Summary
Denne protokollen er designet for avbildning og analyse av dynamikken i celleorientering og vevsvekst i Drosophila abdominal epithelia som fruktfluen gjennomgår metamorfose. Metodikken som er beskrevet her, kan brukes på studiet av ulike utviklingsstadier, vev og subcellulære strukturer i Drosophila eller andre modellorganismer.
Abstract
Innenfor flercellede organismer viser modne vev og organer høye grader av orden i de romlige arrangementene til deres bestanddeler celler. Et bemerkelsesverdig eksempel er gitt av sensorisk epithelia, hvor celler av samme eller distinkte identiteter er samlet via cellecelleadhesjon som viser svært organiserte planarmønstre. Celler justeres til hverandre i samme retning og viser tilsvarende polaritet over store avstander. Denne organiseringen av den modne epithelia er etablert i løpet av morfogenese. For å forstå hvordan den planære ordningen av den modne epithelia oppnås, er det avgjørende å spore celleorientering og vekstdynamikk med høy spatiotemporal gjengivelse under utviklingen in vivo. Robuste analytiske verktøy er også avgjørende for å identifisere og karakterisere lokale til globale overganger. Drosophila pupa er et ideelt system for å evaluere orientert celleform endrer underliggende epitelmorogenese. Det pupale utviklende epitelet utgjør den ytre overflaten av immobile kroppen, slik at langsiktig avbildning av intakte dyr. Protokollen som er beskrevet her er utformet for å bilde og analysere celleatferd på både globale og lokale nivåer i pupal abdominal epidermis som den vokser. Metodikken som er beskrevet, kan enkelt tilpasses avbildningen av celleatferd i andre utviklingsstadier, vev, subcellulære strukturer eller modellorganismer.
Introduction
For å oppnå sine roller, epitelvev fullt ut stole på den romlige organiseringen av sine cellulære komponenter. I de fleste epithelia er celler ikke bare pakket mot hverandre for å skape et presist brosteinslag, men de orienterer seg i forhold til kroppsaksene.
Den funksjonelle betydningen av presis vevsorganisasjon er åpenbar i sensorisk epithelia, som virveldyr indre øre og netthinnen. I det første tilfellet justerer hår- og støtteceller i en bestemt aksial retning for effektivt å føle mekaniske innganger som lyd og bevegelse1,2. På samme måte er fotoreseptorcelle romlig organisasjon avgjørende for å oppnå optimale optiske egenskaper ved netthinnen3. Romlig kontroll av celleposisjon og orientering er dermed av særlig relevans for riktig fysiologisk funksjon.
Drosophila er et holometaboløs insekt som gjennomgår en fullstendig transformasjon av larvalkroppsstrukturene gjennom metamorfose, noe som gir opphav til sitt voksne vev. Drosophila pupa er en utmerket modell for noninvasiv levende avbildning av en rekke dynamiske hendelser, inkludert utviklingscellemigrasjon4,celledeling og vekstdynamikk5,muskelsammentrekning6,celledød7,sårreparasjon8og celleorientering9. I den voksne Drosophilaviser det eksterne epitelet en høy grad av orden. Dette observeres lett på arrangementer av trichomes (dvs. celle fremspring som stammer fra enkelt epitelceller) og sensoriske bust over hele flyets kroppsoverflate10. Faktisk er trichomes justert i parallelle rader som styrer luftstrømmen11. Morfogenesen til den voksne epithelia og det bestilte arrangementet av de enkelte cellene starter under embryogenese og kulminerer under pupale stadier. Mens i embryoer celledelinger, intercalations, og form endrer alle redusere vevsorden12,13, dette er tilbake på senere stadier av utviklingen, spesielt på pupal stadier, når flyet nærmer modenhet9.
Immobile Drosophila pupa gir et ideelt system for å evaluere celleform og orienteringsendringer. Den pupale abdominal epidermis presenterer spesielle fordeler. Mens forløperne til det voksne hodet, thorax, kjønnsorganer og vedlegg vokser og blir mønstret fra larvestadier, histoblasts, som er integrert i larval epidermis, begynner å vokse og differensiere bare ved pupariation14. Denne funksjonen tillater sporing av alle spatiotemporal hendelser involvert i etableringen av vev orden i sin helhet9.
Histoblasts er spesifisert under embryonal utvikling ved kontralaterale stillinger i hvert presumptivt buksegment. Den dorsale abdominal epidermis av den voksne stammer fra dorsolaterally plassert histoblast reir tilstede i fremre og bakre rom15,16. Etter hvert som histoblaster utvides, erstatter larval epitelceller (LECer), smelter de kontralaterale reirene ved dorsalmidlinjen som danner et sammenføyningsark17,,18,,19,,20.
Dette arbeidet beskriver 1) en metodikk for disseksjon, montering og langsiktig levende avbildning av Drosophila-puppene, og 2) analytiske metoder for å studere dynamikken i cellulær orientering og vekst ved høy spatiotemporal oppløsning. En detaljert protokoll er gitt her, som dekker alle trinnene som kreves fra den første pupae forberedelse (dvs. iscenesettelse og bildebehandling) til utvinning og kvantifisering av retningsretningsitet og orientering funksjoner. Vi beskriver også hvordan man utlede lokale vevsegenskaper fra analysen av cellekloner. Alle de beskrevne trinnene er minimalt invasive og tillater langsiktige live analyser. Metodene som er beskrevet her, kan enkelt tilpasses og brukes på andre utviklingsstadier, vev eller modellorganismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Denne protokollen er delt inn i fem trinn: (1) iscenesettelse av puppene, (2) forbereder puppene for avbildning, (3) levende avbildning av den voksende abdominale epithelia, (4) generasjon av genetiske mosaikker, (5) databehandling og analyse (inkludert seksjoner som beskriver hvordan man analyserer celleorienteringsdynamikk fra cellekryssskinser og vekstdynamikk fra cellekloner).
1. Iscenesettelse av Drosophila pupae før avbildning
- Kultur flyr av riktig genotype på standard medium i plast hetteglass ved 25 °C i 5 dager (±12 h) etter egglegging (AEL).
MERK: Metamorfose starter innenfor rammen av de tredje-instar larver inn i pupal tilfelle på 120 h AEL til 0 timer etter puparium dannelse (APF). Denne overgangen er lett identifiserbar, fordi larver slutter å mate og beveger seg og den opercular regionen dannes (Figur 1A) ved 0-12 h APF. Pupariumet er i utgangspunktet mykt og hvitt, men stivner gradvis og brunfarger. - Overfør hvit prepupae (0 h APF) til et friskt hetteglass i plast ved hjelp av en fuktig pensel. Dyr kan holdes ved forskjellige temperaturer avhengig av det utformede eksperimentet til ønsket alder.
MERK: Pupa formasjon (dvs. pupering) oppstår ved 12 t APF, når hodet og vedleggene til den voksne fly er helt everted (Figur 1A). På denne tiden er pupal saken helt atskilt fra puppen, slik at den fullstendige fjerningen (Figur 1A).
2. Forbereder pupper for levende bildebehandling
MERK: Etter iscenesettelse blir puppene dissekert og montert som beskrevet nedenfor (se også figur 1).
- Fjern iscenesatte pupper fra veggen av hetteglasset ved hjelp av tang.
- Lim den ventrale siden av hver pupa på et glasssklie dekket med dobbeltsidig klebrig tape. Trykk forsiktig på hodespirakler (dvs. opercular region) og dorsal overflaten av puppen med spissene på tang for å sikre vedheft av pupal saken til båndet (Figur 1A,B).
MERK: Dorsaloverflaten skal møte opp for å lette disseksjon av saken og gjenopprettingen av puppen. - Begynn disseksjon under et stereomikroskop ved å forsiktig fjerne operculumet fra pupariumet med tangene (figur 1C).
- Sett inn en spiss av tangene i en grunn vinkel mellom pupalhuset og pupaoverflaten gjennom den opercular åpningen. Riv saken fra hode til hale sidelengs i en eller flere svinger, unngå å klemme puppen (Figur 1D). Brett tilbake den sprukne puppesaken til sidesidene mens du fortsetter til den bakre enden (Figur 1E).
MERK: Pupperet er ganske stivt og sprekker lett. Ved høy luftfuktighet eller spesielt genotypisk bakgrunn blir pupperet mykere og rive er vanskeligere. I disse tilfellene kan sprekkingen av pupalsaken bli hjulpet ved å stikke sine frie kanter med begge spissene av tangene. - Fjern puppen fra det åpnede puppehuset ved å sette inn tangen forsiktig under dyret og trekk forsiktig opp (figur 1F). Puppen vil holde seg til spissen av tang (figur 1G−H).
- Overfør puppen ved hjelp av tangen til en glassbunnsfat og deponer den på toppen av en liten dråpe gassgjennomtrengelig halokarbonolje (figur 1I). Hold puppen forsiktig ved ventrale siden for å unngå mulig vevsskade.
MERK: Dråpen av halokarbonolje må være liten, med en diameter omtrent mindre enn halvparten av lengden på puppen. En slik mengde er tilstrekkelig til å følge puppen til glasset med kapillæritet og for å korrigere optikken for oljenedsenkingsmål. - Rull et stykke vått vevspapir på kantene av parabolen for å opprettholde fuktigheten. Dekk parabolen for å unngå dehydrering av puppene under avbildning.
MERK: Både hunn- og hannpusen kan brukes til bildebehandling. Vi anbefaler at du bruker de tredje buksegmentene (AIII) som referanse abdominal metamere siden den er nesten identisk i begge kjønn når det gjelder størrelse, form og mønster.
3. Levende avbildning av voksende abdominal epithelia
MERK: Et invertert laserskanningskonfuskop utstyrt med et mål om nedsenking av 40 x 1,3 NA-olje ble brukt til å avbilde pupae på ulike utviklingsstadier.
- Orienter puppen over oljefallet på glassbunnsfatet i henhold til domenet og prosessen som skal evalueres (f.eks. dorsolateralt for langsiktig levende avbildning av den tidlige utvidelsen av dorsale reir, eller dorsally for å bilde deres sene ekspansjon og vevsremodeling). Se figur 1J,K og figur 4.
- Overfør glassbunnsfatet som inneholder den monterte puppen til mikroskopstadiet og fokuser på overflaten av bukområdet ved hjelp av det overførte lyset.
MERK: Selv om denne protokollen er optimalisert for avbildning på inverterte mikroskoper, er det også mulig å utføre bildebehandling på et oppreist mikroskop. I så fall plasseres prøven på mikroskopstadiet med glassbunnoverflaten vendt opp. Halokarbonoljen holder hver pupa på en menisk. - Angi oppkjøpsparametrene: 1) antall Z-skiver er vanligvis mellom 20−40 for å tillate riktig todimensjonal (2D) rekonstruksjon av abdominal epidermis; 2) trinnstørrelse mellom hver skive (f.eks. 1 mikron); 3) tidsintervall for opptak (et 5 min intervall er egnet for high fidelity analyser av celle orientering dynamikk); og 4) rammeoppløsning (f.eks. 1024 x 1024).
- Slå på de riktige laserne (dvs. 488 nm og 561 nm for å visualisere henholdsvis GFP og RFP fluorofore) og juster laserkraft- og forsterknings-/forskyvningsinnstillingene for å visualisere de merkede cellene. Bruk lavest mulig lasereffekt (i området 5%−20 %) for å minimere fotobleking og fototoksisitet.
- Still inn posisjonen og de riktige Z-stakkgrensene for flere pupper ved hjelp av det vedlagte motoriserte stadiet og mikroskopet multiposisjonsoppkjøpsprogramvare.
4. Generasjon av genetiske mosaikker for å følge atferd av celle kloner
MERK: Vi bruker miitotisk rekombinasjon for å indusere genetiske mosaikker i abdominale epitelet via stedsspesifikk rekombinasjon (FLP/FRT system21,22) ( Figur2).
- Cross virgin hunner som bærer et varmesjokk-udusibel Flippase transgene (hs-FLP), et FLP-gjenkjenningsmål (FRT) på et bestemt genomisk sted (f.eks. FRT-stedet i posisjon 40A ved L-armen av kromosom 2), og en gjenkjennelig cellulær markør (f.eks. Ubi-RFP.nls eller Ubi-GFP.nls) distal til FRT-området, til muterte menn som bærer et FRT-sted på tilsvarende genomisk plassering (Figur 2A−C).
MERK: Autonome og ikke-autonomiske effekter innenfor eller utenfor kloner for eventuelle gentap av funksjon kan studeres ved hjelp av spesifikke recessive alleler distal til FRT-området. - Generer FLP/FRT somatiske kloner i histoblastene ved varmesjokkbehandling på det tredje instar larvalstadiet av avkom av korset. Dette utføres ved å senke plast amp hetteglass som inneholder dyrene i et vannbad ved 37 °C i 45 min til 1 t på vandrende larver (LIII) scenen.
MERK: Den følsomme perioden for miitotisk rekombinasjon er G2-fasen av cellesyklusen. Histoblasts er arrestert i G2 under hele larvalutviklingen. - Score tvilling kloner for fravær (dvs. muterte celler) eller forbedrede (dvs. vill type twin-spot celler) nivåer av fluorescerende protein markør fra 16 h APF og utover (Figur 2D).
MERK: I gjennomsnitt, 45 min til 1 t ved 37 °C gjengir ca bare 2-3 tvilling kloner per region av interesse (f.eks abdominal hemisegment). Pupae som viser for høy klonetetthet (f.eks. mer enn fire tvillingkloner per hemisegment) bør kastes fra ytterligere kvantitative analyser. - Ved kloneidentifikasjon, bilde levende pupper på ønsket stadium og for ønsket tidsperiode som beskrevet i forrige avsnitt.
5. Databehandling og analyser
MERK: Data behandles ved hjelp av ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).
- Skille celleretningsdynamikk fra cellekoblingsoversikter.
- Projiser Z-stakkskivene som er anskaffet av konfikal mikroskopi i 2D ved hjelp av funksjonen MAKSIMAL intensitetsprojeksjon (MIP) i ImageJ.
MERK: Antall skiver per stabel bør holdes på et minimum for å unngå ut av fokusstøy generert av makrofager som patruljerer under epidermis. - Angi et plansystem som identifiserer pålitelige vevslandelandepunkter (f.eks. grenser for A/P-rommet) for analyse av hvert datasett (figur 3A).
MERK: Ved hjelp av de samme planreferansene for hvert datasett kan flere målinger sammenlignes. - Bruk Plugin-modulen OrientationJ (bigwww.epfl.ch/demo/orientation/) for ImageJ23,24 på lokale cellekanter for å oppnå kvalitative og kvantitative orienteringsverdier. Programtillegget gjengir fargekodede overlegg på inndatabilder basert på lokale retninger og gir numeriske verdier når de brukes i kvantitativ modus (figur 3B−B'' og figur C−C'''').
MERK: Orienteringj-plugin-modulen er basert på struktursenker, 2 x 2 matrise av eigenvalues avledet fra gradient og retningsderivater (se referanser23,24 for en detaljert beskrivelse). - Bruk alternativet RetningJ-distribusjon til å fargekode cellekantretninger i forhold til det angitte planplanære koordinatsystemet (dvs. kart for cellekantretning) (Figur 3B). Distribusjonsalternativet finnes under plugin-menyen i ImageJ. Innstillingene som skal brukes er: Gaussian vindu sigma = 1 piksel; Kubikk spline = gradering; Minimum coherency = 20%; Minimum energi = 1%. Cellekantretninger vises som et fargekodet bilde som bruker alternativet Fargeundersøkelse for programtillegget (Hue = orientering; Metning = sammenheng; og Lysstyrke = inndatabilde).
MERK: Områder som inneholder bakgrunnsfluorescens gir ingen retningsinformasjon og må utelukkes manuelt fra analysen. Høye terskelinnstillinger reduserer pikslene som vurderes i de behandlede bildene. - Bruk alternativet OrientationJ Measure til å kvantifisere cellulære orienteringer og retningsbestemt cellecellejustering (dvs. sammenheng) (figur 3C). Mål-alternativet finnes under plugin-menyen i ImageJ. Generer små tilstøtende ikke-overlappende interesseområder (ROIer) av ensartet vekt (64 x 64 piksler, ca. 20 μm x 20 μm) i området som er okkupert av histoblastene (Figur 3C).
- Beregn den dominerende lokale retningen (dvs. den gjennomsnittlige retningen mellom nærliggende celler-gjennomsnittlig cellekantretningskart) og sammenheng fra ROIene. Programvaren beregner den dominerende orienteringen og den lokale sammenhengen innenfor hver avkastning (figur 3C).
MERK: De største og minste eigenvalues av strukturen tensor anslått av OrientationJ er ansatt for å beregne sammenheng som forholdet mellom deres forskjell og deres sum. Sammenheng er avgrenset mellom verdier på 0−1. En verdi på 1 indikerer full justering ensartethet, mens en verdi på 0 indikerer isotropiske områder uten justering. - Analyser de beregnede orienterings- og sammenhengsverdiene fra flere bilder ved hjelp av gratis programvarepakker som PAST25. Aksialdata som orienteringsverdier (i grader) er riktig beskrevet av retningsstatistikk.
- Gjennom programvaren beregner du gjennomsnittlig retning og sirkulær varians for hvert sett med orienteringsdistribusjoner. Den statistiske betydningen av forskjellen mellom fordelingen av orienteringene mellom forskjellige genotyper eller betingelser bestemmes ved hjelp av den ikke-parametriske Mardia-Watson-Wheeler-testen (W-test) for like distribusjoner.
- Beregn den statistiske signifikansen av differansen i sammenheng med å bruke den ikke-parametriske Kolmogorov-Smirnov-testen (K-S-test). Vis data grafisk etter ønske (polare plott, stolpediagrammer, boksplott osv.).
- Projiser Z-stakkskivene som er anskaffet av konfikal mikroskopi i 2D ved hjelp av funksjonen MAKSIMAL intensitetsprojeksjon (MIP) i ImageJ.
- Vekstdynamikk fra cellekloner
MERK: Følgende trinn tillater henting av geometriske og formparametere for celler fra 2D MIP-bilder som inneholder klone(er) av interesse. For sammenligninger mellom flere kloner må bilder anskaffes med de samme innstillingene.- Segment klone områder ved å tegne sine konturer med ImageJ Freehand Selection verktøyet.
- Beregn geometriske og formparametere ved hjelp av verktøyet Angi målinger for ImageJ under Analyser-menyen. Aktiver alternativene Område, Perimeter, Tilpass Ellipseog Figurbeskrivelse.
MERK: Dette vil tillate gjenfinning av ulike geometriske parametere, inkludert området (summen av pikslene i klone), omkretsen (summen av pikselen på klonekanten), sideforholdet (AR, forholdet mellom de store og mindre aksene til den best tilpassede Legendre ellipse innskrevet i klonegrensen), og retningsvinkelen (dvs. vinkelen på den store aksen av klone i forhold til anteroposterior grensen). - Beregning av ikke-dimensjonale forhold fra disse målingene henter formparametere. Disse inkluderer rundhet (4 x [område]/π x [hovedakse]2),grovhet (soliditet - område/ konvekse område) og sirkularitet (4π x [område]/[perimeter]2).
MERK: Hver av formparametrene representerer graden av avvik av klonene fra ideelle former, for eksempel en sirkel eller et avgrenset konveks skrog, og de er alle avgrenset mellom verdier på 0 og 1. Verdier lik 1 indikerer maksimal symmetri (dvs. minimal kompleksitet). - Analyser geometriske og formparametere statistisk mellom ulike genotyper eller betingelser ved hjelp av Microsoft Excel og/eller PAST. Statistisk signifikans av forskjellen bestemmes ved hjelp av en ulønnet to-tailed Student t-test for lik gjennomsnitt eller ikke-parametrisk Kolmogorov-Smirnov K-S-test for like fordelinger mellom forhold. Data kan vises grafisk etter ønske (f.eks. stolpediagrammer, boksplott osv.). Se figur 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskrevet ovenfor dekker utarbeidelsen av Drosophila pupae for langsiktig levende bildebehandling og prosedyrene for analyse av celleorientering og vekstdynamikk i abdominal epidermis. Ved å bruke denne metoden er det mulig å generere høyoppløselige filmer av den utviklende puppene i perioder på opptil 48 timer uten betydelig fotobleking eller fototoksisitet. Øyeblikksbilder som viser abdominal epidermis (f.eks. histoblasts og LECer) på forskjellige tidspunkter og fra pupper orientert i forskjellige vinkler er vist i figur 4. Den påfølgende analysen av disse filmene tillater identifisering og kvantifisering av dynamikken i lokale og globale endringer i de viktigste geometriske og formparametere modulert under utvidelsen av histoblasts og utskifting av LECer. Disse analysene kan utføres i ulike scenarier og spesifikke mutantbakgrunner. De kan også brukes til kloner der genuttrykk endres, noe som fører til autonomt tap eller gevinst av funksjonsforhold. Dette ville tillate utforskning av ikke-autonomøse responser i omkringliggende celler, noe som letter identifisering av krysstale eller cellekommunikasjonsmekanismer (figur 5). Denne tilnærmingen har nylig blitt ansatt i identifiseringen av Fat / Dachsous / Fire skjøtet banen som et sentralt element som styrer og orienterer celler justering under utplassering av planar polarmønster av abdominal epidermis av den voksne9.
Figur 1: Dissekere og monterer pupper for levende bildebehandling. (A)Fra venstre til høyre: dorsal visning av en prepupa ved 0 h APF (venstre) og av en pupa ved 14 t APF før (midten) og etter (høyre) fjerning av ugjennomsiktig pupal tilfelle. Den opercular regionen er angitt (hvite pilspisser). (B) Den essensielle verktøykassen for disseksjon vises. Fra venstre til høyre: glasssklie, dobbeltsidig klebrig tape, et par tang og en glassbunnsrett. (C)Iscenesatte pupper er immobilisert på dobbeltsidig klebrig tape på glasslysbilder dorsal side opp. Det pupale tilfellet av hver pupa åpnes fra opercular regionen med kirurgiske tang. (D−E) Peelingen av puppekassen er gradvis. Saken er revet og brettet til pupalsidene fra hodet til magen. -FJeg har ikke noevalg. Puppen løftes forsiktig fra ventralsiden med spissene på tangene (G) og overføres til en glassbunnsrett over en minimal dråpe halokarbonolje. (I)Puppen er da riktig orientert (dorsolaterally, topp; dorsally, bunn). Flere pupper kan monteres samtidig ved å gjenta trinnene som vises i paneler C−I. (J)Bilde som viser omrisset av cellene i dorsal histoblast reir av AIII segmentet uttrykker koblingsmarkøren Atpα::GFP. Puppen var orientert dorsolaterally og avbildet på 14 h APF. Skala bar = 22 μm. (K) Bilde tilsvarende (J) men fra et dorsalt synspunkt. Dynamikken i vevsutvikling kan visualiseres i flere timer. Se også Figur 4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Generasjon av genetiske mosaikker via FLP/FRT-systemet. (A)En foreldre heterozygotcelle (blek magenta) bærer en resessiv mutert allel (stiplet rektangel) på ett kromosomarm og en genkoding for en fluorescerende markør (magenta) i den andre kromosomarmen [venstre arm av kromosom 2 (2L) i dette eksemplet]. FRT-steder (oransje rektangler) er konstruert i begge armene i samme kromosomale posisjoner proksimale til centromere (grå ovaler). (B) Aktiveringen av FLP recombinase av varmesjokk i celler som er stanset i G2 fører til rekombinasjon mellom FRTs av søsterkromaatider 1-1' og 2-2'. Som et resultat utveksles regionen distal til FRT-områdene (FRT40A på 2L). En forstørret visning vises på høyre panel. (C)Ved polarsegregering av de omorganiserte områdene (1-1' og 2-2 ') under mitose genereres to genetisk forskjellige søsterceller. En datter er homozygot for den recessive allelet og for hele kromosomarmen distal til stedet for rekombinasjon. Denne cellen mangler genet som koder for fluorescerende markør, negativt merket i hvitt. Den andre dattercellen vil være homozygot for den ville typen arm, noe som gir opphav til en twin-spot og uttrykker to kopier av genene koding for fluorescerende markør (mørk magenta). For enkelhets skyld vises ikke segregeringer av omorganiserte områder til motsatte poler i den mitotiske cellen (dvs. 1−2 og 1'−2') . Disse gir opphav til celler fenotypisk uutslettelig fra foreldrecellen (heterozygot bakgrunn, blek magenta). (D) Bilde som viser kloner i et rom generert via FLP/FRT somatisk rekombinasjon på tredje instar larver scenen og visualisert på 26 h APF. Kloner av celler er preget av fravær av RFP.nls (svart) og homozygot uttrykk for RFP.nls (lyse magenta, tvillingflekker) i en ellers heterozygous RFP.nls bakgrunn (dim magenta). Tilsvarende hendelser kan oppnås for FRT-områder som ligger i andre kromosomale steder (2R, 3L, 3R og X). Se også Figur 5. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Illustrasjon av målinger av celleretning. Hvis du vil trekke ut informasjon om celleretninger, angis først et planbasert koordinatsystem for å relatere celleretning med vevsaksen (A). For det andre trekkes celleretninger ut fra celleomriss (B). Sist kvantifiseres celleorientering og justeringer med vevaksen (C). (A)Til venstre, et diagram over en lateral visning av en pupa orientert i henhold til planar koordinatsystemet. Den røde faste og cyan stiplede linjene definerer det kartesiske flyet som representerer anteroposterior (A / P) grensen og dorsalmidlinjen henholdsvis. I midten, et invertert bilde som viser en dorsolateral visning av den ekspanderende histoblasts på 26 h APF skissert av junctional markøren Atpα:: GFP (inndatabilde). Plasseringen av A/P-grensen er uthevet med en rød linje. Til høyre, et aksial kompass som viser fargekoden som brukes til å beskrive cellekantretninger (polygoner) eller gjennomsnittlige celleretninger (stolper). (B)Visning av Plugins/OrientationJ-menyen og vinduet OrientationJ-distribusjon. OrientationJ - Jeghar ikkenoe valg. Visning av vinduet OrientationJ-distribusjon som viser innstillingene for parameterne som brukes for å få kartet for cellekantretning til høyre. - Jeghar ikke noe valg. Illustrasjon av de fargekodede celledisposisjonene på idealiserte celler. En sirkel viser ingen foretrukket farge. (C) Visning av vinduet OrientationJ Measure. - Jeghar ikkenoe valg. Sekvensielle skjermbilder av Vinduet OrientationJ Measure som viser hvordan du måler lokal orientering og sammenheng i påfølgende ROM-er med jevn vekt. Den lokale orienteringsvinkelen og sammenhengen for hver region vises som ellipsoider. - Jeghar ikke noe valg. Representasjon av de endelige resultatene av orienteringsmålingen. Ellipsoider viser visuelt retningen (dvs. vinkelen på ellipsoid lengste aksen med hensyn til A / P-grensen) og sammenheng (dvs. forholdet mellom den lengste og den kortere aksen til ellipsoid). De numeriske verdiene for begge parameterne lagres i et regneark for ytterligere analyser. - Jeghar ikke noe valg. Illustrasjon av de fargekodede celledisposisjonene og gjennomsnittlig celleretning (stolper) på idealiserte celler. En sirkel viser ingen foretrukket orientering. -Jeghar ikke noe å gjøre. Representasjon av den foretrukne lokale retningen for hver avkastning (lokalt gjennomsnittlig orienteringskart). Fargene uthever retningen til hvert område. Fremre er til venstre. Skala bar = 22 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Langsiktig levende avbildning av voksende abdominal epithelia. (A)Representative øyeblikksbilder fra langsiktige bildefilmer fra tidlige til sene faser av histoblast ekspansjon. Topp: Skjematisk utsikt over en pupa orientert for dorsolateral bildebehandling ved 16 t og 26 h APF. Territoriet okkupert av reiret synlig fra den dorsolaterale siden av puppen er uthevet i mørk grå ved 16 og 26 h APF. Bunn: Bilder som viser cellekonturer fra både histoblaster og LECer merket av det allestedsnærværende uttrykket til koblingsmarkøren Atpα::GFP. A/P-grensen ligger mellom de to uthevede rommene (Falske fargede celler i blått = fremre rom; grønn = bakre rom). (B)Representative øyeblikksbilder fra langsiktige bildefilmer fra tidlige til sene faser av reir samløpet. Topp: Skjematisk visning av en pupa orientert for dorsal imaging ved 32 t og 48 h APF. Bunn: Celledisposisjoner (merket og farget som i A). Legg merke til at Atpα::GFP-markøren tillater avgrensning av formen på individuelle epitelceller over tid med høy oppløsning. Skala bar = 22 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Vevsegenskaper hentet fra klonanalyse. (A) Eksempler på vill type kloner i Et rom preget av fravær av RFP.nls (svart) og deres tvillingflekker (lyse magenta) ved 26 h APF. Klonene strekker seg langs segmentalgrensene. Twin kloner ordne parallelt eller i tandem. Skala bar = 22 μm. (B)Topp: Bilder som illustrerer parametrene kvantifisert fra kloneskinsene. Bunn: Sammendragstabell som rapporterer gjennomsnittsverdiene for de angitte parametrene for villtypedyr (n = 29). (C)Morfologi av en vill type klone ved 26 h (venstre) og 47 h (høyre) APF. Klone viser komplekse grensen morfologi på begge stadier. (D) Boks og whisker tomter for geometriske parametere på 26 h (lys gul) og 47 h APF (mørk gul). Det gjennomsnittlige arealet og omkretsen øker betydelig i dette tidsvinduet. (E) Polartomter som representerer klonenes orientering (hyllestørrelse 18°, overflod proporsjonal med området). Orienteringen opprettholdes under utvidelse og ombygging. (F) Boks og whisker tomter for form parametere på 26 h (lys gul) og 47 h APF (mørk gul). Ruhet (soliditet), rundhet og sirkularitet endrer seg knapt. Medianverdiene vises med en rød horisontal linje og whiskers strekker seg til minimums- og maksimumsverdiene for fordelingen. Statistikk ble utført med K-SM-test eller W-tester (p < 0,0001****, p > 0,05 ikke signifikant). Fremre er til venstre, dorsal er oppe. Skala bar = 16 μm. Genotype er hsflp1.22; FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lang rekkevidde er en viktig egenskap ved de fleste funksjonelle fysiologiske enheter. Under morfogenese oppnås orden gjennom integrering av komplekse instruksjoner implementert med høy temporal og romlig presisjon. Flere og multilevel begrensninger er integrert i stereotype vev ordninger.
Polaritet og retningsbestemthet er avgjørende for å bestille romlig ordning under utvikling. Polaritet innebærer symmetribrudd under utviklingen. Oppnåelse av asymmetri er nødvendig for fastsettelse av embryonale anteroposterior (A / P) og dorsoventral (D / V) akser og voksen organisasjon26. Utover denne tidlige rollen er lokale asymmetrier avgjørende for morfologiske mangfold på alle nivåer. Retningsbestemthet er et viktig supplement til asymmetri og polaritet under morfogenese. Global orden implementeres av cellenes evne til å føle og overføre signaler lokalt på en celle-til-celle-base med en presis følelse eller orientering. Enkeltceller asymmetrier harmoniserer samarbeidsvillig over tid ved å orientere posisjoner eller bevegelser i bestemte retninger i rommet. Cellekommunikasjon impliserer utskillede faktorer, cellecellekontakter og mekaniske innganger. Signaler virker på felt av celler som først lokalt og deretter globalt endrer deres atferd27.
Dette arbeidet presenterer en enkel måte å analysere koordinert atferd av individuelle celler, inkludert deres planar orientering og vekst parametere under utviklingen av vev orden. Morfogenese av den voksne magen av Drosophila under pupering presenterer en rekke tekniske fordeler over andre tilsvarende modeller som bakteriebånd forlengelse / tilbaketrekking28 eller dorsal nedleggelse29 under fly embryogenese, Drosophila vinge morfogenese ex vivo30, ventral kabinett i Caenorhabditis elegans31, eller palatal fusion i mus32, blant andre.
For det første utgjør abdomen morfogenese en prosess som kan følges i sin helhet in vivo. Kontinuerlig levende avbildning av utskifting av LECene av histoblastene kan utføres fra 12 h APF, når puppen dannes, opp til ferdigstillelse av voksen epitelmorphogenese. For det andre tillater det analyser av et komplett sett med celleatferd som celleoverføring, divisjon, formendringer, delamination og intercalation. Sist, Det er mottagelig for genetisk interferens og klonal analyse. Autonome og ikke-autonomiske effekter av tap og gevinst av funksjonsaktiviteter kan overvåkes live ved å bruke egnede markører. Imidlertid presenterer puppen som et modellsystem noen mindre begrensninger. På grunn av sin ovale form er det ikke mulig å utføre samtidig levende bildebehandling av laterale og dorsale hendelser med høy oppløsning. Dette problemet kan overvinnes ved å utføre sekvensiell avbildning i dorsolateralt og dorsally orientert pupae eller bedre, ved å bruke flere vinkler lysark selektiv plan belysning mikroskopi (SPIM) mikroskopi. En annen ulempe er tilstedeværelsen av to forskjellige cellepopulasjoner av forskjellige størrelser i analysene (dvs. polyploid LECer og diploid histoblasts). Dette kan gjøre bildesegmentering kompleks og de to cellepopulasjonene må analyseres separat.
I fremtiden kan den langsiktige avbildningen av Drosophila-puppene lett tilpasses for å studere et komplett spekter av morfogenetiske fenomener, inkludert koordinering av epidermal, muskulær og neural utvikling under metamorfose i vill type og muterte forhold. Videre kan algoritmer og plugins i bruk brukes til å studere organisasjonen, mønster, og dynamikk av mange andre vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke medlemmer av Martín-Blanco-laboratoriet for nyttige diskusjoner. Vi takker også Nic Tapon (The Crick Institute, London, STORBRITANNIA), Bloomington Stock Center (University of Indiana, USA) og FlyBase (for Drosophila genmerknad). Federica Mangione ble støttet av et JAE-CSIC predoktorstipend. Martín-Blanco-laboratoriet ble finansiert fra Programa Estatal de Fomento de la Investigación Científica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P og BFU2017-82876-P) og fra Fundación Ramón Areces.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis Software | - | ImageJ | Analyzing data |
| Drosophila | Atpa::GFP | - | Strains employed for data collection |
| Drosophila | hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | - | Strains employed for data collection |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter for dissection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting pupae for data collection |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | mounting pupae |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Data collection |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the pupae during dissection |
References
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Deans, M. R. A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae. Seminars in Cellular and Developmental Biology. 24, 490-498 (2013).
- Stell, W. K. The structure and morphologic relations of rods and cones in the retina of the spiny dogfish, Squalus. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Comparative Physiology. 42, 141-151 (1972).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bosveld, F., et al. Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway. Science. 336, 724-727 (2012).
- Puah, W. C., Wasser, M. Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis. Methods. 96, 103-117 (2016).
- Teng, X., Qin, L., Le Borgne, R., Toyama, Y. Remodeling of adhesion and modulation of mechanical tensile forces during apoptosis in Drosophila epithelium. Development. 144, 95-105 (2017).
- Weavers, H., et al. Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient. Current Biology. 26, 1975-1989 (2016).
- Mangione, F., Martin-Blanco, E. The Dachsous/Fat/Four-Jointed Pathway Directs the Uniform Axial Orientation of Epithelial Cells in the Drosophila Abdomen. Cell Reports. 25, 2836-2850 (2018).
- Casal, J., Struhl, G., Lawrence, P. A. Developmental compartments and planar polarity in Drosophila. Current Biology. 12, 1189-1198 (2002).
- Wootton, R.
- Zallen, J. A., Wieschaus, E. Patterned gene expression directs bipolar planar polarity in Drosophila. Developmental Cell. 6, 343-355 (2004).
- Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epithelia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. Journal of Morphology. 59, 351-399 (1936).
- Mandaravally Madhavan, M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 183, 269-305 (1977).
- Kornberg, T. Compartments in the abdomen of Drosophila and the role of the engrailed locus. Developmental Biology. 86, 363-372 (1981).
- Garcia-Bellido, A., Merriam, J. R. Clonal parameters of tergite development in Drosophila. Developmental Biology. 26, 264-276 (1971).
- Roseland, C. R., Schneiderman, H. A. Regulation and metamorphosis of the abdominal histoblasts of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 186, 235-265 (1979).
- Madhavan, M. M., Madhavan, K. Morphogenesis of the epidermis of adult abdomen of Drosophila. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 60, 1-31 (1980).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Fonck, E., et al. Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries. Stroke. 40, 2552-2556 (2009).
- Rezakhaniha, R., Fonck, E., Genoud, C., Stergiopulos, N. Role of elastin anisotropy in structural strain energy functions of arterial tissue. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 10, 599-611 (2011).
- Hammer, Ø, Harper, D. A., Ryan, P. D. PAST: paleontological statistics software package for education and data analysis. Palaeontologia electronica. 4, 1-9 (2001).
- Gray, R. S., Roszko, I., Solnica-Krezel, L. Planar cell polarity: coordinating morphogenetic cell behaviors with embryonic polarity. Developmental Cell. 21, 120-133 (2011).
- Vogg, M. C., Wenger, Y., Galliot, B. How Somatic Adult Tissues Develop Organizer Activity. Current Topics in Developmental Biology. 116, 391-414 (2016).
- Collinet, C., Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Local and tissue-scale forces drive oriented junction growth during tissue extension. Nature Cell Biology. 17, 1247-1258 (2015).
- Martin-Blanco, E., et al. puckered encodes a phosphatase that mediates a feedback loop regulating JNK activity during dorsal closure in Drosophila. Genes and Development. 12, 557-570 (1998).
- Dye, N. A., et al. Cell dynamics underlying oriented growth of the Drosophila wing imaginal disc. Development. 144, 4406-4421 (2017).
- Williams-Masson, E. M., Malik, A. N., Hardin, J. An actin-mediated two-step mechanism is required for ventral enclosure of the C. elegans hypodermis. Development. 124, 2889-2901 (1997).
- Ferguson, M. W.
