengig bevegelse og gjenstand endringer i fluorescens intensitet. Alternative strategier som ikke inkluderer samtidig bruk av isosbestic eksitasjon av GCaMP kan ha tenkt seg. For eksempel er det mulig å forberede to dyr kohorter, en uttrykker GFP og den andre uttrykker GCaMP2. Men dette er ikke en perfekt kontroll, som det er på tvers av dyr og det er vanskeligere å identifisere om et gitt svar i et gitt dyr var en gjenstand. For det andre, den beskrevne fiber fotometri oppsett tillater forskere å måle aktivitet i flere veier samtidig, åpne døren til spørsmål om signal forplantning i hele hjernen. Tredje, dobbelt-fargen innspillingen innrømmer i tillegg fleksibiliteten å analysere annerledes trasé inne det likt hjerne område forbinder grønn og rød-skiftet GECIs (skikkelsen 1).
Med fiber fotometri innspillinger, må svært lave utslipps fluorescens tas opp gjennom bakgrunnsstøy. Derfor er det avgjørende å sikre maksimal samling av fluorescens som slippes ut fra GECIs. Først når du utvikler en viral strategi man må vurdere at innspillingen fra terminaler kan være utfordrende, fordi axon terminaler i innspillingen feltet kan være sparsom. For å løse dette problemet, kan en alternativ intersectional viral strategi være seg tillater uttrykk for GCaMP i et mål-prosjektering regionen av interesse og optiske fiber kanyler implantert over cellen organer, der mer robust fluorescens kan målt22,23,24. En annen faktor som kan negativt påvirke signal-til-støy-forhold er kvaliteten på optiske fiber kanyle og patch ledningen. For implantat IONS er rustfritt stål dobbsko å foretrekke, fordi zirconia er svært autofluorescent og vil øke bakgrunns signalet. Det er viktig å bruke den høyeste kvalitet optiske fiber kanyler med godt polert Terminal kontakter og høy overføringshastighet (> 85% girkasse). Eventuelle defekter i fibrene vil føre til en reduksjon i signal-til-støy-forhold. Den optiske fiber patch ledningen skal være av høy kvalitet også. Leverandører produserer fibre spesielt utviklet for fiber fotometri, der autofluorescence minimeres så mye som mulig. Skreddersydde patch snorer ofte ikke nå nødvendig effektivitet. Det er også viktig å optimalisere justeringen av den optiske banen for å få et bilde med alle fibre godt løst i fokuspunktet for målet. Videre må den numeriske blenderåpning (NA) av fiber matche den av patch ledningen samt målet brukes med systemet. Alle NA-uoverensstemmelser vil resultere i enten eksitasjon eller utslipps lys tap. Alle tidligere trinn vil gi klare kalsium-avhengige signaler. Imidlertid er en signal korreksjon fortsatt nødvendig. De fleste opptakene har en eksponentiell nedgang i fluorescens på grunn av autofluorescence i fibrene, varme-mediert LED forfall, og photobleaching. Denne reduksjonen varierer med ulike fibre og kanaler, og det er viktig å fjerne den i hver kanal separat ved hjelp av airPLS algoritmen beskrevet i protokollen delen. For det andre må bevegelses korreksjon tas i betraktning. Selv om GCaMP signaler synes høyt hvor noen gjenstand endringer virke meningsløst, er det viktig å korrigere det med kalsium uavhengig signal. Grafen med justert 410 NM og 470 NM signaler er en referanse som viser hvilke endringer i intensitet er forårsaket av GCaMP og ikke artefakter.
Legge til en 560 NM eksitasjon LED, riktig dichroic linser, og en beamsplitter muliggjør samtidig opptak av grønne og røde fluorescens. Dette åpner muligheten til å overvåke neural aktivitet fra to genetisk distinkte neuronal populasjoner eller å overvåke presynaptiske nerve aktivitet fra axon terminaler (for eksempel uttrykke GCaMP6), og postsynaptic neuronal aktivitet (for eksempel uttrykke jrGECO1a). Når du implementerer dual-Color innspillinger, viktige hensyn må holdes i tankene. Betydelig photoconversion og photoactivation er blitt rapportere for mange rød-flyttet GECIs, der hvor belysning med 405 NM, 488 NM, og 560 NM kanne forhøye kalsium-selvstendig fluorescens25. Bruk av jrGECO1a og RCaMP1b kan minimere dette problemet26. En annen bekymring under dual farge Imaging er grønt signal som lekker inn i den røde kanalen. Mange strategier kan ha tenkt å unngå dette problemet. For eksempel er det mulig å veves de tre eksitasjon bølgelengder å opphisse isosbestic punktet av den grønne kalsium sensor (410 NM), det kalsium-avhengige signalet fra den grønne kalsium sensor (470 NM), og den røde kalsium sensor (560 NM) i rekkefølge. I så fall er det mulig å stole på isosbestic punktet til den grønne sensoren for bevegelses korreksjon. Til slutt, når du utfører dual Color Imaging, er det best å skaffe sterkere signal fra den røde kalsium sensor (f. eks, fra celle somas) fordi disse har svakere fluorescens utslipp sammenlignet med grønne sensorer.
Nye genetisk kodede fluorescerende sensorer er utviklet for rask og spesifikk in vivo-deteksjon av signalstoff utgivelsen22,23,24. Disse sensorene avgir grønn fluorescens når bundet med sine respektive endogene ligand og kan kombineres med rød-forskjøvet GECIs, slik som jrGECO1a, for samtidig påvisning av signalstoff utgivelse samtidig med endringer i neuronal aktivitet fra enkelt flere optiske fibre5,27.
Fiber fotometri gir utsøkt fleksibilitet til å overvåke nerve aktivitet i fritt bevegelige dyr gjennom fleksible og lette optiske fiber plaster ledninger. Imidlertid er det ikke godt egnet for situasjoner som krever bevegelse mellom rom, for eksempel lys-mørkt kammer tester. Dette vil være mulig med den videre utviklingen i det trådløse fotometri systemet28. Til slutt, mens det gir store fordeler ved overvåking nevrale dynamikk fra flere hjerneområder, eller fra forskjellige nevrale populasjoner, signalet innhentet i fiber fotometri er en samlet av mange neurons som kanskje ikke brann med samme timelige dynamikk og vil ikke bli løst. Men det gir en utfyllende tilnærming til in vivo microendoscopic kalsium Imaging løse somatiske kalsium signal fra titalls til hundrevis av individuelle neurons29. Til slutt, når du spiller inn fra flere fibre i ett enkelt dyr, kan det være vanskelig å differensiere om signalet kommer fra terminalene eller fra celle somas. Nøye utforming av eksperimenter kan overvinne de fleste av disse begrensningene. Imidlertid, utviklingen av ny GECIs ene og alene lokalisere for cellen somas ville skaffe flere resolution i løpet av mange--fiber kalsium tenkelig eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sage Aronson er administrerende direktør og grunnlegger av Neurophotometrics Ltd, som selger multi-fiber fotometri systemer.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: RGPIN-2017-06131) til CP C. P. er en FRSQ Chercheur-Boursier. Vi takker også Plateforme d'Outils Moléculaires (https://www.neurophotonics.ca/fr/pom) for produksjon av viral vektorer som brukes i denne studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1" Long | Thorlabs | SH25S100 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1/2" Long | Thorlabs | SH25S050 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 3/8" Long | Thorlabs | SH25S038 | |
| 1000 µm, 0.50 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs | M59L01 | |
| 12.7 mm Optical Post | Thorlabs | TR30/M | |
| 12.7 mm Pedestal Post Holder | Thorlabs | PH20EM | |
| 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for T-Cube | Thorlabs | KPS101 | |
| 20x objective | Thorlabs | RMS20X | #10 in Figure 2, #11 in Figure 5 |
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs | CM1-DCH/M | #8-9 in Figure 2, #8-10 in Figure 5 |
| 405 nm LED | Doric Lenses | CLED_405 | #2 in Figure 2 |
| 410 nm bandpass filter | Thorlabs | FB410-10 | #5 in Figure 2; #7 in Figure 5 |
| 465 nm. LED | Doric Lenses | CLED_465 | #1 in Figure 2 |
| 470 nm bandpass filter | Thorlabs | FB470-10 | #4 in Figure 2; #6 in Figure 5 |
| 560 nm bandpass filter | Semrock | FF01-560/14-25 | #5 in Figure 5 |
| 560 nm LED | Doric Lenses | CLED_560 | #1 in Figure 3 |
| 5-axis kinematic Mount | Thorlabs | K5X1 | #11 in Figure 2, #12 in Figure 5 |
| Achromatic Doublet | Thorlabs | AC254-035-A-ML | #7 in Figure 2 |
| Adaptor for 405 collimator | Thorlabs | AD11F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Adaptor for ajustable collimator | Thorlabs | AD127-F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB1824 | |
| Clamping Fork | Thorlabs | CF125 | |
| Cube connector | Thorlabs | CM1-CC | |
| Dual 493/574 dichroic | Semrock | FF493/574-Di01-25x36 | #10 in Figure 5 |
| Emission filter for GCaMP6 | Semrock | FF01-535/22-25 | #6 in Figure 2 |
| Enclosure with Black Hardboard Panels | Thorlabs | XE25C9 | |
| Externally SM1-Threaded End Cap for Machining | Thorlabs | SM1CP2M | |
| Fast-change SM1 Lens Tube Filter Holder | Thorlabs | SM1QP | #4-6 in Figure 2, #5-7 in Figure 5 |
| Fixed Collimator for 405 nm light | Thorlabs | F671SMA-405 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Fixed collimator for 470 and 560 nm light | Thorlabs | F240SMA-532 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Green emission filter | Semrock | FF01-520/35-25 | In light beam splitter |
| High-Resolution USB 3.0 CMOS Camera | Thorlabs | DCC3260M | #13 in Figure 2, #15 in Figure 5 |
| Light beam splitter | Neurophotometrics | SPLIT | #14 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff | Thorlabs | DMLP425R | #8 in Figure 2, #9 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff | Semrock | FF495-Di03 | #9 in Figure 2, #8 in Figure 5 |
| Metabond dental cement | C&B | ||
| M8 - M8 cable | Doric Lenses | Cable_M8-M8 | |
| Optic fiber cannulas | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Optic fiber Patchcords | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Red emission filter | Semrock | FF01-600/37-25 | In light beam splitter |
| T7 LabJack | LabJack | ||
| T-cube LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| USB 3.0 I/O Cable, Hirose 25, for DCC3240 | Thorlabs | CAB-DCU-T3 |
References
- Gunaydin, L. A., et al. Natural Neural Projection Dynamics Underlying Social Behavior. Cell. 157 (7), 1535-1551 (2014).
- Proulx, C. D., et al. A neural pathway controlling motivation to exert effort. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (22), 5792-5797 (2018).
- Muir, J., et al. In Vivo Fiber Photometry Reveals Signature of Future Stress Susceptibility in Nucleus Accumbens. Neuropsychopharmacology. 43 (2), 255-263 (2017).
- Wang, D., et al. Learning shapes the aversion and reward responses of lateral habenula neurons. eLife. 6, (2017).
- de Jong, J. W., et al. A Neural Circuit Mechanism for Encoding Aversive Stimuli in the Mesolimbic Dopamine System. Neuron. 101 (1), 133-151 (2018).
- Lerner, T. N., et al. Intact-Brain Analyses Reveal Distinct Information Carried by SNc Dopamine Subcircuits. Cell. 162 (3), 635-647 (2015).
- Calipari, E. S., et al. In vivo imaging identifies temporal signature of D1 and D2 medium spiny neurons in cocaine reward. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2726-2731 (2016).
- González, A. J., et al. Inhibitory Interplay between Orexin Neurons and Eating. Current Biology. 26 (18), 2486-2491 (2016).
- Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Barker, D. J., et al. Lateral Preoptic Control of the Lateral Habenula through Convergent Glutamate and GABA Transmission. Cell Reports. 21 (7), 1757-1769 (2017).
- Siciliano, C. A., Tye, K. M. Leveraging calcium imaging to illuminate circuit dysfunction in addiction. Alcohol. 74, 47-63 (2018).
- Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13 (4), 325-328 (2016).
- Sych, Y., Chernysheva, M., Sumanovski, L. T., Helmchen, F. High-density multi-fiber photometry for studying large-scale brain circuit dynamics. Nature Methods. 16 (6), 553-560 (2019).
- Akam, T., Walton, M. E. pyPhotometry: Open source Python based hardware and software for fiber photometry data acquisition. Scientific Reports. 9 (1), 3521 (2019).
- Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocol. 7 (1), 12-23 (2011).
- Stamatakis, A. M., et al. Lateral Hypothalamic Area Glutamatergic Neurons and Their Projections to the Lateral Habenula Regulate Feeding and Reward. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 302-311 (2016).
- Tervo, G. D., et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Yu, K., da Silva, P., Albeanu, D. F., Li, B. Central Amygdala Somatostatin Neurons Gate Passive and Active Defensive Behaviors. The Journal of Neuroscience. 36 (24), 6488-6496 (2016).
- Falkner, A. L., Grosenick, L., Davidson, T. J., Deisseroth, K., Lin, D. Hypothalamic control of male aggression-seeking behavior. Nature Neuroscience. 19 (4), 596-604 (2016).
- Ren, J., et al. Anatomically Defined and Functionally Distinct Dorsal Raphe Serotonin Sub-systems. Cell. 175 (2), 472-487 (2018).
- Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. Deciphering the molecular mechanism responsible for GCaMP6m’s Ca2+-dependent change in fluorescence. PLOS ONE. 12 (2), 0170934 (2017).
- Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
- Patriarchi, T., et al. Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors. Science. 360 (6396), (2018).
- Feng, J., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor for Rapid and Specific In Detection of Norepinephrine. Neuron. 102 (4), 745-761 (2019).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
- Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. eLife. 5, (2016).
- Wang, H., Jing, M., Li, Y. Lighting up the brain: genetically encoded fluorescent sensors for imaging neurotransmitters and neuromodulators. Current Opinion in Neurobiology. 50, 171-178 (2018).
- Lu, L., et al. Wireless optoelectronic photometers for monitoring neuronal dynamics in the deep brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1374-1383 (2018).
- Jennings, J. H., et al. Visualizing Hypothalamic Network Dynamics for Appetitive and Consummatory Behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2014).
