Summary
该协议旨在成像和分析果蝇在果蝇发生变质时，果蝇腹部上皮细胞定向和组织生长动力学。本文描述的方法可用于研究果蝇或其他模型生物体的不同发育阶段、组织和亚细胞结构。
Abstract
在多细胞生物体中，成熟的组织和器官在其组成细胞的空间排列中表现出高度的秩序。感官上皮给出了一个显著的例子，其中相同或不同身份的细胞通过细胞粘附性（显示高度组织的平面模式）聚集在一起。单元格以相同的方向相互对齐，并在较大距离内显示等效极性。成熟的上皮体组织是在形态形成过程中建立的。为了理解成熟上皮的平面排列是如何实现的，在体内发育过程中以高时空保真度跟踪细胞方向和生长动力学至关重要。强大的分析工具对于识别和描述本地到全球的过渡也至关重要。果蝇小狗是一个理想的系统，用于评估定向细胞形状变化的基础上皮形态发生。上皮发育的皮毛构成不动体的外表面，允许对完整动物进行长期成像。此处描述的协议旨在成像和分析在皮球腹部表皮生长时全球和局部水平的细胞行为。所述方法可轻松适应其他发育阶段、组织、亚细胞结构或模型生物体的细胞行为成像。
Introduction
为了发挥自身的作用，上皮组织完全依赖于其细胞成分的空间组织。在大多数上皮上，细胞不仅相互挤合，以形成精确的鹅卵石层，而且相对于身体轴的方向。
精确组织组织的功能重要性在感觉上皮中显而易见，如脊椎动物内耳和视网膜。在第一种情况下，头发和支撑细胞以特定的轴向方向对齐，以有效感知机械输入，如声音和运动11、22。同样，光受体细胞空间组织对于通过视网膜3实现最佳光学特性至关重要。因此，细胞位置和方向的空间控制对于适当的生理功能具有特别重要的意义。
果蝇是一种全息昆虫，通过蜕变，对幼虫体结构进行完全转化，导致其成年组织。果蝇pupa是一个优秀的模型，用于各种动态事件的非侵入性活成像，包括发育细胞迁移4、细胞分裂和生长动力学5、肌肉收缩6、细胞死亡7、伤口修复8和细胞定向9。在成人果蝇中，外部上皮表现出高度的秩序。这很容易观察到的三角（即，细胞突起源自单上皮细胞）和感觉刷毛遍布苍蝇的身体表面10。事实上，三角线排列在平行行引导气流11。成人上皮的形态和单个细胞的有序排列在胚胎生成期间开始，并在胚胎阶段达到高潮。虽然在胚胎细胞分裂，杂交和形状的变化都减少组织顺序12，13，这是在发育的后期阶段，特别是在pupal阶段，当苍蝇接近成熟12,9。
不动的果蝇小狗提供了一个理想的系统来评估细胞的形状和方向变化。皮巴腹部表皮具有特殊优势。当成年头、胸腔、生殖器和附属物的前体生长并从幼虫阶段得到图案时，被集成到幼虫表皮中的组状细胞开始生长和区分，仅在幼崽14。此功能允许跟踪所有参与建立组织秩序的时空事件。
在胚胎发育期间，在每个假定腹段的相反位置指定了组织爆炸。成人的背腹部表皮来自地主位置的组震巢穴，存在于前和后舱15，16。15,当组织爆炸扩大，取代幼虫上皮细胞（LECs），反向巢在背侧中线引信形成一个汇管板17，18，19，20。17,18,19,20
本研究描述了1）一种对果蝇小狗进行解剖、安装和长期实时成像的方法，以及2）以高时空分辨率研究细胞定向和生长动力学的分析方法。此处提供了详细的协议，涵盖从初始 pupae 制备（即暂存和成像）到定向和方向特征的提取和定量所需的所有步骤。我们还描述了如何从细胞克隆的分析中推断局部组织特性。所述的所有步骤都是微创的，允许长期实时分析。此处描述的方法可以很容易地适应并应用于其他发育阶段、组织或模型生物体。
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Protocol
注：该协议分为五个步骤：（1） 暂存小狗，（2） 准备小狗成像，（3） 生长的腹部上皮的活成像，（4） 生成遗传马赛克，（5） 数据处理和分析（包括描述如何从细胞结轮廓分析细胞方向动力学和细胞克隆的生长动力学的部分）。
1. 成像前分期使用果蝇小狗
- 产卵（AEL）后，在25°C（±12小时）的塑料小瓶中培养标准基的相应基因型，5天（±12小时）。
注：在幼虫形成（APF）后，在120 h AEL下，在第三颗恒星幼虫的禁闭范围内开始蜕变。这种过渡很容易识别，因为幼虫停止喂食和移动，并在0-12 h APF下形成操作区域（图1A）。紫杉最初是软和白色的，但逐渐变硬和晒黑。 - 使用湿润的画笔将白色预食 （0 h APF） 转移到新鲜的塑料小瓶中。动物可以保持在不同的温度根据设计的实验，直到所需的年龄。
注：Pupa形成（即，小狗）发生在12小时APF，当成人苍蝇的头部和附属物完全被避开时（图1A）。此时，pupal 大小箱与 pupa 完全分离，允许其完全删除（图 1A）。
2. 准备使用小狗进行现场成像
注： 暂存后，将解剖并安装图（另另见图 1）。
- 在钳子的帮助下，从小瓶的墙壁上取下上演的小狗。
- 将每支小狗的腹侧粘在玻璃滑道上，上面覆盖着双面胶带。用钳子的尖端轻轻敲击头螺旋藻（即操作区域）和pupa的背部表面，以确保脓壳与胶带的粘附（图1A，B）。
注：背板表面应朝上，以方便对病例进行解剖和回收小狗。 - 在立体显微镜下开始解剖，用钳子轻轻地从紫杉中取下手术图（图1C）。
- 通过操作性开口，在钳子壳和 pupa 表面之间的浅角度插入钳子的一个尖端。在一个或多个摆动中，横向将箱子从头撕到尾，避免挤压 pupa（图1D）。继续向前端（图 1E），将破裂的 pupal 壳折叠回侧边。
注：小壳外壳相当硬质，容易开裂。在湿度高或特别基因背景的情况下，脓肿情况变软，撕裂更加困难。在这些情况下，通过用钳子的两个尖端刺破其自由边缘，可以帮助 pupal 外壳的开裂。 - 小心地将钳子插入动物下方并轻轻拉起，从打开的脓箱中取出小狗（图1F）。小狗将粘在钳子的尖端（图1G+H）。
- 在钳子的帮助下将pupa转移到玻璃底盘，并放在一小滴透气的卤化碳油上（图1I）。轻轻地握住支室侧，以避免任何可能的组织损伤。
注：卤化碳油的滴必须很小，直径大约不到普帕长度的一半。这种量足以通过毛细管将 pupa 粘附在玻璃上，并纠正用于油浸没目标的光学元件。 - 在盘子边缘卷起一块湿纸巾以保持湿度。盖上盘子，避免在成像过程中使小狗脱水。
注：女性和雄性小狗都可以用于成像。我们建议使用第三腹部段 （AIII） 作为参考腹部元粒，因为它在大小、形状和图案方面几乎在两性上相同。
3. 腹部上皮生长的实时成像
注：一种带 40x/1.3 NA 油浸没目标的倒置激光扫描共聚焦显微镜用于在不同发育阶段成像 Pupae。
- 根据领域和要评估的过程，将 pupa 定向到玻璃底盘上的油滴上（例如，在地底上进行背底早期扩张的长期实时成像，或将拖底成像为其后期膨胀和组织重塑）。参见图 1J、K和图 4。
- 将装有安装的小狗的玻璃底盘转移到显微镜阶段，并使用透射光聚焦腹部表面。
注：即使此协议针对倒置显微镜上的成像进行了优化，也可以在直立显微镜上进行成像。在这种情况下，样品被放置在显微镜舞台上，玻璃底部表面朝上。卤化碳油将每一个小狗都放在半月板上。 - 设置采集参数：1） Z 切片的数量通常在 20~40 之间，以便对腹部表皮进行适当的二维 （2D） 重建;2） 每片之间的步长大小（例如，1 微米）;3） 记录时间间隔（5 分钟间隔适用于细胞方向动力学的高保真分析）;和 4） 帧分辨率（例如，1024 x 1024）。
- 打开适当的激光器（即 488 nm 和 561 nm，分别可视化 GFP 和 RFP 荧光波），并调整激光功率和增益/偏移设置以可视化标记的细胞。使用尽可能低的激光功率（范围为 5%+20%）尽量减少光漂白和光毒性。
- 使用附加的电动级和显微镜多位置采集软件手动设置多普帕的位置和适当的 Z 堆栈限制。
4. 生成遗传马赛克以遵循细胞克隆的行为
注：我们采用线粒体重组，通过部位特异性重组（FLP/FRT系统21，22）诱导腹部上皮的基因马赛克（21,图2）。
- 携带热休克诱导的Flippase转基因（hs-FLP）的跨处女，一个在特定基因组位置的FLP识别靶点（FRT）（例如， FRT位位于2号染色体L臂位置40A处，以及一个可识别的细胞标记（例如，Ubi-RFP.nls或Ubi-GFP.nls），远至FRT部位，与携带FRT位位的突变雄性在等效基因组位置（图2A+C）远。
注：克隆体内或克隆外的自主和非自主效应可用于任何基因功能丧失，可利用与FRT位点远端的特定隐性等位基因进行研究。 - 在十字后代的第三个星幼虫阶段通过热休克处理在原体上生成FLP/FRT体体克隆。在流浪幼虫（LIII）阶段，通过将含有动物的塑料小瓶浸入37°C的水浴中45分钟至1小时进行。
注：线粒体重组的敏感期是细胞循环的 G2 相位。在整个幼虫发育过程中，在G2中逮捕了一些细胞。 - 从16小时APF开始，对荧光蛋白标记物的缺失（即突变细胞）或增强（即野生型双斑细胞）水平进行评分（图2D）。
注：平均而言，在37°C下，45分钟至1小时，每个感兴趣的区域（例如腹部中段）仅产生2-3个双胞胎克隆。从进一步的定量分析中，应该抛弃显示过高克隆密度的Pupae（例如，每个中段超过四个双胞胎克隆）。 - 克隆鉴定后，图像活的pupae在所需的阶段和所需的时间长度，如上一节所述。
5. 数据处理和分析
注： 数据使用 ImageJ （imagej.nih.gov/ij/） 处理。
- 区分细胞方向动力学和细胞结轮廓。
- 使用 ImageJ的最大强度投影（MIP） 函数，在 2D 中投影共聚焦显微镜获取的 Z 堆栈切片。
注： 每个堆栈的切片数应保持在最小，以避免表皮下巡逻的巨噬细胞产生的焦点噪声失焦点。 - 设置平面坐标系，识别可靠的组织地标（例如，A/P 隔间边界），以便分析每个数据集（图 3A）。
注： 为每个数据集使用相同的平面引用将允许比较多个测量值。 - 使用ImageJ23，24,24的定向J插件（bigwww.epfl.ch/demo/orientation/）在局部细胞边缘获得定性和定量方向值。插件根据局部方向在输入图像上渲染颜色编码叠加，并在定量模式下使用时提供数值（图3B+B'和图 C_C''）。
注：定向J插件基于结构张力，2 x 2 矩阵的 eigen值矩阵派生自梯度和方向导数（有关详细说明，请参阅参考文献 23，24）。,24 - 使用"定向J分布"选项对相对于设置平面坐标系（即单元格边缘方向贴图）的单元格边缘方向进行颜色编码（图 3B）。在 ImageJ 中的插件菜单下找到"分发"选项。要采用的设置是：高斯窗口西格玛 = 1 像素;立方样条线 = 渐变;最小一致性 = 20%;最小能量 = 1%。单元格边缘方向显示为使用插件的颜色测量选项的颜色编码图像（Hue = 方向;饱和度 = 一致性;和亮度 = 输入图像）。
注： 包含背景荧光的区域不提供任何方向信息，必须手动从分析中排除。高阈值设置可减少已处理图像中考虑的像素。 - 使用定向J测量选项量化细胞方向和方向细胞-细胞对齐（即一致性）（图3C）。"度量"选项位于 ImageJ 中的插件菜单下。在组织爆炸占用的区域内生成均匀重量（64 x 64 像素，约 20 μm x 20 μm）的较小相邻非重叠感兴趣区域 （ROIs）。Figure 3C
- 计算主要局部方向（即相邻单元格平均单元格边缘方向贴图之间的平均方向）和来自 RO 的一致性。该软件计算每个 ROI 中的主要方向和本地一致性（图3C）。
注：定向J估计的结构拉伸量的最大和最小 eigen 值用于计算一致性，作为其差值和总和之间的比率。一致性在值 0+1 之间受约束。值 1 表示完全对齐均匀性，而值 0 表示无对齐的各向异性区域。 - 使用免费软件包（如 PAST25）从多个图像中分析计算的方向和一致性值。方向统计对方向值（以度计）等轴向数据进行了适当的描述。
- 通过软件计算每组方向分布的平均方向和圆方差。使用非参数马尔迪亚-沃森-惠勒测试（W-test）确定不同基因型或条件之间方向分布差异的统计意义。
- 计算使用非参数科尔莫戈罗夫-斯米尔诺夫测试（K-S 检验）的一致性差异的统计显著性。根据需要以图形方式显示数据（极坐标图、条形图、框图等）。
- 使用 ImageJ的最大强度投影（MIP） 函数，在 2D 中投影共聚焦显微镜获取的 Z 堆栈切片。
- 细胞克隆的生长动态
注： 以下步骤允许从包含感兴趣的克隆的 2D MIP 图像中检索单元格的几何和形状参数。要比较多个克隆，必须使用相同的设置获取图像。- 使用 ImageJ手绘选择工具绘制其轮廓来分割克隆区域。
- 使用"分析"菜单下的 ImageJ设置测量工具计算几何和形状参数。激活"区域"、周长、拟合椭圆和形状描述符选项。
注： 这将允许检索不同的几何参数，包括区域（克隆内像素之和）、周长（克隆边框的像素总和）、纵横比（AR、刻在克隆边框中的最佳拟合图例椭圆的主要轴和次要轴之间的比率）和方向角度（即克隆主轴相对于前轴边界的角度）。 - 从这些测量中计算非维比可检索形状参数。这些包括圆度（4 x 面积*/x [主轴]2）、粗糙度（固体 - 区域/凸区）和圆度（4°x [面积]/[周长]2）。
注： 每个形状参数表示克隆与理想形状（如圆或界形凸体）的偏差程度，它们都边界在值 0 和 1 之间。值等于 1 表示最大对称性（即最小复杂性）。 - 使用 Microsoft Excel 和/或 PAST 以统计方式分析不同基因类型或条件之间的几何和形状参数。差异的统计意义是使用无对的双尾学生 t 检验等均值或非参数科尔莫戈罗夫-斯米尔诺夫 K-S 检验确定条件之间相等分布的 t 检验。数据可以按所需方式以图形方式显示（例如，条形图、框图等）。参见图 5。
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Representative Results
上述协议包括为长期活体成像制备果蝇小狗，以及分析腹部表皮细胞取向和生长动力学的程序。通过应用这种方法，可以生成发育中的普帕的高分辨率电影，时间长达48小时，而不会显著光漂白或光毒性。图4显示了描绘不同时间点和从不同角度方向的pupae的腹部表皮（例如，组织爆炸和LECs）的快照。对这些电影的后续分析能够识别和量化在扩容和更换LEC期间调整的主要几何和形状参数中局部和全局变化的动态。这些分析可以在不同的场景和特定的突变背景中执行。它们还可用于基因表达改变的克隆，导致功能条件的自主丧失或增益。这将允许探索周围细胞中的非自主反应，促进交叉通话或细胞通信机制的识别（图5）。这种方法最近被用于识别脂肪/达奇苏/四个连接通路作为关键元素指导和定向细胞对齐期间部署的平面极性模式的腹部表皮的成人9。
图 1：用于实时成像的解剖和安装 pupae。（A） 从左到右：在 0 h APF（左）处的预赛和 14 小时 APF 处的 pupa 的背视图，以及删除不透明的 pupal 壳盒之前（中）和之后（右）。指示操作区域（白色箭头）。（B） 显示了解剖的基本工具包。从左到右：玻璃滑梯、双面胶带、一对钳子和一个玻璃底盘。（C） 在玻璃滑梯上，在双面胶带上固定着上演的小狗。每个小狗的脓肿病例从手术区域打开，带有手术钳。（D+E）脓壳的剥落是渐进的。箱子被撕开，从头部折叠到腹部。（F=H）用钳子（G） 的尖端轻轻地从通风侧抬起，在少一滴卤化碳油上转移到玻璃底盘中。（I） 然后，pupa 方向适当（地，上;多萨利，底部）。通过重复面板C+I中所示的步骤，可以同时安装多个 pupae。（J） 显示 AIII 段背组织爆炸巢穴的细胞轮廓，表示交点 Atp_：GFP。小狗以地道定向，在14小时APF处成像。比例条 = 22 μm. （K） 图像等效于 （J）， 但从背对条的角度。组织发育的动态可以可视化几个小时。另请参阅图 4。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：通过FLP/FRT系统生成遗传马赛克。（A） 父母杂色细胞（淡洋红色）在一条染色体臂上携带隐性突变等位基因（短形矩形），并在另一染色体手臂（本例中染色体 2L）的左臂上对荧光标记（洋红色）进行基因编码。FRT 场点（橙色矩形）在两臂中设计，其染色体位置与中心（灰色椭圆）近在咫起。（B） 在 G2 中暂停的细胞中，通过热冲击激活 FLP 重组酶，导致姐妹色质 1-1' 和 2-2' 的 FRT 之间的重组。因此，将交换与 FRT 站点（2L 上的 FRT40A）远端的区域。右侧面板上显示放大视图。（C） 在线粒体化期间，在重新排列的区域（1-1' 和 2-2'）的极隔离下，生成了两个基因上不同的姐妹细胞。一个女儿是隐性等位基因的同源，整个染色体手臂远至重组部位。这个细胞缺乏编码荧光标记的基因，以白色标记呈阴性标记。另一个子细胞将为野生型手臂的同源细胞，产生一个双点，并表达荧光标记（暗洋红色）的基因编码的两个副本。为简单起见，不显示重新排列的区域与线粒细胞的对极（即 1⁄2 和 1'2'）的隔离。这些导致细胞表状与亲细胞（异血型背景，淡洋红色）几乎无法区分。（D） 显示通过 FLP/FRT 体体重组在第三个星幼虫阶段通过 FLP/FRT 躯体重组生成的 A 舱中的克隆的图像，并在 26 h APF 时可视化。细胞克隆的特点是在其它 RFP . nls 背景（二丁洋红色）中没有 RFP . nls （黑色）和同源表达 RFP . nls （明亮的品红色，双点）。对于位于其他染色体位置（2R、3L、3R 和 X）的 FRT 站点，可实现等效事件。另请参阅图 5。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 3：细胞方向测量的插图。为了提取细胞方向的信息，首先设置平面坐标系，将细胞方向与组织轴联系起来 （A）。其次，细胞方向是从细胞轮廓（B） 中提取的。最后，细胞方向和与组织轴的对齐被量化 （C）。（A） 在左侧，根据平面坐标系定向的 pupa 横向视图图。红色实体和青色虚线分别定义分别表示前背（A/P） 边界和背底中线的笛卡尔平面。中间是一个倒置图像，显示交点标记 Atp_：GFP（输入图像）在 26 小时 APF 处展开的声带视图。A/P 边界的位置用红线突出显示。右侧，一个轴向指南针，显示用于描述细胞边缘方向（多边形）或平均单元格方向（条形）的颜色代码。（B） 显示插件/方向J菜单和方向J分发窗口。（B'）显示方向J分布窗口，显示用于获取右侧单元格边缘方向贴图的参数的设置。（B'）理想化单元格上颜色编码的单元格轮廓的插图。圆圈不显示任何首选颜色。（C）定向J 测量窗口的显示。（C'）定向J 测量窗口的顺序屏幕截图，显示如何在具有均匀重量的连续 RO 中测量局部方向和一致性。每个区域的局部方向角度和一致性显示为椭圆体。（C'）表示方向测量的最终结果。椭圆体直观地显示方向（即椭圆体最长轴相对于 A/P 边界的角度）和一致性（即椭圆体最长轴和较短轴之间的比率）。这两个参数的数值都保存在电子表格中，以便进一步分析。（C''）理想化单元格上颜色编码的单元格轮廓和平均单元格方向（条形）的插图。圆不显示任何首选方向。（C'''）表示每个 ROI 的首选本地方向（本地平均方向图）。颜色突出显示每个区域的方向。前在左边。刻度柱 = 22 μm。请点击此处查看此图形的较大版本。
图4：腹部上皮生长的长期活成像。（A） 从组织扩张的早期到晚期的长期成像电影中，有代表性的快照。顶部：以 16 小时和 26 小时 APF 为定向多侧成像的 pupa 的原理图视图。从pupa的土方侧可见的巢穴所占据的领土在16和26小时APF处以深灰色突出显示。底部：显示由交界标记 Atp_：GFP 的无处不在表达式标记的声体和 LEC 的细胞轮廓的图像。A/P 边界位于两个高亮的隔间之间（蓝色假彩色单元格 = 前隔间;绿色 = 后隔间）。（B） 从燕窝的早到晚期的长期影像电影中，有代表性的快照。顶部：以 32 小时和 48 小时 APF 为背成像方向的 pupa 的原理图视图。底部：单元格轮廓（标记和着色，如 A 所示）。请注意，Atp®：：GFP 标记允许随着时间的推移以高分辨率对单个上皮细胞的形状进行划定。刻度柱 = 22 μm。请点击此处查看此图形的较大版本。
图5：从克隆分析中提取的组织特性。（A） A ） A 舱中野生型克隆的示例，其标记是 26 小时 APF 时没有 RFP.nls （黑色） 及其双点（明亮的洋红色）。克隆沿段边界拉长。双克隆并行或串联排列。刻度柱 = 22 μm。（B） 顶部：显示从克隆轮廓中量化的参数的图像。底部：汇总表，报告野生类型动物（n = 29）指示参数的平均值。（C） 野生型克隆的形态在 26 小时（左）和 47 小时（右）APF。克隆在两个阶段都显示复杂的边框形态。（D） 在 26 小时（浅黄色）和 47 h APF（深黄色）处的几何参数的框和胡须图。在此时间窗口中，平均面积和周长显著增加。（E） 表示克隆方向的极性图（箱大小 18°，丰度与区域成比例）。在扩展和改造过程中，方向是持续的。（F） 形状参数的框和胡须图位于 26 小时（浅黄色）和 47 h APF（深黄色）。粗糙度（固体）、圆度和圆度几乎没有变化。中值以红色水平线显示，胡须延伸到分布的最小值和最大值。使用 K-SM 测试或 W 测试（p < 0.0001°，p > 0.05 不显著）执行统计信息。前在左边，背对着。刻度柱 = 16 μm。基因型为hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls.请点击此处查看此图形的较大版本。
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Discussion
远程顺序是大多数功能性生理单元的基本特征。在形态生成过程中，通过集成以高时空精度实现的复杂指令来实现顺序。多级和多级约束被集成到定型的组织安排中。
极性和定向性对于开发过程中的有序空间排列至关重要。极性意味着在开发过程中对称性断裂。实现不对称是必要的，以确定胚胎前背（A/P）和多索温托（D/V）轴和成人组织26。除了这种早期作用之外，局部不对称对于各级的形态多样性至关重要。定向性是形态发生过程中不对称和极性的重要补充。全局顺序是通过单元以精确感知或定向在细胞到细胞基座上感应和传输信号的能力实现的。单细胞不对称通过定位空间特定方向的位置或运动，随着时间的推移协同协调。细胞通信涉及分泌因子、细胞接触和机械输入。信号作用于首先在本地进行然后全局修改其行为的单元格区域27。
本文提出了一种简单的方法来分析单个细胞的协调行为，包括其平面方向和组织秩序发展过程中的生长参数。与其它等效型号（如细菌带延伸/回缩28或飞胚胎成期期间背带闭合29、果蝇翅膀形态外体30、卡诺哈卜炎支体31、小鼠32等）的腹膜融合等，果蝇杆菌的成年腹部的形态发生具有一系列技术优势。
首先，腹部形态形成是一个过程，可以遵循其整个体内。从12小时APF开始，在形成pupa时，连续进行由组织爆炸取代LECs的连续实时成像，直到完成成人上皮形态形成。其次，它允许分析一整套细胞行为，如细胞迁移、分裂、形状变化、分层和间位。最后，它适用于遗传干扰和克隆分析。函数活动的丧失和增益的自主和非自主效应可以通过使用适当的标记进行实时监测。然而，pupa作为一个模型系统提出了一些细微的限制。由于其卵形，无法以高分辨率同时对横向和背部事件进行实时成像。通过采用多角度光片选择性平面照明显微镜（SPIM）显微镜，在多角度光片选择性平面照明显微镜（SPIM）显微镜中进行多角度光片选择性平面照明显微镜 （SPIM） 显微镜，可以通过在多声和多声透射中进行连续成像来克服此问题。另一个缺点是分析中存在两种不同大小的细胞群（即多倍体LEC和双倍体组织爆炸）。这会使图像分割变得复杂，并且必须分别分析两个细胞群。
在未来，果蝇果蝇的长期成像可以很容易地适应研究各种形态遗传现象，包括协调表皮，肌肉和神经发展在野生类型和突变条件下的蜕变。此外，可以使用的算法和插件来研究许多其他组织的组织、模式和动力学。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
我们要感谢马丁-布兰科实验室的成员进行了有益的讨论。我们还感谢尼克·塔彭（英国伦敦克里克研究所）、布卢明顿股票中心（美国印第安纳大学）和FlyBase（关于果蝇基因注释）。费德里卡·曼吉奥内得到了JAE-CSIC博士前研究金的支持。马丁-布兰科实验室的资金来自"科学科学和科学投资方案"（BFU2014-57019-P和BFU2017-82876-P）和拉蒙阿雷塞斯基金会。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis Software | - | ImageJ | Analyzing data |
| Drosophila | Atpa::GFP | - | Strains employed for data collection |
| Drosophila | hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | - | Strains employed for data collection |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter for dissection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting pupae for data collection |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | mounting pupae |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Data collection |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the pupae during dissection |
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