Summary
هذا البروتوكول تفاصيل كيفيه تنفيذ وأداء التسجيلات الضوئية متعددة ألياف ، وكيفيه تصحيح للتحف المستقلة الكالسيوم ، والاعتبارات الهامه للتصوير الضوئي ثنائي اللون.
Abstract
تسجيل نشاط مجموعه من الخلايا العصبية في الحيوانية تتحرك بحريه هو مهمة صعبه. وعلاوة علي ذلك ، كما يتم تشريح الدماغ في المجموعات الفرعية الوظيفية أصغر وأصغر ، يصبح من الاهميه بمكان لتسجيل من الإسقاطات و/أو السكان الفرعيين المحددة وراثيا من الخلايا العصبية. ألياف الضوئية القياس هو نهج يمكن الوصول اليها وقويه التي يمكن التغلب علي هذه التحديات. من خلال الجمع بين المنهجيات البصرية والجينية ، يمكن قياس النشاط العصبي في هياكل الدماغ العميق عن طريق التعبير عن مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا ، والتي تترجم النشاط العصبي إلى اشاره بصريه يمكن قياسها بسهوله. ويفصل البروتوكول الحالي مكونات نظام القياس الضوئي متعدد ألياف ، وكيفيه الوصول إلى هياكل الدماغ العميقة لتقديم وجمع الضوء ، وطريقه لحساب القطع الاثريه الحركية ، وكيفيه معالجه وتحليل إشارات الفلورسنت. ويفصل البروتوكول الاعتبارات التجريبية عند اجراء التصوير بألوان الاحاديه أو المزدوجة ، سواء من ألياف بصريه مزروعة واحده أو متعددة.
Introduction
القدرة علي ربط الاستجابات العصبية مع جوانب محدده من سلوك الحيوانية أمر بالغ الاهميه لفهم دور مجموعه معينه من الخلايا العصبية يلعب في توجيه أو الاستجابة لعمل أو التحفيز. نظرا لتعقيد السلوك الحيواني ، مع عدد لا يحصي من الدول الداخلية والمحفزات الخارجية التي يمكن ان تؤثر حتى ابسط الإجراءات ، وتسجيل اشاره مع قرار واحد المحاكمة يزود الباحثين مع الاداات اللازمة للتغلب علي هذه القيود.
أصبحت ألياف الضوئية تقنيه الاختيار للعديد من الباحثين في مجال علم الأعصاب نظم بسبب بساطتها النسبية مقارنه بغيرها من تقنيات التسجيل المجرية ، وارتفاع نسبه الاشاره إلى الضوضاء ، والقدرة علي تسجيل في مجموعه متنوعة من النماذج السلوكية1،2،3،4،5،6،7،8. وخلافا للأساليب الكهربائية الكهربية التقليدية ، فان القياس الضوئي هو النهج البصري الأكثر استخداما بالاقتران مع مؤشرات الكالسيوم المرمزة وراثيا (جيكسيس ، سلسله GCaMP)9. وتقوم اليتالق بتغيير قدرتها علي الاعتماد علي ما إذا كانت مرتبطة بالكالسيوم ام لا. لان التركيز الداخلي للكالسيوم في الخلايا العصبية هو منظم باحكام وقناات الكالسيوم الجهد بوابات مفتوحة عندما حرائق الخلايا العصبية المحتملة العمل ، وزيادات عابره في تركيز الكالسيوم الداخلي ، مما يؤدي إلى زيادات عابره في يمكن للقدرة علي الفلورية إلى مضان ، يمكن ان يكون وكيلا جيدا لإطلاق النار العصبية9.
مع ألياف الضوئية ، يتم توجيه ضوء الاثاره أسفل رقيقه ، وألياف البصرية مولتيمود في الدماغ ، ويتم جمع اشاره الانبعاثات النسخ الاحتياطي من خلال نفس ألياف. لان هذه ألياف البصرية خفيفه الوزن وانحناء ، يمكن للحيوان ان يتحرك إلى حد كبير دون عوائق ، مما يجعل هذه التقنية متوافقة مع مجموعه واسعه من الاختبارات والظروف السلوكية. بعض الظروف ، مثل الحركات السريعة أو الانحناء من ألياف البصرية الحبل التصحيح خارج دائره نصف قطرها التي يمكن ان تحافظ علي الانعكاس الداخلي الكلي ، يمكن إدخال التحف اشاره. لغموض عن اشاره من الضجيج ، يمكننا استغلال ممتلكات GCaMP المعروفة باسم "نقطه isosbestic." بإيجاز, مع [غكمب], بما ان الطول موجي من الاثاره ضوء يكون غيرت إلى اليسار, انبعاثاته في ال [كلسيوم-فيف] دوله تناقصات والاذاعه في الدولة [كلسيوم-اونبد] زيادات هامشيا. والنقطة التي تكون فيها الكثافة النسبية لهذين النوعين من الانبعاثات متساوية تسمي النقطة الايزوبيتيك. عندما يكون GCaMP متحمسا في هذه المرحلة ، فان انبعاثاته لا تتاثر بالتغيرات في تركيزات الكالسيوم الداخلية ، وغالبا ما يكون التباين في الاشاره بسبب توهين الاشاره من الانحناء الزائد لحبل التصحيح بألياف البصرية أو حركه الانسجه العصبية بالنسبة للألياف المزروعة.
وحده واحده من فسيولوجيا الكهربائية لا يزال معيار الذهب للتحرك بحريه في التسجيلات المجرية بسبب الخلية واحده والقرار مستوي واحد سبايك. ومع ذلك ، قد يكون من الصعب تحديد الهوية الجزيئية للخلايا التي يتم تسجيلها ، ويمكن ان يكون التحليل اللاحق لذلك شاقا للغاية. بينما ألياف الضوئية ليس لديها دقه خليه واحده ، فانه يسمح للباحثين لطرح الاسئله من المستحيل معالجه مع التقنيات التقليدية. الجمع بين الاستراتيجيات الفيروسية مع الكائنات المحورة وراثيا ، يمكن توجيه التعبير عن جيكليس إلى أنواع الخلايا العصبية المحددة وراثيا لتسجيل النشاط العصبي المحدد للسكان أو الإسقاط ، والذي يمكن تنفيذه عن طريق مراقبه اشاره الكالسيوم مباشره في محور عصبي انتهائيه10,11. وعلاوة علي ذلك ، من خلال زرع العديد من ألياف البصرية ، فمن الممكن لمراقبه النشاط العصبي في وقت واحد من عده مناطق الدماغ ومسارات في نفس الحيوانية12،13.
في هذه المخطوطة ، نقوم بوصف تقنيه لقياس الضوء الأحادي ومتعدد ألياف ، وكيفيه تصحيح القطع الاثريه المستقلة عن الكالسيوم ، وتفاصيل كيفيه اجراء تسجيلات أحاديه اللون ومزدوجة ألوان. كما نقدم أمثله علي أنواع الاسئله التي تمكن المرء من طرحها ومستوياتها المتزايدة من التعقيد (انظر الشكل 1). ويمكن بناء الاعداد الضوئي ألياف للتسجيلات متعددة ألياف مفصله في هذا البروتوكول باستخدام قائمه من المواد الموجودة في https://sites.google.com/view/multifp/hardware (الشكل 2).
فمن الضروري ان تكون مجهزه للنظام لكل من 410 nm و 470 nm الاثاره الموجات للانبعاثات الكالسيوم مستقله والكالسيوم المعتمدة من GCaMP6 أو المتغيرات لها. للاجهزه التي بنيت خصيصا أو إذا كان هناك اي برنامج متاح لتشغيل النظام ، ويمكن استخدام البرنامج المفتوح المصدر الحرة بونساي (http://www.open-ephys.org/bonsai/). بدلا من ذلك ، يمكن تشغيل ألياف الضوئية من خلال MATLAB (علي سبيل المثال ، https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)12 أو غيرها من لغة البرمجة14. وينبغي ان البرمجيات والاجهزه من النظام تسمح التلاعب في كل من 410 nm و 470 nm المصابيح والكاميرا ، واستخراج الصور (الشكل 2) ، وحساب كثافة الفلورسنت يعني في مناطق الاهتمام (rois) رسمها حول ألياف علي الصور. يجب ان يكون الإخراج جدول قيم كثافة متوسط سجلت مع 470 nm و 410 nm المصابيح من كل ألياف في الحبل التصحيح. عند اجراء التجارب متعددة ألياف ، 400 μm ألياف المجمعة قد تحد من حركه الفئران. في مثل هذه الحالات ، نوصي باستخدام الحبال التصحيح 200 μm ، والتي توفر المزيد من المرونة. قد يكون من الممكن أيضا استخدام أصغر الكابلات وهميه اثناء تدريب الفئران.
ومن الاهميه بمكان ان تكون قادره علي استخراج النقاط الزمنيه للاحداث المثيرة للاهتمام اثناء اكتساب ألياف الضوئية. إذا لم يوفر النظام بسهوله نظام مدمج لدمج TTLs لاحداث محدده ، فان الاستراتيجية البديلة هي تعيين طابع زمني للنقاط الزمنيه الفردية المسجلة لتتماشي مع الأوقات والاحداث المحددة اثناء التجربة. ويمكن القيام به ختم الوقت باستخدام ساعة الكمبيوتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجريت جميع التجارب وفقا للجان المؤسسية للعناية بالماشية واستخدامها التابعة لجامعه كاليفورنيا وسان دييغو والدليل الكندي لرعاية واستخدام المختبرات وتمت الموافقة عليها من قبل جامعه لافال لحماية الماشية اللجنه.
1. محاذاة المسار البصري بين CMOS (التكميلية أكسيد المعدن أشباه الموصلات) الكاميرا والفردية أو المتفرعة الحبل التصحيح
- تخفيف جميع البراغي علي المترجم 5-محور (11 ، الشكل 2ب).
- برغي في الحبل التصحيح (12 ، الشكل 2ب) إلى محول [SMA (الفرعية مصغره A) أو FC (موصل ألياف البصرية)] التي تلصق علي المترجم 5-محور.
- بدوره علي ضوء الاثاره 470 nm (1 ، الشكل 2B) في الطاقة المنخفضة (100 μw) ، ووضع غيض من باتش الاشاره إلى شريحة بلاستيكية الفلورسنت التلقائي. هذا ليس له اي تاثير علي التسجيلات في المستقبل ولكن هو فقط لتصور عمليه المحاذاة.
- سجل من كاميرا CMOS (13 ، الشكل 2B) في الوضع الحي. زيادة الربح أو ضبط جدول البحث (لوط) حتى الصورة ليست سوداء تماما. وهذه النقطة هي ان تكون قادره علي رؤية صوره في نقطه الاتصال للهدف (10 ، الشكل 2 ب).
- تقدم المترجم 5-محور نحو الهدف ، وضمان ان يتم توسيط ضوء 470 nm علي ألياف في SMA أو FC نهاية الحبل التصحيح ، حتى يمكن حل صوره علي الكاميرا.
- اضبط المحورين X و Y حتى يتم توسيط الصورة وحلها بشكل جيد.
- تصور الضوء المنبعث من نهاية السلك اللاصق. يجب ان تظهر كدائره متساوية الخواص. إذا تم استخدام سلك التصحيح المتفرعة ، يجب ان تكون كميه الضوء المنبعثة في نهايات الطواده من كل سلك التصحيح مماثله. إذا لم تكن الدائرة متساوية الخواص أو كان الضوء المنبعث غير متساو ، اضبط المترجم خماسي المحاور في محور س-ص.
2. اعداد ROIs حول ألياف لقياس كثافة الفلورسنت يعني
- بدوره علي جميع أضواء الاثاره لتصور أفضل للألياف. ضبط كسب الكاميرا بحيث يتم المشبعة لا بكسل وصوره واضحة من ألياف موجودة.
- سجل مباشر أو التقاط صوره أوليه.
- رسم ROIs حول ألياف والاحتفاظ بها لقياس قيم كثافة متوسط اثناء التسجيلات (الشكل 2ا).
- لتسجيلات ألياف متعددة ، اختبار للاستقلال في الإشارات.
- سجل حي من كل ألياف.
- نقطه واحده ألياف نحو مصدر الضوء والاستفادة باصبع. وينبغي ان تحدث تقلبات كبيره جدا فقط في تلك القناة (تسرب مقبول 1:1000).
- إذا كانت الإشارات ليست مستقله ، أعاده رسم ROIs أكثر تحفظا وتكرار اختبار الاستقلال.
- لتسميه وتتبع العائد علي الاستثمار الذي يقابل ألياف ، الشريط الملون أو طلاء الأظافر يمكن تطبيقها علي نهاية ألياف. التقط صوره قبل بدء اي تجربه كتذكير ثانوي.
3. الاعداد لتسجيل الساحة
- شنق الحبل التصحيح فوق الساحة باستخدام المدرجات ، والمشابك ، أو أصحاب.
- تاكد من ان الحيوانية يمكن ان تتحرك بحريه في جميع انحاء الساحة بأكملها ، غير المستغلة من قبل طول ألياف.
- ما إذا كان يتم استخدام مربع استثابي أو حقل مفتوح ، والتاكد من ان الحبل التصحيح سوف تكون قادره علي الوصول إلى الحيوانية مع الحد الأدنى من الانحناء. إذا كان هذا يتطلب كزه الأنف ، وضمان ان هناك ما يكفي من المساحة الزائدة لمنع الانحناء من ألياف. تجنب اي الإفراط في الانحناء أو التواء من الحبل التصحيح.
4. في الجسم التسجيلات
ملاحظه: اجراء زرع ألياف البصرية كانولا للتجارب ألياف الضوئية مطابق للاجراء لoptogenetics كما هو موضح في سبارتا وآخرون15. نوصي باستخدام الاسمنت الأسنان (انظر جدول المواد) ، والذي يوفر ترسيخ قوي من الراس إلى عظم الجمجمة. سيكون الاسمنت السني مفيدا بشكل خاص في الحالات التي لا يمكن فيها استخدام مسامير التثبيت.
- بصريا فحص الطرف البعيد من ألياف الحبل التصحيح بالعين ومع مجهر مينيفايبر. إذا تم خدش سطح ألياف ، وأعاده طلاء ألياف باستخدام ألياف تلميع/اللف الفيلم مع حصى غرامه (1 μm و 0.3 μm).
- تنظيف الأطراف البعيدة من الحبل التصحيح مع 70 ٪ الايثانول وقضيب طرف القطن.
- تنظيف ألياف البصرية cannulas باستخدام 70 ٪ الايثانول وقضيب القطن تلميح.
- ربط نهاية الطواده من الحبل التصحيح إلى ألياف مزروع باستخدام السيراميك الانقسام الأكمام مغطاه أنبوب يتقلص الأسود. اثناء الاتصال ، تاكد من ان الأكمام ضيقه ، والا استخدام الأكمام الجديدة.
ملاحظه: سيكون هناك كميه كبيره من فقدان الاشاره إذا كان هناك اي مسافة بين الطواده الحبل التصحيح وزرع ، والتسجيلات لن تعمل. - السماح للحيوان للشفاء لبضع دقائق قبل بدء الاختبارات السلوكية.
- أبدا بتسجيل الاشاره الضوئية وقم بتشغيل التجربة.
- اثناء التسجيل ، والحفاظ علي العين بعناية علي تتبع الحية لضمان جوده التسجيلات. ومن المتوقع ان تنخفض الاشاره بسرعة كداله للوقت في أول 2 دقيقه من التسجيل. ويحدث هذا التاثير بسبب الحرارة التي تتوسطها تسوس الصمام ، حيث تزيد الزيادة في الحرارة مقاومه العنصر البصري.
- إذا قفزه في الاشاره التي تتجاوز حركيه علي/قباله يحدث GCaMP ، وهذا هو في كثير من الأحيان اشاره إلى ان الأكمام ليست ضيقه بما فيه الكفاية والمسافة بين الحبل التصحيح وزرع يتغير. في هذه الحالة ، ووقف التجربة وأعاده الاتصال الحيوانية باستخدام كم جديد.
5. تحليل البيانات الضوئية ألياف
ملاحظه: هذا هو أسلوب تحليل البيانات الذي يعمل بشكل جيد لمعظم التسجيلات. غير انه يمكن تنفيذ نهج بديله. مثال التعليمه البرمجية لتحليل البيانات يمكن العثور عليها هنا: https://github.com/katemartian/Photometry_data_processing.
- استخراج يعني قيم كثافة الفلورية المسجلة من 470 نانومتر (int470) و 410 Nm (int410) المصابيح ، المقابلة لكل ألياف الفردية.
- سلاسة كل اشاره باستخدام خوارزميه متوسطه متحركة (الشكل 3ا).
- قم باجراء تصحيح خط الأساس لكل اشاره (الشكل 3A و 3b) باستخدام خوارزميه التكيف التكراري المتكررة التي تعاقب علي اقل المربعات (airpls) (https://github.com/zmzhang/airPLS) لأزاله الانحدار والتردد المنخفض تقلبات في الإشارات.
- توحيد كل اشاره باستخدام القيمة المتوسطة والانحراف المعياري (الشكل 3ج):
- باستخدام غير سالبه الانحدار الخطي قويه ، تناسب موحده zint410 إلى zint470 إشارات (الشكل 3د) إلى وظيفة الانحدار:
- استخدام معلمات الانحدار الخطي (a، b) للعثور علي قيم جديده من Zint410 المجهزة zint470 (Fitint410 ، الشكل 3د ، ه):
- استخدام معلمات الانحدار الخطي (a، b) للعثور علي قيم جديده من Zint410 المجهزة zint470 (Fitint410 ، الشكل 3د ، ه):
- حساب المبلغ الموحد df/f (z dF/f) (الشكل 3و):
6. التسجيلات ذات ألوان المزدوجة في وقت واحد
- أضافه إلى نظام قياس الضوء LED 560 nm لأثاره الأحمر الفلورسنت الاستشعار الكالسيوم والمرايا والفلاتر المناسبة ديشرويك (انظر كيم وآخرون ، 2016 للحصول علي وصف مفصل)12.
- أضف صوره مقسمه بين الهدف وكاميرا CMOS لفصل الأطوال الموجية للانبعاثات الخضراء والحمراء (انظر الشكل 5). سيشكل التقسيم صوره صورتين معكوسه علي جهاز استشعار الكاميرا ، المقابلة للإشارات الحمراء والخضراء (علي سبيل المثال ، الحبل التصحيح مع 3 فروع سوف تخلق صوره مع 6 ألياف).
- رسم ROIs حول جميع ألياف في كلا اللونين كما هو مفصل أعلاه. تاكد من تحديد كل عائد الاستثمار بوضوح مع ألياف المقابلة والقناة (الأخضر والأحمر) (الشكل 4ا).
- الزناد الاثاره في وقت واحد مع 470 nm و 560 nm المصابيح والبديل لهم مع 410 nm LED (الشكل 5ا).
7. تحليل البيانات المزدوجة اللون
- اتبع الخطوات المنصوص عليها في القسم 5 للعثور علي Fitint410 للاشاره 470 Intوحساب z dF/F.
- لان نقطه isosbestic لاحمر-تحول جيكسيس غير معروف عموما ، اشاره سجلت مع 410 nm الصمام في القناة الخضراء يمكن استخدامها لتصحيح الحركة عبر كلا القناتين. اتبع الخطوات المنصوص عليها في القسم 5 للعثور علي Fitint410 للاشاره 560 Intوحساب z dF/F.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الارتباطات العصبية من الاستجابات السلوكية يمكن ان تختلف تبعا لمجموعه متنوعة من العوامل. في هذا المثال ، استخدمنا في الجسم ألياف الضوئية الفوتومتري لقياس نشاط محطات محور عصبي من منطقه طائي الجانبية (lha) التي تنتهي في عنان وحشي الجانبية (lha). تم حقن الفئران نوع البرية مع فيروس المرتبطة adeno (AAV) ترميز GCaMP6s (AAV-hSyn-GCaMP6s) في LHA وتم زرع ألياف البصرية مع غيض مباشره فوق Lha (الشكل 4ا). تم العثور علي التعبير GCaMP6s في الهيئات الخلوية لل LHA ومحطاتها محور عصبي إسقاط لل Lha ، حيث يمكن تسجيل اشاره الكالسيوم. تنشيط مسار LHA-Lha يعزز التجنب السلبي في اختبار التفضيل في الوقت الحقيقي مما يوحي بان هذا المسار ينقل إشارات الجزم16. ثم تم توصيل الفئران إلى نظام ألياف الضوئية ، وضعت في الساحة المفتوحة لمده 6 دقائق ، ويتعرض لل 1 ثانيه افيليه المناطيد كل 60 ثانيه. وزادت الفلورية المقيسة بشكل ملحوظ بالتزامن مع أداره الطائرات (الشكل 4ب-ج). في الفئران التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ، لم يتم الكشف عن اي تغيير في الاشاره اثناء أداره نفث الهواء (الشكل 4ج). بعد الاختبار السلوكي ، تم تاكيد موقع الحقن في LHA ووضع ألياف فوق Lha تشريحيا (الشكل 4ا).
الشكل 1: الاستراتيجيات والنهج الخاصة بالتعبير الخاص بالنموذج التشريحي والنوعية الخلوية. (ا) يتم حقن الفيروسات المرتبطة بالنواقل الفيروسية (aav) التي يتم ترميزها GCaMP6 (Aav-GCaMP6) في منطقه الدماغ ذات الاهميه. ألياف البصرية يمكن زرعها بصوره مزمنة مع غيض وضعت علي الهيئات الخلوية (1) أو أكثر من محطات محور عصبي (2). للتعبير الانتقائي في الخلايا العصبية المحددة وراثيا ، يمكن حقن AAV التي تعتمد علي cre (علي سبيل المثال ، AAV-GCaMP6) في الفئران المعدلة وراثيا التعبير عن cre للالطبيعيه في السكان العصبية محدده. (ب) لتصوير الكالسيوم ثنائي اللون ، في هذا المثال يتم حقن Aav-GCaMP6s في منطقه الدماغ من الفائدة ، وترميز aav تعتمد علي cre-التي تحولت الأحمر (علي سبيل المثال ، jrGECO1a ؛ يتم حقن AAV-jrGECO1a) في الخلايا العصبية المعرفة وراثيا في منطقه الدماغ المستهدفة. يتم زرع ألياف البصرية لتصوير اشاره الكالسيوم في وقت واحد من المحطات محور عصبي (الفلورية الخضراء) والهيئات الخلية (فلوري الأحمر). (ج) لاستراتيجية الفيروسية المتقاطعة ، وهو ناقل الفيروسية مع خصائص النقل إلى الوراء (مثل ريترواف17) يتم حقن ترميز cre للالطبيعيه (ريترواف-cre) في منطقه الدماغ المستهدفة مع Aav-ديو-GCaMP6s حقن في منطقه الدماغ إسقاط في نفس الماوس. يتم زرع كانولاس ألياف البصرية علي الهيئات الخلوية لتسجيل اشاره قويه تعتمد علي الكالسيوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: ألياف الضوئية التخطيطي. (ا) ضوء الاثاره من اثنين من المصابيح (410 nm و 470 nm) يمر من خلال سلسله من الفلاتر والمرايا الثنائية وتنتج بقعه الاثاره علي مسافة العمل من الهدف 20x. يمر الضوء اما عبر سلك تصحيح واحد أو ألياف مجمعه (لتسجيلات مواقع متعددة) متصلة بالاكله المزروعة. يتم جمع الفلورية المنبعثة من نفس ألياف ، وتصفيتها ، والمتوقعة علي جهاز استشعار الكاميرا CMOS. علي الصور الملتقطة ، يتم تسجيل كثافة الفلورية المتوسطة في ROIs من كل ألياف. للحصول علي إشارات في وقت واحد من كل من 410 nm و 470 nm المصابيح ، يتم تنفيذ الإرسال المضاعف تقسيم الوقت (الرسم البياني الأيمن السفلي). (ب) صوره لنظام القياس الضوئي المصنوع حسب العرف ومكوناته: (1) ألياف إلى 465 NM الصمام ، (2) ألياف إلى الصمام 405 nm ، (3) كولماتورس ، (4) 470 nm الممر فلتر ، (5) 410 nm الممر فلتر ، (6) 535 nm الممر فلتر ، (7) أنبوب عدسه ، (8) مكعب مع longpass 425 المراه التربيعية ، (9) المكعب مع لونغ باس 495 المراه ، (10) 20x الهدف ، (11) 5-محور المترجم ، (12) أحاديه-أو المجمعة-ألياف التصحيح الحبل ، (13) كاميرا CMOS. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليل بيانات قياس ألياف الضوئية. (ا) ممهده كثافة الفلورسنت يعني (Int) سجلت من 470 نانومتر (اعلي خط ازرق) و 410 nm (أسفل الخط الأرجواني) موجات الاثاره. خطوط سوداء هي الأسس التي تم العثور عليها باستخدام خوارزميه airPLS. (ب) التغيرات في الكثافة النسبية في الإشارات بعد تصحيح خط الأساس. (C) موحده 470 nm و 410 nm إشارات (zInt470 ، اعلي ؛ zInt410 ، أسفل). (د) غير سالبه صالحه الخطي قويه من 470 نانومتر و 410 nm الإشارات. (ه) محاذاة التتبع Int410 إلى Int470 استنادا إلى المناسبة. (و) تصحيح وتطبيع التغير المعتمد علي الكالسيوم في الفلورية (z DF/F). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: النتائج التمثيلية. (ا) رسم تخطيطي للاجراء التجريبي. يتم حقن aav-GCaMP6s في lha من الفئران و 4 أسابيع في وقت لاحق ، يتم زرع قني ألياف البصرية علي lha لتسجيل اشاره محطه محور عصبي. أقحم هي الصور مبائر التمثيلية للتعبير عن التعبير في الهيئات الخلية من الخلايا العصبية lha (اليسار) ومحطات محور العصبي الخاصة بهم إسقاط ل lha (يمين). (ب) تتبع اشاره الكالسيوم التمثيلية إلى نفث الهواء (القضبان العمودية متقطعه) تقاس من lhb-إسقاط lhb المحطات الطرفية التي تقاس من الماوس GCaMP6s التعبير. (ج) مؤامرة شبه الحدث لمتوسط استجابه الكالسيوم لاحداث النفخ الجوي. يمثل الخط سميكه خضراء المعدل والمناطق [غرين-مظلل] يمثل الخطا معياريه من المتوسطة ([سم], لوحه يسري), والاشاره يقاس قبل وبعد [ايربف] (3 فيران, 15 حادثات). (دال ، هاء) نفس قياسات (B, C) لأجهزه الماوس التي تعبر عن gfp (2 الفئران, 10 الاحداث). قضبان المقياس هي 200 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: الرسم التخطيطي لقياس ألياف الضوئية ثنائي اللون. (A) اضافيه 560 NM الصمام ، والمرشحات المناسبة والمرايا ثنائيه البعد ، والخائن صوره قبل ان يتم أضافه جهاز استشعار الكاميرا إلى الاعداد الأصلي. (ب) مكونات نظام القياس الضوئي: (1) ألياف إلى 560 NM الصمام ، (2) ألياف إلى الصمام 465 nm ، (3) ألياف إلى الصمام 405 nm ، (4) المنجم ، (5) 560 nm الممر فلتر ، (6) 470 nm الممر فلتر ، (7) 410 nm الممر فلتر ، (8) مكعب مع longpass 495 مراه ديشرويك ، (9) المكعب مع لونغ باس 425 المراه التربيعية ، (10) مكعب مع 493/574 مراه ثنائيه الشكل ، (11) 20x الهدف ، (12) 5-محور المترجم ، (13) أحاديه-أو المجمعة-ألياف التصحيح الحبل ، (14) صوره الخائن ، (15) كاميرا CMOS. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ألياف الضوئية القياس هو نهج يمكن الوصول اليها التي تسمح للباحثين لتسجيل ديناميات الكالسيوم السائبة من السكان الخلايا العصبية المحددة في الحيوانية تتحرك بحريه. ويمكن الجمع بين هذه الطريقة مع مجموعه واسعه من الاختبارات السلوكية, بما في ذلك "حركه ثقيله" المهام مثل اختبارات السباحة القسري2, الخوف-تكييف18, التفاعلات الاجتماعية1,4, وغيرها7, 8و19و20. وهذا يسمح للباحثين لمراقبه ما هي السلوكيات أو المحفزات محرك النشاط في السكان العصبية معينه أو العكس.
وعلي الرغم من بساطتها البديهية ، هناك اعتبارات هامه عند تنفيذ قياس ألياف الضوئية ، والنظام المفصل في هذا البروتوكول يوفر عده مزايا للتحايل علي المزالق الشائعة. أولا ، فانه ياخذ الاستفادة من حقيقة ان المتغيرات GCaMP لديها نقطه الاثاره ايزوبسيتيك الكالسيوم مستقله حول 410 nm21 والوقت-تقسيم تعدد الإرسال لتصحيح التغيرات التي تعتمد علي الكالسيوم في الإشارات في وقت واحد تقريبا12. عندما الخلايا العصبية التعبير عن GCaMP متحمسون مع الطول الموجي 410 nm ، وكثافة الانبعاثات من GCaMP مستقله عن ملزمه لها للكالسيوم ويتصرف أساسا مثل GCAMP منخفضه الكفاءة. الوقت-تقسيم الإرسال المضاعف يستخدم كل من 410 nm الكالسيوم مستقله و 470 nm موجات الاثاره تعتمد علي الكالسيوم في نفس التسجيل. يتم استخدام الاشاره المسجلة مع الطول الموجي 410 nm الاثاره كعنصر تحكم للحركة مستقله الكالسيوم والتغييرات الملموسة في كثافة مضان. ويمكن تصور الاستراتيجيات البديلة التي لا تشمل الاستخدامات المتزامنة لأثاره ايسوسيبستيك من GCaMP. علي سبيل المثال ، فمن الممكن لاعداد اثنين من الماشية الأفواج ، واحد التعبير عن GFP والاخر التعبير عن Gfp2. ومع ذلك ، هذا ليس السيطرة المثالية ، كما هو الحال عبر الكائنات الحيوانية ، وانه من الصعب تحديد ما إذا كانت استجابه معينه في أحد المواشي كانت قطعه أثريه. ثانيا ، الاعداد الموصوفة ألياف الضوئية يسمح للباحثين لقياس النشاط في عده مسارات في وقت واحد ، وفتح الباب للاسئله المتعلقة بانتشار الاشاره في جميع انحاء الدماغ. ثالثا ، يتيح التسجيل بألوان المزدوجة مرونة اضافيه لتشريح مسارات مختلفه في نفس منطقه المخ التي تجمع بين الأخضر والأحمر المحول (الشكل 1).
مع ألياف الضوئية التسجيلات ، والانبعاثات منخفضه جدا فلوري يحتاج إلى ان تسجل من خلال الضوضاء الخلفية. ولذلك ، فمن المهم لضمان الحد الأقصى من جمع الفلورية المنبعثة من جيكليس. أولا ، عند تطوير استراتيجية فيروسية يجب علي المرء ان يعتبر ان تسجيل من المحطات الطرفية يمكن ان تكون صعبه ، لان محطات محور عصبي في مجال التسجيل يمكن ان تكون متفرقة. لحل هذه المشكلة ، يمكن تصور استراتيجية الفيروسية المتقاطعة البديلة السماح بالتعبير عن GCaMP في منطقه المستهدفة التي من الفائدة وألياف البصرية cannulas مزروعة فوق الأجسام الخلوية ، حيث يمكن ان يكون أكثر الفلوري قويه يقاس22،23،24. وهناك عامل آخر قد يؤثر سلبا علي نسبه الاشاره إلى الضوضاء وهو نوعيه ألياف البصرية والحبل التصحيح. لزراعه الأسنان ، الفولاذ المقاوم للصدا الطواده هو الأفضل ، لان زركونيا هو اوتوفلوري للغاية وسوف تزيد من اشاره الخلفية. ومن الضروري استخدام ألياف البصرية الأعلى جوده مع موصلات المحطة المصقولة جيدا ومعدلات انتقال عاليه (> 85 ٪ انتقال). اي عيوب في ألياف سوف تؤدي إلى انخفاض في نسبه الاشاره إلى الضوضاء. يجب ان يكون الحبل التصحيح ألياف البصرية ذات جوده عاليه ، وكذلك. موفري إنتاج ألياف المصممة خصيصا لقياس ألياف الضوئية ، والتي يتم تصغير الفلورية قدر الإمكان. الأسلاك التصحيح مخصصه الصنع في كثير من الأحيان لا تصل إلى الكفاءة المطلوبة. ومن المهم أيضا لتحسين محاذاة المسار البصري للحصول علي صوره مع جميع ألياف حلها بشكل جيد في نقطه الاتصال للهدف. وعلاوة علي ذلك ، فان الفتحة العددية (NA) من ألياف يجب ان تتطابق مع الحبل التصحيح وكذلك الهدف المستخدم مع النظام. اي عدم تطابق NA سيؤدي اما الاثاره أو الانبعاثات فقدان الضوء. ستوفر جميع الخطوات السابقة إشارات واضحة تعتمد علي الكالسيوم. ومع ذلك ، لا يزال مطلوبا تصحيح اشاره. يتلقى كثير تسجيلات تناقص أسيه في مضان بسبب [اوتوفلوكل] في الليف, [هت-بوساطة] [لد] انحلال, و [فوتووبالنض]. ويختلف هذا الانخفاض باختلاف ألياف والقناات ، ومن المهم ازالته في كل قناه علي حده باستخدام خوارزميه airPLS الموصوفة في قسم البروتوكول. وثانيا ، يجب ان يؤخذ تصحيح الحركة في الاعتبار. حتى لو إشارات GCaMP تبدو عاليه حيث اي تغييرات ملموسه تبدو بلا معني ، فمن المهم لتصحيح ذلك مع اشاره الكالسيوم المستقلة. الرسم البياني مع الانحياز 410 nm وإشارات 470 nm هو مرجع تبين التغييرات التي تحدث في شده بسبب GCaMP وليس التحف.
أضافه 560 nm الاثاره الصمام ، والعدسات المناسبة ديشرويك ، والخائن يتيح تسجيل في وقت واحد من فلوري الأخضر والأحمر. هذا يفتح امكانيه لرصد النشاط العصبي من اثنين من السكان العصبية المتميزة وراثيا أو لمراقبه النشاط بريسينابتيك من المحطات العصبية (علي سبيل المثال ، التعبير عن GCaMP6) ، ونشاط الخلايا العصبية بوستمتشابك (علي سبيل المثال ، التعبير عن jrGECO1a). عند تنفيذ التسجيلات ذات ألوان المزدوجة ، يجب مراعاه الاعتبارات الهامه. وقد تم الإبلاغ عن التحويل الضوئي الكبير والتنشيط الضوئي للعديد من الصور التي تحولت باللون الأحمر ، حيث يمكن ان تزيد الاضاءه مع 405 نانومتر ، 488 نانومتر ، و 560 نانومتر من الكالسيوم المستقل25. استخدام jrGECO1a و RCaMP1b قد تقليل هذه المشكلة26. مصدر قلق آخر اثناء التصوير بألوان المزدوجة هو الاشاره الخضراء التي تتسرب إلى القناة الحمراء. ويمكن تصور العديد من الاستراتيجيات لتجنب هذه المشكلة. علي سبيل المثال ، فمن الممكن لنسج موجات الاثاره الثلاثة لأثاره نقطه ايزوبستيك من مستشعر الكالسيوم الأخضر (410 نانومتر) ، واشاره تعتمد علي الكالسيوم من مستشعر الكالسيوم الأخضر (470 نانومتر) ، ومستشعر الكالسيوم الأحمر (560 نانومتر) في تسلسل. في هذه الحالة ، فمن الممكن الاعتماد علي نقطه isosbestic من الاستشعار الأخضر لتصحيح الحركة. وأخيرا ، عند أداء التصوير بألوان المزدوجة ، فمن الأفضل للحصول علي اشاره اقوي من مستشعر الكالسيوم الأحمر (علي سبيل المثال ، من الخلية somas) لان هذه لديها انبعاثات فلوري أضعف مقارنه مع أجهزه الاستشعار الخضراء.
وقد تم تطوير أجهزه الاستشعار الفلورية الجديدة المرمزة وراثيا للكشف السريع والمحدد في الجسم العصبي الإفراج عن النواقل22،23،24. هذه المجسات تنبعث منها الفلورية الخضراء عندما ملزمه مع الخاصة الذاتية الخاصة بهم ، ويمكن الجمع بين الأحمر--تحولت جيكليس ، مثل jrGECO1a ، للكشف في وقت واحد من الإفراج عن الناقل العصبي في وقت واحد مع التغيرات في نشاط الخلايا العصبية من واحد أليافالبصرية متعددة 5 ،27.
يوفر القياس الضوئي للألياف مرونة رائعه لمراقبه النشاط العصبي في الكائنات المتحركة بحريه من خلال حبال التصحيح بألياف البصرية المرنة وخفيفه الوزن. ومع ذلك ، فانه ليس مناسبا تماما للحالات التي تتطلب التنقل بين مقصورات ، مثل اختبارات الغرفة المظلمة الخفيفة. سيكون هذا ممكنا مع المزيد من التطورات في نظام القياس الضوئي لاسلكي28. وأخيرا ، في حين انه يوفر مزايا كبيره عند مراقبه الديناميكيات العصبية من مناطق الدماغ متعددة ، أو من السكان العصبية المتميزة ، والاشاره التي تم الحصول عليها في قياس ألياف الضوئية هو مجموع من العديد من الخلايا العصبية التي قد لا تطلق مع نفس ديناميات الزمانيه ولن يتم حلها. ومع ذلك ، فانه يوفر نهجا تكميليا في الجسم المجهري التصوير بالمنظار الكالسيوم حل اشاره الكالسيوم الجسدية من عشرات إلى مئات من الخلايا العصبية الفردية29. وأخيرا ، عند تسجيل من ألياف متعددة في واحده الحيوانية ، قد يكون من الصعب التفريق بين ما إذا كانت الاشاره قادمه من المحطات الطرفية أو من الخلية somas. بعناية تصميم التجارب يمكن التغلب علي معظم هذه القيود. ومع ذلك ، فان تطوير الجديدة جيكليس حصرا في الخلية اتفاقات مراكز سوف توفر المزيد من القرار خلال التجارب المتعددة ألياف الكالسيوم التصوير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
سيج ارونسون هو الرئيس التنفيذي ومؤسس نيوروفوتوميتريكس المحدودة ، التي تبيع أنظمه القياس الضوئي متعددة ألياف.
Acknowledgments
وكان هذا العمل مدعوما بمنحه من مجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا (NSERC: RGPIN-2017-06131) إلى C.P. c. P. هو FRSQ Chercheur-Boursier. كما نشكر الhttps://www.neurophotonics.ca/fr/pom التي استخدمت في هذه الدراسة لإنتاج النواقل الفيروسية المستخدمة فيها.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1" Long | Thorlabs | SH25S100 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1/2" Long | Thorlabs | SH25S050 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 3/8" Long | Thorlabs | SH25S038 | |
| 1000 µm, 0.50 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs | M59L01 | |
| 12.7 mm Optical Post | Thorlabs | TR30/M | |
| 12.7 mm Pedestal Post Holder | Thorlabs | PH20EM | |
| 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for T-Cube | Thorlabs | KPS101 | |
| 20x objective | Thorlabs | RMS20X | #10 in Figure 2, #11 in Figure 5 |
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs | CM1-DCH/M | #8-9 in Figure 2, #8-10 in Figure 5 |
| 405 nm LED | Doric Lenses | CLED_405 | #2 in Figure 2 |
| 410 nm bandpass filter | Thorlabs | FB410-10 | #5 in Figure 2; #7 in Figure 5 |
| 465 nm. LED | Doric Lenses | CLED_465 | #1 in Figure 2 |
| 470 nm bandpass filter | Thorlabs | FB470-10 | #4 in Figure 2; #6 in Figure 5 |
| 560 nm bandpass filter | Semrock | FF01-560/14-25 | #5 in Figure 5 |
| 560 nm LED | Doric Lenses | CLED_560 | #1 in Figure 3 |
| 5-axis kinematic Mount | Thorlabs | K5X1 | #11 in Figure 2, #12 in Figure 5 |
| Achromatic Doublet | Thorlabs | AC254-035-A-ML | #7 in Figure 2 |
| Adaptor for 405 collimator | Thorlabs | AD11F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Adaptor for ajustable collimator | Thorlabs | AD127-F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB1824 | |
| Clamping Fork | Thorlabs | CF125 | |
| Cube connector | Thorlabs | CM1-CC | |
| Dual 493/574 dichroic | Semrock | FF493/574-Di01-25x36 | #10 in Figure 5 |
| Emission filter for GCaMP6 | Semrock | FF01-535/22-25 | #6 in Figure 2 |
| Enclosure with Black Hardboard Panels | Thorlabs | XE25C9 | |
| Externally SM1-Threaded End Cap for Machining | Thorlabs | SM1CP2M | |
| Fast-change SM1 Lens Tube Filter Holder | Thorlabs | SM1QP | #4-6 in Figure 2, #5-7 in Figure 5 |
| Fixed Collimator for 405 nm light | Thorlabs | F671SMA-405 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Fixed collimator for 470 and 560 nm light | Thorlabs | F240SMA-532 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Green emission filter | Semrock | FF01-520/35-25 | In light beam splitter |
| High-Resolution USB 3.0 CMOS Camera | Thorlabs | DCC3260M | #13 in Figure 2, #15 in Figure 5 |
| Light beam splitter | Neurophotometrics | SPLIT | #14 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff | Thorlabs | DMLP425R | #8 in Figure 2, #9 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff | Semrock | FF495-Di03 | #9 in Figure 2, #8 in Figure 5 |
| Metabond dental cement | C&B | ||
| M8 - M8 cable | Doric Lenses | Cable_M8-M8 | |
| Optic fiber cannulas | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Optic fiber Patchcords | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Red emission filter | Semrock | FF01-600/37-25 | In light beam splitter |
| T7 LabJack | LabJack | ||
| T-cube LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| USB 3.0 I/O Cable, Hirose 25, for DCC3240 | Thorlabs | CAB-DCU-T3 |
References
- Gunaydin, L. A., et al. Natural Neural Projection Dynamics Underlying Social Behavior. Cell. 157 (7), 1535-1551 (2014).
- Proulx, C. D., et al. A neural pathway controlling motivation to exert effort. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (22), 5792-5797 (2018).
- Muir, J., et al. In Vivo Fiber Photometry Reveals Signature of Future Stress Susceptibility in Nucleus Accumbens. Neuropsychopharmacology. 43 (2), 255-263 (2017).
- Wang, D., et al. Learning shapes the aversion and reward responses of lateral habenula neurons. eLife. 6, (2017).
- de Jong, J. W., et al. A Neural Circuit Mechanism for Encoding Aversive Stimuli in the Mesolimbic Dopamine System. Neuron. 101 (1), 133-151 (2018).
- Lerner, T. N., et al. Intact-Brain Analyses Reveal Distinct Information Carried by SNc Dopamine Subcircuits. Cell. 162 (3), 635-647 (2015).
- Calipari, E. S., et al. In vivo imaging identifies temporal signature of D1 and D2 medium spiny neurons in cocaine reward. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2726-2731 (2016).
- González, A. J., et al. Inhibitory Interplay between Orexin Neurons and Eating. Current Biology. 26 (18), 2486-2491 (2016).
- Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Barker, D. J., et al. Lateral Preoptic Control of the Lateral Habenula through Convergent Glutamate and GABA Transmission. Cell Reports. 21 (7), 1757-1769 (2017).
- Siciliano, C. A., Tye, K. M. Leveraging calcium imaging to illuminate circuit dysfunction in addiction. Alcohol. 74, 47-63 (2018).
- Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13 (4), 325-328 (2016).
- Sych, Y., Chernysheva, M., Sumanovski, L. T., Helmchen, F. High-density multi-fiber photometry for studying large-scale brain circuit dynamics. Nature Methods. 16 (6), 553-560 (2019).
- Akam, T., Walton, M. E. pyPhotometry: Open source Python based hardware and software for fiber photometry data acquisition. Scientific Reports. 9 (1), 3521 (2019).
- Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocol. 7 (1), 12-23 (2011).
- Stamatakis, A. M., et al. Lateral Hypothalamic Area Glutamatergic Neurons and Their Projections to the Lateral Habenula Regulate Feeding and Reward. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 302-311 (2016).
- Tervo, G. D., et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Yu, K., da Silva, P., Albeanu, D. F., Li, B. Central Amygdala Somatostatin Neurons Gate Passive and Active Defensive Behaviors. The Journal of Neuroscience. 36 (24), 6488-6496 (2016).
- Falkner, A. L., Grosenick, L., Davidson, T. J., Deisseroth, K., Lin, D. Hypothalamic control of male aggression-seeking behavior. Nature Neuroscience. 19 (4), 596-604 (2016).
- Ren, J., et al. Anatomically Defined and Functionally Distinct Dorsal Raphe Serotonin Sub-systems. Cell. 175 (2), 472-487 (2018).
- Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. Deciphering the molecular mechanism responsible for GCaMP6m’s Ca2+-dependent change in fluorescence. PLOS ONE. 12 (2), 0170934 (2017).
- Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
- Patriarchi, T., et al. Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors. Science. 360 (6396), (2018).
- Feng, J., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor for Rapid and Specific In Detection of Norepinephrine. Neuron. 102 (4), 745-761 (2019).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
- Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. eLife. 5, (2016).
- Wang, H., Jing, M., Li, Y. Lighting up the brain: genetically encoded fluorescent sensors for imaging neurotransmitters and neuromodulators. Current Opinion in Neurobiology. 50, 171-178 (2018).
- Lu, L., et al. Wireless optoelectronic photometers for monitoring neuronal dynamics in the deep brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1374-1383 (2018).
- Jennings, J. H., et al. Visualizing Hypothalamic Network Dynamics for Appetitive and Consummatory Behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2014).
