प्यूपल चरणों के दौरान विकासशील ड्रोसोफिला एपिथेलिया में ऊतक अभिविन्यास और विकास गतिशीलता का इमेजिंग और विश्लेषण

Summary

यह प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला पेट एपिथेलिया में सेल ओरिएंटेशन और ऊतक वृद्धि की गतिशीलता के इमेजिंग और विश्लेषण के लिए डिज़ाइन किया गया है क्योंकि फल मक्खी कायापलट से गुजरती है। यहां वर्णित कार्यप्रणाली को ड्रोसोफिला या अन्य मॉडल जीवों में विभिन्न विकासात्मक चरणों, ऊतकों और उपकोशिकीय संरचनाओं के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है।

Abstract

बहुकोशिकीय जीवों के भीतर, परिपक्व ऊतक और अंग अपने घटक कोशिकाओं की स्थानिक व्यवस्थाओं में उच्च क्रम प्रदर्शित करते हैं। संवेदी एपिथेलिया द्वारा एक उल्लेखनीय उदाहरण दिया जाता है, जहां एक ही या विशिष्ट पहचान की कोशिकाओं को सेल-सेल आसंजन के माध्यम से अत्यधिक संगठित प्लानर पैटर्न दिखाते हुए एक साथ लाया जाता है। कोशिकाएं एक ही दिशा में एक-दूसरे के साथ संरेखित होती हैं और बड़ी दूरी पर समकक्ष ध्रुवता प्रदर्शित करती हैं। परिपक्व एपिथेलिया का यह संगठन मॉर्फोजेनेसिस के दौरान स्थापित किया गया है। यह समझने के लिए कि परिपक्व एपिथेलिया की प्लानर व्यवस्था कैसे प्राप्त की जाती है, वीवो में विकास के दौरान उच्च स्थानिक निष्ठा के साथ सेल अभिविन्यास और विकास गतिशीलता को ट्रैक करना महत्वपूर्ण है। स्थानीय-से-वैश्विक संक्रमणों की पहचान और विशेषता के लिए मजबूत विश्लेषणात्मक उपकरण भी आवश्यक हैं। ड्रोसोफिला पिल्ला ओरिएंटेड सेल आकार परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए एक आदर्श प्रणाली है जो एपिथेलियल मॉर्फोजेनेसिस अंतर्निहित है। प्यूपल विकासशील एपिथेलियम स्थिर शरीर की बाहरी सतह का गठन करता है, जिससे अक्षुण्ण जानवरों की दीर्घकालिक इमेजिंग की अनुमति होती है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल को वैश्विक और स्थानीय दोनों स्तरों पर वैश्विक और स्थानीय दोनों स्तरों पर सेल व्यवहार की छवि और विश्लेषण करने के लिए डिज़ाइन किया गया है क्योंकि यह बढ़ता है। वर्णित पद्धति को अन्य विकासात्मक चरणों, ऊतकों, उपकोशिकीय संरचनाओं, या मॉडल जीवों पर कोशिका व्यवहार की इमेजिंग के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

अपनी भूमिकाओं को प्राप्त करने के लिए, एपिथेलियल ऊतक पूरी तरह से अपने सेलुलर घटकों के स्थानिक संगठन पर भरोसा करते हैं। अधिकांश एपिथेलिया में, कोशिकाओं को न केवल एक सटीक कोबलस्टोन परत बनाने के लिए एक दूसरे के खिलाफ पैक किया जाता है बल्कि वे शरीर की कुल्हाड़ियों के सापेक्ष खुद को उन्मुख करते हैं।

सटीक ऊतक संगठन का कार्यात्मक महत्व संवेदी एपिथेलिया में स्पष्ट है, जैसे कशेरुकी आंतरिक कान और रेटिना। पहले मामले में, बाल और सहायक कोशिकाएं ध्वनि और गति^1,,2जैसे यांत्रिक आदानों को कुशलतापूर्वक समझने के लिए एक विशिष्ट अक्षीय दिशा में संरेखित होती हैं। इसी तरह, रेटिना³द्वारा इष्टतम ऑप्टिकल गुणों को प्राप्त करने के लिए फोटोरिसेप्टर सेल स्थानिक संगठन आवश्यक है। इस प्रकार उचित शारीरिक कार्य के लिए कोशिका की स्थिति और अभिविन्यास का स्थानिक नियंत्रण विशेष प्रासंगिकता है।

ड्रोसोफिला एक होलोमेटाबोलस कीट है जो कायापलट के माध्यम से अपनी लार्वा शरीर संरचनाओं के पूर्ण परिवर्तन से गुजरती है, जिससे इसके वयस्क ऊतकों को जन्म मिलता है। ड्रोसोफिला पिल्ला विभिन्न गतिशील घटनाओं की नॉनइनवेसिव लाइव इमेजिंग के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है, जिसमें विकासात्मक सेल माइग्रेशन^4,सेल डिवीजन और विकास गतिशीलता^5,मांसपेशियों का संकुचन^6,सेल डेथ^7,घाव मरम्मत⁸और सेल ओरिएंटेशन⁹शामिल हैं। वयस्क ड्रोसोफिलामें, बाहरी एपिथेलियम उच्च स्तर के आदेश दिखाता है। यह ट्राइहोम (यानी, एकल विशेषण कोशिकाओं से उत्पन्न होने वाले सेल प्रोट्रूशन) की व्यवस्थाओं पर आसानी से मनाया जाता है और फ्लाई के शरीर की सतह¹⁰पर संवेदी ब्रिस्टल होते हैं। दरअसल, ट्राइहोम समानांतर पंक्तियों में गठबंधन कर रहे हैं एयरफ्लो¹¹मार्गदर्शन । वयस्क एपिथेलिया का मॉर्फोजेनेसिस और व्यक्तिगत कोशिकाओं की आदेश ित व्यवस्था भ्रूण उत्पत्ति के दौरान शुरू होती है और प्यूपल चरणों के दौरान समापन होती है। जबकि भ्रूण कोशिका विभाजन, इंटरकैलेशन और आकार में सभी ऊतक आदेश^12,,13में कमी बदलते हैं, यह विकास के बाद के चरणों में वापस आ जाता है, विशेष रूप से प्यूपल चरणों में, जब फ्लाई परिपक्वता⁹तक पहुंचती है।

स्थिर ड्रोसोफिला पिल्ला सेल आकार और अभिविन्यास परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए एक आदर्श प्रणाली प्रदान करता है। प्यूपल पेट एपिडर्मिस विशेष लाभ प्रस्तुत करता है। जबकि वयस्क सिर, छाती, जननांग और उपांग के अग्रदूत बढ़ते हैं और लार्वा चरणों से पैटर्न हो जाते हैं, हिस्टोब्लास्ट, जो लार्वा एपिडर्मिस में एकीकृत होते हैं, केवल प्यूरीशन¹⁴पर बढ़ना और अंतर करना शुरू करते हैं। यह सुविधा ऊतक आदेश की स्थापना में शामिल सभी स्थानिक घटनाओं की ट्रैकिंग को पूरी तरह से⁹में ट्रैक करने की अनुमति देती है ।

हिस्टोब्लास्ट प्रत्येक प्रकल्पित पेट खंड में गर्भनिरोधक पदों पर भ्रूणीय विकास के दौरान निर्दिष्ट कर रहे हैं। वयस्क के पृष्ठीय पेट के एपिडर्मिस डोरसोपार्श्व रूप से स्थित हिस्टोब्लास्ट घोंसले से प्राप्त होते हैं जो पूर्वकाल और पीछे के डिब्बों में मौजूद होते हैं^15,16। जैसे ही हिस्टोब्लास्ट का विस्तार होता है, लार्वा एपिथेलियल कोशिकाओं (एलईसी) की जगह, कॉन्ट्रालेटरल घोंसले पृष्ठीय मिडलाइन पर फ्यूज करते हैं जो एक शंकुदार शीट बनाते हैं^{17,,18,,19,,20।}

यह काम 1) Drosophila pupae के विच्छेदन, बढ़ते, और दीर्घकालिक लाइव इमेजिंग के लिए एक पद्धति का वर्णन करता है, और 2) उच्च स्थानिक संकल्प पर सेलुलर अभिविन्यास और विकास की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए विश्लेषणात्मक तरीके। यहां एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है, जिसमें प्रारंभिक पिल्ला तैयारी (यानी, मचान और इमेजिंग) से आवश्यक सभी चरणों को विस्तारित करने और दिशात्मकता और अभिविन्यास सुविधाओं के परिमाणीकरण के लिए कवर किया गया है। हम यह भी वर्णन करते हैं कि सेल क्लोन के विश्लेषण से स्थानीय ऊतक गुणों का अनुमान कैसे लगाया जाए। वर्णित सभी चरण न्यूनतम आक्रामक हैं और दीर्घकालिक लाइव विश्लेषण की अनुमति देते हैं। यहां वर्णित तरीकों को आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है और अन्य विकासात्मक चरणों, ऊतकों या मॉडल जीवों पर लागू किया जा सकता है।

Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल को पांच चरणों में विभाजित किया गया है: (1) पिल्ले का मंचन, (2) इमेजिंग के लिए पिल्ले की तैयारी करना, (3) बढ़ते पेट एपिथेलिया की लाइव इमेजिंग, (4) आनुवंशिक मोज़ेक की पीढ़ी, (5) डेटा प्रसंस्करण और विश्लेषण (कोशिका जंक्शन रूपरेखा और कोशिका क्लोन से विकास गतिशीलता का विश्लेषण करने के तरीके का वर्णन करने वाले अनुभागों सहित)।

1. इमेजिंग से पहले ड्रोसोफिला पिल्ले का मंचन

1. संस्कृति अंडे बिछाने (एईएल) के बाद 5 दिनों (± 12 घंटे) के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर प्लास्टिक शीशियों में मानक मध्यम पर उपयुक्त जीनोटाइप की मक्खियों ।
   नोट: कायापलट पुपरियम गठन (एपीएफ) के बाद 0 घंटे तक 120 घंटे एईएल में पुपल मामले में तीसरे-इंस्टार लार्वा के कारावास के भीतर शुरू होता है। यह संक्रमण आसानी से पहचाना जा सकता है, क्योंकि लार्वा खिलाना और आगे बढ़ना बंद कर देता है और ऑपरकुलर क्षेत्र 0-12 घंटे एपीएफ पर(चित्रा 1ए)बनता है। प्यूपरियम शुरू में नरम और सफेद होता है, लेकिन उत्तरोत्तर कठोर और टैन होता है।
2. एक गीला तूलिका का उपयोग कर एक ताजा प्लास्टिक शीशी के लिए सफेद prepupae (0 h APF) स्थानांतरण । वांछित उम्र तक डिजाइन किए गए प्रयोग के आधार पर जानवरों को विभिन्न तापमान ों पर रखा जा सकता है।
   नोट: पिल्ला गठन (यानी, पिल्ला) 12 घंटे एपीएफ में होता है, जब वयस्क मक्खी के सिर और उपांग पूरी तरह से एवरेटेड होते हैं(चित्रा 1ए)। इस समय तक प्यूपल केस पूरी तरह से प्यूपा से अलग हो जाता है, जिससे इसकी पूरी तरह से हटाने की अनुमति(चित्रा 1ए)हो ता है।

2. लाइव इमेजिंग के लिए पिल्ला तैयार करना

नोट: मंचन के बाद, पिल्ले विच्छेदित और नीचे वर्णित के रूप में घुड़सवार है (यह भी चित्रा 1देखें) ।

1. संदंश की मदद से शीशी की दीवार से मंचन पिल्ले निकालें।
2. दो तरफा चिपचिपा टेप के साथ कवर एक गिलास स्लाइड पर प्रत्येक पिल्ला के वेंट्रल पक्ष गोंद । टेप(चित्रा 1ए, बी)को पुपल मामले के आसंजन को आश्वस्त करने के लिए संदंश के सुझावों के साथ सिर सर्पिल (यानी, ऑपरकुलर क्षेत्र) और पिल्ला की पृष्ठीय सतह पर धीरे-धीरे टैप करें।
   नोट: पृष्ठीय सतह का सामना करना चाहिए ताकि मामले के विच्छेदन और पिल्ला की वसूली को सुविधाजनक बनाया जा सके।
3. धीरे से संदंश(चित्रा 1सी)के साथ puparium से ऑपरकुलम हटाने के द्वारा एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत विच्छेदन शुरू करते हैं ।
4. ऑपरकुलर खोलने के माध्यम से प्यूपल मामले और पिल्ला सतह के बीच एक उथले कोण में संदंश की एक टिप डालें। एक या अधिक झूलों में सिर से पूंछ तक मामले को फाड़ दें, पिल्ला(चित्रा 1डी)को चुटकी लेने से बचें। फटा प्यूपल मामले को पार्श्व पक्षों में वापस मोड़ें क्योंकि आप पीछे के अंत में आगे बढ़ते रहते हैं(चित्रा 1ई)।
   नोट: प्यूपल मामला काफी कठोर और दरारें आसानी से है। उच्च आर्द्रता या विशेष रूप से जीनोटिपिक पृष्ठभूमि के मामले में, प्यूपल मामला नरम हो जाता है और फाड़ना अधिक कठिन होता है। इन मामलों में, पुल्पल मामले के क्रैकिंग को संदंश के दोनों सुझावों के साथ अपने मुक्त किनारों को चुभने में मदद की जा सकती है।
5. जानवर के नीचे संदंश को ध्यान से डालकर और धीरे-धीरे खींचकर खुले-अप प्यूपल मामले से पिल्ला निकालें(चित्रा 1एफ)। पिल्ला संदंश की नोक पर अडिग रहेगा(चित्रा 1जी−एच)।
6. एक गिलास नीचे पकवान के लिए संदंश की मदद से पिल्ला हस्तांतरण और गैस की एक छोटी सी बूंद के शीर्ष पर जमा-permeable हेलोकार्बन तेल(चित्रा 1I)। किसी भी संभावित ऊतक क्षति से बचने के लिए वेंट्रल पक्ष द्वारा धीरे से पिल्ला पकड़ो।
   नोट: हेलोकार्बन तेल की बूंद को छोटा होना चाहिए, जिसका व्यास पिल्ला की लगभग आधे से भी कम लंबाई है। ऐसी राशि केशिकाद्वारा कांच के लिए पिल्ला का पालन करने और तेल विसर्जन उद्देश्यों के लिए प्रकाशिकी को सही करने के लिए पर्याप्त है।
7. आर्द्रता बनाए रखने के लिए पकवान के किनारों पर गीले टिश्यू पेपर का एक टुकड़ा रोल करें। इमेजिंग के दौरान प्यूप्पी के निर्जलीकरण से बचने के लिए पकवान को कवर करें।
   नोट: इमेजिंग के लिए महिला और पुरुष दोनों पिल्ले को नियोजित किया जा सकता है। हम तीसरे पेट खंडों (AIII) को संदर्भ पेट मेटामेरे के रूप में नियोजित करने की सलाह देते हैं क्योंकि यह आकार, आकार और पैटर्निंग के मामले में दोनों लिंगों में लगभग समान है।

3. बढ़ते पेट एपिथेलिया की लाइव इमेजिंग

नोट: एक उलटा लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप एक 40x/1.3 एनए तेल विसर्जन उद्देश्य से सुसज्जित विभिन्न विकास के चरणों में छवि पिल्ले के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

1. डोमेन के अनुसार ग्लास-बॉटम डिश पर तेल की बूंद पर पिल्ला उन्मुख करें और मूल्यांकन की जाने वाली प्रक्रिया (उदाहरण के लिए पृष्ठीय घोंसले के शुरुआती विस्तार के दीर्घकालिक लाइव इमेजिंग के लिए डोरसोलेटरल रूप से, या उनके देर से विस्तार और ऊतक रीमॉडलिंग को छवि बनाने के लिए पृष्ठीय)। देखें चित्रा 1J, K और चित्रा 4।
2. माउंटेड पिल्ले वाले ग्लास-बॉटम डिश को माइक्रोस्कोप स्टेज में स्थानांतरित करें और प्रेषित प्रकाश का उपयोग करके पेट के क्षेत्र की सतह पर ध्यान केंद्रित करें।
   नोट: भले ही इस प्रोटोकॉल को उल्टे माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग के लिए अनुकूलित किया जाए, लेकिन एक ईमानदार माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग करना भी संभव है। उस मामले में, नमूना को माइक्रोस्कोप चरण पर ग्लास-बॉटम सतह के साथ रखा गया है। हेलोकार्बन तेल प्रत्येक पिल्ला को मेनिकस पर रखता है।
3. अधिग्रहण मापदंड निर्धारित करें: 1) जेड-स्लाइस की संख्या आमतौर पर 20−40 के बीच होती है ताकि पेट के एपिडर्मिस के उचित द्वि-आयामी (2डी) पुनर्निर्माण की अनुमति दी जा सके; 2) प्रत्येक टुकड़ा (जैसे, 1 माइक्रोन) के बीच कदम आकार; 3) रिकॉर्डिंग के लिए समय अंतराल (5 मिन अंतराल सेल ओरिएंटेशन गतिशीलता के उच्च निष्ठा विश्लेषण के लिए उपयुक्त है); और 4) फ्रेम रिज़ॉल्यूशन (उदाहरण के लिए, 1024 x 1024)।
4. क्रमशः जीएफपी और आरएफपी फ्लोरोफोरस की कल्पना करने के लिए उपयुक्त लेजर (यानी, 488 एनएम और 561 एनएम) चालू करें और चिह्नित कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए लेजर पावर और लाभ/ऑफसेट सेटिंग्स को समायोजित करें। सबसे कम संभव लेजर पावर का उपयोग करें (सीमा 5%−20%) फोटोब्लीचिंग और फोटोटॉक्सिकिटी को कम करने के लिए।
5. मैन्युअल रूप से संलग्न मोटर चालित चरण और माइक्रोस्कोप मल्टीपोजिशन अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके कई पिल्ले के लिए स्थिति और उपयुक्त जेड-स्टैक सीमा निर्धारित करें।

4. आनुवंशिक मोज़ेक की पीढ़ी सेल क्लोन के व्यवहार का पालन करने के लिए

नोट: हम साइट-विशिष्ट पुनर्संयोजन (एफएलपी/एफआरटी सिस्टम^21,,22)(चित्रा 2)के माध्यम से पेट के विशेषण में आनुवंशिक मोज़ेक को प्रेरित करने के लिए माइटोटिक पुनर्संयोजन को नियोजित करते हैं।

1. एक विशिष्ट जीनोमिक स्थान (जैसे, पर एक एफएलपी मान्यता लक्ष्य (एफआरटी) साइट, एक हीट शॉक-इंड्यूबल फ्लिपपासे ट्रांसजीन (एचएस-एफएलपी) ले जाने वाली कुंवारी मादाओं को पार करें क्रोमोसोम 2 के एल आर्म में स्थिति 40A पर एफआरटी साइट), और एक पहचानने योग्य सेलुलर मार्कर (जैसे, यूबी-आरएफपी.एनएलएस या यूबी-GFP.nls) एफआरटी साइट पर डिस्टल, उत्परिवर्ती पुरुषों को समकक्ष जीनोमिक स्थान(चित्रा2−ए सी)पर एफआरटी साइट ले जाने के लिए ।
   नोट: समारोह के किसी भी जीन हानि के लिए क्लोन के भीतर या बाहर स्वायत्त और गैर स्वायत्त प्रभाव FRT साइट के लिए विशिष्ट अप्रभावी alleles जिला रोजगार का अध्ययन किया जा सकता है ।
2. क्रॉस की संतान के तीसरे इंस्टार लार्वा चरण में हीट शॉक ट्रीटमेंट द्वारा हिस्टोब्लास्ट में FLP/FRT दैहिक क्लोन उत्पन्न करें । यह भटक लार्वा (एलआईआईआई) चरण में 45 मिन से 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में जानवरों से युक्त प्लास्टिक शीशियों को जलमग्न करके किया जाता है।
   नोट: माइटोटिक पुनर्संयोजन के लिए संवेदनशील अवधि सेल चक्र का जी-2 चरण है। हिस्टोब्लास्ट पूरे लार्वा विकास के दौरान जी2 में गिरफ्तार किए जाते हैं ।
3. अनुपस्थिति के लिए जुड़वां क्लोन स्कोर (यानी, उत्परिवर्ती कोशिकाओं) या बढ़ाया (यानी, जंगली प्रकार जुड़वां हाजिर कोशिकाओं) फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्कर के स्तर से 16 एच एपीएफ आगे(चित्रा 2डी)।
   नोट: औसतन, 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 00 से 1 घंटे ब्याज के क्षेत्र में लगभग केवल 2−3 जुड़वां क्लोन प्रदान करता है (उदाहरण के लिए, पेट हेमीसेगमेंट)। Pupae बहुत अधिक क्लोन घनत्व दिखा (जैसे, हेमीसेगमेंट प्रति चार जुड़वां क्लोन से अधिक) को आगे मात्रात्मक विश्लेषणों से त्याग दिया जाना चाहिए।
4. क्लोन पहचान पर, वांछित चरण में छवि रहने वाले पिल्ले और पिछले खंड में वर्णित समय की वांछित लंबाई के लिए।

5. डेटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण

नोट: डेटा इमेजजे (imagej.nih.gov/ij/) का उपयोग करके संसाधित किया जाता है।

1. सेल जंक्शन रूपरेखा से सेल ओरिएंटेशन गतिशीलता को अलग करें।
   1. इमेजजे के अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (एमआईपी) समारोह का उपयोग करके 2डी में कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा अधिग्रहीत जेड-स्टैक स्लाइस को प्रोजेक्ट करें।
      नोट: प्रति स्टैक स्लाइस की संख्या को कम से कम रखा जाना चाहिए ताकि एपिडर्मिस के तहत मैक्रोफेज पेट्रोलिंग द्वारा उत्पन्न फोकस शोर से बाहर होने से बचा जा सके।
   2. प्रत्येक डेटासेट(चित्रा 3ए)के विश्लेषण के लिए विश्वसनीय ऊतक स्थलों (जैसे, ए/पी कंपार्टमेंट सीमाओं) की पहचान करने वाली एक प्लानर समन्वय प्रणाली सेट करें।
      नोट: प्रत्येक डेटा सेट के लिए एक ही प्लानर संदर्भ ों को नियोजित करने से कई मापों की तुलना की जा सकेगी।
   3. गुणात्मक और मात्रात्मक अभिविन्यास मूल्यों को प्राप्त करने के लिए स्थानीय सेल किनारों पर इमेजजे^23,,24 के ओरिएंटेशनजे प्लगइन (bigwww.epfl.ch/demo/orientation/) का उपयोग करें। प्लगइन स्थानीय झुकाव के आधार पर इनपुट छवियों पर रंग-कोडित ओवरले प्रदान करता है और मात्रात्मक मोड(चित्रा 3बी−बी' और फिगर सी−सी ''में उपयोग किए जाने पर संख्यात्मक मूल्य प्रदान करता है।
      नोट: ओरिएंटेशनजे प्लगइन संरचना टेंपरर्स पर आधारित है, ग्रेडिएंट और दिशात्मक डेरिवेटिव से प्राप्त ईजीनवैल्यूज के 2 x 2 मैट्रिक्स (विस्तृत विवरण के लिए संदर्भ^23,,24 देखें)।
   4. सेट प्लानर समंवयप्रणाली (यानी सेल एज ओरिएंटेशन मैप्स)(चित्रा 3B)के सापेक्ष रंग-कोड सेल एज ओरिएंटेशन के लिए ओरिएंटेशनजे डिस्ट्रीब्यूशन ऑप्शन का इस्तेमाल करें। वितरण विकल्प इमेजजे में प्लगइन मेनू के तहत पाया जाता है। रोजगार के लिए सेटिंग्स हैं: गॉसियन विंडो सिग्मा = 1 पिक्सेल; क्यूबिक स्प्लीन = ढाल; न्यूनतम Coherency = 20%; न्यूनतम ऊर्जा = 1% सेल एज ओरिएंटेशन को प्लगइन (ह्यू = ओरिएंटेशन) के रंग सर्वेक्षण विकल्प को नियोजित करने वाली रंग-कोडित छवि के रूप में प्रदर्शित किया जाता है; संतृप्ति = सहधारण; और चमक = इनपुट छवि)।
      नोट: जिन क्षेत्रों में पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस होता है, वे कोई दिशात्मक जानकारी प्रदान नहीं करते हैं और उन्हें मैन्युअल रूप से विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए। उच्च थ्रेसहोल्ड सेटिंग्स प्रसंस्कृत छवियों में विचार किए गए पिक्सेल को कम करती हैं।
   5. सेलुलर ओरिएंटेशन और दिशात्मक सेल-सेल संरेखण (यानी, coherency)(चित्रा 3सी)की मात्रा निर्धारित करने के लिए ओरिएंटेशनजे उपाय विकल्प का उपयोग करें। इमेजजे में प्लगइन मेनू के तहत उपाय विकल्प पाया जाता है। हिस्टोब्लास्ट(चित्रा 3सी)द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र के भीतर एक समान वजन (64 x 64 पिक्सल, लगभग 20 μm x 20 μm) के ब्याज (आरओआई) के छोटे आसन्न गैर-ओवरलैपिंग क्षेत्रों को उत्पन्न करें।
   6. प्रमुख स्थानीय अभिविन्यास (यानी, पड़ोसी कोशिकाओं के बीच औसत अभिविन्यास-औसत सेल एज ओरिएंटेशन मानचित्र) और आरओआई से जुटना की गणना करें। सॉफ्टवेयर प्रत्येक आरओआई(चित्रा 3सी)के भीतर प्रमुख अभिविन्यास और स्थानीय सहधारण की गणना करता है।
      नोट: ओरिएंटेशनजे द्वारा अनुमानित संरचना टेन्सर के सबसे बड़े और छोटे eigenvalues को उनके अंतर और उनकी राशि के बीच अनुपात के रूप में सहधारण की गणना करने के लिए नियोजित किया जाता है। सहधारण 0−1 के मूल्यों के बीच घिरा हुआ है। 1 का मूल्य पूर्ण संरेखण एकरूपता को इंगित करता है, जबकि 0 का मूल्य कोई संरेखण वाले आइसोट्रोपिक क्षेत्रों को इंगित करता है।
   7. सांख्यिकीय रूप से पिछले²⁵जैसे मुफ्त सॉफ्टवेयर पैकेजों का उपयोग करके कई छवियों से गणना अभिविन्यास और सहधारण मूल्यों का विश्लेषण करें। अभिविन्यास मूल्यों (डिग्री में) जैसे अक्षीय डेटा को दिशात्मक आंकड़ों द्वारा उचित रूप से वर्णित किया जाता है।
   8. सॉफ्टवेयर के माध्यम से, अभिविन्यास वितरण के प्रत्येक सेट के लिए मतलब दिशा और परिपत्र विचरण की गणना करें। विभिन्न जीनोटाइप या शर्तों के बीच झुकाव के वितरण के बीच अंतर का सांख्यिकीय महत्व समान वितरण के लिए नॉनपैरामेट्रिक मार्डिया-वाटसन-व्हीलर परीक्षण (डब्ल्यू-टेस्ट) का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है।
   9. गैर-पैरामेट्रिक कोलमोगोरोव-स्मिरनोव परीक्षण (के-एस परीक्षण) को लागू करने में सहधारण में अंतर के सांख्यिकीय महत्व की गणना करें। वांछित (ध्रुवीय भूखंड, बार चार्ट, बॉक्स प्लॉट, आदि) के रूप में ग्राफिक रूप से डेटा प्रदर्शित करें।
2. सेल क्लोन से विकास गतिशीलता
   नोट: निम्नलिखित कदम 2डी एमआईपी छवियों से कोशिकाओं के लिए ज्यामितीय और आकार मापदंडों को पुनः प्राप्त करने की अनुमति देते हैं जिसमें ब्याज का क्लोन (एस) होता है। कई क्लोन के बीच तुलना के लिए, छवियों को एक ही सेटिंग्स के साथ प्राप्त किया जाना चाहिए।
   1. इमेजजे फ्रीहैंड चयन उपकरण के साथ अपनी रूपरेखा खींचकर सेगमेंट क्लोन क्षेत्र।
   2. एनालाइजा मेनू के तहत इमेजजे के सेट माप उपकरण का उपयोग करके ज्यामितीय और आकार के मापदंडों की गणना करें। क्षेत्र, परिधि, फिट एलिप्स,और आकार वर्णनकर्ता विकल्पों को सक्रिय करें।
      नोट: यह क्षेत्र (क्लोन के भीतर पिक्सल का योग), परिधि (क्लोन सीमा के पिक्सेल का योग), पहलू अनुपात (एआर, क्लोन सीमा में अंकित सर्वश्रेष्ठ फिट Legendre ellipse के प्रमुख और छोटे कुल्हाड़ियों के बीच अनुपात), और अभिविन्यास के कोण (यानी, पूर्व सीमा के सापेक्ष क्लोन के प्रमुख धुरी के कोण) सहित विविध ज्यामितीय मापदंडों की प्राप्ति की अनुमति देगा ।
   3. इन मापों से गैर-आयामी अनुपात की गणना आकार मापदंडों को पुनः प्राप्त करती है। इनमें गोलाई (4 x [क्षेत्र]/एक्स [प्रमुख धुरी]^2),खुरदरापन (दृढ़ता-क्षेत्र/उत्तल क्षेत्र), और परिपत्र (40 x [क्षेत्र]/[परिधि]²⁾शामिल हैं ।
      नोट: आकार मापदंडों में से प्रत्येक आदर्श आकार से क्लोन के विचलन की डिग्री का प्रतिनिधित्व करता है जैसे एक सर्कल या एक बाध्य उत्तल पतवार, और वे सभी 0 और 1 के मूल्यों के बीच बंधे हैं । 1 के बराबर मूल्य अधिकतम समरूपता (यानी, न्यूनतम जटिलता) का संकेत देते हैं।
   4. माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल और/या अतीत का उपयोग करके विभिन्न जीनोटाइप या शर्तों के बीच ज्यामितीय और आकार के मापदंडों का सांख्यिकीय विश्लेषण करें। अंतर का सांख्यिकीय महत्व समान मतलब के लिए एक अनपेयरी दो पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट या शर्तों के बीच समान वितरण के लिए गैर-पैरामेट्रिक कोलमोगोरोव-स्मिरनोव के-एस-टेस्ट का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है। डेटा को रेखांकन रूप से वांछित (जैसे, बार चार्ट, बॉक्स प्लॉट आदि) के रूप में प्रदर्शित किया जा सकता है। देखें चित्र 5।

Representative Results

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल में दीर्घकालिक लाइव इमेजिंग के लिए ड्रोसोफिला प्यूपी की तैयारी और सेल ओरिएंटेशन और पेट एपिडर्मिस की विकास गतिशीलता के विश्लेषण के लिए प्रक्रियाओं को शामिल किया गया है। इस पद्धति को लागू करके महत्वपूर्ण फोटोब्लीचिंग या फोटोटॉक्सिकिटी के बिना 48 घंटे तक की अवधि के लिए विकासशील पिल्ले की उच्च-रिज़ॉल्यूशन वाली फिल्में उत्पन्न करना संभव है। विभिन्न समय बिंदुओं पर पेट एपिडर्मिस (जैसे, हिस्टोब्लास्ट और एलईसी) का चित्रण करने वाले स्नैपशॉट और विभिन्न कोणों पर उन्मुख प्यूपी ओरिएंटेड से चित्रा 4में दिखाए गए हैं। इन फिल्मों के बाद के विश्लेषण से हिस्टोब्लास्ट के विस्तार और एलईसी के प्रतिस्थापन के दौरान संग्राहक मुख्य ज्यामितीय और आकार मापदंडों में स्थानीय और वैश्विक परिवर्तनों की गतिशीलता की पहचान और मात्रा की अनुमति मिलती है। ये विश्लेषण विभिन्न परिदृश्यों और विशिष्ट उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में किए जा सकते हैं। उन्हें क्लोन के लिए भी नियोजित किया जा सकता है जिसमें जीन अभिव्यक्ति को बदल दिया जाता है, जिससे स्वायत्त हानि या कार्य स्थितियों का लाभ होता है। यह आसपास की कोशिकाओं में गैर स्वायत्त प्रतिक्रियाओं की खोज की अनुमति देगा, क्रॉस टॉक या सेल संचार तंत्र(चित्रा 5)की पहचान को सुविधाजनक बनाता है। इस दृष्टिकोण को हाल ही में वयस्क⁹के पेट के एपिडर्मिस के प्लानर ध्रुवीय पैटर्न की तैनाती के दौरान एक प्रमुख तत्व निर्देशन और उन्मुख कोशिकाओं के संरेखण के रूप में वसा/Dachsous/चार संयुक्त मार्ग की पहचान में नियोजित किया गया है ।

चित्रा 1: लाइव इमेजिंग के लिए विच्छेदन और बढ़ते पिल्ले। (क)बाएं से दाएं: 0 एच एपीएफ (बाएं) पर एक प्रीपुपा का पृष्ठीय दृश्य और 14 घंटे एपीएफ पर एक पिल्ला का पहले (मध्य) और बाद (दाएं) अपारदर्शी पुपल मामले को हटाने के लिए । नेत्र क्षेत्र (सफेद तीरसिर) इंगित किया गया है। (ख)विच्छेदन के लिए आवश्यक टूलकिट दिखाया गया है। बाएं से दाएं: ग्लास स्लाइड, डबल तरफा चिपचिपा टेप, संदंश की एक जोड़ी, और एक गिलास नीचे पकवान। (ग)कांच स्लाइड पृष्ठीय पक्ष पर दो तरफा चिपचिपा टेप पर पिल्ला का मंचन किया जाता है । प्रत्येक पिल्ले का पुपा का पुपल मामला सर्जिकल संदंश के साथ ऑपरकुलर क्षेत्र से खोला जाता है। (DD−E) पुपल मामले की छीलने का मामला धीरे-धीरे होता है। मामला फटे हुए हैं और सिर से पेट तक पुपल पक्ष ों को मोड़ा जाता है। (एफ−एच) पिल्ला धीरे-धीरे संदंश(जी)के सुझावों के साथ वेंट्रल साइड से उठाया जाता है और हेलोकार्बन तेल की न्यूनतम बूंद पर ग्लास-बॉटम डिश में स्थानांतरित हो जाता है। (I)पिल्ला तो उचित उन्मुख है (डोरसोलेटरली, ऊपर; पृष्ठीय, नीचे) । पैनलसी −Iमें दिखाए गए कदमों को Cदोहराकर एक साथ कई पिल्ले लगाए जा सकते हैं । (जे)छवि जंक्शनल मार्कर Atpα व्यक्त AIII खंड के पृष्ठीय हिस्टोब्लास्ट घोंसले की कोशिकाओं की रूपरेखा दिखा:: GFP । पिल्ला डोरसोलेटरली उन्मुख था और 14 एच एपीएफ में इमेज्ड था। स्केल बार = 22 μm.(कश्मीर)छवि के बराबर(जम्मू)लेकिन देखने के एक पृष्ठीय बिंदु से । ऊतक विकास की गतिशीलता कई घंटों के लिए कल्पना की जा सकती है। यह भी देखें 4 चित्रा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 2: FLP/FRT प्रणाली के माध्यम से आनुवंशिक मोज़ेक की पीढ़ी । (क)एक माता-पिता के विषमता कोशिका (पीला मजेंटा) में एक गुणसूत्र हाथ पर एक अप्रभावी उत्परिवर्ती एलील (धराशायी आयत) और अन्य गुणसूत्र हाथ में फ्लोरोसेंट मार्कर (मजेंटा) के लिए जीन एन्कोडिंग [इस उदाहरण में गुणसूत्र 2 (2एल की बाईं बांह) होती है] । एफआरटी साइटें (नारंगी आयत) दोनों बाहों में एक ही गुणसूत्र पदों पर सेंटोमेरोमर (ग्रे अंडाकार) के समीपस्थ हैं। (ख)जी2 में रुकी कोशिकाओं में हीट शॉक द्वारा एफएलपी को पुनः संयोजित करने से सिस्टर क्रोमाटिड 1-1 और 2-2 के एफआरटी के बीच पुनर्संयोजन होता है । नतीजतन, एफआरटी साइटों (2L पर FRT40A) के लिए क्षेत्र का आदान-प्रदान किया जाता है। सही पैनल पर एक बढ़ाया हुआ दृश्य दिखाया गया है। (ग)माइटोसिस के दौरान पुनर्व्यवस्थित क्षेत्रों (1-1' और 2-2 ') के ध्रुवीय अलगाव पर, दो आनुवंशिक रूप से अलग-अलग बहन कोशिकाएं उत्पन्न होती हैं। एक बेटी अप्रभावी एलील के लिए और पुनर्संयोजन की साइट के लिए पूरे गुणसूत्र हाथ डिस्टल के लिए होमोज़िगौस है। इस कोशिका में उस जीन का अभाव है जो फ्लोरोसेंट मार्कर के लिए एन्कोड करता है, जो सफेद रंग में नकारात्मक रूप से चिह्नित होता है। दूसरी बेटी सेल जंगली प्रकार के हाथ के लिए homozygous होगा, एक जुड़वां स्थान को जंम दे रही है और फ्लोरोसेंट मार्कर (डार्क मजेंटा) के लिए एन्कोडिंग जीन की दो प्रतियां व्यक्त । सादगी के लिए, माइटोटिक सेल (यानी, 1−2 और 1'−2') के विपरीत ध्रुवों के लिए पुनर्व्यवस्थित क्षेत्रों के अलगाव नहीं दिखाए गए हैं। ये माता-पिता की कोशिका (विषमता पृष्ठभूमि, पीला मजेंटा) से आमतौर पर अविवेच्य कोशिकाओं को जन्म देते हैं। (घ)तीसरे इंस्टार लार्वा चरण में एफएलपी/एफआरटी दैहिक पुनर्संयोजन के माध्यम से उत्पन्न डिब्बे में क्लोन दिखाऔर 26 घंटे एपीएफ में कल्पना की गई । कोशिकाओं के क्लोन एक अन्यथा विषमताओं RFP.nls पृष्ठभूमि (मंद मजेंटा) में RFP.nls (काले) और RFP.nls (उज्ज्वल मजेंटा, जुड़वां धब्बे) की होमोज़िगौस अभिव्यक्ति की अनुपस्थिति से चिह्नित किए जाते हैं। अन्य गुणसूत्र स्थानों (2आर, 3एल, 3आर और एक्स) में स्थित एफआरटी साइटों के लिए समकक्ष घटनाओं को प्राप्त किया जा सकता है। यह भी देखें चित्र5। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 3: सेल ओरिएंटेशन माप का चित्रण। सेल झुकाव के बारे में जानकारी निकालने के लिए, ऊतक धुरी के साथ सेल अभिविन्यास से संबंधित करने के लिए पहले एक प्लानर समन्वय प्रणाली सेट(ए)है। दूसरा, सेल झुकाव सेल रूपरेखा(बी)से निकाले जाते हैं । अंतिम, ऊतक धुरी के साथ सेल झुकाव और संरेखण की मात्रा निर्धारित की जाती है(सी)। (क)बाईं ओर, प्लैपर समन्वय प्रणाली के अनुसार एक पिल्ला उन्मुख के पार्श्व दृश्य का एक चित्र। लाल ठोस और सियान धराशायी लाइनें कार्टेशियन विमान को परिभाषित करती हैं जो क्रमशः एंट्रोपोस्टरीयर (ए/पी) सीमा और पृष्ठीय मिडलाइन का प्रतिनिधित्व करती हैं । बीच में, जंक्शनल मार्कर Atpα द्वारा उल्लिखित 26 घंटे एपीएफ में विस्तार हिस्टोब्लास्ट के एक डोरसोलेटरल दृश्य को दिखाने वाली एक उलटा छवि::GFP (इनपुट छवि)। ए/पी बाउंड्री की स्थिति को लाल रेखा से हाइलाइट किया गया है । दाईं ओर, सेल एज ओरिएंटेशन (पॉलीगॉन) या औसत सेल झुकाव (बार) का वर्णन करने के लिए लागू रंग कोड दिखाने वाला एक अक्षीय कंपास। (ख)प्लगइन्स/ओरिएंटेशनजे मेनू औरOrientationJ ओरिएंटेशनजे डिस्ट्रीब्यूशन विंडो का प्रदर्शन । (बी') ओरिएंटेशनजे डिस्ट्रीब्यूशन विंडो का डिस्प्ले जो दाईं ओर सेल एज ओरिएंटेशन मैप प्राप्त करने के लिए नियोजित मापदंडों की सेटिंग्स दिखाता है। (बी') रंग-कोडित कोशिका का चित्रण आदर्श कोशिकाओं पर रेखांकित करता है। एक सर्कल में कोई पसंदीदा रंग नहीं दिखा। (ग) ओरिएंटेशनजे उपाय खिड़की का प्रदर्शन। (ग)) ओरिएंटेशनजे उपाय खिड़की के अनुक्रमिक स्क्रीनशॉट दिखा कैसे एक समान वजन के लगातार ROIs में स्थानीय अभिविन्यास और सहधारण को मापने के लिए । प्रत्येक क्षेत्र के लिए स्थानीय अभिविन्यास कोण और सहधारण को एलिप्लाइड के रूप में प्रदर्शित किया जाता है। (C'') अभिविन्यास माप के अंतिम परिणामों का प्रतिनिधित्व। एलिप्लाइड्स नेत्रहीन अभिविन्यास (यानी, ए/पी सीमा के संबंध में सबसे लंबी धुरी का कोण) और सहधारण (यानी, एलिप्लाइड की सबसे लंबी और छोटी धुरी के बीच अनुपात) प्रदर्शित करते हैं। दोनों मापदंडों के संख्यात्मक मूल्यों को आगे के विश्लेषण के लिए स्प्रेडशीट में सहेजा जाता है । (C'') आदर्शकोशिकाओं पर रंग-कोडित सेल रूपरेखा और औसत सेल अभिविन्यास (बार) का चित्रण। एक सर्कल में कोई पसंदीदा अभिविन्यास नहीं दिखाहै। (C''') प्रत्येक आरओआई (स्थानीय रूप से औसत अभिविन्यास मानचित्र) के पसंदीदा स्थानीय अभिविन्यास का प्रतिनिधित्व। रंग प्रत्येक क्षेत्र के अभिविन्यास को उजागर करते हैं। पूर्वकाल बाईं ओर है । स्केल बार = 22 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 4: पेट के बढ़ते एपिथेलिया की दीर्घकालिक लाइव इमेजिंग। (क)हिस्टोब्लास्ट विस्तार के शुरुआती से देर तक लंबी इमेजिंग फिल्मों से प्रतिनिधि स्नैपशॉट । शीर्ष: 16 एच और 26 एच एपीएफ में डोरसोलेटरल इमेजिंग के लिए उन्मुख एक पिल्ला के योजनाबद्ध दृश्य। प्यूपा के डोरसोलेटरल साइड से दिखाई देने वाले घोंसले द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र को 16 और 26 घंटे एपीएफ में डार्क ग्रे में हाइलाइट किया गया है। नीचे: जंक्शनल मार्कर Atpα की सर्वव्यापी अभिव्यक्ति द्वारा लेबल दोनों हिस्टोब्लास्ट और एलईसी से सेल रूपरेखा दिखा छवियां:: GFP । ए/पी सीमा दो हाइलाइट किए गए डिब्बों (नीले = पूर्वकाल डिब्बे में नकली रंग की कोशिकाओं; हरे = पीछे के डिब्बों) के बीच में निहित है । (ख)घोंसले संगम के शुरुआती से देर तक लंबी अवधि की इमेजिंग फिल्मों से प्रतिनिधि स्नैपशॉट । शीर्ष: 32 घंटे और 48 एच एपीएफ पर पृष्ठीय इमेजिंग के लिए उन्मुख एक पिल्ला का योजनाबद्ध दृश्य। नीचे: सेल रूपरेखा (लेबल और एक में के रूप में रंग) । ध्यान दें कि Atpα:: GFP मार्कर उच्च संकल्प के साथ समय के साथ व्यक्तिगत एपिथेलियल कोशिकाओं के आकार के चित्रण की अनुमति देता है। स्केल बार = 22 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 5: ऊतक गुण क्लोनल विश्लेषण से निकाले गए। (क)26 घंटे एपीएफ में RFP.nls (ब्लैक) और उनके जुड़वां धब्बे (उज्ज्वल मजेंटा) की अनुपस्थिति से चिह्नित डिब्बे में जंगली प्रकार के क्लोन के उदाहरण । क्लोन खंडीय सीमाओं के साथ एकत्र ित होते हैं। जुड़वाक्लोन समानांतर या मिलकर व्यवस्था करते हैं। स्केल बार = 22 माइक्रोन। (ख)शीर्ष: क्लोन रूपरेखा से निर्धारित मापदंडों को दर्शाती छवियां । नीचे: सारांश तालिका जंगली प्रकार के जानवरों के लिए संकेत मापदंडों के लिए औसत मूल्यों की रिपोर्टिंग (n = 29) । (ग)26 घंटे (बाएं) और 47 घंटे (दाएं) एपीएफ पर जंगली प्रकार के क्लोन की आकृति विज्ञान। क्लोन दोनों चरणों में जटिल सीमा आकृति विज्ञान दिखाता है। (घ)26 घंटे (हल्का पीला) और 47 घंटे एपीएफ (गहरा पीला) पर ज्यामितीय मापदंडों के लिए बॉक्स और मूंछ भूखंड। इस समय खिड़की में औसत क्षेत्र और परिधि में काफी वृद्धि हुई है। (ई)क्लोन अभिविन्यास का प्रतिनिधित्व करने वाले ध्रुवीय भूखंड (बिन आकार 18 डिग्री, क्षेत्र के आनुपातिक बहुतायत)। विस्तार और रीमॉडलिंग के दौरान ओरिएंटेशन कायम है। (एफ)बॉक्स और मूंछ भूखंड 26 घंटे (हल्के पीले) और ४७ घंटे एपीएफ (गहरे पीले) पर आकार मापदंडों के लिए । खुरदरापन (दृढ़ता), गोलाई, और परिपत्रता मुश्किल से बदल जाते हैं। औसत मूल्यों को लाल क्षैतिज रेखा के साथ दिखाया गया है और मूंछ वितरण के न्यूनतम और अधिकतम मूल्यों तक फैली हुई है। आंकड़े K-SM परीक्षण या डब्ल्यू परीक्षण (पी एंड एलटी; ०.०००१ ***,, पी एंड जीटी; ०.०५ महत्वपूर्ण नहीं) के साथ किया गया था । पूर्वकाल बाईं ओर है, पृष्ठीय ऊपर है । स्केल बार = 16 माइक्रोन। जीनोटाइप एचएसफ्लेप1.22है ; FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

लंबी दूरी का आदेश अधिकांश कार्यात्मक शारीरिक इकाइयों की एक अनिवार्य विशेषता है। मॉर्फोजेनेसिस के दौरान, उच्च लौकिक और स्थानिक परिशुद्धता के साथ लागू जटिल निर्देशों के एकीकरण के माध्यम से आदेश प्राप्त किया जाता है। कई और बहुस्तरीय विवश टकसाली ऊतक व्यवस्था में एकीकृत कर रहे हैं ।

विकास के दौरान स्थानिक व्यवस्था का आदेश देने के लिए ध्रुवीकरण और दिशात्मकता महत्वपूर्ण है। ध्रुवता का तात्पर्य विकास के दौरान समरूपता तोड़ना है । विषमता की उपलब्धि भ्रूण एंटेरोपोस्टर (ए/पी) और डोरसोवेंट्रल (डी/वी) कुल्हाड़ियों और वयस्क संगठन²⁶के निर्धारण के लिए आवश्यक है । इस प्रारंभिक भूमिका से परे, स्थानीय विषमताएं सभी स्तरों पर रूपात्मक विविधता के लिए आवश्यक हैं। दिशात्मकता मॉर्फोजेनेसिस के दौरान विषमता और ध्रुवता का एक अनिवार्य पूरक है। वैश्विक व्यवस्था कोशिकाओं की भावना और एक सटीक भावना या अभिविन्यास के साथ सेल-टू-सेल आधार पर स्थानीय स्तर पर संकेतों को संचारित करने की क्षमता द्वारा लागू किया जाता है। एकल कोशिकाएं विषमताएं अंतरिक्ष में विशेष दिशाओं के भीतर पदों या आंदोलनों को उन्मुख करके समय के साथ सहकारी रूप से सामंजस्य बिठाती हैं। सेल संचार स्रावित कारकों, सेल-सेल संपर्कों और यांत्रिक आदानों को फंसाता है। संकेत कोशिकाओं के क्षेत्रों पर कार्य करते हैं जो पहले स्थानीय रूप से और फिर विश्व स्तर पर उनके व्यवहार को संशोधित करते हैं²⁷।

यह काम ऊतक आदेश के विकास के दौरान उनके प्लानर अभिविन्यास और विकास मापदंडों सहित व्यक्तिगत कोशिकाओं के समन्वित व्यवहार का विश्लेषण करने का एक सरल तरीका प्रस्तुत करता है। पिल्ला के दौरान ड्रोसोफिला के वयस्क पेट की मॉर्फोजेनेसिस अन्य समकक्ष मॉडलों जैसे रोगाणु बैंड एक्सटेंशन/रिऐक्शन²⁸ या पृष्ठीय बंद होने पर तकनीकी लाभों की एक श्रृंखला प्रस्तुत करती है, फ्लाई भ्रूण जेनेसिस के दौरान²⁸ या पृष्ठीय बंद होना, ड्रोसोफिला विंग मॉर्फोजेनेसिस एक्स वीवो^30, कैनोरहैब्डिटिस मेंवेंट्रल बाड़े 31, या^{चूहों}में पाताल संलयन, चूहों में^31,या चूहों में पाताल संलयन, अन्य लोगों के बीच

सबसे पहले, पेट मॉर्फोजेनेसिस एक प्रक्रिया का गठन करता है जिसे वीवो में इसकी संपूर्णता में पालन किया जा सकता है। हिस्टोब्लास्ट द्वारा एलईसी के प्रतिस्थापन की निरंतर लाइव इमेजिंग 12 घंटे एपीएफ से की जा सकती है, जब पिल्ला बनता है, वयस्क एपिथेलियल मॉर्फोजेनेसिस के पूरा होने तक। दूसरा, यह सेल माइग्रेशन, डिवीजन, आकार परिवर्तन, delamination, और intercalation के रूप में सेल व्यवहार का एक पूरा सेट के विश्लेषण की अनुमति देता है । अंत में, यह आनुवंशिक हस्तक्षेप और क्लोनल विश्लेषण के लिए उत्तरदायी है। उचित मार्कर को नियोजित करके लाभ और कार्य गतिविधियों के लाभ के स्वायत्त और गैर-स्वायत्त प्रभावों की निगरानी की जा सकती है। हालांकि, एक मॉडल प्रणाली के रूप में पिल्ला कुछ छोटी सीमाएं प्रस्तुत करता है। इसके ओवोइड आकार के कारण, उच्च संकल्प के साथ पार्श्व और पृष्ठीय घटनाओं की एक साथ लाइव इमेजिंग करना संभव नहीं है। कई कोणों प्रकाश पत्रक चयनात्मक विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी (एसपीआईएम) माइक्रोस्कोपी को नियोजित करके डोरसोलेटरली और पृष्ठीय उन्मुख पिल्ले या बेहतर में अनुक्रमिक इमेजिंग करके इस मुद्दे को दूर किया जा सकता है। एक और दोष विश्लेषण (यानी, पॉलीप्लाइड एलईसी और डिप्लॉयड हिस्टोब्लास्ट) में विभिन्न आकारों की दो अलग-अलग सेल आबादी की उपस्थिति है। यह छवि विभाजन जटिल बना सकते हैं और दो सेल आबादी का अलग से विश्लेषण किया जाना चाहिए।

भविष्य में, ड्रोसोफिला पिल्ले की दीर्घकालिक इमेजिंग को आसानी से जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती स्थितियों में कायापलट के दौरान एपिडर्मल, पेशी और तंत्रिका विकास के समन्वय सहित मॉर्फोजेनेटिक घटनाओं की एक पूरी श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, उपयोग में एल्गोरिदम और प्लगइन्स को संगठन, पैटर्निंग और कई अन्य ऊतकों की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analysis Software	-	ImageJ	Analyzing data
Drosophila	Atpa::GFP	-	Strains employed for data collection
Drosophila	hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls	-	Strains employed for data collection
Dumont 5 Forceps	FST	11251-20	1.5 mm diameter for dissection
Glass Bottom Plates	Mat Tek	P35G-0.170-14-C	Mounting pupae for data collection
Halocarbon Oil 27	Sigma-Aldrich	9002-83-9	mounting pupae
Inverted Confocal microscope	Zeiss	LSM700	Data collection
Stereomicroscope	Leica	DFC365FX	Visualization of the pupae during dissection