Summary
Detta protokoll är utformat för avbildning och analys av dynamiken i cellorientering och vävnad tillväxt i Drosophila buken epithelia som fruktflugan genomgår metamorfos. Den metod som beskrivs här kan tillämpas på studier av olika utvecklingsstadier, vävnader och subcellulära strukturer i Drosophila eller andra modellorganismer.
Abstract
Inom flercelliga organismer uppvisar mogna vävnader och organ höga ordningsgrader i de rumsliga arrangemangen av deras beståndsdelar. Ett anmärkningsvärt exempel ges av sensorisk epithelia, där celler av samma eller distinkta identiteter förs samman via cell-cell vidhäftning visar mycket organiserade plana mönster. Cellerna anpassar sig till varandra i samma riktning och visar motsvarande polaritet över stora avstånd. Denna organisation av den mogna epithelia är etablerad under loppet av morphogenesis. För att förstå hur den mogna epithelias plana arrangemang uppnås är det viktigt att spåra cellorientering och tillväxtdynamik med hög spatiotemporal trohet under utveckling in vivo. Robusta analysverktyg är också nödvändiga för att identifiera och karakterisera lokala till globala övergångar. Drosophila pupa är ett idealiskt system för att utvärdera orienterade cell form förändringar underliggande epitelial morphogenesis. Den pupal utvecklande epitel utgör den yttre ytan av den orörliga kroppen, vilket möjliggör långsiktig avbildning av intakta djur. Protokollet som beskrivs här är utformat för att avbilda och analysera cellbeteenden på både globala och lokala nivåer i pupal abdominal epidermis som växer. Den metod som beskrivs kan enkelt anpassas till avbildning av cellbeteenden i andra utvecklingsstadier, vävnader, subcellulära strukturer eller modellorganismer.
Introduction
För att uppnå sina roller, epitelvävnader helt förlita sig på den rumsliga organisationen av sina cellulära komponenter. I de flesta epithelia, celler är inte bara packade mot varandra för att skapa en exakt kullersten lager men de orienterar sig i förhållande till kroppen axlar.
Den funktionella betydelsen av exakt vävnad organisation är uppenbart i sensorisk epithelia, såsom ryggradsdjur innerörat och näthinnan. I det första fallet, hår och stödjande celler anpassa i en specifik axiell riktning för att effektivt känna av mekaniska ingångar såsom ljud och rörelse1,2. På samma sätt är fotoreceptorcellens rumsliga organisation nödvändig för att uppnå optimala optiska egenskaper vid näthinnan3. Rumslig kontroll av cellens position och orientering är därför av särskild betydelse för korrekt fysiologisk funktion.
Drosophila är en holometabolous insekt som genomgår en fullständig omvandling av dess larvkroppsstrukturer genom metamorfos, vilket ger upphov till dess vuxna vävnader. Den Drosophila pupa är en utmärkt modell för noninvasive levande bildbehandling av en mängd olika dynamiska händelser, inklusive utvecklingscell migration4, celldelning och tillväxtdynamik5, muskelkontraktion6, celldöd7, sår reparation8, och cell orientering9. I den vuxna Drosophilavisar den yttre epitelen en hög grad av ordning. Detta observeras lätt på arrangemangen av trichomes (dvs. cell utsprång som härrör från enstaka epitelceller) och sensoriska borst över hela flugan kroppsyta10. Faktum är att trichomes är i linje i parallella rader vägledande luftflödet11. Den morphogenesis av den vuxna epithelia och den beställda arrangemang av de enskilda cellerna börjar under embryogenesis och kulminerar under pupal stadier. Även i embryon cell divisioner, intercalations, och form förändringar alla minska vävnad ordning12,13, detta återgått i senare utvecklingsstadier, särskilt i pupal stadier, när flugan närmar mognad9.
Den orörliga Drosophila puppan ger ett idealiskt system för att utvärdera cellens form och orientering förändringar. Pupal abdominal epidermis presenterar speciella fördelar. Medan prekursorer av vuxna huvudet, bröstkorgen, könsorganen, och bihang växa och få mönstrad från larv stadier, histoblaster, som är integrerade i larv epidermis, börja växa och skilja endast på pupariation14. Denna funktion gör det möjligt att spåra alla spatiotemporal händelser som deltar i inrättandet av vävnad ordning i sin helhet9.
Histoblasts anges under embryonal utveckling på kontralateral positioner i varje presumtiva buken segmentet. Den dorsala buken epidermis av den vuxna härrör från dorsolaterally ligger histoblast bon närvarande vid främre och bakre fack15,16. Som histoblaster expandera, ersätter larv epitelceller (LECs), kontralaterala bon säkring vid dorsala mittlinjen bildar en konfluent ark17,18,19,20.
Detta arbete beskriver 1) en metodik för dissekering, montering och långsiktig live imaging av Drosophila pupae och 2) analytiska metoder för att studera dynamiken i cellulär orientering och tillväxt vid hög spatiotemporal upplösning. Ett detaljerat protokoll finns här, som omfattar alla de steg som krävs från den ursprungliga puppor beredning (dvs. mellanstationer och bildbehandling) till extraktion och kvantifiering av riktning och orientering funktioner. Vi beskriver också hur man kan härleda lokala vävnadsegenskaper från analys av cell kloner. Alla de beskrivna stegen är minimalt invasiva och tillåter långsiktiga liveanalyser. De metoder som beskrivs här kan enkelt anpassas och tillämpas på andra utvecklingsstadier, vävnader eller modellorganismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Detta protokoll är indelat i fem steg: (1) mellanstationer av poppar, (2) förbereda puppor för bildbehandling, (3) levande bildbehandling av den växande buken epithelia, (4) generering av genetiska mosaiker, (5) databehandling och analys (inklusive avsnitt som beskriver hur man analyserar cellorientering dynamik från cellkorsningkonturering och tillväxtdynamik från cell kloner).
1. Iscensättning av Drosophila puppor före avbildning
- Odla flugor av lämplig genotyp på standardmedium i injektionsflaska med plast vid 25 °C i 5 dagar (±12 h) efter äggläggning (AEL).
OBS: Metamorfos börjar inom inneslutning av tredje-instar larver i pupal fallet vid 120 h AEL tills 0 h efter puparium bildas (APF). Denna övergång är lätt att identifiera, eftersom larver slutar mata och flytta och operkulära regionen bildas (figur 1A) vid 0-12 h APF. Puparium är ursprungligen mjukt och vitt, men gradvis härdar och solbränna. - Överför vit prepupae (0 h APF) till en färsk plastflaska med hjälp av en fuktad pensel. Djur kan hållas vid olika temperaturer beroende på det utformade experimentet fram till önskad ålder.
OBS: Pupa bildning (dvs. pupation) sker vid 12 h APF, när huvudet och bihang av den vuxna flugan är helt everted(Figur 1A). Vid denna tidpunkt är pupalfallet helt avskilt från poppen, vilket gör att det kan avlägsnas fullständigt (figur 1A).
2. Förbereda puppor för levande bildbehandling
OBS: Efter iscensättningen dissekeras popporna och monteras enligt beskrivningen nedan (se även figur 1).
- Ta bort iscensatt puppor från injektionsflaskans vägg med hjälp av pincetten.
- Limma den ventrala sidan av varje puppa på en glasskiva täckt med dubbelsidig tejp. Knacka försiktigt på huvudspiraklerna (dvs. operkulär region) och puppans dorsala yta med pincettens spetsar för att säkerställa att pupalfallet vidhäftning till tejpen (figur 1A,B).
OBS: Dorsala ytan bör möta upp för att underlätta dissekering av fallet och återvinning av puppan. - Börja dissekera under ett stereomikroskop genom att försiktigt ta bort operculum från puparium med pincett (figur 1C).
- Sätt in en spets av pincetten i en grund vinkel mellan pupal fallet och pupa ytan genom opercular öppning. Riv fodralet från huvud till svans i sidled i en eller flera gungor, undvik att nypa poppan (figur 1D). Vik tillbaka det spruckna pupal fallet till de laterala sidorna som du fortsätter att gå till den bakre änden(Figur 1E).
OBS: Pupal fallet är ganska stel och sprickor lätt. Vid hög luftfuktighet eller i synnerhet genotypisk bakgrund blir pupalfallet mjukare och det är svårare att riva och riva. I dessa fall kan sprickbildning av pupal fallet få hjälp genom prickning dess fria kanter med båda spetsarna av pincett. - Ta bort poppen från det upp öppnade valpfallet genom att försiktigt föra in pincetten under djuret och försiktigt dra upp (figur 1F). Poppan fastnar på tångens spets (figur 1G−H).
- Överför poppen med hjälp av pincetten till en glasbottensskål och sätt in den ovanpå en liten droppe gaspermeabel halocarbonolja (figur 1I). Håll poppan försiktigt vid ventrala sidan för att undvika eventuella vävnadsskador.
OBS: Droppen av halocarbonolja måste vara liten, med en diameter som är ungefär mindre än hälften av poppens längd. Sådan mängd är tillräcklig för att fästa poppan på glaset genom kapilläritet och för att korrigera optiken för oljenedsänkningsmål. - Rulla en bit vått mjukpapper i kanterna av skålen för att upprätthålla luftfuktigheten. Täck skålen för att undvika uttorkning av poppar under bildbehandling.
OBS: Både kvinnliga och manliga puppor kan användas för bildbehandling. Vi rekommenderar att använda de tredje buksegmenten (AIII) som referens bukmetastamer eftersom det är nästan identiskt i båda könen när det gäller storlek, form och mönster.
3. Levande avbildning av växande bukepetelel
OBS: En inverterad laserscanning confocal mikroskop utrustad med en 40x/1.3 NA olja nedsänkning mål användes för att avbilda puppor i olika utvecklingsstadier.
- Orientera poppan över oljedroppen på glasbottenskålen enligt domänen och den process som ska utvärderas (t.ex. dorsolaterally för långsiktig levande avbildning av den tidiga expansionen av dorsala bon, eller dorsally att avbilda deras sena expansion och vävnad ombyggnad). Se figur 1J,K och figur 4.
- Överför glasbottenskålen som innehåller den monterade poppen till mikroskopstadiet och fokusera på bukområdets yta med hjälp av det överförda ljuset.
OBS: Även om detta protokoll är optimerat för bildbehandling på inverterade mikroskop, är det också möjligt att utföra avbildning på ett upprätt mikroskop. I så fall placeras provet på mikroskopstadiet med glasbottensytan uppåt. Halocarbonoljan håller varje puppa på en menisk. - Ställ in förvärvsparametrar: 1) antalet Z-skivor är vanligtvis mellan 20−40 för att möjliggöra lämplig tvådimensionell (2D) rekonstruktion av bukeepdermis; 2) stegstorlek mellan varje skiva (t.ex. 1 mikron); 3) tidsintervall för inspelning (ett 5 min intervall är lämplig för hifi-analyser av cellorienteringsdynamik); och 4) ramupplösning (t.ex. 1024 x 1024).
- Slå på lämpliga lasrar (dvs. 488 nm och 561 nm för att visualisera GFP respektive RFP fluorofores) och justera lasereffekt- och förstärknings-/offsetinställningarna för att visualisera de markerade cellerna. Använd lägsta möjliga lasereffekt (i intervallet 5%−20%) för att minimera fotobleaching och fototoxicitet.
- Ställ manuellt in position och lämpliga Z-stackgränser för flera puppor med hjälp av det motoriserade steget och mikroskopmultångsförvärvsprogrammet.
4. Generering av genetiska mosaiker för att följa beteendet hos cell kloner
OBS: Vi använder mitotisk rekombination för att inducera genetiska mosaiker i bukepitelet via platsspecifik rekombination (FLP/FRT-system21,22) ( figur2).
- Cross virgin honors carrying a heat shock-inducible Flippase transgene (hs-FLP), en FLP erkännande mål (FRT) plats på en specifik genomisk plats (t.ex. FRT-plats vid position 40A vid kromosomens L-arm 2) och en igenkännlig cellmarkör (t.ex.Figure 2A−C
OBS: Autonoma och icke-atonoma effekter inom eller utanför kloner för genförlust av funktion kan studeras med specifika Recessiv alleler distala till FRT webbplats. - Generera FLP/FRT somatiska kloner i histoblasterna genom värmechockbehandling vid det tredje instar larvstadiet av avkomman av korset. Detta utförs genom att plastflaskan som innehåller djuren sänks ned i ett vattenbad vid 37 °C i 45 min till 1 h vid det vandrande larverna (LIII) stadiet.
OBS: Den känsliga perioden för mitotisk rekombination är cellcykelns G2-fas. Histoblasts arresteras i G2 under hela larvutvecklingen. - Poäng dubbla kloner för frånvaro (dvs. mutantceller) eller förbättrade (dvs. wild type twin-spot cells) nivåer av fluorescerande proteinmarkör från 16 h APF och framåt(figur 2D).
OBS: I genomsnitt, 45 min till 1 h vid 37 °C gör ungefär endast 2−3 dubbla kloner per region av intresse (t.ex. buken hemisegment). Puppor som visar för hög klontäthet (t.ex. mer än fyra tvillingkloner per hemisegment) bör kasseras från ytterligare kvantitativa analyser. - Vid klonidentifiering, bildlevande puppor i önskat skede och under önskad tidsperiod enligt beskrivningen i föregående avsnitt.
5. Databehandling och analyser
Obs imagej.nih.gov/ij/!
- Skilja cellorienteringsdynamik från cellkorsningskonturer.
- Projicera Z-stack skivor som förvärvats genom konfokalmikroskopi i 2D med hjälp av funktionen Maximal intensitetprojektion (MIP) i ImageJ.
OBS: Antalet skivor per stapel bör hållas till ett minimum för att undvika ofokuserat buller som genereras av makrofager som patrullerar under epidermis. - Ställ in ett planarkoordinatsystem som identifierar tillförlitliga vävnadslandmärken (t.ex. a/p-avdelningsgränser) för analys av varje datauppsättning (figur 3A).
Obs! - Använd OrientationJ plugin (bigwww.epfl.ch/demo/orientation/) av ImageJ23,24 på lokala cellkanter för att få kvalitativa och kvantitativa orienteringsvärden. Insticksprogrammet återger färgkodade överlägg på indatabilder baserat på lokala orienteringar och ger numeriska värden när de används i kvantitativt läge (figur 3B-B'' och figur C−C'''').
INSTICKSPROGRAMMET OrientationJ är baserad på strukturtrors, 2 x 2 matris av egenvärden som härleds från gradient- och riktningsderivat (se referenser23,24 för en detaljerad beskrivning). - Använd alternativet OrientationJ Distribution för att färgkoda cellkantsorienteringar i förhållande till det angivna planarkoordinatsystemet (dvs. cellkantsorienteringskartor) (bild 3B). Distributionsalternativet finns under plugin-menyn i ImageJ. Inställningarna att använda är: Gaussiska fönster sigma = 1 pixel; Kubisk spline = övertoning; Minsta samstämmighet = 20 %; Minsta energi = 1%. Cellkantsorienteringar visas som en färgkodad bild som använder alternativet Färggranskning för insticksprogrammet (Hue = orientering; Mättnad = sammanhållning; och Ljusstyrka = indatabild).
OBS: Områden som innehåller bakgrundsfluorescens ger ingen riktningsinformation och måste uteslutas manuellt från analysen. Höga tröskelvärden minskar pixlarna som beaktas i de bearbetade bilderna. - Använd alternativet OrientationJ Mått för att kvantifiera cellorienteringar och riktningscellcelljustering (dvs. koherens) (bild 3C). Alternativet Åtgärd finns under plugin-menyn i ImageJ. Generera små angränsande icke-överlappande områden av intresse (ROIs) med enhetlig vikt (64 x 64 pixlar, ca 20 μm x 20 μm) inom det område som upptas av histoblasterna (figur 3C).
- Beräkna den dominerande lokala orienteringen (dvs. den genomsnittliga orienteringen mellan angränsande celler i genomsnitt cellkantorienteringskarta) och koherens från ROI: erna. Programvaran beräknar den dominerande orienteringen och den lokala sammanhållningen inom varje avkastning på sysselsatt kapital (figur 3C).
OBS: De största och minsta egenvärdena av strukturhållerhållaren som uppskattas av OrientationJ används för att beräkna samstämmigheten som förhållandet mellan deras skillnad och deras belopp. Samstämmighet begränsas mellan värden på 0−1. Värdet 1 anger fullständig anpassningsuniform, medan värdet 0 anger isotropiska områden utan justering. - Statistiskt analysera den beräknade orientering och konsekvens värden från flera bilder med hjälp av fri programvara paket såsom TIDIGARE25. Axiella data som orienteringsvärden (i grader) beskrivs på lämpligt sätt av riktningsstatistik.
- Genom programvaran, beräkna medelriktningen och cirkulär varians för varje uppsättning orienteringsfördelningar. Den statistiska betydelsen av skillnaden mellan fördelningen av orienteringarna mellan olika genotyper eller villkor bestäms med hjälp av det ickeparametriska Mardia-Watson-Wheeler-testet (W-test) för lika distributioner.
- Beräkna den statistiska betydelsen av skillnaden i koherens med tillämpning av icke-parametriska Kolmogorov-Smirnov-testet (K-S-testet). Visa data grafiskt efter behov (polära ritplaner, stapeldiagram, låddiagram osv.).
- Projicera Z-stack skivor som förvärvats genom konfokalmikroskopi i 2D med hjälp av funktionen Maximal intensitetprojektion (MIP) i ImageJ.
- Tillväxtdynamik från cellkloner
OBS: Följande steg tillåter hämtning av geometriska och formparametrar för celler från 2D MIP-bilder som innehåller kloner av intresse. För jämförelser mellan flera kloner måste bilder hämtas med samma inställningar.- Segmentkloera områden genom att rita sina konturer med verktyget ImageJ Freehand Selection.
- Beräkna geometriska parametrar och formparametrar med hjälp av verktyget Ange mått i ImageJ under menyn Analysera. Aktivera alternativen Område, Omkrets, Anpassa Ellips och Formbeskrivning.
OBS: Detta kommer att möjliggöra hämtning av olika geometriska parametrar, inklusive området (summan av pixlarna i klonen), omkretsen (summan av pixeln på klonkanten), bildförhållandet (AR, förhållandet mellan de stora och mindre axlarna i den bäst lämpade Legendre ellipsen inskriven i klongränsen) och orienteringsvinkeln (dvs. vinkeln på den stora axeln av klonen i förhållande till antero-gränsen). - Om du beräknar icke-dimensionella förhållanden från dessa mätningar hämtas formparametrar. Dessa inkluderar rundhet (4 x [område]/π x [huvudaxel]2), ojämnhet (soliditet - område/konvext område) och cirkuläritet (4π x [område]/[omkrets]2).
OBS: Var och en av formparametrarna representerar klonernas grad av avvikelse från idealiska former som en cirkel eller ett avgränsat konvexskrov, och de avgränsas alla mellan värdena 0 och 1. Värden som är lika med 1 anger maximal symmetri (dvs minimal komplexitet). - Statistiskt analysera geometriska och forma parametrar mellan olika genotyper eller villkor med hjälp av Microsoft Excel och/eller PAST. Den statistiska betydelsen av skillnaden bestäms med hjälp av ett opartat tvåstjärtat Students t-test för lika medelvärde eller det icke-parametriska Kolmogorov-Smirnov K-S-testet för lika fördelning mellan förhållandena. Data kan visas grafiskt som önskat (t.ex. stapeldiagram, låddiagram osv.). Se figur 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet som beskrivs ovan omfattar beredning av Drosophila puppor för långsiktiga levande bildbehandling och förfarandena för analys av cellorientering och tillväxt dynamik buken epidermis. Genom att tillämpa denna metod är det möjligt att generera högupplösta filmer av den utvecklande poppen under perioder på upp till 48 timmar utan betydande fotobleaching eller fototoxicitet. Ögonblicksbilder som visar bukeeepdermis (t.ex. histoblaster och LECs) vid olika tidpunkter och från puppor orienterade i olika vinklar visas i figur 4. Den efterföljande analysen av dessa filmer gör det möjligt att identifiera och kvantifiera dynamiken i lokala och globala förändringar i de viktigaste geometriska och formparametrar modulerade under utbyggnaden av histoblaster och ersättning av LECs. Dessa analyser kan utföras i olika scenarier och specifika mutanta bakgrunder. De kan också användas för kloner där genuttryck ändras, vilket leder till autonom förlust eller vinst av funktionsförhållanden. Detta skulle göra det möjligt att utforska icke-atonoma reaktioner i omgivande celler, vilket skulle underlätta identifieringen av korsprat eller cellkommunikationsmekanismer (figur 5). Detta tillvägagångssätt har nyligen använts för att identifiera fett/Dachsous/Four ledade vägen som en viktig faktor som styr och orienterar cellernas anpassning under utplaceringen av det planarpolära mönstret hos bukeexider hos den vuxna9.
Figur 1: Dissekering och montering av puppor för levande bildbehandling. (A)Från vänster till höger: dorsala syn på en prepupa vid 0 h APF (vänster) och av en puppa vid 14 h APF före (mitten) och efter (höger) avlägsnandet av det ogenomskinliga pupalfallet. Opercular regionen anges (vita pilspetsar). (B)Den väsentliga verktygslådan för dissekering visas. Från vänster till höger: glasbild, dubbelsidig tejp, ett par pincett och en glasbottensskål. (C) Iscensatta puppor är immobiliserade på dubbelsidig tejp på glasglas dorsala sida upp. Pupal fallet av varje puppa öppnas från opercular regionen med kirurgiska pincett. (D−E) Peeling av pupal fallet är gradvis. Fallet slits och viks till pupal sidorna från huvudet till buken. (F−H) Poppan lyfts försiktigt från den ventrala sidan med pincettens spetsar (G) och överförs till en glasbottensskål över en minimal droppe halocarbonolja. (I)Poppan är då lämpligt orienterad (dorsolaterally, topp; dorsally, botten). Flera puppor kan monteras samtidigt genom att upprepa stegen som visas i panelerna C−I. ( J)Bild som visar konturerna av cellerna i det dorsala histoblastboet i AIII-segmentet som uttrycker korspunktsmarkören Atpα::GFP. Poppan var orienterad dorsolaterally och avbildas på 14 h APF. Skalstång = 22 μm.(K) Bild motsvarande(J) men ur dorsal synvinkel. Dynamiken i vävnadsutveckling kan visualiseras i flera timmar. Se även figur 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Generering av genetiska mosaiker via FLP/FRT-system. (A)En föräldraanozygous cell (blek magenta) bär en recessiv mutant allel (streckad rektangel) på en kromosomarm och en genkodning för en fluorescerande markör (magenta) i den andra kromosomarmen [den vänstra armen av kromosomen 2 (2L) i detta exempel]. FRT-platser (orange rektanglar) är konstruerade i båda armarna vid samma kromosomala positioner proximala till centromere (grå ovaler). (B)Aktivering av FLP-rekombination genom värmechock i celler som pausats i G2 leder till rekombination mellan mängderna av systerkromat 1-1' och 2-2". Som ett resultat, regionen distala till FRT platser (FRT40A på 2L) utbyts. En förstorad vy visas på den högra panelen. C)Vid polarsegregeringen i de omarrangerade regionerna (1-1' och 2-2') under mitos genereras två genetiskt olika systerceller. En dotter är homozygous för recessiv allel och för hela kromosomen arm distala till platsen för rekombination. Denna cell saknar den gen som kodar för fluorescerande markör, negativt markerade i vitt. Den andra dottercellen kommer att vara homozygous för den vilda typen armen, vilket ger upphov till en twin-spot och uttrycker två kopior av de gener kodning för fluorescerande markör (mörk magenta). För enkelhetens skull visas inte segregering av omarrangerade regioner till motsatta poler i den mitotiska cellen (dvs. 1−2 och 1'−2'). Dessa ger upphov till celler fenotypiskt omöjlig att skilja från föräldracellen (heterozygous bakgrund, blek magenta). (D)Bild som visar kloner i A-facket som genereras via FLP/FRT somatisk rekombination vid det tredje instarlarvstadiet och visualiseras vid 26 h APF. Kloner av celler markeras av frånvaron av RFP.nls (svart) och homozygous uttryck av RFP.nls (ljus magenta, dubbla fläckar) i en annars heterozygous RFP.nls bakgrund (dim magenta). Motsvarande händelser kan uppnås för FRT-platser som finns på andra kromosomplatser (2R, 3L, 3R och X). Se även figur 5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Illustration av cellorienteringsmätningar. Om du vill extrahera information om cellorienteringar ställs först ett planarkoordinatsystem för att relatera cellorientering med vävnadsaxeln (A). För det andra extraheras cellorienteringar från cellkonturer (B). Sist kvantifieras cellorienteringar och justeringar med vävnadsaxeln (C). (A)Till vänster ett diagram över en sidovy av en puppa orienterad enligt planarkoordinatsystemet. De röda fasta och cyanstreckade linjerna definierar det kartesiska planet som representerar gränsen anteroposterior (A/P) respektive den dorsala mittlinjen. I mitten, en inverterad bild som visar en dorsolateral vy av expanderande histoblaster vid 26 h APF som beskrivs av junctional markör Atpα::GFP (indatabild). A/P-gränsens position markeras med en röd linje. Till höger en axiell kompass som visar den färgkod som används för att beskriva cellkantsorienteringar (polygoner) eller genomsnittliga cellorienteringar (staplar). (B)Visning av Plugins /OrientationJ menyn och OrientationJ Distribution fönster. (B) Visning av fönstret OrientationJ Distribution som visar inställningarna för de parametrar som används för att hämta cellkantsorienteringskartan till höger. (B'') Illustration av de färgkodade cellkonturerna på idealiserade celler. En cirkel visar ingen önskad färg. (C)Visning av fönstret OrientationJ-mått. C. Sekventiella skärmdumpar av fönstret OrientationJ-mått som visar hur man mäter lokal orientering och koherens i på varandra följande rois med enhetlig vikt. Den lokala orienteringsvinkeln och samstämmigheten för varje region visas som ellipsoider. (C'') Representation av de slutliga resultaten av orienteringsmätningen. Ellipsoider visar visuellt orienteringen (dvs. vinkeln på den ellipsoid längsta axeln med avseende på A / P-gränsen) och samstämmighet (dvs förhållandet mellan den längsta och kortare axeln av ellipsoid). De numeriska värdena för båda parametrarna sparas i ett kalkylblad för ytterligare analyser. (C''') Illustration av de färgkodade cellkonturerna och den genomsnittliga cellorienteringen (staplarna) på idealiserade celler. En cirkel visar ingen önskad orientering. (C'''') Representation av den önskade lokala orienteringen för varje avkastning (lokalt medelvärdeslägeskarta). Färgerna markerar orienteringen för varje region. Anterior är till vänster. Skalstång = 22 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Långsiktig levande bildbehandling av växande buken epithelia. (A)Representativa ögonblicksbilder från långsiktiga bildhanteringsfilmer från tidiga till sena faser av histoblastexpansion. Överst: Schematiska vyer av en puppa orienterad för dorsolateral avbildning vid 16 h och 26 h APF. Det territorium som upptas av bon synliga från den dorsolatala sidan av poppen markeras i mörkgrå vid 16 och 26 h APF. Nederkant: Bilder som visar cellkonturer från både histoblaster och LECs märkta med det allestädes närvarande uttrycket för korspunktören Atpα::GFP. A/P-gränsen ligger mellan de två markerade facken (Falska färgade celler i blått = främre fack; grön = bakre fack). (B)Representativa ögonblicksbilder från långsiktiga bildframställning filmer från tidiga till sena faser av bon sammanflödet. Överst: Schematisk vy av en puppa orienterad för dorsala imaging vid 32 h och 48 h APF. Nederkant: Cellkonturer (märkta och färgade som i A). Observera att Atpα::GFP-markören tillåter avgränsning av formen på enskilda epitelceller över tid med hög upplösning. Skalstång = 22 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Vävnadsegenskaper som extraherats från klonal analys. (A)Exempel på kloner av vildtyp i A-facket som kännetecknas av frånvaron av RFP.nls (svart) och deras dubbla fläckar (ljus magenta) vid 26 timmar h APF. Klonerna förlänger längs de segmentella gränserna. Tvillingkloner ordnar parallellt eller parallellt. Skalstång = 22 μm. (B)Överst: Bilder som illustrerar de parametrar som kvantifieras från klonkonturerna. Nederkant: Sammanfattande tabell med medelvärden för de angivna parametrarna för vilda djur (n = 29). C)Morfologi av vild typ klon vid 26 h (vänster) och 47 h (höger) APF. Klonen visar komplex gränsmorfologi i båda stadierna. (D)Box- och morrhårstomter för geometriska parametrar vid 26 timmar (ljusgul) och 47 timmar APF (mörkgul). Det genomsnittliga området och omkretsen ökar avsevärt under detta tidsfönster. E)Polarområden som representerar klonorienteringen (bin storlek 18°, förekomst proportionell mot området). Orienteringen bibehålls under expansion och ombyggnad. (F)Box- och morrhårstlotter för formparametrar vid 26 timmar (ljusgul) och 47 timmar APF (mörkgul). Ojämnhet (soliditet), rundhet och cirkuläritet förändras knappt. Medianvärdena visas med en röd horisontell linje och morrhåren sträcker sig till fördelningens lägsta och högsta värden. Statistik utfördes med K-SM-test eller W-tester (p < 0,0001****, p > 0,05 inte signifikant). Anterior är till vänster, dorsal är upp. Skalstång = 16 μm. Genotyp är hsflp1.22; FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Långväga ordning är en viktig egenskap hos de flesta funktionella fysiologiska enheter. Under morfogenesis uppnås ordning genom integration av komplexa instruktioner som genomförs med hög tidsmässig och rumslig precision. Flera och multilevel begränsningar är integrerade i stereotypa vävnad arrangemang.
Polaritet och riktning är avgörande för ordnade rumsliga arrangemang under utveckling. Polaritet innebär symmetribrott under utveckling. Uppnåendet av asymmetri är nödvändigt för bestämningen av de embryonala anteroposterior (A/P) och dorsoventral (D/V) axlar och vuxen organisation26. Utöver denna tidiga roll är lokala asymmetrier nödvändiga för morfologisk mångfald på alla nivåer. Riktning är ett viktigt komplement av asymmetri och polaritet under morphogenesis. Global ordning genomförs genom cellernas förmåga att känna av och överföra signaler lokalt på en cell-till-cell-bas med en exakt känsla eller orientering. Enskilda celler asymmetrier harmoniserakooperativt över tiden genom att orientera positioner eller rörelser inom särskilda riktningar i rymden. Cellkommunikation involverar utsöndrade faktorer, cellcellkontakter och mekaniska ingångar. Signaler fungerar på cellfält som först lokalt och sedan globalt ändra sina beteenden27.
Detta arbete presenterar ett enkelt sätt att analysera samordnade beteenden av enskilda celler, inklusive deras plana orientering och tillväxtparametrar under utvecklingen av vävnadsordning. Morphogenesis av den vuxna buken av Drosophila under pupation presenterar en rad tekniska fördelar jämfört med andra likvärdiga modeller såsom könsporsband förlängning / upprullning28 eller dorsala stängning29 under flyga embryogenesis, Drosophila vinge morphogenesis ex vivo30, ventrala inneslutningen i Caenorhabditis elegans31, eller palatal fusion hos möss32, bland andra.
Först utgör bukmorfogenes en process som kan följas i sin helhet in vivo. Kontinuerlig levande bildbehandling av ersättning av LECs av histoblasts kan utföras från 12 h APF, när poppan bildas, upp till slutförandet av vuxna epitelial morphogenesis. För det andra tillåter det analyser av en fullständig uppsättning cellbeteenden som cellmigrering, division, formändringar, delaminering och intercalation. Slutligen är det mottagligt för genetisk inblandning och klonal analys. Autonoma och icke-atonoma effekter av förlust och vinst av funktionsaktiviteter kan övervakas live genom att använda lämpliga markörer. Men poppan som modellsystem presenterar några mindre begränsningar. På grund av dess äggformade form är det inte möjligt att utföra samtidig levande avbildning av laterala och dorsala händelser med hög upplösning. Den här lämna ut kanna bli övervinna vid utförande sekventiell avbildning i dorsolaterally och dorsally orientering pupae eller bättre, vid användande mångfaldig vinkel ljus blad selektiv planlili mikroskopi (SPIM) mikroskopi. En annan nackdel är förekomsten av två olika cellpopulationer av olika storlekar i analyserna (dvs. polyploida LECs och diploida histoblaster). Detta kan göra bildsegmentering komplex och de två cellpopulationerna måste analyseras separat.
I framtiden kan den långsiktiga avbildningen av Drosophila puppor enkelt anpassas för att studera ett komplett utbud av morfogenetiska fenomen, inklusive samordning av epidermal, muskulös och neural utveckling under metamorfos i vilda typer och mutanta tillstånd. Dessutom kan algoritmer och plugins som används användas för att studera organisationen, mönstring och dynamiken i många andra vävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi vill tacka medlemmarna i Martín-Blanco-laboratoriet för hjälpsamma diskussioner. Vi tackar också Nic Tapon (The Crick Institute, London, Storbritannien), Bloomington Stock Center (University of Indiana, USA) och FlyBase (för Drosophila genanteckning). Federica Mangione stöddes av en JAE-CSIC predocstipendium. Laboratoriet Martín-Blanco finansierades genom Programmeta Estatal de Fomento de la Investigación Científica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P och BFU2017-82876-P) och från Fundación Ramón Areces.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis Software | - | ImageJ | Analyzing data |
| Drosophila | Atpa::GFP | - | Strains employed for data collection |
| Drosophila | hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | - | Strains employed for data collection |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter for dissection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting pupae for data collection |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | mounting pupae |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Data collection |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the pupae during dissection |
References
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Deans, M. R. A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae. Seminars in Cellular and Developmental Biology. 24, 490-498 (2013).
- Stell, W. K. The structure and morphologic relations of rods and cones in the retina of the spiny dogfish, Squalus. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Comparative Physiology. 42, 141-151 (1972).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bosveld, F., et al. Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway. Science. 336, 724-727 (2012).
- Puah, W. C., Wasser, M. Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis. Methods. 96, 103-117 (2016).
- Teng, X., Qin, L., Le Borgne, R., Toyama, Y. Remodeling of adhesion and modulation of mechanical tensile forces during apoptosis in Drosophila epithelium. Development. 144, 95-105 (2017).
- Weavers, H., et al. Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient. Current Biology. 26, 1975-1989 (2016).
- Mangione, F., Martin-Blanco, E. The Dachsous/Fat/Four-Jointed Pathway Directs the Uniform Axial Orientation of Epithelial Cells in the Drosophila Abdomen. Cell Reports. 25, 2836-2850 (2018).
- Casal, J., Struhl, G., Lawrence, P. A. Developmental compartments and planar polarity in Drosophila. Current Biology. 12, 1189-1198 (2002).
- Wootton, R.
- Zallen, J. A., Wieschaus, E. Patterned gene expression directs bipolar planar polarity in Drosophila. Developmental Cell. 6, 343-355 (2004).
- Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epithelia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. Journal of Morphology. 59, 351-399 (1936).
- Mandaravally Madhavan, M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 183, 269-305 (1977).
- Kornberg, T. Compartments in the abdomen of Drosophila and the role of the engrailed locus. Developmental Biology. 86, 363-372 (1981).
- Garcia-Bellido, A., Merriam, J. R. Clonal parameters of tergite development in Drosophila. Developmental Biology. 26, 264-276 (1971).
- Roseland, C. R., Schneiderman, H. A. Regulation and metamorphosis of the abdominal histoblasts of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 186, 235-265 (1979).
- Madhavan, M. M., Madhavan, K. Morphogenesis of the epidermis of adult abdomen of Drosophila. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 60, 1-31 (1980).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Fonck, E., et al. Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries. Stroke. 40, 2552-2556 (2009).
- Rezakhaniha, R., Fonck, E., Genoud, C., Stergiopulos, N. Role of elastin anisotropy in structural strain energy functions of arterial tissue. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 10, 599-611 (2011).
- Hammer, Ø, Harper, D. A., Ryan, P. D. PAST: paleontological statistics software package for education and data analysis. Palaeontologia electronica. 4, 1-9 (2001).
- Gray, R. S., Roszko, I., Solnica-Krezel, L. Planar cell polarity: coordinating morphogenetic cell behaviors with embryonic polarity. Developmental Cell. 21, 120-133 (2011).
- Vogg, M. C., Wenger, Y., Galliot, B. How Somatic Adult Tissues Develop Organizer Activity. Current Topics in Developmental Biology. 116, 391-414 (2016).
- Collinet, C., Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Local and tissue-scale forces drive oriented junction growth during tissue extension. Nature Cell Biology. 17, 1247-1258 (2015).
- Martin-Blanco, E., et al. puckered encodes a phosphatase that mediates a feedback loop regulating JNK activity during dorsal closure in Drosophila. Genes and Development. 12, 557-570 (1998).
- Dye, N. A., et al. Cell dynamics underlying oriented growth of the Drosophila wing imaginal disc. Development. 144, 4406-4421 (2017).
- Williams-Masson, E. M., Malik, A. N., Hardin, J. An actin-mediated two-step mechanism is required for ventral enclosure of the C. elegans hypodermis. Development. 124, 2889-2901 (1997).
- Ferguson, M. W.
