Summary
Bu protokol, meyve sineği metamorfoza uğrarken Drosophila abdominal epitelde hücre oryantasyonu ve doku büyüme dinamiklerinin görüntülenmesi ve analizi için tasarlanmıştır. Burada açıklanan metodoloji Drosophila veya diğer model organizmalarda farklı gelişimsel aşamaların, dokuların ve hücre altı yapıların incelenmesine uygulanabilir.
Abstract
Çok hücreli organizmalar içinde, olgun doku lar ve organlar kurucu hücrelerinin mekansal düzenlemelerinde yüksek derecede düzen gösterirler. Dikkat çekici bir örnek duyusal epitel tarafından verilir, aynı veya farklı kimlikleri nhücreleri son derece organize düzlemsel desenler gösteren hücre-hücre adezyonu ile bir araya getirilir. Hücreler birbirlerine aynı yönde hizalanır ve büyük mesafelerde eşdeğer polarite görüntüler. Olgun epitelin bu organizasyonu morfogenez boyunca kurulmuştur. Olgun epitelin düzlemsel düzenlemesinin nasıl sağlandığını anlamak için, in vivo gelişimi sırasında hücre oryantasyonve büyüme dinamiklerini yüksek spatiotemporal sadakatle izlemek çok önemlidir. Yerelden küresele geçişleri tanımlamak ve tanımlamak için sağlam analitik araçlar da gereklidir. Drosophila pupa epitel morfogenez altında yatan yönelimli hücre şekli değişiklikleri değerlendirmek için ideal bir sistemdir. Pupal gelişen epitel hareketsiz vücudun dış yüzeyini oluşturur, bozulmamış hayvanların uzun süreli görüntülenmesi sağlar. Burada açıklanan protokol, büyüdükçe pupal abdominal epidermiste hem küresel hem de lokal düzeyde hücre davranışlarını görüntülemek ve analiz etmek için tasarlanmıştır. Açıklanan metodoloji, diğer gelişim evrelerinde, dokularda, hücre altı yapılarda veya model organizmalarda hücre davranışlarının görüntülenmesine kolayca adapte edilebilir.
Introduction
Rollerini başarmak için, epitel dokular tamamen hücresel bileşenlerinin mekansal organizasyon güveniyor. Epitelin çoğunda hücreler sadece kesin bir parke taşı tabakası oluşturmak için birbirlerine karşı paketlenmezler, aynı zamanda vücut eksenlerine göre kendilerini yönlendirirler.
Omurgalı iç kulak ve retina gibi duyusal epitelde hassas doku organizasyonunun fonksiyonel önemi açıktır. İlk durumda, saç ve destekleyici hücreler ses ve hareket1gibi mekanik girdileri verimli bir şekilde algılamak için belirli bir eksenel yönde hizalamak1 ,2. Benzer şekilde, fotoreseptör hücre mekansal organizasyonretina3 tarafından optimum optik özellikleri elde etmek için gereklidir. Hücre pozisyonu ve oryantasyonuz mekansal kontrolü böylece uygun fizyolojik fonksiyon için özel bir alaka olduğunu.
Drosophila, larva vücut yapılarının metamorfoz yoluyla tamamen dönüşümüne neden olan ve erişkin dokularına yol açan holometabolöz bir böcektir. Drosophila pupa dinamik olayların çeşitli noninvaziv canlı görüntüleme için mükemmel bir modeldir, gelişimsel hücre göçü dahil4, hücre bölünmesi ve büyüme dinamikleri5, kas kasılması6, hücre ölümü7, yara onarımı 8, ve hücre oryantasyonu9. Yetişkin Drosophilaolarak , dış epitel sipariş yüksek derecede gösterir. Bu kolayca trichomes düzenlemeleri gözlenir (yani, tek epitel hücrelerinden kaynaklanan hücre çıkıntıları) ve duyusal kıllar sinek vücut yüzeyinde10. Nitekim, trichomes paralel satırlar hava akımı11rehberlik hizalanır. Erişkin epitelinin morfogenezi ve tek tek hücrelerin düzenli düzenlenmesi embriyogenez sırasında başlar ve pupal evrelerinde doruğa ulaşır. Embriyolarda hücre bölünmeleri, intercalations, ve şekil değişiklikleri tüm doku düzeni azaltmakiken 12,13, Bu gelişmenin daha sonraki aşamalarında geri, özellikle pupal aşamalarında, sinek olgunluğa yaklaştığında9.
Hareketsiz Drosophila pupa hücre şekli ve oryantasyon değişiklikleri değerlendirmek için ideal bir sistem sağlar. Pupal abdominal epidermis özel avantajlar sunar. Yetişkin baş öncüleri, toraks, genital, ve uzantıları büyümek ve larva aşamalarından desenli olsun iken, larva epidermis entegre histoblastlar, büyüyen başlar ve sadece pupariation farklılaşma14. Bu özellik, doku düzeninin kurulmasında rol oynayan tüm spatiotemporal olayların tümünün izlenmesine olanak sağlar9.
Histoblastlar her varsayımsal abdominal segmentte kontralateral pozisyonlarda embriyonik gelişim sırasında belirtilir. Erişkin dorsal abdominal epidermis dorsolaterally anterior ve posterior bölmeleri mevcut histoblast yuvaları bulunan türetilmiştir15,16. Histoblastlar genişledikçe, larva epitel hücreleri (LECs) yerine, konfluent levha oluşturan dorsal orta hat kontralateral yuvaları sigorta17,18,19,20.
Bu çalışma 1) Drosophila pupa diseksiyon, montaj ve uzun vadeli canlı görüntüleme için bir metodoloji açıklar, ve 2) yüksek spatiotemporal çözünürlükte hücresel oryantasyon ve büyüme dinamiklerini incelemek için analitik yöntemler. Burada, ilk pupa hazırlığından (evreleme ve görüntüleme) yönlülük ve oryantasyon özelliklerinin çıkarılması ve ölçülmesi için gerekli tüm adımları kapsayan ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır. Ayrıca hücre klonları analizinden yerel doku özelliklerini nasıl çıkarabileceğimizi de açıklıyoruz. Açıklanan tüm adımlar minimal invazivdir ve uzun süreli canlı analizlere olanak sağlar. Burada açıklanan yöntemler kolayca adapte edilebilir ve diğer gelişim evrelerine, dokulara veya model organizmalara uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokol beş adıma ayrılır: (1) pupanın evreleme, (2) pupanın görüntüleme için hazırlanması, (3) büyüyen abdominal epitelin canlı görüntülemesi, (4) genetik mozaik lerin üretimi, (5) veri işleme ve analizi (hücre kavşağı anahatlarından hücre oryantasyon dinamiklerinin nasıl analiz edilebildiğini açıklayan bölümler ve hücre klonlarından büyüme dinamikleri dahil).
1. Görüntüleme öncesi Drosophila pupa evreleme
- Kültür, 25 °C'de 25 °C'de standart ortamda uygun genotipten 5 gün (±12 saat) sonra yumurta yumurtladıktan (AEL) uçar.
NOT: Metamorfoz, puparium oluşumundan sonra 0 saate kadar 120 h AEL'de pupal kasaya üçüncü instar larvalarının hapsedilmesi nde başlar. Larvalar beslenmeyi ve hareket etmeyi bıraktığından ve operküler bölge 0-12 h APF'de(Şekil 1A)oluştuğu ndan, bu geçiş kolayca tanımlanabilir. Puparium başlangıçta yumuşak ve beyaz, ama giderek sertleşir ve tans. - Beyaz prepupae 'yi (0 saat APF) nemli bir fırça kullanarak taze plastik şişeye aktarın. Hayvanlar istenilen yaşa kadar tasarlanan deneye bağlı olarak farklı sıcaklıklarda tutulabilir.
NOT: Pupa oluşumu (yani, yavrulama) 12 saat APF oluşur, ne zaman baş ve yetişkin sinek uzantıları tamamen everted(Şekil 1A). Bu zamana kadar pupal durumda tamamen pupa ayrılır, tam kaldırılmasına izin (Şekil 1A).
2. Canlı görüntüleme için pupa hazırlanması
NOT: Evrelemeden sonra, pupa lar aşağıda açıklandığı gibi kesilir ve monte edilir (ayrıca bkz. Şekil 1).
- Forceps yardımı ile şişe duvarından sahnelenmiş pupa çıkarın.
- Çift taraflı yapışkan bant ile kaplı bir cam slayt üzerinde her pupa ventral tarafı tutkal. Pupanın uçları yla birlikte pupanın baş spiracles'lerine (yani operküler bölge) ve sırt yüzeyine hafifçe dokunun ve pupal kasanın banda yapışmasını sağlar(Şekil 1A,B).
NOT: Sırt yüzeyi, kılıfın diseksiyonunu ve pupanın iyileşmesini kolaylaştırmak için yukarı yaslanmalıdır. - Operkülonu puparium'dan forceplerle hafifçe çıkararak stereomikroskop altında diseksiyonun başlamasına başlanır(Şekil 1C).
- Operküler açıklık yoluyla pupal durumda ve pupa yüzeyi arasında sığ bir açıda forceps bir ucu yerleştirin. Bir veya daha fazla salıncakta kılıfı baş lardan kuyrağa yırtarak pupanın kıstırılmasından kaçının (Şekil 1D). Arka uça doğru ilerlerken çatlak pupal kılıfı lateral kenarlara katlayın (Şekil 1E).
NOT: Pupal kasa oldukça serttir ve kolayca çatlar. Yüksek nem veya özellikle genotypik arka planlar durumunda, pupal durumda daha yumuşak olur ve yırtılma daha zordur. Bu gibi durumlarda, pupal durumda çatlama forseps her iki ucu ile serbest kenarları dikme ile yardımcı olabilir. - Pupayı hayvanın altına dikkatlice sokarak ve yavaşça yukarı çekerek açılan pupal kılıftan çıkarın (Şekil 1F). Pupa, çerterlerin ucuna yapışır (Şekil 1G−H).
- Pupayı bir cam alt çanağa geçirin ve küçük bir damla gaz geçirilmez halokarbon yağının üzerine yatırın(Şekil 1I). Olası doku hasarını önlemek için pupayı ventral tarafta hafifçe tutun.
NOT: Halokarbon yağının düşmesi, çapı pupanın yaklaşık yarısından daha az olan küçük olmalıdır. Bu miktar kılcal lık ile cama pupa yapıştırmak ve yağ daldırma hedefleri için optik düzeltmek için yeterlidir. - Nemi korumak için yemeğin kenarlarına ıslak mendil kağıdı bir parça rulo. Görüntüleme sırasında pupa dehidratasyon önlemek için çanak kapağı.
NOT: Görüntüleme için hem kadın hem de erkek pupa kullanılabilir. Boyut, şekil ve desenleme açısından her iki cinste de hemen hemen aynı olduğundan, üçüncü karın segmentlerinin (AIII) referans olarak abdominal metamere olarak çalıştırManızı öneririz.
3. Büyüyen abdominal epitelin canlı görüntülemesi
NOT: Farklı gelişim evrelerinde pupaların görüntülenebilmek için 40x/1.3 NA yağ daldırma hedefi ile donatılmış ters lazer tarama konfokal mikroskobu kullanıldı.
- Diyatal ve değerlendirilecek sürece göre cam alt çanak üzerinde yağ damla üzerinde pupa Orient (örneğin dorsal dorsal dorsal dorsal dorsal yuvalarıerken genişleme uzun vadeli canlı görüntüleme için, ya da dorsally onların geç genişleme ve doku remodeling görüntü). Bkz. Şekil 1J,K ve Şekil 4.
- Monte edilmiş pupa içeren cam dipli kabı mikroskop aşamasına aktarın ve iletilen ışığı kullanarak karın bölgesinin yüzeyine odaklanın.
NOT: Bu protokol ters mikroskoplarda görüntüleme için optimize edilmiş olsa bile, dik bir mikroskop üzerinde görüntüleme yapmak da mümkündür. Bu durumda, örnek cam alt yüzeyi yukarı bakacak şekilde mikroskop aşamasına yerleştirilir. Halokarbon yağı her pupayı bir menisküs üzerinde tutar. - Kazanım parametrelerini ayarlayın: 1) Z-dilimlerinin sayısı genellikle 20−40 arasında dır ve abdominal epidermisin uygun iki boyutlu (2D) rekonstrüksiyonuna izin verir; 2) her dilim (örneğin, 1 mikron) arasında adım boyutu; 3) kayıt için zaman aralığı (5 dk aralık hücre oryantasyon dinamikleri yüksek sadakat analizleri için uygundur); ve 4) kare çözünürlüğü (örn. 1024 x 1024).
- Uygun lazerleri açın (sırasıyla GFP ve RFP florofororları görselleştirmek için 488 nm ve 561 nm) ve işaretli hücreleri görselleştirmek için lazer gücünü ve kazanç/ofset ayarlarını ayarlayın. Mümkün olan en düşük lazer gücünü kullanın (%5−%20 aralığında) fotobeyaztlama ve fototoksisiteyi en aza indirmek için.
- Bağlı motorlu sahne ve mikroskop çok pozisyonlu satın alma yazılımı kullanarak birden fazla pupa için pozisyonu ve uygun Z-stack limitlerini manuel olarak ayarlayın.
4. Hücre klonların davranışlarını takip etmek için genetik mozaiklerin üretimi
NOT: Abdominal epitelde genetik mozaikleri bölgeye özgü rekombinasyon yoluyla indüklemek için mitotik rekombinasyon kullanırız (FLP/FRT sistemi21,22) (Şekil 2).
- Belirli bir genomik konumda bir FLP tanıma hedefi (FRT) bölgesi olan ısı şokuna neden olan Flippase transgeni (hs-FLP) taşıyan çapraz bakire dişiler (örn. Kromozom 2'nin L kolunda ki 40A pozisyonundaki FRT bölgesi ve FRT bölgesine eşdeğer genomik konumda FRT alanı taşıyan mutant erkeklere(Şekil 2A−C)tanınabilir bir hücresel belirteç (örneğin, Ubi-RFP.nls veya Ubi-GFP.nls) distal.
NOT: Herhangi bir gen fonksiyon kaybı için klonların içinde veya dışında otonom olmayan etkiler FRT bölgesine özgü resesif aleller intihal olarak incelenebilir. - Haç ın soyundan üçüncü instar larva aşamasında ısı şoku tedavisi ile histoblastlarda FLP/FRT somatik klonlar oluşturun. Bu, 37 °C'de bir su banyosunda hayvanları içeren plastik şişelerin 45 dakika ile 1 saat arasında gezici larva (LIII) evresinde batırılarak yapılır.
NOT: Mitotik rekombinasyon için hassas dönem hücre döngüsünün G2 fazıdır. Histoblastlar g2'de tüm larva gelişimi sırasında tutuklanır. - 16 saat APF'den itibaren floresan protein belirteci seviyelerinin yokluk (yani mutant hücreler) veya geliştirilmiş (yani, yabani tip çift noktalı hücreler) seviyelerini 16 saat APF'den itibaren puanlamak(Şekil 2D).
NOT: Ortalama olarak, 37 °C'de 45 dk ile 1 saat arasında, ilgi çeken bölgelere göre yaklaşık olarak sadece 2−3 ikiz klon (örn. abdominal hemisegment) meydana getirir. Çok yüksek klon yoğunluğu gösteren pupalar (örneğin, hemisegment başına dörtten fazla ikiz klon) daha fazla kantitatif analizden atılmalıdır. - Klon tanımlaması üzerine, bir önceki bölümde açıklandığı gibi istenilen aşamada ve istenilen süre boyunca pupa görüntü canlı.
5. Veri işleme ve analizleri
NOT: Veriler ImageJ (imagej.nih.gov/ij/) kullanılarak işlenir.
- Hücre yön dinamiği nin hücre birleşme anahatlarından ayırt edin.
- ImageJ'in Maksimum Yoğunluk Projeksiyonu (MIP) işlevini kullanarak konfokal mikroskopi ile elde edilen Z-yığın dilimlerini 2B olarak yansıtın.
NOT: Epidermisin altında devriye gezen makrofajların ürettiği odak gürültüsünden kaçınmak için yığın başına dilim sayısı minimumda tutulmalıdır. - Her veri kümesinin analizi için güvenilir doku simgelerini (örn. A/P bölme sınırları) tanımlayan düzlemsel bir koordinat sistemi ayarlayın(Şekil 3A).
NOT: Her veri kümesi için aynı düzlemsel başvuruların çalıştırılması, birden çok ölçümün karşılaştırılmasına olanak sağlar. - Nitel ve nicel yönlendirme değerlerini elde etmek için yerel hücre kenarlarında ImageJ23,24'ün OrientationJ eklentisini (bigwww.epfl.ch/demo/orientation/) kullanın. Eklenti, giriş görüntülerinde yerel yönlendirmelere dayalı renk kodlu bindirmeler işler ve nicel modda kullanıldığında sayısal değerler sağlar(Şekil 3B−B'' ve Şekil C−C''').
NOT: OrientationJ eklentisi yapı tensörleri, degrade ve yön türevlerinden türetilen 2 x 2 matris iigenvalues dayanmaktadır (Ayrıntılı bir açıklama içinreferanslar 23,24 bakınız). - Belirlenen düzlemsel koordinat sistemine göre hücre kenar yönlendirmelerini renk kodulandırmak için OrientationJ Dağıtım seçeneğini kullanın (örn. hücre kenarı yönlendirme haritaları)(Şekil 3B). Dağıtım seçeneği ImageJ'deki eklenti menüsünün altında bulunur. Kullanmak için ayarlar şunlardır: Gaussian pencere sigma = 1 piksel; Kübik Spline = Gradyan; Minimum Tutarlılık = %20; Minimum Enerji = %1. Hücre kenar yönlendirmeleri, eklentinin Renk Anketi seçeneğini kullanan renk kodlu bir görüntü olarak görüntülenir (Hue = yönlendirme; Doygunluk = tutarlılık; ve Parlaklık = giriş görüntüsü).
NOT: Arka plan floresaniçeren alanlar herhangi bir yön bilgisi sağlamaz ve analizin el ile dışlanmalıdır. Yüksek eşik ayarları, işlenen görüntülerde düşünülen pikselleri azaltır. - Hücresel oryantasyonları ve yönlü hücre-hücre hizasını (yani tutarlılık) ölçmek için OrientationJ Ölçümü seçeneğini kullanın (Şekil 3C). Ölçüle seçeneği ImageJ'deki eklenti menüsünün altında bulunur. Histoblastların işgal ettiği alanda tek tip ağırlıkta (64 x 64 piksel, yaklaşık 20 μm x 20 m) küçük bitişik çakışmayan, örtüşen olmayan bölgeler (ROI) oluşturun (Şekil 3C).
- Baskın yerel yönünü (örneğin, komşu hücrelerin ortalama hücre kenarı yönlendirme haritası arasındaki ortalama yönelimi) ve ROI'ların tutarlılığını hesaplayın. Yazılım, her yG içinde baskın yönlendirme ve yerel tutarlılık(Şekil 3C)bilgisayardır.
NOT: OrientationJ tarafından tahmin edilen yapı tensorunun en büyük ve en küçük özdeğerleri, aralarındaki fark ile toplamı arasındaki oran olarak tutarlılığı hesaplamak için kullanılır. Tutarlılık 0−1 değerleri arasında sınırlanır. 1 değeri tam hizalama tekdüzeliğini gösterirken, 0 değeri hizalama olmayan isotropik alanları gösterir. - GEÇMIŞ25gibi özgür yazılım paketlerini kullanarak birden fazla görüntüden hesaplanan yönlendirme ve tutarlılık değerlerini istatistiksel olarak analiz edin. Yönlendirme değerleri (derece olarak) gibi eksenel veriler yön istatistikleri ile uygun şekilde tanımlanır.
- Yazılım aracılığıyla, her bir yönlendirme dağılımı kümesi için ortalama yönü ve dairesel varyansı hesaplayın. Farklı genotipler veya koşullar arasındaki oryantasyonların dağılımı arasındaki farkın istatistiksel önemi, eşit dağılımlar için parametrik olmayan Mardia-Watson-Wheeler testi (W-testi) kullanılarak belirlenir.
- Parametrik olmayan Kolmogorov-Smirnov testini (K-S testi) uygulayarak tutarlılık farkının istatistiksel önemini hesaplayın. Verileri istenilen şekilde grafikolarak görüntüleyin (kutup çizimleri, çubuk grafikler, kutu çizimleri, vb.).
- ImageJ'in Maksimum Yoğunluk Projeksiyonu (MIP) işlevini kullanarak konfokal mikroskopi ile elde edilen Z-yığın dilimlerini 2B olarak yansıtın.
- Hücre klonlarından büyüme dinamikleri
NOT: Aşağıdaki adımlar, ilgi çeken klonu içeren 2B MIP görüntülerinden hücreler için geometrik ve şekil parametrelerinin alınmasına olanak sağlar. Birden çok klon arasındaki karşılaştırmalar için, görüntüler aynı ayarlarla elde edilmelidir.- ImageJ Freehand Selection aracıyla konturlarını çizerek klon alanlarını segmentleyin.
- Analiz menüsü altındaki ImageJ'in Ölçümleri Ayarla aracını kullanarak geometrik ve şekil parametrelerini hesaplayın. Alanı, Çevreyi, Elipse Sığdır'ıve Şekil Tanımlayıcı seçeneklerini etkinleştirin.
NOT: Bu alan (klon içindeki piksellerin toplamı), çevre (klon kenarlığı piksel toplamı), en boy oranı (AR, klon sınırına kazınmış en uygun Legendre elipsin in major ve minör eksenleri arasındaki oran) ve sınır açısı (yani, anteroposterigöre klona göre klonun ana ekseninin açısı) dahil olmak üzere çeşitli geometrik parametrelerin alınmasını sağlayacaktır. - Bu ölçümlerden boyutsal olmayan oranların hesaplanması şekil parametrelerini alır. Bunlar arasında yuvarlaklık (4 x [alan]/π x [ana eksen]2),pürüzlülük (sağlamlık - alan/konveks alanı) ve dairesellik (4π x [alan]/[çevre]2)sayılabilir.
NOT: Şekil parametrelerinin her biri, klonların bir daire veya sınırlı konveks gövdesi gibi ideal şekillerden sapma derecesini temsil eder ve bunların hepsi 0 ve 1 değerleri arasında sınırlanır. 1'e eşit değerler maksimum simetriyi (yani minimal karmaşıklığı) gösterir. - Microsoft Excel ve/veya PAST kullanarak farklı genotipler veya koşullar arasındaki geometrik ve şekil parametrelerini istatistiksel olarak analiz edin. Farkın istatistiksel önemi, eşit ortalama için eşleşmemiş iki kuyruklu öğrencinin t-testi veya koşullar arasında eşit dağılımlar için parametrik olmayan Kolmogorov-Smirnov K-S-testi kullanılarak belirlenir. Veriler istenilen şekilde grafiksel olarak görüntülenebilir (örn. çubuk grafikler, kutu çizimleri, vb.). Bkz. Şekil 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan protokol, Drosophila pupasının uzun süreli canlı görüntüleme için hazırlanmasını ve karın epidermisinin hücre oryantasyon ve büyüme dinamiklerinin analizini kapsamaktadır. Bu metodolojiyi uygulayarak, gelişmekte olan pupanın yüksek çözünürlüklü filmlerini, önemli bir fotobeyazrlama veya fototoksisite olmaksızın 48 saate kadar çıkarmak mümkündür. Karın epidermisini (örneğin histoblastlar ve LED'ler) farklı zaman noktalarında ve farklı açılardan pupa yönelimli pupalardan gösteren enstantaneler Şekil 4'tegösterilmiştir. Bu filmlerin sonraki analizi, histoblastların genişlemesi ve LED'lerin değiştirilmesi sırasında modüle edilen ana geometrik ve şekil parametrelerindeki yerel ve küresel değişikliklerin dinamiklerinin tanımlanmasına ve ölçülmesine olanak sağlar. Bu analizler farklı senaryolarda ve belirli mutant arka planlarda yapılabilir. Ayrıca gen ekspresyonunun değiştirildiği klonlar için de kullanılabilirler, bu da otonom kayıplara veya fonksiyon koşullarının kazanılmasına yol açabilir. Bu, çevredeki hücrelerde otonom olmayan tepkilerin araştırılmasına olanak sağlayarak çapraz konuşma veya hücre iletişim mekanizmalarının tanımlanmasını kolaylaştıracaktır(Şekil 5). Bu yaklaşım son zamanlarda fat / Dachsous / Dört eklemli yolun belirlenmesinde önemli bir unsur yönlendiren ve yetişkin abdominal epidermisin düzlemsel polar desen dağıtılması sırasında hücre hizalama yönlendirme olarak istihdam edilmiştir9.
Şekil 1: Canlı görüntüleme için pupanın kesilmesi ve montajı. (A) Soldan sağa: 0 h APF (solda) ve bir pupa 14 h APF önce (orta) ve sonra (sağ) opak pupal durumda kaldırılması bir prepupa dorsal görünümü. Operküler bölge (beyaz ok başları) gösterilir. (B) Diseksiyon için gerekli araç seti gösterilir. Soldan sağa: cam slayt, çift taraflı yapışkan bant, bir çift çifonluk ve cam alt çanak. (C) Sahnelenen pupa, cam kaydıraklar dorsal tarafında çift taraflı yapışkan bant üzerinde hareketsiz hale getirilir. Her pupanın pupal olgusu cerrahi forcepile operküler bölgeden açılır. (D−E) Pupal kılıfın soyulması aşamalıdır. Olgu yırtılmış ve karın baş pupal yanlara katlanmış. (F−H) Pupa hafifçe forseps uçları ile ventral taraftan kaldırılır(G) ve halokarbon yağı en az bir damla üzerinde cam alt çanak aktarılır. (I) Pupa daha sonra uygun (dorsolaterally, üst; dorsally, alt) odaklıdır. C −I. (J) AIII segmentinin dorsal histoblast yuvasının hücrelerinin ana hatlarını gösteren ve kavşak belirteci Atpα::GFP'yi ifade eden görüntü. Pupa dorsolaterally odaklı ve 14 h APF görüntülendi. Ölçek çubuğu = 22 μm. (K) Görüntü eşdeğer (J) ama bir dorsal bakış açısından. Doku gelişimi dinamikleri birkaç saat için görselleştirilmiş olabilir. Ayrıca bkz. Şekil 4. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: FLP/FRT sistemi ile genetik mozaik üretimi. (A) Bir ebeveyn heterozigot hücre (soluk macenta) bir kromozom kolunda çekinik mutant alel (kesikli dikdörtgen) ve diğer kromozom kolunda bir floresan belirteç (macenta) için kodlayan bir gen taşır [bu örnekte kromozom 2 (2L) sol kolu]. FRT siteleri (turuncu dikdörtgenler) her iki kolda da sentromere (gri oval) yakın aynı kromozom pozisyonlarında tasarlanır. (B) FlP rekombinazın G2'de duraklatılmış hücrelerde ısı şoku ile aktivasyonu kardeş kromatitlerin 1-1' ve 2-2'lik FRT'leri arasında rekombinasyona yol açar. Sonuç olarak, FRT sitelerine (FRT40A on 2L) bölge distal değiştirilir. Sağ panelde büyütülmüş bir görünüm gösterilir. (C) Mitoz sırasında yeniden düzenlenmiş bölgelerin (1-1' ve 2-2') kutupsal ayrımı üzerine genetik olarak farklı iki kardeş hücre oluşturulur. Bir kız resesif alel için homozigot ve rekombinasyon bölgesine tüm kromozom kol distal için. Bu hücre, negatif olarak beyaz olarak işaretlenmiş floresan belirteci kodlayan genden yoksun. Diğer kız hücre vahşi tip kol için homozigot olacak, bir ikiz nokta yol açan ve floresan marker için kodlama genlerin iki kopyasını ifade (koyu macenta). Basitlik için, yeniden düzenlenmiş bölgelerin mitotik hücrenin zıt kutuplarına (yani 1−2 ve 1'−2') ayrıştırılması gösterilmez. Bunlar, ebeveyn hücresinden (heterozigot arka plan, soluk macenta) fenotipik olarak ayırt edilemeyen hücrelere yol açar. (D) Üçüncü instar larva aşamasında FLP/FRT somatik rekombinasyonu ile oluşturulan ve 26 saat APF'de görselleştirilen A bölmesindeki klonları gösteren görüntü. Hücrelerin klonları rfp.nls yokluğu ile işaretlenir (siyah) ve RFP.nls homozigot ifade (parlak macenta, ikiz noktalar) başka bir heterozigot RFP.nls arka plan (dim macenta). Diğer kromozomal konumlarda (2R, 3L, 3R ve X) bulunan FRT siteleri için eşdeğer olaylar elde edilebilir. Ayrıca bkz. Şekil 5. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Hücre oryantasyon ölçümlerinin çizimi. Hücre yönelimleri hakkında bilgi almak için, önce hücre yönelimini doku ekseni ile ilişkilendirecek düzlemsel koordinat sistemi(A)olarak ayarlanır. İkinci olarak, hücre yönelimleri hücre anahatlarından çıkarılır (B). Son olarak, hücre oryantasyonları ve doku ekseni ile hizalamalar ölçülür (C). (A) Solda, düzlemsel koordinat sistemine göre bir pupa nın yanal görünümünün diyagramı. Kırmızı katı ve siyan kesik çizgileri, anteroposterior (A/P) sınırını ve dorsal orta hattı temsil eden Kartezyen düzlemini tanımlar. Ortada, genişleyen histoblastların 26 saat APF'de dorsolateral görünümünü gösteren ters bir görüntü, kavşak belirteci Atpα::GFP (giriş görüntüsü) tarafından özetlenmiştir. A/P sınırının konumu kırmızı bir çizgiyle vurgulanır. Sağda, hücre kenar ı yönelimlerini (çokgenler) veya ortalama hücre yönelimlerini (çubuklar) tanımlamak için uygulanan renk kodunu gösteren eksenel bir pusula. (B) Eklentilerin/OrientationJ menüsünün ve OrientationJ Dağıtım penceresinin görüntülenmesi. (B') Sağdaki hücre kenarı yönlendirme eşlemi elde etmek için kullanılan parametrelerin ayarlarını gösteren OrientationJ Dağıtım penceresinin görüntülenmesi. (B'') İdealleştirilmiş hücrelerüzerinde renk kodlu hücre anahatlarının çizimi. Daire, tercih edilen renk göstermez. (C) YönlenJ Ölçümü penceresinin görüntülenmesi. (C') OrientationJ Measure penceresinin sıralı ekran görüntüleri, tek düze ağırlıktaki art arda ROI'larda yerel oryantasyon ve tutarlılığın nasıl ölçüleceklerini gösterir. Her bölge için yerel oryantasyon açısı ve tutarlılık elipsoid olarak görüntülenir. (C'') Oryantasyon ölçümünün nihai sonuçlarının temsili. Elipsoidler, a/p sınırına göre elipsoidin en uzun ekseninin açısını ve tutarlılığı (yani elipsoidin en uzun ve kısa ekseni arasındaki oranı) görsel olarak görüntülerler. Her iki parametrenin sayısal değerleri daha fazla analiz için bir elektronik tabloya kaydedilir. (C''') İdealleştirilmiş hücrelerde renk kodlu hücre anahatları ve ortalama hücre yönlendirmesi (çubuklar) çizimi. Bir daire tercih edilen yönlendirmeyi göstermez. (C'''') Her YG'nin tercih edilen yerel yönünün temsili (yerel ortalama oryantasyon haritası). Renkler her bölgenin yönünü vurgular. Ön sola. Ölçek çubuğu = 22 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Büyüyen abdominal epitelin uzun süreli canlı görüntülemesi. (A) Histoblast genişlemesinin erken evrelerinden geç evrelerine kadar uzun süreli görüntüleme filmlerinden temsili anlık görüntüler. Üst: 16 saat ve 26 h APF dorsolateral görüntüleme odaklı bir pupa şematik görünümleri. Pupanın dorsolateral tarafından görülebilen yuvaların işgal ettiği bölge 16 ve 26 saat APF'de koyu gri renkle vurgulanır. Alt: Hem histoblastlardan hem de kavşak belirteci Atpα::GFP'nin her yerde bulunan ifadesiyle etiketlenmiş HÜCRE anahatlarını gösteren görüntüler. A/P sınırı, vurgulanan iki bölmenin arasında yer alır (Mavi deki sahte renkli hücreler = ön bölme; yeşil = posterior bölmeler). (B) Yuvaların erken evrelerinden geç evrelerine kadar uzun süreli görüntüleme filmlerinden temsili anlık görüntüler. Üst: 32 saat ve 48 h APF dorsal görüntüleme odaklı bir pupa şematik görünümü. Alt: Hücre anahatları (Etiketli ve A gibi renkli). Atpα::GFP işaretçisinin zaman içinde yüksek çözünürlükte tek tek epitel hücrelerinin şeklinin belirtilmesine olanak sağladığını unutmayın. Ölçek çubuğu = 22 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Klonal analizden elde edilen doku özellikleri. (A) RFP.nls (siyah) ve ikiz noktaları (parlak macenta) 26 h APF yokluğu ile işaretlenmiş A bölmesinde yabani tip klonlar örnekleri. Klonlar segmental sınırlar boyunca elongate. İkiz klonlar paralel veya birlikte düzenlerler. Ölçek çubuğu = 22 μm. (B) Üst: Klon anahatlarında ölçülen parametreleri gösteren görüntüler. Alt: Yabani hayvanlar için belirtilen parametrelerin ortalama değerlerini bildiren özet tablosu (n = 29). (C) 26 saat (sol) ve 47 saat (sağ) APF'de yabani tip bir klonun morfolojisi. Klon her iki aşamada karmaşık sınır morfolojisi gösterir. (D) 26 saat (açık sarı) ve 47 saat APF (koyu sarı) geometrik parametreler için kutu ve bıyık çizimleri. Bu zaman diliminde ortalama alan ve çevre önemli ölçüde artar. (E) Klonların yönünü temsil eden kutup çizimleri (depo gözü boyutu 18°, alanla orantılı bolluk). Oryantasyon genişleme ve yeniden şekillendirme sırasında sürdürülür. (F) Şekil parametreleri için 26 saat (açık sarı) ve 47 saat APF (koyu sarı) kutu ve bıyık çizimleri. Pürüzlülük (sağlamlık), yuvarlaklık ve dairesellik ancak değişir. Ortanca değerler kırmızı yatay bir çizgi ile gösterilir ve bıyıklar dağılımın minimum ve maksimum değerlerine kadar uzanır. İstatistikler K-SM testi veya W-testleri ile gerçekleştirildi (p < 0.0001****, p > 0.05 anlamlı değil). Ön sola, dorsal yukarı. Ölçek çubuğu = 16 μm. Genotip hsflp1.22olduğunu; FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uzun menzilli düzen en fonksiyonel fizyolojik birimlerin temel bir özelliğidir. Morfogenez sırasında, yüksek zamansal ve mekansal hassasiyetle uygulanan karmaşık talimatların entegrasyonu ile düzen elde edilir. Çoklu ve çok düzeyli konsuşlar stereotipli doku düzenlemelerine entegre edilmiştir.
Polarite ve yönlülük gelişim sırasında düzenli mekansal düzenleme için çok önemlidir. Polarite gelişme sırasında simetri kırılması anlamına gelir. Embriyonik anteroposterior (A/P) ve dorsoventral (D/V) eksenlerinin ve yetişkin organizasyonunun belirlenmesi için asimetri nin sağlanması gereklidir26. Bu erken rolün ötesinde, her düzeyde ki morfolojik çeşitlilik için yerel asimetriler gereklidir. Yönlülük morfogenez sırasında asimetri ve polaritenin önemli bir tamamlayıcısıdır. Küresel düzen, hücrelerin sinyalleri kesin bir duyu veya yönlendirme ile hücreden hücreye bir bazda yerel olarak algılama ve iletme yeteneği ile uygulanır. Tek hücre asimetrileri uzaydaki belirli yönlerde konumları veya hareketleri yönlendirerek zaman içinde işbirliği içinde uyumlu hale. Hücre iletişimi salgılanan faktörleri, hücre hücre kontalarını ve mekanik girişleri ima eder. Sinyaller, önce yerel olarak ve daha sonra genel olarak davranışlarını değiştiren hücre alanlarında hareket eder27.
Bu çalışma, doku düzeninin gelişimi sırasında düzlemsel oryantasyon ve büyüme parametreleri de dahil olmak üzere, bireysel hücrelerin koordine davranışlarını analiz etmek için basit bir yol sunar. Pupasyon sırasında Drosophila yetişkin karın morfogenezi mikrop bant uzantısı / retraksiyon28 veya dorsal kapatma29 sinek embriyogenez sırasında, Drosophila kanat morfogenez ex vivo30, Caenorhabditisgans31 ventral muhafaza gibi diğer eşdeğer modeller üzerinde teknik avantajlar bir dizi sunuyor31, fareler de paletal füzyon32,diğerleri arasında.
İlk olarak, karın morfogenezinin bütünüyle izlenebilecek bir süreç tir. Led'lerin histoblastlar tarafından değiştirilmesinin sürekli canlı görüntülemesi, pupa oluştuğunda yetişkin epitel morfingenezinin tamamlanmasına kadar 12 saat APF'den yapılabilir. İkinci olarak, hücre geçişi, bölme, şekil değişiklikleri, delaminasyon ve intercalation gibi hücre davranışlarının tam bir kümesinin analizedilmesine olanak sağlar. Son olarak, genetik girişim ve klonal analiz için münasiptir. Kayıp ve fonksiyon kazancı nın otonom ve özerk olmayan etkileri, uygun belirteçler çalıştırılarak canlı olarak izlenebilir. Ancak, bir model sistemi olarak pupa bazı küçük sınırlamalar sunar. Oval şekli nedeniyle, yüksek çözünürlükte lateral ve dorsal olayların eşzamanlı canlı görüntülenmesi mümkün değildir. Bu sorun, birden fazla açı ışık levhaseçici düzlem aydınlatma mikroskopisi (SPIM) mikroskopisi ile dorsolaterally ve dorsesel odaklı pupa veya daha iyi sıralı görüntüleme gerçekleştirerek aşılabilir. Başka bir dezavantajı analizlerde farklı boyutlarda iki farklı hücre popülasyonlarının varlığıdır (yani, poliploid LECs ve diploid histoblastlar). Bu görüntü segmentasyon karmaşık yapabilir ve iki hücre popülasyonları ayrı ayrı analiz edilmelidir.
Gelecekte, Drosophila pupa uzun vadeli görüntüleme kolayca yabani tip ve mutant koşullarda metamorfoz sırasında epidermal, kas ve nöral gelişim koordinasyonu da dahil olmak üzere morfogenetik olayların tam bir dizi çalışma için adapte edilebilir. Ayrıca, kullanılan algoritmalar ve eklentiler organizasyon, desenleme ve diğer birçok doku dinamikleri incelemek için istihdam edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yok.
Acknowledgments
Martín-Blanco laboratuvarı üyelerine yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Ayrıca Nic Tapon (Crick Enstitüsü, Londra, İngiltere), Bloomington Stock Center (University of Indiana, ABD) ve FlyBase (Drosophila gen ek gösterimi için) teşekkür ederiz. Federica Mangione JAE-CSIC doktora öncesi bursu ile desteklendi. Martín-Blanco laboratuvarı Programa Estatal de Fomento de la Investigación Científica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P ve BFU2017-82876-P) ve Fundación Ramón Areces tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis Software | - | ImageJ | Analyzing data |
| Drosophila | Atpa::GFP | - | Strains employed for data collection |
| Drosophila | hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | - | Strains employed for data collection |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter for dissection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting pupae for data collection |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | mounting pupae |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Data collection |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the pupae during dissection |
References
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Deans, M. R. A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae. Seminars in Cellular and Developmental Biology. 24, 490-498 (2013).
- Stell, W. K. The structure and morphologic relations of rods and cones in the retina of the spiny dogfish, Squalus. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Comparative Physiology. 42, 141-151 (1972).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bosveld, F., et al. Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway. Science. 336, 724-727 (2012).
- Puah, W. C., Wasser, M. Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis. Methods. 96, 103-117 (2016).
- Teng, X., Qin, L., Le Borgne, R., Toyama, Y. Remodeling of adhesion and modulation of mechanical tensile forces during apoptosis in Drosophila epithelium. Development. 144, 95-105 (2017).
- Weavers, H., et al. Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient. Current Biology. 26, 1975-1989 (2016).
- Mangione, F., Martin-Blanco, E. The Dachsous/Fat/Four-Jointed Pathway Directs the Uniform Axial Orientation of Epithelial Cells in the Drosophila Abdomen. Cell Reports. 25, 2836-2850 (2018).
- Casal, J., Struhl, G., Lawrence, P. A. Developmental compartments and planar polarity in Drosophila. Current Biology. 12, 1189-1198 (2002).
- Wootton, R.
- Zallen, J. A., Wieschaus, E. Patterned gene expression directs bipolar planar polarity in Drosophila. Developmental Cell. 6, 343-355 (2004).
- Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epithelia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. Journal of Morphology. 59, 351-399 (1936).
- Mandaravally Madhavan, M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 183, 269-305 (1977).
- Kornberg, T. Compartments in the abdomen of Drosophila and the role of the engrailed locus. Developmental Biology. 86, 363-372 (1981).
- Garcia-Bellido, A., Merriam, J. R. Clonal parameters of tergite development in Drosophila. Developmental Biology. 26, 264-276 (1971).
- Roseland, C. R., Schneiderman, H. A. Regulation and metamorphosis of the abdominal histoblasts of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 186, 235-265 (1979).
- Madhavan, M. M., Madhavan, K. Morphogenesis of the epidermis of adult abdomen of Drosophila. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 60, 1-31 (1980).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Fonck, E., et al. Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries. Stroke. 40, 2552-2556 (2009).
- Rezakhaniha, R., Fonck, E., Genoud, C., Stergiopulos, N. Role of elastin anisotropy in structural strain energy functions of arterial tissue. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 10, 599-611 (2011).
- Hammer, Ø, Harper, D. A., Ryan, P. D. PAST: paleontological statistics software package for education and data analysis. Palaeontologia electronica. 4, 1-9 (2001).
- Gray, R. S., Roszko, I., Solnica-Krezel, L. Planar cell polarity: coordinating morphogenetic cell behaviors with embryonic polarity. Developmental Cell. 21, 120-133 (2011).
- Vogg, M. C., Wenger, Y., Galliot, B. How Somatic Adult Tissues Develop Organizer Activity. Current Topics in Developmental Biology. 116, 391-414 (2016).
- Collinet, C., Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Local and tissue-scale forces drive oriented junction growth during tissue extension. Nature Cell Biology. 17, 1247-1258 (2015).
- Martin-Blanco, E., et al. puckered encodes a phosphatase that mediates a feedback loop regulating JNK activity during dorsal closure in Drosophila. Genes and Development. 12, 557-570 (1998).
- Dye, N. A., et al. Cell dynamics underlying oriented growth of the Drosophila wing imaginal disc. Development. 144, 4406-4421 (2017).
- Williams-Masson, E. M., Malik, A. N., Hardin, J. An actin-mediated two-step mechanism is required for ventral enclosure of the C. elegans hypodermis. Development. 124, 2889-2901 (1997).
- Ferguson, M. W.
