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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

Multi-Fiber Photometrie zur Aufzeichnung neuronaler Aktivität bei frei beweglichen Tieren

Published: October 20, 2019 doi: 10.3791/60278
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1CERVO Brain Research Center, Department of Psychiatry and Neurosciences, Université Laval, 2Center for Neural Circuits and Behavior, Department of Neuroscience and Section of Neurobiology, Division of Biology, University of California at San Diego, 3Neurophotometrics Ltd.

Summary

In diesem Protokoll wird erläutert, wie Multifaserphotometrieaufzeichnungen implementiert und durchgeführt werden, wie Kalzium-unabhängige Artefakte korrigiert werden und wie wichtige Überlegungen für die duale Photometrie-Bildgebung berücksichtigt werden.

Abstract

Die Aufzeichnung der Aktivität einer Gruppe von Neuronen in einem frei beweglichen Tier ist ein schwieriges Unterfangen. Darüber hinaus wird es, da das Gehirn in kleinere und kleinere funktionelle Untergruppen zerlegt wird, von größter Bedeutung, aus Projektionen und/oder genetisch definierten Subpopulationen von Neuronen aufzuzeichnen. Fiber-Photometrie ist ein zugänglicher und leistungsstarker Ansatz, der diese Herausforderungen bewältigen kann. Durch die Kombination optischer und genetischer Methoden kann die neuronale Aktivität in tiefen Gehirnstrukturen gemessen werden, indem genetisch kodierte Kalziumindikatoren exexzessiert werden, die die neuronale Aktivität in ein optisches Signal übersetzen, das leicht messbar ist. Das aktuelle Protokoll beschreibt die Komponenten eines Multifaser-Photometriesystems, wie man auf tiefe Gehirnstrukturen zugreift, um Licht zu liefern und zu sammeln, eine Methode, um Bewegungsartefakte zu berücksichtigen, und wie fluoreszierende Signale verarbeitet und analysiert werden. Das Protokoll beschreibt experimentelle Überlegungen bei der Durchführung von Einzel- und Dual-Farb-Bildgebung, entweder aus einzelnen oder mehreren implantierten Optischen Fasern.

Introduction

Die Fähigkeit, neuronale Reaktionen mit bestimmten Aspekten des Verhaltens eines Tieres zu korrelieren, ist entscheidend, um die Rolle zu verstehen, die eine bestimmte Gruppe von Neuronen bei der Leitung oder Reaktion auf eine Handlung oder einen Reiz spielt. Angesichts der Komplexität des Verhaltens von Tieren, mit den unzähligen inneren Zuständen und äußeren Reizen, die selbst die einfachsten Aktionen beeinflussen können, rüstet die Aufzeichnung eines Signals mit Einer-Versuchs-Auflösung die Forscher mit den notwendigen Werkzeugen aus, um diese zu überwinden. Einschränkungen.

Die Faserphotometrie ist für viele Forscher auf dem Gebiet der Systemneurowissenschaften aufgrund ihrer relativen Einfachheit im Vergleich zu anderen In-vivo-Aufnahmetechniken, ihrem hohen Signal-Rausch-Verhältnis und der Fähigkeit, in einer Vielzahl von Verhaltensparadigmen1,2,3,4,5,6,7,8. Im Gegensatz zu herkömmlichen elektrophysiologischen Methoden ist die Photometrie der optische Ansatz, der am häufigsten in Verbindung mit genetisch kodierten Calciumindikatoren (GECIs, gCaMP-Serie)9verwendet wird. GECIs ändern ihre Fluoreszenzfähigkeit, je nach, ob sie an Kalzium gebunden sind oder nicht. Da die innere Konzentration von Kalzium in Neuronen sehr streng reguliert ist und spannungsgebundene Kalziumkanäle sich öffnen, wenn ein Neuron ein Aktionspotential abfeuert, erhöht sich die innere Kalziumkonzentration vorübergehend, was zu vorübergehenden Fähigkeit eines GECI zur Fluoreszenz, kann ein guter Proxy für neuronaleFeuerung 9sein.

Mit der Faserphotometrie wird das Anregungslicht eine dünne Multimode-Optikfaser ins Gehirn geleitet, und ein Emissionssignal wird durch dieselbe Faser wieder nach oben gesammelt. Da diese Glasfasern leicht und biegsam sind, kann sich ein Tier weitgehend ungehindert bewegen, was diese Technik mit einer Vielzahl von Verhaltenstests und -bedingungen kompatibel macht. Einige Bedingungen, wie schnelle Bewegungen oder das Biegen des Glasfaser-Patchkabels über den Radius hinaus, in dem es die gesamte interne Reflexion aufrechterhalten kann, können Signalartefakte einführen. Um Signalvon Rauschen zu verkennen, können wir eine Eigenschaft von GCaMP ausnutzen, die als "isosbestic point" bekannt ist. Kurz gesagt, mit GCaMP, da die Wellenlänge des Anregungslichts nach links verschoben wird, nimmt seine Emission im kalziumgebundenen Zustand ab und die Emission im Kalzium-ungebundenen Zustand nimmt geringfügig zu. Der Punkt, an dem die relative Intensität dieser beiden Emissionen gleich ist, wird als isosbestischer Punkt bezeichnet. Wenn GCaMP an dieser Stelle angeregt wird, wird seine Emission nicht durch Veränderungen der inneren Kalziumkonzentrationen beeinflusst, und die Varianz des Signals ist am häufigsten auf die Dämpfung des Signals durch Überbiegung des Glasfaser-Patchkabels oder die Bewegung des Neuronalgewebes zurückzuführen. relativ zur implantierten Faser.

Die Ein-Einheiten-Elektrophysiologie ist aufgrund ihrer einzelligen und Single-Spike-Level-Auflösung nach wie vor der Goldstandard für frei bewegliche In-vivo-Aufnahmen. Es kann jedoch schwierig sein, die molekulare Identität der zellen zu bestimmen, die aufgezeichnet werden, und die Post-hoc-Analyse kann ziemlich mühsam sein. Faserphotometrie hat zwar keine einzellige Auflösung, ermöglicht es Forschern jedoch, Fragen zu stellen, die mit herkömmlichen Techniken nicht angegangen werden können. Durch die Kombination viraler Strategien mit transgenen Tieren kann die Expression von GECIs auf genetisch definierte neuronale Typen gerichtet werden, um populations- oder projektionsdefinierte neuronale Aktivität aufzuzeichnen, die durch die Überwachung des Calciumsignals direkt am Axon durchgeführt werden kann. Klemmen10,11. Darüber hinaus ist es durch die Implantation mehrerer faseroptischer Kanülen möglich, die neuronale Aktivität aus mehreren Hirnregionen und -wegen im selben Tier gleichzeitig zu überwachen12,13.

In diesem Manuskript beschreiben wir eine Technik für Einzel- und Multifaserphotometrie, wie man kalziumunabhängige Artefakte korrigiert und detailliert beschreibt, wie man mono- und dualfarbene Aufnahmen durchführt. Wir bieten auch Beispiele für die Arten von Fragen, die man stellen kann, und deren zunehmende Komplexität (siehe Abbildung 1). Das Faserphotometrie-Setup für Multifaseraufzeichnungen, die in diesem Protokoll detailliert sind, kann mithilfe einer Liste von Materialien erstellt werden, die unter https://sites.google.com/view/multifp/hardware (Abbildung 2) zu finden sind.

Es ist wichtig, dass das System sowohl für 410 nm als auch für 470 nm Anregungswellenlängen für kalziumunabhängige und kalziumabhängige Fluoreszenzemissionen aus GCaMP6 oder seinen Varianten ausgestattet ist. Für kundenspezifische Setups oder wenn keine Software zum Ausführen des Systems verfügbar ist, kann das kostenlose Open-Source-Programm Bonsai (http://www.open-ephys.org/bonsai/) verwendet werden. Alternativ kann die Faserphotometrie über MATLAB (z.B. https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)12 oder eine andere Programmiersprache14ausgeführt werden. Die Software und Hardware des Systems sollte die Manipulation der 410 nm und 470 nm LEDs und der Kamera, die Extraktion von Bildern (Abbildung 2), und die Berechnung der mittleren Fluoreszenzintensität in den Bereichen von Interesse (ROIs) um die Fasern auf die Bilder. Der Ausgang sollte eine Tabelle mit mittleren Intensitätswerten sein, die mit den LEDs 470 nm und 410 nm von jeder Faser im Patchkabel aufgezeichnet werden. Bei Multifaserexperimenten können gebündelte Fasern mit 400 m die Bewegung von Mäusen einschränken. In solchen Fällen empfehlen wir die Verwendung von 200 m Patchkabeln, die mehr Flexibilität bieten. Es kann auch möglich sein, kleinere Dummy-Kabel während des Trainings von Mäusen zu verwenden.

Es ist entscheidend, in der Lage zu sein, Zeitpunkte für Ereignisse von Interesse während der Faserphotometrie-Erfassung zu extrahieren. Wenn das System nicht ohne weiteres ein integriertes System zur Integration von TTLs für bestimmte Ereignisse bereitstellt, besteht eine alternative Strategie darin, einzelnen aufgezeichneten Zeitpunkten einen Zeitstempel zuzuweisen, um sich an bestimmten Zeiten und Ereignissen während des Experiments auszurichten. Die Zeitstempelung kann mit der Computeruhr erfolgen.

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Protocol

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Institutional Animal Care and Use Committees der University of California, San Diego, und dem Canadian Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt und von der Université Laval Animal Protection genehmigt. ausschuß.

1. Ausrichtung des optischen Pfades zwischen der CMOS-Kamera (komplementärer Metalloxid-Halbleiter) und dem einzelnen oder verzweigten Patchkabel

  1. Lösen Sie alle Schrauben am 5-Achsen-Übersetzer (11, Abbildung 2B).
  2. Schrauben Sie das Patchkabel (12, Abbildung 2B) an den Adapter [SMA (Subminiatur A) oder FC (Faseroptikstecker)] ein, der am 5-Achsen-Übersetzer befestigt ist.
  3. Schalten Sie das 470 nm Anregungslicht (1, Abbildung 2B) bei geringer Leistung (100 W) ein und platzieren Sie die Spitze des Patchcords, das auf einen autofluoreszierenden Kunststoffschlitten zeigt. Dies hat keinen Einfluss auf zukünftige Aufnahmen, sondern dient ausschließlich der Visualisierung des Ausrichtungsprozesses.
  4. Aufnahme von der CMOS-Kamera (13, Abbildung 2B) im Live-Modus. Erhöhen Sie die Verstärkung oder passen Sie die Suchtabelle (LUT) an, bis das Bild nicht vollständig schwarz ist. Es geht darum, ein Bild im Mittelpunkt des Ziels zu sehen (10, Abbildung 2B).
  5. Bringen Sie den 5-Achsen-Übersetzer auf das Ziel zu, um sicherzustellen, dass das 470 nm Licht auf der Faser am SMA- oder FC-Ende des Patchkabels zentriert ist, bis ein Bild auf der Kamera aufgelöst werden kann.
  6. Passen Sie die X- und Y-Achsen an, bis das Bild zentriert und gut aufgelöst ist.
  7. Visualisieren Sie das Licht, das vom Ferrule-Ende des Patchkabels ausgesendet wird. Es sollte als isotrope Kreis erscheinen. Wenn ein verzweigendes Patchkabel verwendet wird, sollte die Menge an Licht, das an den Ferrule-Enden jedes Patchkabels emittiert wird, ähnlich sein. Wenn der Kreis nicht isottrop ist oder das emittierte Licht ungleich ist, stellen Sie den 5-Achsen-Übersetzer in der X-Y-Achse ein.

2. Einrichtung von ROIs um Fasern zur Messung der mittleren Fluoreszenzintensität

  1. Schalten Sie alle Anregungsleuchten ein, um die Fasern besser zu visualisieren. Passen Sie die Kameraverstärkung so an, dass keine Pixel gesättigt sind und ein klares Bild der Fasern vorhanden ist.
  2. Live-Aufnahme oder nehmen Sie ein vorläufiges Bild.
  3. Zeichnen Sie ROIs um die Fasern und halten Sie sie für die Messung der mittleren Intensitätswerte während der Aufnahmen(Abbildung 2A).
  4. Testen Sie bei mehreren Faseraufzeichnungen die Unabhängigkeit in Signalen.
    1. Live-Rekord aus allen Fasern.
    2. Zeigen Sie eine Faser auf eine Lichtquelle und tippen Sie mit einem Finger. Sehr große Schwankungen sollten nur in diesem Kanal auftreten (akzeptable Leckage 1:1000).
    3. Wenn die Signale nicht unabhängig sind, zeichnen Sie konservativere ROIs neu und wiederholen Sie den Unabhängigkeitstest.
  5. Um zu beschriften und zu verfolgen, welcher ROI entspricht, welche Faser, farbiges Klebeband oder Nagellack am Ende der Fasern aufgetragen werden kann. Nehmen Sie ein Bild vor dem Start eines Experiments als sekundäre Erinnerung auf.

3. Einrichtung der Aufnahmearena

  1. Hängen Sie das Patchkabel über der Arena mit Ständern, Klammern oder Halterungen.
  2. Stellen Sie sicher, dass sich das Tier ungehindert durch die gesamte Arena bewegen kann, ungehindert durch die Länge der Faser.
  3. Unabhängig davon, ob eine Operantbox oder ein offenes Feld verwendet wird, stellen Sie sicher, dass das Patchkabel in der Lage ist, das Tier mit minimaler Biegung zu erreichen. Wenn dies einen Nasensack erfordert, stellen Sie sicher, dass genügend Platz über dem Kopf vorhanden ist, um eine Beugung der Faser zu verhindern. Vermeiden Sie übermäßiges Biegen oder Verdrehen des Patchkabels.

4. In-vivo-Aufnahmen

HINWEIS: Das Verfahren der optischen Kanülenimplantation für Faserphotometrieexperimente ist identisch mit dem Verfahren für die Optogenetik, wie in Sparta et al15beschrieben. Wir empfehlen die Verwendung von Zahnzement (siehe Tabelle der Materialien), der eine robuste Verankerung der Kopfkappe am Schädelknochen ermöglicht. Dentalzement ist besonders nützlich, wenn Verankerungsschrauben nicht verwendet werden können.

  1. Überprüfen Sie visuell das distale Ende der Fasern der Patchschnur per Auge und mit einem Minifasermikroskop. Wenn die Oberfläche der Fasern zerkratzt ist, polieren Sie die Fasern mit Faserpol-/Lappenfolie mit feinem Körnung (1 m und 0,3 m).
  2. Reinigen Sie die distalen Enden des Patchkabels mit 70% Ethanol und einem Baumwollspitzenapplikator.
  3. Reinigen Sie die faseroptischen Kanülen mit 70% Ethanol und einem Baumwollspitzenapplikator.
  4. Verbinden Sie das Ferrule-Ende des Patchkabels mit der implantierten Faser mit einer Keramik-Split-Sleeve mit einem schwarzen Schrumpfrohr bedeckt. Achten Sie während des Anschlusses darauf, dass die Hülse fest ist, ansonsten eine neue Hülse verwenden.
    HINWEIS: Es wird eine große Menge an Signalverlust, wenn es einen Platz zwischen dem Patch-Kabel Ferrule und dem Implantat, und die Aufnahmen werden nicht funktionieren.
  5. Lassen Sie das Tier einige Minuten vor Beginn der Verhaltenstests erholen.
  6. Starten Sie die Aufzeichnung des optischen Signals und führen Sie das Experiment aus.
  7. Behalten Sie während der Aufnahme die Live-Trace sorgfältig im Auge, um qualitativ hochwertige Aufnahmen zu gewährleisten. Es wird erwartet, dass das Signal in den ersten 2 min der Aufnahme als Funktion der Zeit schnell abnimmt. Dieser Effekt wird durch wärmevermittelten LED-Zerfall verursacht, wodurch die Wärmezunahme den Widerstand des optischen Elements erhöht.
  8. Wenn ein Sprung in das Signal auftritt, das die Ein-/Aus-Kinetik von GCaMP überschreitet, ist dies oft ein Hinweis darauf, dass die Hülse nicht eng genug ist und sich der Abstand zwischen patch cord und dem Implantat ändert. In diesem Fall stoppen Sie das Experiment und verbinden Sie das Tier mit einer neuen Hülse wieder.

5. Fiberphotometrie Datenanalyse

HINWEIS: Dies ist eine Methode zur Datenanalyse, die für die meisten Aufzeichnungen gut funktioniert. Es können jedoch alternative Ansätze umgesetzt werden. Beispielcode für die Datenanalyse finden Sie hier: https://github.com/katemartian/Photometry_data_processing.

  1. Extrahieren Sie mittlere Fluoreszenzintensitätswerte, die von 470 nm (Int470) und 410 nm (Int410) LEDs aufgezeichnet wurden, entsprechend jeder einzelnen Faser.
  2. Glätten Sie jedes Signal mit einem beweglichen Mittelwertalgorithmus (Abbildung 3A).
  3. Führen Sie die Basiskorrektur jedes Signals(Abbildung 3A und 3B) mit dem adaptiven iterativ neu gewichteten Penalized Least Squares (airPLS) Algorithmus (https://github.com/zmzhang/airPLS airPLS) durch, um die Steigung und die niedrige Frequenz zu entfernen. Schwankungen der Signale.
  4. Standardisieren Sie jedes Signal mit dem Mittelwert und der Standardabweichung(Abbildung 3C):
    Equation 1
  5. Mit nicht-negativen robusten linearen Regression, passen standardisierte zInt410 bis zInt470 Signale (Abbildung 3D) an die Regressionsfunktion:
    Equation 2
    1. Verwenden Sie die Parameter der linearen Regression (a, b), um neue Werte von zInt410 zu finden, die an zInt470 (fitInt410, Abbildung 3D,E) angepasst sind:
      Equation 3
  6. Berechnen Sie die normalisierte dF/F (z dF/F) (Abbildung 3F):
    Equation 4

6. Gleichzeitige duale Aufnahmen

  1. Fügen Sie dem Photometriesystem eine 560 nm LED hinzu, um den roten fluoreszierenden Kalziumsensor und die entsprechenden dichroitischen Spiegel und Filter zu erregen (siehe Kim et al., 2016 für eine detaillierte Beschreibung)12.
  2. Fügen Sie einen Bildspalter zwischen dem Objektiv und der CMOS-Kamera hinzu, um die grünen und roten Emissionswellenlängen zu trennen (siehe Abbildung 5). Der Bildteiler bildet zwei gespiegelte Bilder auf dem Kamerasensor, entsprechend den roten und grünen Signalen (z. B. erzeugt ein Patchkabel mit 3 Zweigen ein Bild mit 6 Fasern).
  3. Zeichnen Sie ROIs um alle Fasern in beiden Farben, wie oben beschrieben. Achten Sie darauf, jeden ROI mit der entsprechenden Faser und dem entsprechenden Kanal (grün und rot) eindeutig zu identifizieren (Abbildung 4A).
  4. Lösen Sie die gleichzeitige Anregung mit 470 nm und 560 nm LEDs aus und wechseln Sie sie mit 410 nm LED ab (Abbildung 5A).

7. Duale Farbdatenanalyse

  1. Folgen Sie den Schritten in Abschnitt 5, um fitInt410 für das Int470 Signal zu finden und z dF/Fzu berechnen.
  2. Da der isosbestische Punkt für rot versetzte GECIs in der Regel unbekannt ist, kann das mit 410 nm LED im grünen Kanal aufgezeichnete Signal zur Bewegungskorrektur über beide Kanäle hinweg verwendet werden. Folgen Sie den Schritten in Abschnitt 5, um fitInt410 für das Int560 Signal zu finden und z dF/Fzu berechnen.

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Representative Results

Neuronale Korrelationen von Verhaltensreaktionen können je nach einer Vielzahl von Faktoren variieren. In diesem Beispiel haben wir die In-vivo-Faserphotometrie verwendet, um die Aktivität von Axonklemmen aus dem lateralen hypothalamischen Bereich (LHA) zu messen, die in der lateralen Hatula (LHb) enden. Wildtyp-Mäuse wurden mit einem Adeno-assoziierten Virus (AAV) injiziert, das GCaMP6s (AAV-hSyn-GCaMP6s) in die LHA kodiert, und eine Optische Faser wurde mit der Spitze unmittelbar über dem LHb implantiert (Abbildung 4A). GCaMP6s-Expression findet sich in den Zellkörpern des LHA und deren Axonklemmen, die auf das LHb projiziert werden, wo Kalziumsignale aufgezeichnet werden können. Die Aktivierung des LHA-LHb-Signalwegs fördert die passive Vermeidung im Echtzeit-Präferenztest, was darauf hindeutet, dass dieser Signalweg aversive Signale16überträgt. Die Mäuse wurden dann mit dem Faserphotometriesystem verbunden, für 6 min in einer offenen Arena platziert und alle 60 Sek. 1 sec aversive Airpuffs ausgesetzt. Die gemessene Fluoreszenz erhöhte sich gleichzeitig signifikant mit der Verabreichung von Luftpuffs (Abbildung 4B-C). Bei Mäusen, die grünes fluoreszierendes Protein (GFP) exdrücken, wurde während der Verabreichung von Airpuffs keine Änderung des Signals festgestellt (Abbildung 4C). Nach Verhaltenstests wurden die Injektionsstelle in der LHA und die Faserplatzierung oberhalb des LHb histologisch bestätigt (Abbildung 4A).

Figure 1
Abbildung 1: Strategien und Ansätze für geCI-Expression mit anatomischer und zelltypischer Spezifität. (A) Ein viraler Vektor Adeno-assoziierter Virus (AAV) Codierung GCaMP6 (AAV-GCaMP6) wird in eine Gehirnregion von Interesse injiziert. Die Optische Faser kann chronisch mit der Spitze über den Zellkörpern (1) oder über die Axonklemmen (2) implantiert werden. Zur selektiven Expression in einer genetisch definierten neuronalen Population kann ein kre-abhängiges AAV (z.B. AAV-DIO-GCaMP6) in transgene Mäuse injiziert werden, die die Cre-Rekombination in einer bestimmten neuronalen Population exemitenken. (B) Für die duale Kalziumbildgebung wird in diesem Beispiel ein AAV-GCaMP6s in eine Hirnregion von Interesse injiziert, und ein kre-abhängiger AAV kodiert eine rot verschobene GECI (z. B. jrGECO1a; AAV-DIO-jrGECO1a) wird in eine genetisch definierte neuronale Population in einer Zielhirnregion injiziert. Die Optische Faser wird zur simultanen Calciumsignalbildgebung der Axonklemmen (grüne Fluoreszenz) und Zellkörper (rote Fluoreszenz) implantiert. (C) Für eine intersektionale virale Strategie wird ein viraler Vektor mit retrograden Transporteigenschaften (wie retroAAV17), der die Cre Recombinase (retroAAV-cre) kodiert, in die Zielhirnregion injiziert, zusammen mit einem AAV-DIO-GCaMP6s, in das die projizierte Hirnregion in derselben Maus. Optische Faserkanülen werden über die Zellkörper implantiert, um eine robuste kalziumabhängige Signalaufzeichnung zu erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Faserphotometrie-Schema. (A) Das Anregungslicht von zwei LEDs (410 nm und 470 nm) durchläuft eine Reihe von Filtern und dichroitischen Spiegeln und erzeugt einen Anregungspunkt im Arbeitsabstand des 20x-Objektivs. Das Licht durchläuft entweder ein einzelnes Patchkabel oder gebündelte Fasern (für mehrere Standortaufzeichnungen), die mit den implantierten Kanülen verbunden sind. Die emittierte Fluoreszenz wird von denselben Fasern erfasst, gefiltert und auf einen CMOS-Kamerasensor projiziert. Auf den aufgenommenen Bildern wird die mittlere Fluoreszenzintensität an den ROIs jeder Faser aufgezeichnet. Um gleichzeitig Signale von 410 nm und 470 nm LEDs zu erfassen, wird ein Time-Division-Multiplexing implementiert (unteres rechtes Diagramm). (B) Bild unseres maßgeschneiderten Photometriesystems und seiner Komponenten: (1) Fiber to the 465 nm LED, (2) Fiber to the 405 nm LED, (3) Collimators, (4) 470 nm Bandpassfilter, (5) 410 nm Bandpassfilter, (6) 535 nm Bandpassfilter, (7) Rohrlinse, (8) Würfel mit Langpass 425 dichroitischer Spiegel, (9) Würfel mit Langpass 495 dichroitischem Spiegel, (10) 20x Objektiv, (11) 5-Achsen-Übersetzer, (12) Mono- oder Bundle-Faser-Patchkabel, (13) CMOS-Kamera. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Analyse von Faserphotometriedaten. (A) Geglättete mittlere fluoreszierende Intensitäten (Int) aufgezeichnet von 470 nm (obere blaue Linie) und 410 nm (untere lila Linie) Anregungswellenlängen. Schwarze Linien sind Basislinien, die mit dem airPLS-Algorithmus gefunden werden. (B) Relative Intensitätsänderungen der Signale nach der Basiskorrektur. (C) Standardisierte 470 nm und 410 nm Signale (zInt470, oben; zInt410, unten). (D) Nicht-negative robuste lineare Passung von 470 nm und 410 nm Signalen. (E) Ausrichtung der Spur Int410 nach Int470 basierend auf der Passform. (F) Korrigierte und normalisierte calciumabhängige Fluoreszenzveränderung (z dF/F). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse. (A) Diagramm des Versuchsverfahrens. Ein AAV-GCaMP6s wird in die LHA von Mäusen injiziert und 4 Wochen später wird eine Optische Faserkanüle über dem LHb zur Axon-Terminal-Signalaufzeichnung implantiert. Inset sind repräsentative konfokale Bilder der GCaMP6s-Expression in den Zellkörpern von LHA-Neuronen (links) und deren Axon-Terminals, die auf die LHb (rechts) projizieren. (B) Repräsentative Kalziumsignalspur zu Luftpuffs (gestrichelte vertikale Balken), gemessen von LHb-projizierten LHA-Axonklemmen, gemessen von einer GCaMP6s-exezierenden Maus. (C) Peri-Event-Diagramm der durchschnittlichen Kalzium-Antwort auf Airpuff-Ereignisse. Die dicke grüne Linie stellt den Durchschnitt dar, und die grün schattierten Bereiche stellen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM, linkes Panel) und das signal dar, das vor und nach einem Airpuff gemessen wird (3 Mäuse, 15 Ereignisse). (D,E) Gleiche Messungen wie (B,C) für GFP-exzessierende Mäuse (2 Mäuse, 10 Ereignisse). Die Maßstabsleisten sind 200 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Schematic der dualen Faserphotometrie. (A) Eine zusätzliche 560 nm LED, entsprechende Filter und dichroitische Spiegel sowie ein Bildteiler vor dem Hinzufügen des Kamerasensors zum ursprünglichen Setup. (B) Photometriesystemkomponenten: (1) Fiber zur 560 nm LED, (2) Fiber zur 465 nm LED, (3) Fiber zur 405 nm LED, (4) Kollimatoren, (5) 560 nm Bandpassfilter, (6) 470 nm Bandpassfilter, (7) 410 nm Bandpassfilter, (8) Würfel mit Langpass 495 , (9) Würfel mit Langpass 425 dichroitischem Spiegel, (10) Würfel mit 493/574 dichroitischem Spiegel, (11) 20x objektiv, (12) 5-Achsen-Übersetzer, (13) Mono- oder Bundled-Fiber-Patchkabel, (14) Bildsplitter, (15) CMOS-Kamera. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Die Faserphotometrie ist ein zugänglicher Ansatz, der es Forschern ermöglicht, Massenkalzium-Dynamiken von definierten neuronalen Populationen bei frei beweglichen Tieren aufzuzeichnen. Diese Methode kann mit einer Vielzahl von Verhaltenstests kombiniert werden, einschließlich "bewegungslastige" Aufgaben wie erzwungene Schwimmtests2, Angstkonditionierung18, soziale Interaktionen1,4und andere7 , 8,19,20. Dies ermöglicht es Forschern zu beobachten, welche Verhaltensweisen oder Reize die Aktivität in einer bestimmten neuronalen Population antreiben oder umgekehrt.

Trotz seiner anscheinen Einfachheit gibt es wichtige Überlegungen bei der Implementierung der Faserphotometrie, und das in diesem Protokoll beschriebene System bietet mehrere Vorteile, um häufige Fallstricke zu umgehen. Erstens nutzt sie die Tatsache, dass GCaMP-Varianten einen kalziumunabhängigen isosbestischen Anregungspunkt um 410 nm21 und Zeitteilungsmultiplexing haben, um kalziumabhängige Signaleveränderungen fast gleichzeitig zu korrigieren12. Wenn Neuronen, die GCaMP exemiten, mit einer Wellenlänge von 410 nm angeregt werden, ist die Emissionsintensität von GCaMP unabhängig von ihrer Bindung an Kalzium und verhält sich im Wesentlichen wie ein gfP mit geringer Effizienz. Das Time-Division-Multiplexing verwendet sowohl 410 nm calciumunabhängige als auch 470 nm calciumabhängige Anregungswellenlängen in derselben Aufzeichnung. Das mit der 410 nm Anregungswellenlänge aufgezeichnete Signal wird als Steuerung für kalziumunabhängige Bewegungen und Artefaktänderungen in der Fluoreszenzintensität verwendet. Alternative Strategien, die keine gleichzeitige Verwendung von isosbestischer Anregung von GCaMP beinhalten, können sich vorstellen. Beispielsweise ist es möglich, zwei Tierkohorten vorzubereiten, von denen eine GFP und die andere GCaMP2ausdrückt. Dies ist jedoch keine perfekte Kontrolle, da es sich um Tiere hinweg handelt und es schwieriger ist zu erkennen, ob eine bestimmte Reaktion in einem bestimmten Tier ein Artefakt war. Zweitens ermöglicht das beschriebene Faserphotometrie-Setup forschern, die Aktivität in mehreren Bahnen gleichzeitig zu messen, und öffnet die Tür für Fragen zur Signalausbreitung im gesamten Gehirn. Drittens ermöglicht die duale Aufnahme zusätzliche Flexibilität, um verschiedene Bahnen in derselben Hirnregion zu sezieren, die grüne und rot verschobene GECIs kombinieren (Abbildung 1).

Bei Aufnahmen von Faserphotometrieaufnahmen muss eine sehr emissionsarme Fluoreszenz durch Hintergrundgeräusche aufgezeichnet werden. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, die maximale Erfassung der von GECIs emittierten Fluoreszenz sicherzustellen. Erstens muss man bei der Entwicklung einer viralen Strategie berücksichtigen, dass die Aufzeichnung von Terminals eine Herausforderung sein kann, da Axonklemmen im Aufnahmefeld spärlich sein können. Um dieses Problem zu lösen, kann eine alternative intersektionale virale Strategie geplant werden, die die Expression von GCaMP in einem Zielprojektbereich von Interesse und optischen Faserkanülen ermöglicht, die über den Zellkörpern implantiert werden, wo eine robustere Fluoreszenz möglich ist. gemessen22,23,24. Ein weiterer Faktor, der sich negativ auf das Signal-Rausch-Verhältnis auswirken kann, ist die Qualität der Glasfaserkanüle und des Patchkabels. Bei Implantationen ist Edelstahl-Ferrule vorzuziehen, da Zirkonia stark autofluoreszierend ist und das Hintergrundsignal erhöht. Es ist wichtig, die hochwertigsten Glasfaserkanülen mit gut polierten Klemmenanschlüssen und hohen Übertragungsraten (>85% Übertragung) zu verwenden. Eventuelle Defekte in den Fasern führen zu einer Verringerung des Signal-Rausch-Verhältnisses. Auch das Glasfaser-Patchkabel sollte von hoher Qualität sein. Anbieter produzieren Fasern, die speziell für die Faserphotometrie entwickelt wurden, bei denen die Autofluoreszenz so weit wie möglich minimiert wird. Maßgeschneiderte Patchkabel erreichen oft nicht die erforderliche Effizienz. Es ist auch wichtig, die Ausrichtung des optischen Pfades zu optimieren, um ein Bild mit allen Fasern gut gelöst an der Brennpunkt des Ziels zu erhalten. Darüber hinaus muss die numerische Blende (NA) der Faser mit der des Patchkabels sowie dem mit dem System verwendeten Objektiv übereinstimmen. Jede NA-Inübereinstimmung führt entweder zu Erregung oder Emissionslichtverlust. Alle vorherigen Schritte liefern klare kalziumabhängige Signale. Eine Signalkorrektur ist jedoch weiterhin erforderlich. Die meisten Aufnahmen haben eine exponentielle Abnahme der Fluoreszenz aufgrund der Autofluoreszenz in den Fasern, wärmevermittelten LED-Zerfall und Photobleichung. Diese Abnahme variiert mit verschiedenen Fasern und Kanälen, und es ist wichtig, sie in jedem Kanal separat mit dem im Protokollabschnitt beschriebenen airPLS-Algorithmus zu entfernen. Zweitens muss die Bewegungskorrektur berücksichtigt werden. Auch wenn GCaMP-Signale hoch erscheinen, wo artefaktium Änderungen bedeutungslos erscheinen, ist es wichtig, es mit Kalzium-unabhängigem Signal zu korrigieren. Das Diagramm mit ausgerichteten 410 nm- und 470 nm-Signalen ist eine Referenz, die zeigt, welche Intensitätsänderungen durch GCaMP und nicht durch Artefakte verursacht werden.

Das Hinzufügen einer 560 nm Anregungs-LED, richtige dichroitische Linsen und ein Strahlteiler ermöglicht die gleichzeitige Aufzeichnung von grüner und roter Fluoreszenz. Dies eröffnet die Möglichkeit, die neuronale Aktivität von zwei genetisch unterschiedlichen neuronalen Populationen zu überwachen oder die präsynaptische Aktivität von Axonterminals (z. B. GCaMP6 auszudrücken) und postsynaptische neuronale Aktivität (z. B. ausdrückende jrGECO1a) zu überwachen. Bei der Implementierung von dual-farbigen Aufnahmen müssen wichtige Überlegungen berücksichtigt werden. Signifikante Photokonversion und Photoaktivierung wurde für viele rot versetzte GECIs berichtet, wo Beleuchtung mit 405 nm, 488 nm und 560 nm die calciumunabhängige Fluoreszenz25erhöhen kann. Die Verwendung von jrGECO1a und RCaMP1b kann dieses Problem minimieren26. Ein weiteres Problem bei der Dual-Farb-Bildgebung ist grünes Signal, das in den roten Kanal austritt. Viele Strategien können sich vorstellen, um dieses Problem zu vermeiden. So ist es beispielsweise möglich, die drei Anregungswellenlängen zu verweben, um den isosbestischen Punkt des grünen Kalziumsensors (410 nm), das kalziumabhängige Signal des grünen Kalziumsensors (470 nm) und des roten Calciumsensors (560 nm) nacheinander zu erregen. In diesem Fall ist es möglich, sich zur Bewegungskorrektur auf den isosbestischen Punkt des grünen Sensors zu verlassen. Schließlich ist es bei der Dual-Farb-Bildgebung am besten, stärkeres Signal vom roten Kalziumsensor (z. B. von Zellsomas) zu erhalten, da diese schwächere Fluoreszenzemissionen haben als grüne Sensoren.

Neue genetisch kodierte Fluoreszenzsensoren wurden für den schnellen und spezifischen In-vivo-Nachweis der Neurotransmitter-Freisetzung22,23,24entwickelt. Diese Sensoren emittieren grüne Fluoreszenz, wenn sie mit ihrem jeweiligen endogenen Ligand gebunden sind, und können mit rot verschiebeten GECIs, wie z. B. jrGECO1a, kombiniert werden, um gleichzeitig die Freisetzung von Neurotransmittern gleichzeitig mit Veränderungen der neuronalen Aktivität von einzelne mehrfache Glasfasern5,27.

Die Faserphotometrie bietet exquisite Flexibilität, um die neuronale Aktivität bei frei beweglichen Tieren durch flexible und leichte Glasfaser-Patchkabel zu überwachen. Es eignet sich jedoch nicht für Situationen, die eine Bewegung zwischen den Fächern erfordern, wie z. B. helldunkle Kammertests. Dies wird mit Weiterentwicklungen im drahtlosen Photometriesystem28möglich sein. Schließlich, während es große Vorteile bei der Überwachung der neuronalen Dynamik aus mehreren Gehirnregionen oder von verschiedenen neuronalen Populationen bietet, ist das Signal in der Faserphotometrie ein Aggregat vieler Neuronen, die nicht mit der gleichen zeitlichen Dynamik feuern können und wird nicht gelöst. Es bietet jedoch einen komplementären Ansatz für in vivo mikroendoskopische Kalzium-Bildgebung auflösung somatische Calciumsignal von Dutzenden bis Hunderte von einzelnen Neuronen29. Schließlich kann es bei der Aufnahme von mehreren Fasern in einem einzigen Tier schwierig sein zu unterscheiden, ob das Signal von den Klemmen oder von Zellsomas kommt. Sorgfältiges Entwerfen von Experimenten kann die meisten dieser Einschränkungen überwinden. Die Entwicklung neuer GECIs, die ausschließlich bei Zellsomas lokalisiert sind, wird jedoch eine größere Auflösung bei Multifaser-Calcium-Bildgebungsexperimenten bieten.

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Disclosures

Sage Aronson ist CEO und Gründer von Neurophotometrics Ltd., die Multifaser-Photometriesysteme vertreibt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: RGPIN-2017-06131) an C.P. C. P. unterstützt. Wir danken auch dem Plateforme d'Outils Moléculaires (https://www.neurophotonics.ca/fr/pom) für die Herstellung der in dieser Studie verwendeten viralen Vektoren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1" Long Thorlabs SH25S100
1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1/2" Long Thorlabs SH25S050
1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 3/8" Long Thorlabs SH25S038
1000 µm, 0.50 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable Thorlabs M59L01
12.7 mm Optical Post Thorlabs TR30/M
12.7 mm Pedestal Post Holder Thorlabs PH20EM
15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for T-Cube Thorlabs KPS101
20x objective Thorlabs RMS20X #10 in Figure 2, #11 in Figure 5
30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount Thorlabs CM1-DCH/M #8-9 in Figure 2, #8-10 in Figure 5
405 nm LED Doric Lenses CLED_405 #2 in Figure 2
410 nm bandpass filter Thorlabs FB410-10 #5 in Figure 2; #7 in Figure 5
465 nm. LED Doric Lenses CLED_465 #1 in Figure 2
470 nm bandpass filter Thorlabs FB470-10 #4 in Figure 2; #6 in Figure 5
560 nm bandpass filter Semrock FF01-560/14-25 #5 in Figure 5
560 nm LED Doric Lenses CLED_560 #1 in Figure 3
5-axis kinematic Mount Thorlabs K5X1 #11 in Figure 2, #12 in Figure 5
Achromatic Doublet Thorlabs AC254-035-A-ML #7 in Figure 2
Adaptor for 405 collimator Thorlabs AD11F #3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Adaptor for ajustable collimator Thorlabs AD127-F #3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Aluminum Breadboard Thorlabs MB1824
Clamping Fork Thorlabs CF125
Cube connector Thorlabs CM1-CC
Dual 493/574 dichroic Semrock FF493/574-Di01-25x36 #10 in Figure 5
Emission filter for GCaMP6 Semrock FF01-535/22-25 #6 in Figure 2
Enclosure with Black Hardboard Panels Thorlabs XE25C9
Externally SM1-Threaded End Cap for Machining Thorlabs SM1CP2M
Fast-change SM1 Lens Tube Filter Holder Thorlabs SM1QP #4-6 in Figure 2, #5-7 in Figure 5
Fixed Collimator for 405 nm light Thorlabs F671SMA-405 #3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Fixed collimator for 470 and 560 nm light Thorlabs F240SMA-532 #3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Green emission filter Semrock FF01-520/35-25 In light beam splitter
High-Resolution USB 3.0 CMOS Camera Thorlabs DCC3260M #13 in Figure 2, #15 in Figure 5
Light beam splitter Neurophotometrics SPLIT #14 in Figure 5
Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff Thorlabs DMLP425R #8 in Figure 2, #9 in Figure 5
Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff Semrock FF495-Di03 #9 in Figure 2, #8 in Figure 5
Metabond dental cement C&B
M8 - M8 cable Doric Lenses Cable_M8-M8
Optic fiber cannulas Doric Lenses Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence
Optic fiber Patchcords Doric Lenses Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence
Red emission filter Semrock FF01-600/37-25 In light beam splitter
T7 LabJack LabJack
T-cube LED Driver Thorlabs LEDD1B
USB 3.0 I/O Cable, Hirose 25, for DCC3240 Thorlabs CAB-DCU-T3

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References

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Verhalten Ausgabe 152 genetisch kodierter Kalziumindikator GCaMP Faserphotometrie Verhalten neuronale Bahnen frei bewegliche Tiere
Multi-Fiber Photometrie zur Aufzeichnung neuronaler Aktivität bei frei beweglichen Tieren
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Martianova, E., Aronson, S., Proulx, C. D. Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals. J. Vis. Exp. (152), e60278, doi:10.3791/60278 (2019).

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