Summary
이 프로토콜은 과일 파리가 변형을 겪으면서 Drosophila 복부 상피에서 세포 배향 및 조직 성장의 역학을 이미징 및 분석하기 위해 설계되었습니다. 여기에서 기술된 방법론은 Drosophila 또는 그밖 모형 유기체에 있는 다른 발달 단계, 조직 및 subcellular 구조물의 연구 결과에 적용될 수 있습니다.
Abstract
다세포 유기체 내에서, 성숙한 조직 및 기관은 그들의 구성 세포의 공간 배열에 순서의 높은 학위를 표시합니다. 놀라운 예는 동일하거나 명백한 정체성의 세포가 고도로 조직된 평면 패턴을 보여주는 세포 세포 접착을 통해 함께 모이는 감각 에피텔리아에 의해 주어집니다. 셀은 동일한 방향으로 서로 정렬하고 큰 거리에서 동등한 극성을 표시합니다. 성숙한 상피의이 조직은 형태 형성의 과정을 통해 확립됩니다. 성숙한 상피의 평면 배열이 달성되는 방법을 이해하기 위하여는, 생체 내에서 발달 도중 높은 주시부 충실도를 가진 세포 배향 그리고 성장 역학을 추적하는 것이 중요합니다. 또한 로컬-글로벌 전환을 식별하고 특성화하는 데 강력한 분석 도구도 필수적입니다. Drosophila pupa는 상피 형태 형성의 근본적인 지향성 세포 모양 변경을 평가하는 이상적인 시스템입니다. pupal 개발 상피는 움직이지 않는 바디의 외부 표면을 구성합니다, 손상되지 않은 동물의 장기 적인 화상 진찰을 허용하. 여기에서 기술된 프로토콜은 퍼팔 복부 표피에 있는 글로벌 그리고 현지 수준 둘 다에 있는 세포 행동을 심상하고 분석하기 위하여 디자인됩니다. 기술된 방법론은 그밖 발달 단계, 조직, 세포이하 구조물, 또는 모형 유기체에 세포 행동의 화상 진찰에 쉽게 적응될 수 있습니다.
Introduction
그들의 역할을 달성하기 위해 상피 조직은 세포 구성 요소의 공간 조직에 완전히 의존합니다. 대부분의 에피텔리아에서 세포는 정확한 조약돌 층을 만들기 위해 서로 에피테일뿐만 아니라 신체 축을 기준으로 방향을 조정합니다.
정확한 조직 조직의 기능적 중요성은 척추 동물 내이및 망막과 같은 감각 상피에서 명백합니다. 첫 번째 경우, 머리카락과 지지 셀은 특정 축 방향으로 정렬되어 소리 및 동작1,,2와같은 기계적 입력을 효율적으로 감지합니다. 유사하게, 광수용체 세포 공간 조직은 망막3에의해 최적의 광학 적 특성을 달성하기 위해 필수적이다. 세포 위치 및 방향의 공간 제어는 따라서 적절한 생리 기능에 대한 특정 관련성이다.
Drosophila는 변형을 통해 애벌레 신체 구조의 완전한 변형을 겪는 홀로 메타 볼곤충으로 성인 조직을 초래합니다. Drosophila pupa는 발달 세포 이동4,세포 분열 및 성장 역학5,근육 수축6,세포 사멸7,상처 수리8,세포 방향9등 다양한 동적 사건의 비침습적 라이브 이미징을 위한 우수한 모델이다. 성인 초파리에서외부 상피는 높은 수준의 질서를 보여줍니다. 이것은 쉽게 상피 (즉, 단일 상피 세포에서 유래 세포 돌출)와 비행의 신체 표면(10)에걸쳐 감각 강모의 배열에 관찰된다. 실제로, 허집은 공기 흐름을 안내 병렬 행에정렬된다 11. 성인 에피탈리아의 형태 형성과 개별 세포의 정렬 된 배열은 배아 발생 중에 시작되고 pupal 단계 동안 절정을 이룬다. 배아 세포 분열에서, intercalations 및 모양은 모두 감소 조직 순서12,,13,이것은 개발의 나중 단계에서, 특히 푸팔 단계에서, 비행이 성숙에 접근할 때9.
움직이지 않는 초파리 퍼프는 세포 모양과 배향 변화를 평가하는 이상적인 시스템을 제공합니다. pupal 복부 표피는 특별한 이점을 제시합니다. 성인 머리, 흉부, 생식기 및 부속기의 전구체가 자라고 애벌레 단계에서 패턴화되는 동안, 애벌레 표피에 통합된 히스토블라스트는14번에서만 성장하고 분화하기 시작한다. 이 기능은 전체9에서조직 질서의 확립에 관련된 모든 시공간적 사건을 추적 할 수 있습니다.
조직 폭발은 각 추정 복부 세그먼트에 있는 반대 측 위치에 배아 발달 도중 지정됩니다. 성인의 등쪽 복부 표피는 전방 및 후방 구획에 존재하는 등측에 위치한 히스토블라스트둥지로부터 유래15,,16. 히스토블라스트가 팽창함에 따라, 애벌레 상피 세포(LECs)를 대체하며, 상반된 둥지는 등쪽 중간선에서 융합되어17,,18,,19,,20을형성한다.
이 작품은 1) Drosophila pupae의 해부, 장착 및 장기 라이브 이미징을위한 방법론, 2) 높은 주분체 해상도에서 세포 배향 및 성장의 역학을 연구하는 분석 방법을 설명합니다. 상세한 프로토콜은 초기 pupae 준비 (즉, 준비 및 이미징)에서 방향성 및 방향 기능의 추출 및 정량화에 필요한 모든 단계를 포함하는 여기에 제공됩니다. 우리는 또한 세포 클론의 분석에서 국소 조직 특성을 추론하는 방법을 설명합니다. 설명된 모든 단계는 최소 침습적이며 장기 적인 라이브 분석을 허용합니다. 여기에 설명된 방법은 다른 발달 단계, 조직 또는 모델 유기체에 쉽게 적응하고 적용할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
참고 : 이 프로토콜은 다섯 단계로 나뉩니다 : (1) 번데기, (2) 이미징을위한 번데기를 준비하고, (3) 성장하는 복부 상피의 라이브 이미징, (4) 유전 모자이크의 생성, (5) 데이터 처리 및 분석 (세포 접합 윤곽선및 세포 클론에서 성장 역학에서 세포 배향 역학을 분석하는 방법을 설명하는 섹션 포함).
1. 화상 진찰의 앞에 초파리 pupae의 발판
- 배양은 계란 누워 후 5 일 동안 25 °C (±12 h)에서 플라스틱 바이알에서 표준 배지에 적절한 유전자형을 날아다닙니다 (AEL).
참고 : 변태는 puparium 형성 후 0 시간까지 120 h AEL에서 pupal 케이스로 세 번째 instar 애벌레의 감금 내에서 시작됩니다 (APF). 이러한 전이는 유충이 먹이와 이동을 멈추고 0-12 h APF에서 안방영역이A형성되어 있기 때문에 쉽게 식별할 수 있다. 퍼파륨은 처음에는 부드럽고 흰색이지만 점진적으로 굳어지고 황갈색이 됩니다. - 촉촉한 페인트 브러시를 사용하여 신선한 플라스틱 바이알에 흰색 prepupae (0 h APF)를 옮김. 동물은 원하는 나이까지 설계된 실험에 따라 다른 온도로 유지될 수 있다.
참고 : pupa 형성 (즉, pupation)은 12 시간 APF에서 발생하며, 성인 비행의 머리와 부속제가 완전히 매혹될 때(그림 1A). 이때까지 푸팔 케이스는 강아지로부터 완전히 분리되어 완전한 제거가 허용됩니다(그림 1A).
2. 라이브 이미징을 위한 푸페 준비
참고: 스테이징 후, 번데기는 해부되고 아래에 설명된 대로 장착된다(도 1참조).
- 집게의 도움으로 유리병의 벽에서 준비 된 강아지를 제거합니다.
- 양면 끈적끈적한 테이프로 덮인 유리 슬라이드에 각 번데카의 복부 면을 붙입니다. 푸팔 케이스의 부착을 테이프에 부착하기 위해 집게 의 끝과 함께 머리 첨추 (즉, 방과 영역)와 등도 표면을 부드럽게 두드려 테이프에 퍼팔 케이스의 부착을 보장합니다(그림 1A,B).
참고 : 등쪽 표면은 케이스의 해부와 강아지의 회복을 용이하게하기 위해 위를 향해야합니다. - 집게(그림 1C)와함께 puparium에서 피퍼럼을 부드럽게 제거하여 입체 현미경으로 해부를 시작합니다.
- 포셉의 한 팁을 퍼팔 케이스와 퍼피 표면 사이의 얕은 각도로 코피소 개구부를 통해 삽입합니다. 한 번 이상의 스윙으로 머리에서 꼬리까지 케이스를 찢어 서, 강아지를 꼬집는 것을 피하십시오(그림 1D). 후부 끝까지 계속 진행하면서 금이 간 푸팔 케이스를 측면으로접습니다(그림 1E).
참고 : pupal 케이스는 매우 단단하고 쉽게 균열됩니다. 습도가 높거나 특히 지질형 배경이 있는 경우 푸팔 케이스가 부드러워지고 찢어지기가 더 어려워집니다. 이러한 경우, 포셉의 두 팁으로 자유 가장자리를 찌르는 것으로 푸팔 케이스의 균열을 도움이 될 수 있습니다. - 열린 푸팔 케이스에서 퍼파를 조심스럽게 동물 밑에 끼우고 부드럽게 당기십시오(그림 1F). 퍼프는 집게의 끝에 달라 붙을 것이다(그림 1G−H).
- 집게의 도움으로 푸파를 유리 바닥 접시에 옮기고 가스 투과성 할로카본 오일의 작은 방울 위에 적증합니다(그림 1I). 가능한 조직 손상을 피하기 위해 복부 측에서 번데기를 부드럽게 잡으십시오.
참고 : 할로 카본 오일의 방울은 pupa의 길이의 절반 이하의 직경으로 작아야합니다. 이러한 양은 모세 혈관에 의해 유리에 번데기를 부착하고 오일 침지 목적을 위해 광학을 수정하기에 충분하다. - 습도를 유지하기 위해 접시 가장자리에 젖은 티슈 페이퍼 조각을 굴려주세요. 이미징 중에 번데의 탈수를 방지하기 위해 접시를 덮습니다.
참고: 여성과 남성 모두 화상 진찰을 위해 사용될 수 있습니다. 크기, 모양 및 패터닝 측면에서 남녀 모두에서 거의 동일하기 때문에 세 번째 복부 세그먼트 (AIII)를 참조 복부 메타미어로 사용하는 것이 좋습니다.
3. 성장하는 복부 에피탈리아의 살아있는 화상 진찰
참고 : 40x / 1.3 NA 오일 침지 목표를 갖춘 거꾸로 된 레이저 스캐닝 공초점 현미경은 다양한 발달 단계에서 번개를 이미지하는 데 사용되었습니다.
- 도메인 및 공정에 따라 유리 바닥 접시상에 투파를 배향(예를 들어 등쪽 둥지의 조기 팽창의 장기 라이브 이미징을 위해 등쪽, 또는 그들의 후기 팽창 및 조직 리모델링을 이미지화하기 위해 등쪽). 그림 1J, K 및 그림 4를참조하십시오.
- 장착된 번데오를 함유한 유리 바닥 접시를 현미경 단계로 옮기고 투과된 빛을 사용하여 복부 의 표면에 초점을 맞춥니다.
참고 : 이 프로토콜이 반전 된 현미경의 이미징에 최적화되어 있더라도 직립 현미경으로 이미징을 수행 할 수도 있습니다. 이 경우, 샘플은 유리 바닥 표면이 위를 향하고 있는 현미경 스테이지에 놓입니다. 할로카본 오일은 반월 상 연골에 각 번들을 보유합니다. - 획득 매개 변수 설정: 1) Z-슬라이스의 수는 일반적으로 복부 표피의 적절한 2차원(2D) 재건을 허용하기 위해 20-40 사이; 2) 각 슬라이스(예를 들어, 1 미크론) 사이의 단계 크기; 3) 기록 시간 간격 (5 분 간격은 세포 배향 역학의 높은 충실도 분석에 적합); 및 4) 프레임 해상도(예: 1024 x 1024).
- 적절한 레이저(예: 488nm 및 561 nm)를 켜서 GFP 및 RFP 형광단을 각각 시각화하고 레이저 전력 및 게인/오프셋 설정을 조정하여 표시된 셀을 시각화합니다. 가능한 최저 레이저 전력 사용(범위 5%-20%) 광표백 및 광독성을 최소화합니다.
- 부착된 전동 스테이지 및 현미경 다중 위치 수집 소프트웨어를 사용하여 다중 pupae에 대한 위치 및 적절한 Z-stack 한계를 수동으로 설정합니다.
4. 세포 클론의 행동을 따르는 유전 모자이크의 생성
참고 : 우리는 사이트 별 재조합을 통해 복부 상피의 유전 모자이크를 유도하기 위해 유사 분열 재조합을 사용합니다 (FLP / FRT 시스템21,22)(그림 2).
- 특정 게놈 위치에서 열 충격 유도성 플립파제 이식유전자(hs-FLP), FLP 인식 표적(FRT) 부위를 운반하는 크로스 버진 암컷(예를 들어, FRT 부위는 염색체 2의 L 암에서 위치 40A에 있고, 인식 가능한 세포 마커(예를 들어, Ubi-RFP.nls 또는 Ubi-GFP.nls)가 FRT 부위에 말단, 동등한 게놈 위치에서 FRT 부위를 운반하는 돌연변이 남성에게(그림2A−C).
참고: 기능의 유전자 손실에 대한 클론 내 또는 외부 클론 내의 자율적 및 비자율적 효과는 FRT 부위에 특정 열성 대말론을 사용하여 연구 될 수있다. - 십자가의 자손의 세 번째 instar 애벌레 단계에서 열 충격 처리에 의해 히스토 블라스트에서 FLP / FRT 체세포 클론을 생성합니다. 이것은 방황하는 유충(LIII) 단계에서 45분 내지 1시간 동안 37°C에서 수조에 동물을 포함하는 플라스틱 바이알을 침수시킴으로써 수행된다.
참고: 유사분열 재조합에 대한 민감한 기간은 세포 주기의 G2 단계입니다. 히스토블라스트는 전체 애벌레 개발 중에 G2에서 체포된다. - 16h APF 이후의 형광 단백질 마커의 부재(즉, 돌연변이 세포) 또는 강화된(즉, 야생형 트윈 스팟 세포) 수준에 대한 트윈 클론점수(도2D).
참고: 평균적으로 37°C에서 45분에서 1시간까지는 관심 영역당 약 2-3개의 트윈 클론(예: 복부 헤미세그먼트)만 렌더링됩니다. 너무 높은 클론 밀도를 보여주는 Pupae (예를 들어, 헤미 세그먼트 당 4 개 이상의 트윈 클론)는 추가 정량 적 분석에서 폐기해야합니다. - 복제 식별 시, 이미지 살아있는 pupae는 이전 섹션에서 설명한 바와 같이 원하는 단계와 원하는 시간 길이에 대해.
5. 데이터 처리 및 분석
참고: 데이터는 ImageJ(imagej.nih.gov/ij/)를 사용하여 처리됩니다.
- 셀 방향 역학을 셀 접합 윤곽선과 구별합니다.
- ImageJ의 최대 강도 프로젝션(MIP) 기능을 사용하여 공초점 현미경으로 획득한 Z 스택 조각을 2D로 투영합니다.
참고: 표피 아래를 순찰하는 대식세포에 의해 생성된 초점 부족 소음을 피하기 위해 스택당 슬라이스 수를 최소한으로 유지해야 합니다. - 각 데이터 세트의 분석을 위해 신뢰할 수 있는 조직 랜드마크(예: A/P 구획 경계)를 식별하는 평면 좌표 계를 설정합니다(그림3A).
참고: 각 데이터 집합에 대해 동일한 평면 참조를 사용하면 여러 측정값을 비교할 수 있습니다. - 정성적 및 정량적 방향 값을 얻으려면 로컬 셀 가장자리에 ImageJ23,24의 OrientationJ 플러그인(bigwww.epfl.ch/demo/orientation/)을 사용합니다. 이 플러그인은 로컬 방향을 기반으로 입력 이미지에 색으로 구분된 오버레이를 렌더링하고 정량 적 모드에서 사용할 때 숫자 값을제공합니다(그림 3B-B'및 그림 C−').
참고 : OrientationJ 플러그인은 구조 텐서, 그라데이션 및 방향 파생 에서 파생 된 고유 값의 2 x 2 매트릭스를 기반으로합니다 (자세한 설명참조23,24 참조참조). - 방향J 분포 옵션을 사용하여 설정된 평면 좌표계(예: 셀 에지 방향 맵)(그림3B)를기준으로 셀 가장자리 방향을 색상 코드로 구분합니다. 배포 옵션은 ImageJ의 플러그인 메뉴에서 찾을 수 있습니다. 사용할 설정은 다음과 같습니다: 가우시안 윈도우 시그마 = 1 픽셀; 입방 스프라인 = 그라데이션; 최소 일관성 = 20%; 최소 에너지 = 1%. 셀 에지 방향은 플러그인의 색상 조사 옵션을 사용하는 색상으로 구분된 이미지로 표시됩니다(색조 = 방향; 포화 = 일관성; 및 밝기 = 입력 이미지).
참고: 배경 형광이 포함된 영역은 방향 정보를 제공하지 않으며 해석에서 수동으로 제외해야 합니다. 임계값 설정이 높음설정은 처리된 이미지에서 고려되는 픽셀을 줄입니다. - 방향J 측정 옵션을 사용하여 셀룰러 방향 방향 및 방향 셀 정렬(즉, 일관성)(그림3C)을정량화합니다. 측정 옵션은 ImageJ의 플러그인 메뉴에서 찾을 수 있습니다. 히스토블라스트가 차지하는 영역 내에서 균일한 중량(64 x 64 픽셀, 약 20 μm x 20 μm)의 작은 인접한 비중첩 영역(ROI)을 생성합니다(그림3C).
- 지배적인 로컬 방향(즉, 인접 셀 평균 셀 가장자리 방향 맵 간의 평균 방향)과 ROI의 일관성을 계산합니다. 이 소프트웨어는 각 ROI 내에서 주요 방향 및 로컬 일관성을 계산합니다(그림3C).
참고: OrientationJ가 추정한 구조 텐서의 가장 크고 작은 고유값은 그 차이와 합계 사이의 비율로 일관성을 계산하기 위해 사용됩니다. 일관성은 0−1의 값 사이에 경계가 있습니다. 값이 1이면 전체 정렬 균일성을 나타내고 값이 0은 정렬이 없는 등방성 영역을 나타냅니다. - PAST25와같은 무료 소프트웨어 패키지를 사용하여 여러 이미지에서 계산된 방향 및 일관성 값을 통계적으로 분석합니다. 방향 값(정도)과 같은 축 데이터는 방향 통계에 의해 적절하게 설명됩니다.
- 소프트웨어를 통해 각 방향 분포 세트에 대한 평균 방향과 원형 분산을 계산합니다. 상이한 유전자형 또는 조건 사이의 배향분포의 분포의 통계적 유의성은 동등한 분포를 위한 비모문 마르디아-왓슨-휠러 시험(W-test)을 사용하여 결정된다.
- 비파라메트릭 콜모고로프-스미르노프 시험(K-S 시험)을 적용한 일관성의 차이에 대한 통계적 유의성을 계산한다. 원하는 대로 데이터를 그래픽으로 표시합니다(극좌표 플롯, 막대형 차트, 상자 플롯 등).
- ImageJ의 최대 강도 프로젝션(MIP) 기능을 사용하여 공초점 현미경으로 획득한 Z 스택 조각을 2D로 투영합니다.
- 세포 클론에서 성장 역학
참고: 다음 단계를 통해 관심 있는 클론을 포함하는 2D MIP 이미지에서 셀에 대한 기하학적 및 모양 매개변수를 검색할 수 있습니다. 여러 클론을 비교하려면 동일한 설정으로 이미지를 수집해야 합니다.- ImageJ 프리핸드 선택 도구를 사용하여 윤곽선을 그려 서를 분할합니다.
- 분석 메뉴에서 ImageJ의 측정 설정 도구를 사용하여 기하학적 및 모양 매개변수를 계산합니다. 영역, 둘레, 타원 맞추기및 모양 설명자 옵션을 활성화합니다.
참고: 이렇게 하면 영역(클론 내픽셀의 합), 경계(클론 테두리픽셀의 합), 종횡비(AR, 클론 테두리에 새겨진 가장 적합한 레전드 타원의 주요 축과 마이너 축 간의 비율), 그리고 방향 각도(즉, 클론 경계의 주 축의 각도)를 포함한 다양한 기하학적 매개변수를 검색할 수 있습니다. - 이러한 측정에서 비차원 비율을 계산하여 모양 매개변수를 검색합니다. 여기에는 진원도(4 x [영역]/π x [주요 축]2),거칠기(견고성 - 면적/볼록 영역) 및 원형(4π x [영역]/[둘레]2)이포함됩니다.
주: 각 셰이프 매개변수는 원 또는 경계볼각 선체와 같은 이상적인 모양에서 복제본의 편차 정도를 나타내며 모두 0과 1 값 사이에 경계가 있습니다. 값이 1과 같음은 최대 대칭(즉, 최소 복잡성)을 나타냅니다. - Microsoft Excel 및/또는 PAST를 사용하여 서로 다른 유전자형 또는 조건 간의 기하학적 및 모양 매개변수를 통계적으로 분석합니다. 차이의 통계적 유의는 동등한 평균에 대한 짝이없는 두 꼬리 학생의 t 테스트를 사용하여 결정하거나 조건 사이의 동등한 분포에 대한 비 파라 메트릭 콜모고로프 - 스미르 노프 K-S-시험을. 데이터를 원하는 대로 그래픽으로 표시할 수 있습니다(예: 막대 차트, 상자 플롯 등). 그림 5를참조하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
위에서 설명한 프로토콜은 장기 라이브 이미징을 위한 Drosophila pupae의 준비와 복부 표피의 세포 배향 및 성장 역학의 분석을 위한 절차를 다룹니다. 이 방법론을 적용함으로써 유의한 광표백 또는 광독성 없이 최대 48시간 동안 개발 된 번데의 고해상도 영화를 생성 할 수 있습니다. 상이한 시점과 다른 각도에서 배반되는 번데기에서 복부 표피(예를 들어, 히스토블라스트 및 LEC)를 묘사하는 스냅샷은 도 4에나와 있다. 이러한 영화의 후속 분석을 통해 히스토블라스트의 확장 및 LEC 교체 중에 변조된 주요 기하학적 및 형상 파라미터의 국부적 및 글로벌 변화의 역학을 식별하고 정량화할 수 있습니다. 이러한 분석은 다양한 시나리오 및 특정 돌연변이 배경에서 수행될 수 있습니다. 그(것)들은 또한 유전자 발현이 변경되는 클론을 위해 채택될 수 있습니다, 자율적인 손실 또는 기능 조건의 이득으로 이끌어 내는. 이것은 크로스 토크 또는 세포 통신 메커니즘의 식별을 용이하게, 주변 세포에서 비 자율 적 반응의 탐구를 허용(그림 5). 이러한 접근법은 최근 성인 9의 복부 표피의 평면 극성 패턴을 전개하는 동안 세포 정렬을 지시하고 방향을 지정하는 핵심 요소로서 지방/Dachsous/Four jointed pathway의 식별에 사용되고있다.
그림 1: 라이브 이미징을 위해 번데기 의 해부 및 장착. (A)왼쪽에서 오른쪽으로: 0h APF에서 의 프레프푸시(왼쪽)와 14시간 APF에서의 퍼프의 등도 보기(가운데) 및 불투명 푸팔 케이스의 제거 전후(오른쪽). 안방 영역이 표시됩니다 (흰색 화살촉). (B)해부를 위한 필수 툴킷이 표시됩니다. 왼쪽에서 오른쪽으로: 유리 슬라이드, 양면 스티커 테이프, 집게 한 쌍, 유리 바닥 접시. (C)무대 가판대는 유리 슬라이드 등쪽 위에 양면 스티커 테이프에 고정되어 있습니다. 각 강아지의 pupal 케이스는 외과 집게를 가진 방문 지역에서 열립니다. (D−E) 푸팔 케이스의 박리가 점진적입니다. 케이스는 찢어지고 머리에서 복부에 pupal 측으로 접혀 있습니다. (F−H) 번지는 집게(G)의끝으로 복부 측에서 부드럽게 들어 올려 할로 카본 오일의 최소 한 방울을 통해 유리 바닥 접시로 옮겨집니다. (I)강아지는 적절한 방향 (등쪽, 상단, 등쪽, 아래)입니다. 여러 번데포는 패널 C에표시된 단계를 반복하여 동시에 장착 할 수 있습니다 -I. (J)접합 마커 Atpα를 발현하는 AIII 세그먼트의 등쪽 히스토블라스트 둥지의 세포의 윤곽을 나타내는 이미지::GFP. 퍼프는 등쪽으로 향했고 14 시간 APF에서 이미지화되었습니다. 배율 막대 = 22 μm.(K)이미지(J)와동일하지만 등쪽 의 관점에서. 조직 발달의 역학은 몇 시간 동안 시각화 될 수 있습니다. 그림 4를참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: FLP/FRT 시스템을 통한 유전자 모자이크 생성. (a)부모 이형 세포(pale magenta)는 하나의 염색체 암에 열성 돌연변이 알레일(dashed 사각형)을 운반하고 다른 염색체 암[이 예에서 염색체 2(2L)의 왼쪽 팔]에서 형광 마커(magenta)를 코딩하는 유전자를 인코딩한다. FRT 사이트(주황색 사각형)는 중심(회색 타원형)에 근접한 동일한 염색체 위치에서 양 팔로 설계됩니다. (B)G2에서 일시 중지된 세포에서 열 충격에 의한 FLP 재조합의 활성화는 1-1'과 2-2'의 크로마티드 자매의 FRTs 사이의 재결합을 유도한다. 그 결과, FRT 사이트(2L상 FRT40A)에 대한 영역 부위가 교환된다. 오른쪽 패널에 확대된 뷰가 표시됩니다. (C)유사분열 동안 재배열된 영역(1-1' 및 2-2')의 극성 분리시, 2개의 유전적으로 다른 자매 세포가 생성됩니다. 한 딸은 열성 알레과 재조합 부위에 대한 전체 염색체 암 말단에 대한 동형접합체입니다. 이 세포는 백색으로 부정적으로 표시된 형광 마커를 위해 부호를 인코딩하는 유전자가 결여됩니다. 다른 딸 세포는 야생형 암에 대한 동형균이 될 것이고, 쌍둥이 자리를 초래하고 형광 마커(dark magenta)를 코딩하는 유전자의 2개의 사본을 발현한다. 단순화를 위해 유사분열 세포의 반대극(예: 1-2 및 1'−2')에 재배열된 영역의 분리는 표시되지 않습니다. 이들은 부모 세포 (이형 시구 배경, 창백한 자홍색)와 구별 할 수없는 세포를 현상적으로 발생시다. (D)세 번째 인스타 애벌레 단계에서 FLP/FRT 체세포 재결합을 통해 생성된 A 구획에서 클론을 보여주는 이미지및 26시간 APF에서 시각화하였다. 세포의 클론은 RFP.nls (검은 색) 및 RFP.nls의 동형 접합 식의 부재에 의해 표시됩니다 (밝은 자홍색, 쌍둥이 반점) 그렇지 않으면 이형 이종 RFP.nls 배경 (희미한 마젠타). 다른 염색체 위치(2R, 3L, 3R 및 X)에 위치한 FRT 부위에 대해 동등한 이벤트를 달성할 수 있습니다. 그림 5를참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 셀 방향 측정 그림입니다. 세포 배향에 대한 정보를 추출하기 위해 먼저 세포 배향을 조직A축과 연관하는 평면 좌표계가 설정된다(A). 둘째, 셀 배향은 셀윤곽선(B)에서추출됩니다. 마지막으로, 세포 방향 및 조직 축과의 정렬은C정량화된다(C). (A)왼쪽에는 평면 좌표계에 의한 강아지의 측면 도면입니다. 빨간색 솔리드와 시안 파선선은 각각 전방 경계(A/P) 경계와 등중간선을 나타내는 카르테시안 평면을 정의합니다. 중간에, 접합 마커 Atpα::GFP(입력 이미지)에 의해 설명된 26시간 APF에서 확장 히스토블라스트의 등쪽 뷰를 보여주는 반전된 이미지. A/P 경계의 위치는 빨간색 선으로 강조 표시됩니다. 오른쪽의 축 나침반은 셀 가장자리 방향(다각형) 또는 평균 셀 방향(막대)을 설명하기 위해 적용된 색상 코드를 보여 줍니다. (B)플러그인/오리엔테이션J 메뉴 및 오리엔테이션J 배포 창의 표시. (B') 오른쪽에 있는 셀 에지 방향 맵을 얻기 위해 사용되는 매개변수의 설정을 보여주는 OrientationJ 분포 창을 표시합니다. (B'') 이상화 된 셀에 색상 코딩 된 셀 개요의 그림. 원은 기본 색상을 표시하지 않습니다. (C) 방향J 측정 창을 표시합니다. (C') 균일 한 무게의 연속 ROI에서 로컬 방향과 일관성을 측정하는 방법을 보여주는 OrientationJ 측정 창의 순차스크린샷. 각 영역의 로컬 방향 각도와 일관성은 타원으로 표시됩니다. (C'') 방향 측정의 최종 결과를 표현합니다. 타원로이드는 방향을 시각적으로 표시합니다(즉, A/P 경계에 대한 타원 최장축의 각도) 및 일관성(즉, 타원지의 가장 긴 축과 더 짧은 축 사이의 비율). 추가 분석을 위해 두 매개변수의 숫자 값이 스프레드시트에 저장됩니다. (C''') ) 이상적인 셀에 대한 색으로 구분된 셀 윤곽선 및 평균 셀 방향(막대)의 그림입니다. 원은 기본 방향을 표시하지 않습니다. (C'''') 각 ROI의 기본 로컬 방향 표현(로컬 평균 방향 맵). 색상은 각 영역의 방향을 강조 표시합니다. 앞쪽은 왼쪽에 있습니다. 배율 막대 = 22 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 성장 하는 복 부 상피의 장기 라이브 이미징. (A)히스토블라스트 확장의 초기 단계부터 후기 단계까지 장기 이미징 영화의 대표 스냅샷. 상단: 16 시간 및 26 시간 APF에서 등쪽 이미징을 위한 지향 된 강아지의 회로도 보기. 강아지의 등쪽에서 볼 수있는 둥지에 의해 점유 영토는 16 및 26 시간 APF에서 어두운 회색으로 강조표시됩니다. 아래쪽: 접합 마커 Atpα::GFP의 유비쿼터스 발현에 의해 표지된 히스토블라스트 및 LEC 모두에서 세포 윤곽을 보여주는 이미지. A/P 경계는 강조 표시된 두 구획 사이에 있습니다(파란색 = 앞쪽 구획의 가짜 컬러 셀, 녹색 = 후방 구획). (B)둥지 합류의 초기에서 후반 단계까지 장기 이미징 영화에서 대표 스냅 샷. 상단: 32 시간 및 48 시간 APF에서 등쪽 이미징을 위한 지향 퍼프의 회로도보기. 아래쪽: 셀 윤곽선(A에서와 같이 레이블및 색상). Atpα::GFP 마커는 고해상도로 시간이 지남에 따라 개별 상피 세포의 모양을 묘사할 수 있습니다. 배율 막대 = 22 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 클론 분석에서 추출된 조직 특성. (a)26h APF에서 RFP.nls (검정) 및 그들의 쌍둥이 반점 (밝은 마젠타)의 부재에 의해 표시된 A 구획에서 야생 형 클론의 예. 클론은 세그먼트 경계를 따라 길게 표시됩니다. 쌍둥이 클론은 병렬 또는 나란히 배열. 배율 막대 = 22 μm. (B)맨 위: 복제 윤곽선에서 정량화된 매개 변수를 보여주는 이미지입니다. 아래쪽: 야생 형 동물에 대한 표시된 매개 변수에 대한 평균 값을 보고하는 요약 테이블(n = 29). (C)26 시간 (왼쪽) 및 47 시간 (오른쪽) APF에서 야생 형 클론의 형태. 복제본은 두 단계에서 복잡한 테두리 형태를 보여줍니다. (D)26시간(연한 노란색) 및 47시간 APF(진한 노란색)의 기하학적 매개변수에 대한 상자 및 수염 플롯. 이 시간 창에서 평균 면적과 둘레가 크게 증가합니다. (e)클론 방향을 나타내는 극지 플롯(빈 크기 18°, 영역에 비례하는 풍부함). 방향은 확장 및 리모델링 중에 유지됩니다. (F)상자와 수염 플롯 모양 매개 변수에 대 한 26 시간 (밝은 노란색) 그리고 47 h APF (진한 노란색). 거칠기(견고성), 둥글림 및 원형은 거의 변경되지 않습니다. 중앙값은 빨간색 수평선으로 표시되고 수염은 분포의 최소값과 최대값으로 확장됩니다. 통계는 K-SM 시험 또는 W-검정(p< 0.0001****, p> 0.05 유의하지 않음)으로 수행하였다. 앞쪽은 왼쪽, 등도는 위로. 배율 막대 = 16 μm. 유전자형은 hsflp1.22; FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
장거리 주문은 대부분의 기능성 생리학적 단위의 필수 특성입니다. 형태 형성 동안, 순서는 높은 시간 및 공간 정밀도로 구현 된 복잡한 명령의 통합을 통해 달성된다. 다중 및 다단계 구속은 스테레오타입 조직 배열로 통합됩니다.
극성과 지향성은 개발 중에 정렬된 공간 배열에 매우 중요합니다. 극성은 개발 중에 대칭 파괴를 의미합니다. 비대칭의 성취는 배아 전방 후방 (A/P) 및 dorsoventral (D/V) 축 및 성인 조직(26)의결정에 필요하다. 이 초기 역할 외에도 지역 비대칭은 모든 수준에서 형태학적 다양성에 필수적입니다. 지향성은 형태 형성 동안 비대칭과 극성의 필수적인 보완이다. 글로벌 순서는 정확한 감각 또는 방향을 가진 셀 대 세포 기지에 로컬로 신호를 감지하고 전송하는 셀의 능력에 의해 구현됩니다. 단일 세포 비대칭은 공간에서 특정 방향 내에서 위치 또는 움직임을 방향을 지정하여 시간이 지남에 따라 협력적으로 조화를 이수합니다. 세포 통신은 분비 된 인자, 세포 세포 접촉 및 기계적 입력을 연루합니다. 신호는 먼저 로컬로 작동한 다음 전 세계적으로 동작 을 수정하는 셀 필드에 작용합니다27.
이 작품은 조직 순서의 발달 도중 그들의 평면 방향 및 성장 매개변수를 포함하여 개별 적인 세포의 조정한 행동을 분석하는 간단한 쪽을 제시합니다. 32대두 시 초파리의 성인 복부의 형태발생은 비행배아 발생 시 세균밴드 확장/후퇴(28) 또는 등쪽폐쇄(29) 등 다른 동등한 모델에 비해 일련의 기술적 이점을 제시하며, 드로소필라 날개 형태체 ex vivo30, 피노르하브디티스 예쁜꼬마제르간31,또는 성모융합31, 또는 성모융합중의 복부 인클로저 31, 또는 성모융합체중 에서 의외로 변형된다.28
첫째, 복부 형태 형성은 생체 내에서 전체적으로 따를 수 있는 과정을 구성한다. 히스토블라스트에 의한 LEC의 교체의 연속적인 라이브 이미징은 12 h APF에서, pupa가 형성될 때, 성인 상피 형태 형성의 완료까지 수행 될 수 있다. 둘째, 세포 이동, 분열, 모양 변화, 배설 및 인터칼레이션과 같은 전체 세포 거동 집합을 분석할 수 있습니다. 마지막으로, 그것은 유전 간섭 및 클론 분석에 순종. 적절한 마커를 사용하여 손실 및 기능 활동의 이득의 자율적 및 비자율적 효과를 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 그러나, 모델 시스템으로 pupa는 몇 가지 사소한 제한을 제공합니다. 난형 모양으로 인해 고해상도로 측면 및 등측 이벤트의 동시 라이브 이미징을 수행할 수 없습니다. 이 문제는 여러 각도라이트시트 선택적 평면 조명 현미경(SPIM) 현미경 검사법을 채택하여 등쪽 및 등쪽 배향 적인 번데기 에서 순차적 이미징을 수행함으로써 극복될 수 있다. 또 다른 단점은 분석에서 서로 다른 크기의 두 개의 서로 다른 세포 집단의 존재입니다 (즉, 다각형 LECs 및 디플로이드 히스토블라스트). 이렇게 하면 이미지 분할이 복잡해질 수 있으며 두 셀 채우기를 별도로 분석해야 합니다.
미래에, Drosophila pupae의 장기 화상 진찰은 야생 모형 및 돌연변이 조건에 있는 변태 도중 표피, 근육 및 신경 발달의 조정을 포함하여 형태유전학 현상의 전체 범위를 공부하기 위하여 쉽게 적응될 수 있습니다. 더욱이, 사용 중의 알고리즘 및 플러그인은 다른 많은 조직의 조직, 패터닝 및 역학을 연구하기 위해 사용될 수 있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 이해 관계의 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 도움이 토론에 대한 마틴 - 블랑코 연구소의 회원들에게 감사드립니다. 우리는 또한 닉 타폰 (크릭 연구소, 런던, 영국), 블루밍턴 스톡 센터 (인디애나 대학, 미국) 및 FlyBase (초파리 유전자 별표)에 감사드립니다. 페데리카 만지오네는 JAE-CSIC 박사 전 펠로우십의 지원을 받았습니다. 마르틴-블랑코 연구소는 프로그램 아토타 에스타탈 드 포멘토 드 라 인베스티가시온 Científica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P 및 BFU2017-82876-P)와 Fundación 라몬 아레세스로부터 자금을 지원받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis Software | - | ImageJ | Analyzing data |
| Drosophila | Atpa::GFP | - | Strains employed for data collection |
| Drosophila | hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | - | Strains employed for data collection |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter for dissection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting pupae for data collection |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | mounting pupae |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Data collection |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the pupae during dissection |
References
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Deans, M. R. A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae. Seminars in Cellular and Developmental Biology. 24, 490-498 (2013).
- Stell, W. K. The structure and morphologic relations of rods and cones in the retina of the spiny dogfish, Squalus. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Comparative Physiology. 42, 141-151 (1972).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bosveld, F., et al. Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway. Science. 336, 724-727 (2012).
- Puah, W. C., Wasser, M. Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis. Methods. 96, 103-117 (2016).
- Teng, X., Qin, L., Le Borgne, R., Toyama, Y. Remodeling of adhesion and modulation of mechanical tensile forces during apoptosis in Drosophila epithelium. Development. 144, 95-105 (2017).
- Weavers, H., et al. Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient. Current Biology. 26, 1975-1989 (2016).
- Mangione, F., Martin-Blanco, E. The Dachsous/Fat/Four-Jointed Pathway Directs the Uniform Axial Orientation of Epithelial Cells in the Drosophila Abdomen. Cell Reports. 25, 2836-2850 (2018).
- Casal, J., Struhl, G., Lawrence, P. A. Developmental compartments and planar polarity in Drosophila. Current Biology. 12, 1189-1198 (2002).
- Wootton, R.
- Zallen, J. A., Wieschaus, E. Patterned gene expression directs bipolar planar polarity in Drosophila. Developmental Cell. 6, 343-355 (2004).
- Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epithelia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. Journal of Morphology. 59, 351-399 (1936).
- Mandaravally Madhavan, M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 183, 269-305 (1977).
- Kornberg, T. Compartments in the abdomen of Drosophila and the role of the engrailed locus. Developmental Biology. 86, 363-372 (1981).
- Garcia-Bellido, A., Merriam, J. R. Clonal parameters of tergite development in Drosophila. Developmental Biology. 26, 264-276 (1971).
- Roseland, C. R., Schneiderman, H. A. Regulation and metamorphosis of the abdominal histoblasts of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 186, 235-265 (1979).
- Madhavan, M. M., Madhavan, K. Morphogenesis of the epidermis of adult abdomen of Drosophila. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 60, 1-31 (1980).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Fonck, E., et al. Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries. Stroke. 40, 2552-2556 (2009).
- Rezakhaniha, R., Fonck, E., Genoud, C., Stergiopulos, N. Role of elastin anisotropy in structural strain energy functions of arterial tissue. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 10, 599-611 (2011).
- Hammer, Ø, Harper, D. A., Ryan, P. D. PAST: paleontological statistics software package for education and data analysis. Palaeontologia electronica. 4, 1-9 (2001).
- Gray, R. S., Roszko, I., Solnica-Krezel, L. Planar cell polarity: coordinating morphogenetic cell behaviors with embryonic polarity. Developmental Cell. 21, 120-133 (2011).
- Vogg, M. C., Wenger, Y., Galliot, B. How Somatic Adult Tissues Develop Organizer Activity. Current Topics in Developmental Biology. 116, 391-414 (2016).
- Collinet, C., Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Local and tissue-scale forces drive oriented junction growth during tissue extension. Nature Cell Biology. 17, 1247-1258 (2015).
- Martin-Blanco, E., et al. puckered encodes a phosphatase that mediates a feedback loop regulating JNK activity during dorsal closure in Drosophila. Genes and Development. 12, 557-570 (1998).
- Dye, N. A., et al. Cell dynamics underlying oriented growth of the Drosophila wing imaginal disc. Development. 144, 4406-4421 (2017).
- Williams-Masson, E. M., Malik, A. N., Hardin, J. An actin-mediated two-step mechanism is required for ventral enclosure of the C. elegans hypodermis. Development. 124, 2889-2901 (1997).
- Ferguson, M. W.
