Summary
Detta protokoll specificerar hur man implementerar och utför multifiberfotometri inspelningar, hur man rättar för kalcium-oberoende artefakter, och viktiga överväganden för Dual-Color fotometri Imaging.
Abstract
Registrering av aktiviteten hos en grupp av nervceller i ett fritt rörligt djur är ett utmanande företag. Dessutom, som hjärnan dissekeras i mindre och mindre funktionella undergrupper, det blir avgörande att spela in från prognoser och/eller genetiskt definierade subpopulationer av nervceller. Fiberfotometri är en tillgänglig och kraftfull metod som kan övervinna dessa utmaningar. Genom att kombinera optiska och genetiska metoder, neurala aktivitet kan mätas i djupa hjärnstrukturer genom att uttrycka genetiskt kodade kalcium indikatorer, som översätter neurala aktivitet till en optisk signal som lätt kan mätas. Det aktuella protokollet specificerar komponenterna i ett multifiberfotometri-system, hur man tillgång till djupa hjärnstrukturer för att leverera och samla in ljus, en metod för att redogöra för rörelse artefakter, och hur man bearbetar och analyserar fluorescerande signaler. Protokollet Detaljer experimentella överväganden när du utför enkel och dubbel färg avbildning, från antingen enstaka eller flera implanterade optiska fibrer.
Introduction
Förmågan att korrelera neurala svar med specifika aspekter av ett djurs beteende är avgörande för att förstå den roll en viss grupp av nervceller spelar i styra eller reagera på en åtgärd eller stimulans. Med tanke på komplexiteten i djurens beteende, med den myriad av inre stater och yttre stimuli som kan påverka även de enklaste av åtgärder, spela in en signal med en enda rättegång utrustar forskare med de nödvändiga verktygen för att övervinna dessa Begränsningar.
Fiber fotometri har blivit den teknik som val för många forskare inom området för system neurovetenskap på grund av dess relativa enkelhet jämfört med andra in vivo inspelningsteknik, dess höga signal-brus-förhållande, och förmågan att spela in i en mängd olika beteendemässiga paradigm1,2,3,4,5,6,7,8. Till skillnad från traditionella elektrofysiologiska metoder är fotometri den optiska metoden som oftast används tillsammans med genetiskt kodade kalcium indikatorer (GECIs, GCaMP-serien)9. GECIs ändra sin förmåga att fluorescera baserat på huruvida de är bundna till kalcium. Eftersom den interna koncentrationen av kalcium i nervceller är mycket hårt reglerad och spännings-gated kalciumkanaler öppna när en neuron bränder en åtgärd potential, övergående ökningar av intern kalciumkoncentration, vilket resulterar i övergående ökningar i förmåga att en GECI till fluorescens, kan vara en bra proxy för neuronala bränning9.
Med fiberfotometri, excitation ljus riktas ner en tunn, multimode optisk fiber i hjärnan, och en emissions signal samlas tillbaka upp genom samma fiber. Eftersom dessa optiska fibrer är lätta och böjbara, ett djur kan röra sig obehindrat, vilket gör denna teknik kompatibel med ett brett spektrum av beteendemässiga tester och villkor. Vissa villkor, såsom snabba rörelser eller böjning av fiberoptiska patch sladden bortom den radie där den kan upprätthålla total inre reflektion, kan införa signal artefakter. För att skilja signal från buller, kan vi utnyttja en egendom GCaMP kallas "isosbestic Point." Kort med gcamp, som våglängden av magnetiseringen ljust skiftas till lämnat, dess utsläpp i Calcium-begränsar statliga minskningar och utsläppet i Calcium-obunden påstå marginellt förhöjningar. Den punkt där den relativa intensiteten av dessa två utsläpp är lika kallas den isosbestic punkt. När GCaMP är upphetsad på denna punkt, dess utsläpp påverkas inte av förändringar i interna kalciumkoncentrationer, och variansen i signalen är oftast på grund av dämpning av signalen från överböjning av fiberoptiska patch sladden eller förflyttning av neurala vävnad i förhållande till den implanterade fibern.
En enhet elektrofysiologi är fortfarande den gyllene standarden för fritt rörliga in vivo inspelningar på grund av dess Single-cell och Single-Spike nivå upplösning. Det kan dock vara svårt att precisera den molekylära identiteten hos de celler som registreras, och post-hoc-analysen kan vara ganska mödosam. Medan fiberfotometri inte har Single-cell upplösning, tillåter det forskare att ställa frågor omöjliga att ta itu med traditionella tekniker. Kombinera viral strategier med transgena djur, uttrycket av GECIs kan riktas till genetiskt definierade neuronala typer att registrera population-eller projektion definierade neurala aktivitet, som kan utföras genom att övervaka kalcium signalen direkt på Axon terminalerna10,11. Dessutom, genom att implantera flera fiberoptiska kanyler, är det möjligt att samtidigt övervaka neurala aktivitet från flera regioner i hjärnan och vägar i samma djur12,13.
I detta manuskript beskriver vi en teknik för enkel-och multifiberfotometri, hur man rättar till kalcium oberoende artefakter, och detalj hur man utför mono-och Dual-Color inspelningar. Vi ger också exempel på de typer av frågor som det gör det möjligt att fråga och deras ökande komplexitetsnivåer (se figur 1). Den fiber fotometri setup för multi-fiber inspelningar som beskrivs i detta protokoll kan byggas med hjälp av en lista över material som finns på https://sites.Google.com/View/multifp/Hardware (figur 2).
Det är viktigt att systemet utrustas för både 410 nm och 470 nm excitation våglängder för kalcium oberoende och kalciumberoende fluorescens emission från GCaMP6 eller dess varianter. För skräddarsydda inställningar eller om det inte finns någon tillgänglig programvara för att köra systemet, kan den fria, öppen källkod program Bonsai (http://www.open-ephys.org/bonsai/) användas. Alternativt kan fiberfotometri köras genom MATLAB (t. ex. https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)12 eller annat programmeringsspråk14. Programvara och hårdvara i systemet bör möjliggöra manipulation av både 410 nm och 470 nm lysdioder och kameran, extraktion av bilder (figur 2), och beräkning av medelvärdet fluorescerande intensitet i de regioner av intresse (Rois) dras runt fibrerna på bilderna. Utdata bör vara en tabell över medelintensitetsvärden som registrerats med lysdioderna 470 nm och 410 nm från varje fiber i patch-sladden. När du utför multi-fiber experiment, 400 μm kombinerade fibrer kan begränsa rörligheten för möss. I sådana fall rekommenderar vi att du använder 200 μm patch sladdar, som ger mer flexibilitet. Det kan också vara möjligt att använda mindre dummy kablar under träning av möss.
Det är viktigt att kunna extrahera tid punkter för händelser av intresse under fiber fotometri förvärv. Om systemet inte ger ett inbyggt system för att integrera TTLs för specifika händelser, är en alternativ strategi att tilldela en tidsstämpel till enskilda tidspunkter registreras för att justera med specifika tider och händelser under experimentet. Tidsstämpling kan göras med datorklockan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment utfördes i enlighet med den institutionella djuromsorg och använda kommittéer vid University of California, San Diego, och den kanadensiska guide för vård och användning av försöksdjur och godkändes av Université Laval Animal Protection Kommittén.
1. anpassning av den optiska banan mellan CMOS (komplementär metalloxid halvledar) kamera och den enskilde eller förgrenade patch sladd
- Lossa alla skruvar på 5-axlig översättare (11, figur 2B).
- Skruva i plåstret sladden (12, figur 2B) till adaptern [sma (sub-Miniature A) eller FC (fiberoptisk kontakt)] som fästs på 5-axlig översättare.
- Slå på 470 nm excitation Light (1, figur 2b) vid låg effekt (100 μW), och Placera spetsen på patchcord pekar på en autofluorescent plast Slide. Detta har inte någon betydelse för framtida inspelningar utan är enbart för att visualisera justeringsprocessen.
- Spela in från CMOS-kameran (13, figur 2b) i Live-läge. Öka förstärkningen eller justera uppslagstabellen (LUT) tills bilden inte är helt svart. Poängen är att kunna se en bild i fokuspunkten för målet (10, figur 2b).
- Advance 5-axlig översättare mot målet, se till att 470 nm ljus är centrerad på fiber på SMA eller FC slutet av plåstret sladden, tills en bild kan lösas på kameran.
- Justera X-och Y-axlarna tills bilden är centrerad och väl löst.
- Visualisera det ljus som avges från Ferrule-änden av patch-sladden. Det bör visas som en isotrop cirkel. Om en förgrening patch sladd används, mängden ljus som avges vid Ferrule-ändarna av varje patch sladd bör vara liknande. Om cirkeln inte är isotrop eller om det avgivna ljuset är ojämnt justerar du 5-axlig översättare i X-Y-axeln.
2. inställning av ROIs runt fibrer för mätning av genomsnittlig fluorescerande intensitet
- Slå på alla excitation lampor för att bättre visualisera fibrerna. Justera kamera förstärkningen så att inga pixlar är mättade och en tydlig bild av fibrerna finns.
- Live Record eller ta en preliminär bild.
- Rita ROIs runt fibrerna och hålla dem för mätning av medelintensitet värden under inspelningar (figur 2a).
- För flera fiber inspelningar, test för oberoende i signaler.
- Live Record från alla fibrer.
- Peka en fiber mot en ljuskälla och knacka med ett finger. Mycket stora svängningar bör ske enbart i den kanalen (godtagbart läckage 1:1000).
- Om signalerna inte är oberoende, rita om mer konservativ ROIs och upprepa självständighets provet.
- Att märka och hålla koll på vilken ROI motsvarar vilken fiber, färgad tejp eller nagellack kan appliceras på slutet av fibrerna. Ta en bild före början av ett experiment som en sekundär påminnelse.
3. inställning av inspelnings Arena
- Häng upp patch-sladden ovanför arenan med stativ, klämmor eller hållare.
- Se till att djuret fritt kan röra sig genom hela arenan, ohämmad av längden på fibern.
- Om en operant låda eller öppna fält används, se till att plåstret sladden kommer att kunna nå djuret med minimal böjning. Om detta kräver en näsa säcken, se till att det finns tillräckligt med utrymme overhead för att förhindra böjning av fiber. Undvik överdriven böjning eller vridning av plåstret sladden.
4. in vivo inspelningar
Anmärkning: förfarandet för optisk fiber kanyl implantation för fiber fotometri experiment är identisk med förfarandet för optogenetik som beskrivs i Sparta et al15. Vi rekommenderar att du använder tandcement (se tabell över material), som ger robust förankring av headcap till skallbenet. Tandcement kommer att vara särskilt användbart i de fall där förankrings skruvar inte kan användas.
- Visuellt inspektera den distala änden av fibrerna i plåstret sladden med ögat och med ett minifibermikroskop. Om ytan av fibrerna är repad, repolish fibrerna med hjälp av fiber polering/läppning film med fint grus (1 μm och 0,3 μm).
- Rengör den distala ändarna på patchsladden med 70% etanol och en bomulls spets applikator.
- Rengör fiberoptiska kanylar med 70% etanol och en bomulls spets applikator.
- Anslut kontakt förtennad änden av plåstret sladden till den implanterade fiber med en keramisk Split-ärm täckt med en svart krympslang. Under anslutningen, se till att hylsan är tight, annars använda en ny hylsa.
Obs: det kommer att finnas en stor mängd signalförlust om det finns något utrymme mellan plåstret sladden kontakt förtennad och implantatet, och inspelningarna kommer inte att fungera. - Låt djuret återhämta sig i några minuter före starten av beteende testning.
- Börja spela in den optiska signalen och kör experimentet.
- Under inspelningen håller du ett försiktigt öga på Live-spårningen för att säkerställa kvalitets inspelningar. Signalen väntas snabbt minska som en funktion av tiden i den första 2 min av inspelningen. Denna effekt orsakas av värmemedierad LED förfall, varvid ökningen i värme ökar motståndet i det optiska elementet.
- Om ett hopp i signalen som överskrider på/av kinetik av GCaMP inträffar, detta är ofta en indikation på att hylsan inte är tight nog och utrymmet mellan plåstret sladden och implantatet förändras. I detta fall, stoppa experimentet och återanslut djuret med hjälp av en ny hylsa.
5. dataanalys för fiberfotometri
Obs: Detta är en metod för dataanalys som fungerar bra för de flesta inspelningar. Alternativa metoder kan dock genomföras. Exempelkod för dataanalys finns här: https://github.com/katemartian/Photometry_data_processing.
- Extrahera medelvärdet fluorescens intensitet värden inspelade från 470 nm (int470) och 410 nm (int410) lysdioder, vilket motsvarar varje enskild fiber.
- Jämna ut varje signal med en glidande medelalgoritm (figur 3a).
- Utför baslinjekorrektion för varje signal (figur 3A och 3b) med hjälp av den adaptiva iterativt omvägda Penaliserade minsta kvadratalgoritmen (airpls) algoritm (https://github.com/zmzhang/airPLS) för att ta bort lutningen och låg frekvens svängningar i signalerna.
- Standardisera varje signal med medelvärdet och standardavvikelsen (figur 3C):
- Använda icke-negativ robust linjär regression, passa standardiserade zint410 till zint470 signaler (figur 3D) till regression funktion:
- Använd parametrarna för den linjära regressionen (a, b) för att hitta nya värden för zint410 monterad på zint470 (fitint410, figur 3D, E):
- Använd parametrarna för den linjära regressionen (a, b) för att hitta nya värden för zint410 monterad på zint470 (fitint410, figur 3D, E):
- Beräkna den normaliserade DF/f (z DF/f) (figur 3F):
6. simultana inspelningar med dubbla färger
- Lägg till fotometri systemet en 560 nm ledde till excitera den röda fluorescerande kalcium sensor och lämpliga DICHROIC speglar och filter (se Kim et al., 2016 för detaljerad beskrivning)12.
- Lägg till en bild splitter mellan målet och CMOS-kameran för att separera de gröna och röda emissions våglängderna (se figur 5). Bild delaren kommer att bilda två speglade bilder på kamerans sensor, vilket motsvarar den röda och gröna signaler (t. ex. en patch sladd med 3 grenar kommer att skapa en bild med 6 fibrer).
- Rita ROIs runt alla fibrer i båda färgerna som beskrivs ovan. Se till att tydligt identifiera varje ROI med motsvarande fiber och kanal (grön och röd) (figur 4a).
- Utlösa samtidig excitation med 470 nm och 560 nm lysdioder och suppleant dem med 410 nm LED (figur 5A).
7. Dual Color dataanalys
- Följ stegen i avsnitt 5 för att hitta Fitint410 för int470-signalen och beräkna z DF/F.
- Eftersom den isosbestic punkt för röd-skiftade GECIs är i allmänhet okänd, signalen inspelad med 410 nm LED i den gröna kanalen kan användas för rörelse korrigering över båda kanalerna. Följ stegen i avsnitt 5 för att hitta Fitint410 för int560-signalen och beräkna z DF/F.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neurala korrelat av beteendemässiga svar kan variera beroende på en mängd olika faktorer. I detta exempel använde vi in vivo fiber fotometri att mäta aktiviteten av axon terminaler från det laterala hypotalamus område (LHA) som avslutas i den laterala habenula (LHB). Wild typ möss injicerades med ett Adeno-associerat virus (AAV) kodning GCaMP6s (AAV-hSyn-GCaMP6s) i LHA och en optisk fiber var implanteras med spetsen omedelbart ovanför LHb (figur 4a). GCaMP6s uttryck finns i cellen organ i LHA och deras Axon terminaler projicerar till LHb, där kalcium signalen kan registreras. Aktivering av LHA-LHb väg främjar passiv undvikande i realtid preferens test tyder på att denna väg sänder aversiva signaler16. Möss var sedan ansluten till fiber fotometri systemet, placeras i en öppen Arena för 6 min, och utsätts för 1 SEK aversiva airpuffs varje 60 SEK. Den uppmätta fluorescensen ökade signifikant samtidigt med administrering av luftpuffar (figur 4B-C). Hos möss som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) upptäcktes ingen förändring i signalen under administreringen av airpuffar (figur 4C). Efter beteendemässiga tester, platsen för injektion i LHA och fiber placering ovanför LHb bekräftades histologiskt (figur 4A).
Figur 1: strategier och tillvägagångssätt för GECI-uttryck med anatomisk och celltyp specificitet. (A) en viral Vector Adeno-Associated virus (AAV) kodning GCaMP6 (AAV-GCaMP6) injiceras i en hjärnregion av intresse. Den optiska fiber kan kroniskt implanteras med spetsen placeras över cellen organ (1) eller över Axon terminalerna (2). För selektiva uttryck i en genetiskt definierad neuronala population kan en CRE-beroende AAV (t. ex., AAV-DIO-GCaMP6) injiceras i transgena möss som uttrycker CRE-driver i en specifik neuronala population. (B) för Dual-Color kalcium avbildning, i detta exempel en AAV-GCaMP6s injiceras i en hjärna region av intresse, och en CRE-beroende AAV kodning en röd-SKIFTADE geci (t. ex., jrGECO1a; AAV-DIO-jrGECO1a) injiceras i en genetiskt definierad neuronala population i en mål hjärnregion. Optisk fiber implanteras för samtidig kalcium signal avbildning av axon terminalerna (grön fluorescens) och cell kroppar (röd fluorescens). C) för en intersektionell viral strategi injiceras en viral vektor med retrograd transportegenskaper (som retroaav17) som kodar för CRE driver (retroaav-CRE) i mål hjärnregionen tillsammans med en AAV-Dio-GCaMP6s injicerad i den projicerar hjärnregionen i samma mus. Optisk fiber kanyl är implanteras över cellen organ för robust kalcium-beroende signal inspelning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk fiber fotometri. (A) exciteringslampa från två lysdioder (410 nm och 470 nm) passerar genom en serie filter och DICHROIC-speglar och ger en exciteringsplats på arbets distansen för 20x-målet. Ljuset passerar genom antingen en enda patch sladd eller kombinerade fibrer (för flera plats inspelningar) som är anslutna till de implanterade kanylar. Den avgivna fluorescensen samlas in av samma fibrer, filtreras och projiceras på en CMOS-kamerasensor. På de tagna bilderna registreras den genomsnittliga fluorescensintensiteten vid ROIs av varje fiber. Att samtidigt förvärva signaler från både 410 nm och 470 nm lysdioder, en Time-Division Multiplexing genomförs (nedre högra diagrammet). (B) bild av vårt skräddarsydda fotometri-system och dess komponenter: (1) fiber till 465 nm LED, (2) fiber till 405 nm LED, (3) Collimators, (4) 470 nm bandpass filter, (5) 410 nm bandpass filter, (6) 535 nm bandpass filter, (7) Tube Lens, (8) kub med longpass 425 Dichroic Mirror, (9) kub med longpass 495 Dichroic Mirror, (10) 20x mål, (11) 5-axlig översättare, (12) mono-eller paketerad fiber patch sladd, (13) CMOS-kamera. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: analys av data för fiberfotometri. (A) utjämnade medel fluorescerande intensitet (int) inspelade från 470 nm (Top Blue Line) och 410 nm (Bottom Purple Line) excitation våglängder. Svarta linjer är baslinjer som hittats med hjälp av airPLS-algoritmen. B) förändringar i relativ intensitet i signaler efter baseline-korrigering. C) standardiserade 470 nm-och 410 nm-signaler (zInt470, topp, zInt410, botten). D) icke-negativ robust linjär passning av signalerna 470 nm och 410 nm. E) anpassning av spårnings Int410 till Int470 baserat på passformen. F) korrigerad och normaliserad kalciumberoende förändring av fluorescens (z DF/f). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa resultat. A) diagram över försöksförfarandet. En AAV-GCaMP6s injiceras i LHA av möss och 4 veckor senare, en optisk fiber kanyl implanteras över LHb för Axon Terminal signal inspelning. Inset är representativa konfokala bilder av GCaMP6s uttryck i cellen organ av LHA neuroner (vänster) och deras Axon terminaler projicerar till LHb (höger). B) representativ kalcium signal spår till airpuffs (streckade vertikala streck) mätt från LHB-PROJICERA LHA Axon terminaler mätt från en GCaMP6s-uttrycker mus. C) den genomsnittliga kalcium reaktionen vid airpuff-händelser. Den tjocka gröna linjen representerar genomsnittet och de grönskuggade regionerna representerar standardfelet för medelvärdet (SEM, vänster panel) och den signal som mäts före och efter en airpuff (3 möss, 15 händelser). (D, E) Samma mätningar som (B, C) för GFP-uttrycker möss (2 möss, 10 händelser). Skalstreck är 200 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Schematisk tvåfärgad fiberfotometri. A) ytterligare 560 nm-LED, lämpliga filter och DICHROIC-speglar samt en bild splitter innan kamerasensorn lades till i den ursprungliga installationen. Bsystem komponenter för fotometri: (1) fiber till 560 nm LED, (2) fiber till 465 nm LED, (3) fiber till 405 nm LED, (4) Collimators, (5) 560 nm bandpass filter, (6) 470 nm bandpass filter, (7) 410 nm bandpass filter, (8) kub med longpass 495 Dichroic Mirror , (9) kub med longpass 425 Dichroic Mirror, (10) kub med 493/574 Dichroic Mirror, (11) 20x mål, (12) 5-axlig översättare, (13) mono-eller bundled-fiber patch sladd, (14) bild Splitter, (15) CMOS-kamera. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fiberfotometri är en tillgänglig metod som gör det möjligt för forskare att spela in bulk-kalciumdynamik från definierade neuronala populationer i fritt rörliga djur. Denna metod kan kombineras med ett brett spektrum av beteendemässiga tester, inklusive "rörelse tunga" uppgifter såsom påtvingade simma tester2, Fear-Conditioning18, sociala interaktioner1,4, och andra7, 8,19,20. Detta gör det möjligt för forskare att observera vilka beteenden eller stimuli driva aktivitet i en viss neurala befolkningen eller vice versa.
Trots sin prima facie -enkelhet finns det viktiga överväganden vid genomförandet av fiberfotometri, och det system som beskrivs i detta protokoll erbjuder flera fördelar som kringgår vanliga fallgropar. Först, det tar fördel av det faktum att GCaMP varianter har en kalcium-oberoende isosbestic excitation punkt runt 410 nm21 och Time-Division Multiplexing att korrigera kalcium-beroende förändringar i signaler nästan samtidigt12. När neuroner uttrycker GCaMP är glada med 410 nm våglängd, är utsläppsintensitet från GCaMP oberoende från dess bindning till kalcium och beter sig i huvudsak som en låg verkningsgrad GFP. Time-Division Multiplexing använder både 410 nm kalcium oberoende och 470 nm kalciumberoende excitation våglängder i samma inspelning. Signalen som registrerats med 410 nm excitation våglängd används som en kontroll för kalcium-oberoende rörelse och artefakt förändringar i fluorescens intensitet. Alternativa strategier som inte inkluderar samtidig användning av isosbestic excitation av GCaMP kan vara tänkt. Till exempel är det möjligt att förbereda två djur kohorter, en uttrycker GFP och den andra uttrycker GCaMP2. Detta är dock inte en perfekt kontroll, eftersom det är över djur och det är svårare att identifiera om ett visst svar i ett visst djur var en artefakt. För det andra, den beskrivna fiber fotometri Setup tillåter forskare att mäta aktivitet i flera vägar samtidigt, öppna dörren till frågor om signal spridning i hela hjärnan. Tredje, Dual-Color inspelning ger ytterligare flexibilitet att dissekera olika vägar i samma hjärnregion som kombinerar grön och röd-skiftade GECIs (figur 1).
Med fiberfotometri-inspelningar måste mycket låg emissions fluorescens registreras genom bakgrundsbrus. Därför är det viktigt att säkerställa maximal uppsamling av fluorescensen som avges från GECIs. Först, när man utvecklar en viral strategi måste man tänka på att inspelning från terminaler kan vara utmanande, eftersom Axon terminaler i inspelnings fältet kan vara glesa. För att lösa detta problem, en alternativ intersektionell viral strategi kan vara tänkt att tillåta uttryck av GCaMP i ett mål-projicera intresseområde och optisk fiber kanyl implanteras ovanför cellen organ, där mer robust fluorescens kan vara mätt22,23,24. En annan faktor som kan inverka negativt signal-brus-förhållande är kvaliteten på optisk fiber kanyl och patch sladd. För implantations, rostfrittstål kontakt förtennad är att föredra, eftersom zirconia är mycket autofluorescent och kommer att öka bakgrunds signalen. Det är viktigt att använda den högsta kvalitet optisk fiber kanyler med väl polerade Terminal kontakter och höga överföringshastigheter (> 85% överföring). Eventuella defekter i fibrerna kommer att leda till en minskning av signal-brus-förhållandet. Den optiska fiber patch sladden ska vara av hög kvalitet samt. Leverantörer producerar fibrer speciellt konstruerade för fiberfotometri, där autofluorescence minimeras så mycket som möjligt. Skräddarsydda patch sladdar ofta inte nå erforderlig effektivitet. Det är också viktigt att optimera anpassningen av den optiska banan för att få en bild med alla fibrer väl lösta i brännpunkten av målet. Dessutom måste den numeriska öppningen (NA) av fibern matcha det av lappa binder med rep, såväl som det mål som används med systemet. Alla NA mismatch kommer att resultera i antingen excitation eller utsläpp ljus förlust. Alla tidigare steg kommer att ge tydliga kalcium-beroende signaler. En signal korrigering krävs dock fortfarande. De flesta inspelningar har en exponentiell minskning av fluorescensen på grund av autofluorescence i fibrerna, värmemedierad LED-sönderfall och foto blekning. Minskningen varierar med olika fibrer och kanaler, och det är viktigt att ta bort den i varje kanal separat med hjälp av airPLS-algoritmen som beskrivs i avsnittet protokoll. För det andra måste man ta hänsyn till rörelse korrigeringen. Även om GCaMP signaler verkar hög där någon artefakt förändringar verkar meningslöst, är det viktigt att korrigera det med kalcium oberoende signal. Grafen med justerade 410 nm och 470 nm signaler är en referens som visar vilka förändringar i intensitet orsakas av GCaMP och inte artefakter.
Lägga till en 560 nm excitation LED, ordentlig Dichroic linser, och en beamsplitter möjliggör samtidig inspelning av grön och röd fluorescens. Detta öppnar möjligheten att övervaka neurala aktivitet från två genetiskt distinkta neuronala populationer eller för att övervaka presynaptisk aktivitet från Axon terminaler (t. ex., uttrycker GCaMP6), och postsynaptisk neuronala aktivitet (t. ex., uttrycker jrGECO1a). Vid implementering av dubbel färgs inspelningar måste viktiga överväganden hållas i åtanke. Betydande photoconversion och ljusaktivering har rapporterats för många röda skiftade gecis, där belysning med 405 nm, 488 nm, och 560 nm kan öka kalcium oberoende fluorescens25. Användning av jrGECO1a och RCaMP1b kan minimera problemet26. Ett annat bekymmer under Dual Color Imaging är grön signal som läcker in i den röda kanalen. Många strategier kan vara tänkt att undvika detta problem. Till exempel är det möjligt att blandar de tre excitation våglängder att excitera den isosbestic punkt av den gröna kalcium sensorn (410 nm), kalcium-beroende signalen från den gröna kalcium sensorn (470 nm), och den röda kalcium sensorn (560 nm) i sekvens. I så fall är det möjligt att förlita sig på den isosbestic punkten av den gröna sensorn för rörelse korrigering. Slutligen, när du utför Dual Color Imaging, är det bäst att förvärva starkare signal från den röda kalcium sensorn (t. ex. från cell Somas) eftersom dessa har svagare fluorescensutsläpp jämfört med gröna sensorer.
Nya genetiskt kodade fluorescerande sensorer har utvecklats för snabb och specifik in vivo detektion av signalsubstansen release22,23,24. Dessa sensorer avger grön fluorescens när de binds med sina respektive endogena ligand och kan kombineras med röd-skiftade GECIs, såsom jrGECO1a, för samtidig detektion av signalsubstansen frisättning samtidigt med förändringar i neuronala aktivitet från enstaka multipla optiska fibrer5,27.
Fiberfotometri ger utsökt flexibilitet för att övervaka neurala aktivitet i fritt rörliga djur genom flexibla och lätta optiska fiber patch sladdar. Den lämpar sig dock inte väl för situationer som kräver förflyttning mellan fack, till exempel ljusmörka kammar prov. Detta kommer att vara möjligt med ytterligare utvecklingar i Wireless fotometri system28. Slutligen, även om det ger stora fördelar när man övervakar neurala dynamik från flera hjärnregioner, eller från olika neurala populationer, signalen erhålls i fiberfotometri är en sammanvägning av många nervceller som inte kan avfyra med samma temporala dynamik och kommer inte att lösas. Emellertid, det ger en kompletterande metod för in vivo mikroendoskopisk kalcium avbildning lösa somatiska kalcium signal från tiotals till hundratals enskilda nervceller29. Slutligen, när du spelar in från flera fibrer i ett enda djur, kan det vara svårt att skilja om signalen kommer från terminalerna eller från cell Somas. Att noggrant designa experiment kan övervinna de flesta av dessa begränsningar. Men utvecklingen av nya GECIs uteslutande lokaliserade på cell Somas kommer att ge mer upplösning under multi-fiber kalcium Imaging experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sage Aronson är VD och grundare av Neurophotometrics Ltd., som säljer multifiberfotometri system.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag från naturvetenskapliga och tekniska forskningsrådet i Kanada (NSERC: RGPIN-2017-06131) till C.P. är en FRSQ Chercheur-Boursier. Vi tackar också Plateforme D' outils Moléculaires (https://www.neurophotonics.ca/fr/pom) för produktion av de virala vektorer som används i denna studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1" Long | Thorlabs | SH25S100 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1/2" Long | Thorlabs | SH25S050 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 3/8" Long | Thorlabs | SH25S038 | |
| 1000 µm, 0.50 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs | M59L01 | |
| 12.7 mm Optical Post | Thorlabs | TR30/M | |
| 12.7 mm Pedestal Post Holder | Thorlabs | PH20EM | |
| 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for T-Cube | Thorlabs | KPS101 | |
| 20x objective | Thorlabs | RMS20X | #10 in Figure 2, #11 in Figure 5 |
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs | CM1-DCH/M | #8-9 in Figure 2, #8-10 in Figure 5 |
| 405 nm LED | Doric Lenses | CLED_405 | #2 in Figure 2 |
| 410 nm bandpass filter | Thorlabs | FB410-10 | #5 in Figure 2; #7 in Figure 5 |
| 465 nm. LED | Doric Lenses | CLED_465 | #1 in Figure 2 |
| 470 nm bandpass filter | Thorlabs | FB470-10 | #4 in Figure 2; #6 in Figure 5 |
| 560 nm bandpass filter | Semrock | FF01-560/14-25 | #5 in Figure 5 |
| 560 nm LED | Doric Lenses | CLED_560 | #1 in Figure 3 |
| 5-axis kinematic Mount | Thorlabs | K5X1 | #11 in Figure 2, #12 in Figure 5 |
| Achromatic Doublet | Thorlabs | AC254-035-A-ML | #7 in Figure 2 |
| Adaptor for 405 collimator | Thorlabs | AD11F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Adaptor for ajustable collimator | Thorlabs | AD127-F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB1824 | |
| Clamping Fork | Thorlabs | CF125 | |
| Cube connector | Thorlabs | CM1-CC | |
| Dual 493/574 dichroic | Semrock | FF493/574-Di01-25x36 | #10 in Figure 5 |
| Emission filter for GCaMP6 | Semrock | FF01-535/22-25 | #6 in Figure 2 |
| Enclosure with Black Hardboard Panels | Thorlabs | XE25C9 | |
| Externally SM1-Threaded End Cap for Machining | Thorlabs | SM1CP2M | |
| Fast-change SM1 Lens Tube Filter Holder | Thorlabs | SM1QP | #4-6 in Figure 2, #5-7 in Figure 5 |
| Fixed Collimator for 405 nm light | Thorlabs | F671SMA-405 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Fixed collimator for 470 and 560 nm light | Thorlabs | F240SMA-532 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Green emission filter | Semrock | FF01-520/35-25 | In light beam splitter |
| High-Resolution USB 3.0 CMOS Camera | Thorlabs | DCC3260M | #13 in Figure 2, #15 in Figure 5 |
| Light beam splitter | Neurophotometrics | SPLIT | #14 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff | Thorlabs | DMLP425R | #8 in Figure 2, #9 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff | Semrock | FF495-Di03 | #9 in Figure 2, #8 in Figure 5 |
| Metabond dental cement | C&B | ||
| M8 - M8 cable | Doric Lenses | Cable_M8-M8 | |
| Optic fiber cannulas | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Optic fiber Patchcords | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Red emission filter | Semrock | FF01-600/37-25 | In light beam splitter |
| T7 LabJack | LabJack | ||
| T-cube LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| USB 3.0 I/O Cable, Hirose 25, for DCC3240 | Thorlabs | CAB-DCU-T3 |
References
- Gunaydin, L. A., et al. Natural Neural Projection Dynamics Underlying Social Behavior. Cell. 157 (7), 1535-1551 (2014).
- Proulx, C. D., et al. A neural pathway controlling motivation to exert effort. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (22), 5792-5797 (2018).
- Muir, J., et al. In Vivo Fiber Photometry Reveals Signature of Future Stress Susceptibility in Nucleus Accumbens. Neuropsychopharmacology. 43 (2), 255-263 (2017).
- Wang, D., et al. Learning shapes the aversion and reward responses of lateral habenula neurons. eLife. 6, (2017).
- de Jong, J. W., et al. A Neural Circuit Mechanism for Encoding Aversive Stimuli in the Mesolimbic Dopamine System. Neuron. 101 (1), 133-151 (2018).
- Lerner, T. N., et al. Intact-Brain Analyses Reveal Distinct Information Carried by SNc Dopamine Subcircuits. Cell. 162 (3), 635-647 (2015).
- Calipari, E. S., et al. In vivo imaging identifies temporal signature of D1 and D2 medium spiny neurons in cocaine reward. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2726-2731 (2016).
- González, A. J., et al. Inhibitory Interplay between Orexin Neurons and Eating. Current Biology. 26 (18), 2486-2491 (2016).
- Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Barker, D. J., et al. Lateral Preoptic Control of the Lateral Habenula through Convergent Glutamate and GABA Transmission. Cell Reports. 21 (7), 1757-1769 (2017).
- Siciliano, C. A., Tye, K. M. Leveraging calcium imaging to illuminate circuit dysfunction in addiction. Alcohol. 74, 47-63 (2018).
- Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13 (4), 325-328 (2016).
- Sych, Y., Chernysheva, M., Sumanovski, L. T., Helmchen, F. High-density multi-fiber photometry for studying large-scale brain circuit dynamics. Nature Methods. 16 (6), 553-560 (2019).
- Akam, T., Walton, M. E. pyPhotometry: Open source Python based hardware and software for fiber photometry data acquisition. Scientific Reports. 9 (1), 3521 (2019).
- Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocol. 7 (1), 12-23 (2011).
- Stamatakis, A. M., et al. Lateral Hypothalamic Area Glutamatergic Neurons and Their Projections to the Lateral Habenula Regulate Feeding and Reward. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 302-311 (2016).
- Tervo, G. D., et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Yu, K., da Silva, P., Albeanu, D. F., Li, B. Central Amygdala Somatostatin Neurons Gate Passive and Active Defensive Behaviors. The Journal of Neuroscience. 36 (24), 6488-6496 (2016).
- Falkner, A. L., Grosenick, L., Davidson, T. J., Deisseroth, K., Lin, D. Hypothalamic control of male aggression-seeking behavior. Nature Neuroscience. 19 (4), 596-604 (2016).
- Ren, J., et al. Anatomically Defined and Functionally Distinct Dorsal Raphe Serotonin Sub-systems. Cell. 175 (2), 472-487 (2018).
- Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. Deciphering the molecular mechanism responsible for GCaMP6m’s Ca2+-dependent change in fluorescence. PLOS ONE. 12 (2), 0170934 (2017).
- Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
- Patriarchi, T., et al. Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors. Science. 360 (6396), (2018).
- Feng, J., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor for Rapid and Specific In Detection of Norepinephrine. Neuron. 102 (4), 745-761 (2019).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
- Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. eLife. 5, (2016).
- Wang, H., Jing, M., Li, Y. Lighting up the brain: genetically encoded fluorescent sensors for imaging neurotransmitters and neuromodulators. Current Opinion in Neurobiology. 50, 171-178 (2018).
- Lu, L., et al. Wireless optoelectronic photometers for monitoring neuronal dynamics in the deep brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1374-1383 (2018).
- Jennings, J. H., et al. Visualizing Hypothalamic Network Dynamics for Appetitive and Consummatory Behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2014).
