Summary
Este protocolo está diseñado para la toma de imágenes y el análisis de la dinámica de la orientación celular y el crecimiento del tejido en la drosophila epitelia abdominal a medida que la mosca de la fruta sufre metamorfosis. La metodología descrita aquí se puede aplicar al estudio de diferentes etapas del desarrollo, tejidos y estructuras subcelulares en Drosophila u otros organismos modelo.
Abstract
Dentro de los organismos multicelulares, los tejidos y órganos maduros muestran altos grados de orden en las disposiciones espaciales de sus células constituyentes. Un ejemplo notable es dado por la epitelia sensorial, donde las células de las mismas o distintas identidades se reúnen a través de la adhesión de células celulares que muestran patrones planos altamente organizados. Las celdas se alinean entre sí en la misma dirección y muestran una polaridad equivalente a grandes distancias. Esta organización de la epitelia madura se establece en el curso de la morfogénesis. Para entender cómo se logra la disposición plana de la epitelia madura, es crucial realizar un seguimiento de la orientación celular y la dinámica de crecimiento con alta fidelidad espaciotemporal durante el desarrollo in vivo. Las herramientas analíticas sólidas también son esenciales para identificar y caracterizar las transiciones de local a global. La Drosophila pupa es un sistema ideal para evaluar los cambios orientados en la forma celular subyacentes a la morfogénesis epitelial. El epitelio pupal que desarrolla constituye la superficie externa del cuerpo inmóvil, permitiendo imágenes a largo plazo de animales intactos. El protocolo descrito aquí está diseñado para imaginar y analizar los comportamientos celulares a nivel global y local en la epidermis abdominal pupal a medida que crece. La metodología descrita se puede adaptar fácilmente a las imágenes de comportamientos celulares en otras etapas del desarrollo, tejidos, estructuras subcelulares u organismos modelo.
Introduction
Para lograr sus funciones, los tejidos epiteliales dependen plenamente de la organización espacial de sus componentes celulares. En la mayoría de las epitelias, las células no sólo se embalan unas contra otras para crear una capa de adoquines precisa, sino que se orientan en relación con los ejes del cuerpo.
La importancia funcional de la organización precisa del tejido es evidente en la epitelia sensorial, como el oído interno vertebrado y la retina. En el primer caso, el cabello y las células de apoyo se alinean en una dirección axial específica para detectar eficientemente entradas mecánicas como el sonido y el movimiento1,2. Del mismo modo, la organización espacial de las células fotorreceptores es esencial para lograr propiedades ópticas óptimas por la retina3. Por lo tanto, el control espacial de la posición y la orientación de la célula es de particular relevancia para la función fisiológica adecuada.
Drosophila es un insecto holometaboloso que sufre una transformación completa de sus estructuras corporales larvales a través de la metamorfosis, dando lugar a sus tejidos adultos. La Drosophila pupa es un excelente modelo para la imagen en vivo no invasiva de una variedad de eventos dinámicos, incluyendo la migración celular del desarrollo4,división celular y dinámica de crecimiento5, contracción muscular6, muerte celular7, reparación deheridas 8, y orientación celular9. En el Drosophilaadulto, el epitelio externo muestra un alto grado de orden. Esto se observa fácilmente en los arreglos de los tricomas (es decir, las protuberancias celulares procedentes de células epiteliales individuales) y las cerdas sensoriales en toda la superficie corporal de la mosca10. De hecho, los tricomas están alineados en filas paralelas que guían el flujo de aire11. La morfogénesis de la epitelia adulta y la disposición ordenada de las células individuales comienza durante la embriogénesis y culmina durante las etapas pupales. Mientras que en las divisiones celulares embrionarias, intercalaciones, y cambios de forma todos disminuyen el ordentisular12,13, esto se revierte en etapas posteriores de desarrollo, especialmente en etapas pupales, cuando la mosca se acerca a la madurez9.
La pupa Drosophila inmóvil proporciona un sistema ideal para evaluar la forma de la célula y los cambios de orientación. La epidermis abdominal pupal presenta ventajas especiales. Mientras que los precursores de la cabeza adulta, tórax, genitales, y apéndices crecen y se modelan desde etapas larvales, los histoblastos, que se integran en la epidermis larvaria, comienzan a crecer y diferenciar sólo en la pupariación14. Esta característica permite el seguimiento de todos los eventos espaciotemporales involucrados en el establecimiento del orden de los tejidos en su totalidad9.
Los histoblastos se especifican durante el desarrollo embrionario en posiciones contralaterales en cada segmento abdominal presuntivo. La epidermis abdominal dorsal del adulto deriva de nidos histoblastos localizados dorsolateralmente presentes en los compartimentos anterior y posterior15,,16. A medida que los histoblastos se expanden, reemplazando las células epiteliales larvales (LEC), los nidos contralaterales se fusionan en la línea media dorsal formando una hoja confluente17,18,19,20.
Este trabajo describe 1) una metodología para la disección, el montaje y la imagen en vivo a largo plazo de las drosophila pupae, y 2) métodos analíticos para estudiar la dinámica de la orientación celular y el crecimiento a alta resolución espaciotemporal. Aquí se proporciona un protocolo detallado, que abarca todos los pasos necesarios desde la preparación inicial de las pupas (es decir, la puesta en escena y la imagen) hasta la extracción y cuantificación de las características de direccionalidad y orientación. También describimos cómo inferir propiedades de tejido local del análisis de clones celulares. Todos los pasos descritos son mínimamente invasivos y permiten análisis en vivo a largo plazo. Los métodos descritos aquí se pueden adaptar y aplicar fácilmente a otras etapas del desarrollo, tejidos u organismos modelo.
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Protocol
NOTA: Este protocolo se divide en cinco pasos: (1) la puesta en escena de las pupas, (2) la preparación de las pupas para la toma de imágenes, (3) imágenes en vivo de la epitelia abdominal en crecimiento, (4) generación de mosaicos genéticos, (5) procesamiento y análisis de datos (incluidas las secciones que describen cómo analizar la dinámica de orientación celular a partir de uniones de contorno celular y la dinámica de crecimiento a partir de clones celulares).
1. Escenificación de Drosophila pupae antes de la toma de imágenes
- El cultivo vuela el genotipo adecuado en el medio estándar en viales de plástico a 25 oC durante 5 días (12 h) después de la puesta del huevo (AEL).
NOTA: La metamorfosis comienza dentro del confinamiento de las larvas de la tercera estrella en el caso pupal a las 120 h de AEL hasta 0 h después de la formación del puparium (APF). Esta transición es fácilmente identificable, porque las larvas dejan de alimentarse y moverse y se forma la región opercular(Figura 1A)en 0-12 h APF. El puparium es inicialmente suave y blanco, pero progresivamente se endurece y se broncea. - Transfiera prepupae blanco (0 h APF) a un vial de plástico fresco con un pincel humedecido. Los animales se pueden mantener a diferentes temperaturas dependiendo del experimento diseñado hasta la edad deseada.
NOTA: La formación de Pupa (es decir, pupación) se produce a las 12 h de APF, cuando la cabeza y los apéndices de la mosca adulta están totalmente aspersos (Figura 1A). En este momento el caso pupal está completamente separado de la pupa, permitiendo su eliminación completa (Figura 1A).
2. Preparación de pupas para imágenes en vivo
NOTA: Después de la puesta en escena, las pupas se diseccionan y montan como se describe a continuación (véase también la figura 1).
- Retire las pupas por etapas de la pared del vial con la ayuda de los fórceps.
- Pegue el lado ventral de cada pupa en una corredera de vidrio cubierta con cinta adhesiva de doble cara. Toque suavemente los espiráculos de la cabeza (es decir, región opercular) y la superficie dorsal de la pupa con las puntas de los fórceps para asegurar la adhesión de la caja pupal a la cinta (Figura 1A,B).
NOTA: La superficie dorsal debe estar boca arriba para facilitar la disección del caso y la recuperación de la pupa. - Comience la disección bajo un estereomicroscopio retirando suavemente el opérculo del puparium con los fórceps (Figura 1C).
- Inserte una punta de los fórceps en un ángulo poco profundo entre la caja pupal y la superficie de la pupa a través de la abertura opercular. Desgarrar el estuche de la cabeza a la cola lateralmente en uno o más columpios, evitando pellizcar la pupa (Figura 1D). Doble hacia atrás la caja pupal agrietada a los lados laterales mientras sigue avanzando hacia el extremo posterior (Figura 1E).
NOTA: El estuche pupal es bastante rígido y se agrieta fácilmente. En caso de alta humedad o en particular fondos genotípicos, el caso pupal se vuelve más suave y el desgarro es más difícil. En estos casos, el agrietamiento de la caja pupal se puede ayudar pinchando sus bordes libres con ambas puntas de los fórceps. - Retire la pupa de la caja pupal abierta insertando cuidadosamente los fórceps debajo del animal y tirando suavemente hacia arriba (Figura 1F). La pupa se pegará a la punta de los fórceps(Figura 1G-H).
- Transfiera la pupa con la ayuda de los fórceps a un plato de fondo de cristal y deposite encima de una pequeña gota de aceite de halocarbono permeable al gas(Figura 1I). Sostenga la pupa suavemente por el lado ventral para evitar cualquier posible daño tisular.
NOTA: La gota de aceite de halocarbono tiene que ser pequeña, con un diámetro aproximadamente menos de la mitad de la longitud de la pupa. Dicha cantidad es suficiente para adherir la pupa al vidrio por capilaridad y para corregir la óptica para los objetivos de inmersión en aceite. - Enrolle un pedazo de papel de tejido húmedo en los bordes del plato para mantener la humedad. Cubra el plato para evitar la deshidratación de las pupas durante la toma de imágenes.
NOTA: Tanto las pupas femeninas como las masculinas se pueden emplear para la toma de imágenes. Recomendamos emplear los terceros segmentos abdominales (AIII) como metamere abdominal de referencia, ya que es casi idéntico en ambos sexos en términos de tamaño, forma y patrón.
3. Imágenes en vivo de epitelia abdominal en crecimiento
NOTA: Se utilizó un microscopio confocal de escaneo láser invertido equipado con un objetivo de inmersión en aceite de 40x/1.3 NA para crear imágenes de pupas en diferentes etapas del desarrollo.
- Orientar la pupa sobre la gota de aceite en el plato de fondo de vidrio de acuerdo con el dominio y el proceso a evaluar (por ejemplo, dorsolateralmente para imágenes vivas a largo plazo de la expansión temprana de los nidos dorsales, o dorsalmente para imaginar su expansión tardía y remodelación del tejido). Vea la figura 1J,K y la figura 4.
- Transfiera el plato de fondo de vidrio que contiene las pupas montadas a la etapa del microscopio y concéntrese en la superficie de la zona abdominal utilizando la luz transmitida.
NOTA: Incluso si este protocolo está optimizado para la toma de imágenes en microscopios invertidos, también es posible realizar imágenes en un microscopio vertical. En ese caso, la muestra se coloca en la etapa del microscopio con la superficie de fondo de vidrio hacia arriba. El aceite de halocarbono sostiene cada pupa en un menisco. - Establecer los parámetros de adquisición: 1) el número de cortes Z suelen estar entre 20 y 40 para permitir la reconstrucción bidimensional (2D) adecuada de la epidermis abdominal; 2) tamaño del paso entre cada rebanada (por ejemplo, 1 micra); 3) intervalo de tiempo para la grabación (un intervalo de 5 minutos es adecuado para análisis de alta fidelidad de la dinámica de orientación celular); y 4) resolución de fotogramas (por ejemplo, 1024 x 1024).
- Encienda los láseres apropiados (es decir, 488 nm y 561 nm para visualizar los fluoróforos GFP y RFP respectivamente) y ajuste la potencia láser y los ajustes de ganancia/desplazamiento para visualizar las celdas marcadas. Utilice la potencia láser más baja posible (en el rango de 5% a 20%) para minimizar el fotoblancada y la fototoxicidad.
- Ajuste manualmente la posición y los límites de pila Z adecuados para varias pupas utilizando la etapa motorizada conectada y el software de adquisición de multiposición del microscopio.
4. Generación de mosaicos genéticos para seguir los comportamientos de los clones celulares
NOTA: Empleamos la recombinación mitótica para inducir mosaicos genéticos en el epitelio abdominal a través de la recombinación específica del sitio (sistema FLP/FRT21,22) ( Figura2).
- Hembras vírgenes cruzadas que llevan un transgén flippase inducible por choques térmicos (hs-FLP), un sitio de reconocimiento de FLP (FRT) en un lugar genómico específico (por ejemplo, Sitio FRT en la posición 40A en el brazo L del cromosoma 2), y un marcador celular reconocible (por ejemplo, Ubi-RFP.nls o Ubi-GFP.nls) distal al sitio FRT, a los machos mutantes que llevan un sitio FRT en la ubicación genómica equivalente (Figura 2A-C).
NOTA: Los efectos autónomos y no autónomos dentro o fuera de los clones para cualquier pérdida de función genética podrían estudiarse empleando alelos recesivos específicos distales para el sitio FRT. - Generar clones somáticos FLP/FRT en los histoblastos mediante tratamiento de choque térmico en la tercera etapa larval instar de la progenie de la cruz. Esto se realiza sumergiendo los viales de plástico que contienen a los animales en un baño de agua a 37 oC durante 45 min a 1 h en la etapa de larvas errantes (LIII).
NOTA: El período sensible para la recombinación mitótica es la fase G2 del ciclo celular. Los histoblastos son arrestados en G2 durante todo el desarrollo larvario. - Puntuar clones gemelos para detectar ausencias (es decir, células mutantes) o niveles mejorados (es decir, células de doble punto de tipo salvaje) del marcador de proteína fluorescente a partir de 16 h APF(Figura 2D).
NOTA: En promedio, de 45 min a 1 h a 37 oC representa aproximadamente sólo 2 x 3 clones gemelos por región de interés (por ejemplo, el hemisegmento abdominal). Las pupas que muestren una densidad de clones demasiado alta (por ejemplo, más de cuatro clones gemelos por hemisegment) deben descartarse de otros análisis cuantitativos. - Tras la identificación del clon, las pupas vivas de la imagen en la etapa deseada y durante el tiempo deseado como se describe en la sección anterior.
5. Procesamiento y análisis de datos
NOTA: Los datos se procesan mediante ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).
- Distinga la dinámica de orientación de celda de los contornos de unión de celda.
- Proyecte las rodajas de pila Z adquiridas por microscopía confocal en 2D utilizando la función de proyección de intensidad máxima (MIP) de ImageJ.
NOTA: El número de rebanadas por pila debe mantenerse al mínimo para evitar el ruido fuera de foco generado por los macrófagos que patrullan bajo la epidermis. - Establezca un sistema de coordenadas planas que identifique puntos de referencia de tejido fiables (por ejemplo, límites de compartimento A/P) para el análisis de cada conjunto de datos (Figura 3A).
NOTA: El uso de las mismas referencias planas para cada conjunto de datos permitirá comparar varias mediciones. - Utilice el plugin OrientationJ (bigwww.epfl.ch/demo/orientation/) de ImageJ23,24 en los bordes de celda local para obtener valores de orientación cualitativos y cuantitativos. El plugin representa superposiciones codificadas por colores en imágenes de entrada basadas en orientaciones locales y proporciona valores numéricos cuando se utiliza en modo cuantitativo(Figura 3B-B'' y Figura C-C'''').
NOTA: El plugin OrientationJ se basa en tensores de estructura, 2 x 2 matrices de valores propios derivados de gradientes y derivados direccionales (Ver referencias23,24 para una descripción detallada). - Utilice la opción Distribución OrientationJ para codificar el color de las orientaciones de arista de celda en relación con el sistema de coordenadas planas establecido (es decir, mapas de orientación de borde de celda) (Figura 3B). La opción Distribución se encuentra en el menú del plugin en ImageJ. Los ajustes a emplear son: ventana gaussiana sigma 1 píxel; Spline cúbica: Degradado; Coherencia mínima: 20%; Energía mínima: 1%. Las orientaciones de los bordes de celda se muestran como una imagen codificada por colores que emplea la opción De Survey del plugin (Hue - orientación; Saturación - coherencia; y Brillo - imagen de entrada).
NOTA: Las áreas que contienen fluorescencia de fondo no proporcionan ninguna información direccional y deben excluirse manualmente del análisis. La configuración de umbral alto reduce los píxeles considerados en las imágenes procesadas. - Utilice la opción OrientationJ Measure para cuantificar las orientaciones celulares y la alineación direccional de celdas de celda (es decir, coherencia) (Figura 3C). La opción Medir se encuentra en el menú del plugin en ImageJ. Generar pequeñas regiones adyacentes no superpuestas de interés (ROI) de peso uniforme (64 x 64 píxeles, alrededor de 20 m x 20 m) dentro del área ocupada por los histoblastos (Figura 3C).
- Calcule la orientación local dominante (es decir, la orientación promediada entre el mapa de orientación de borde de celda promediado de celdas vecinas) y la coherencia de los ROI. El software calcula la orientación predominante y la coherencia local dentro de cada ROI (Figura 3C).
NOTA: Los valores propios más grandes y más pequeños del tensor de estructura estimados por OrientationJ se emplean para calcular la coherencia como la relación entre su diferencia y su suma. La coherencia está limitada entre los valores de 0 a 1. Un valor de 1 indica uniformidad de alineación completa, mientras que un valor de 0 indica áreas isotrópicas sin alineación. - Analice estadísticamente los valores calculados de orientación y coherencia a partir de varias imágenes utilizando paquetes de software libre como PAST25. Los datos axiales, como los valores de orientación (en grados), se describen adecuadamente mediante estadísticas direccionales.
- A través del software, calcule la dirección media y la varianza circular para cada conjunto de distribuciones de orientación. La significancia estadística de la diferencia entre la distribución de las orientaciones entre diferentes genotipos o condiciones se determina utilizando la prueba no paramétrica Mardia-Watson-Wheeler (prueba W) para distribuciones iguales.
- Calcular la significancia estadística de la diferencia de coherencia aplicando la prueba No paramétrica Kolmogorov-Smirnov (prueba K-S). Mostrar los datos gráficamente como desee (gráficos polares, gráficos de barras, diagramas de caja, etc.).
- Proyecte las rodajas de pila Z adquiridas por microscopía confocal en 2D utilizando la función de proyección de intensidad máxima (MIP) de ImageJ.
- Dinámica de crecimiento a partir de clones celulares
NOTA: Los pasos siguientes permiten la recuperación de parámetros geométricos y de forma para celdas a partir de imágenes MIP 2D que contienen los clones de interés. Para las comparaciones entre varios clones, las imágenes deben adquirirse con la misma configuración.- Segmente las áreas de clonación dibujando sus contornos con la herramienta Selección a mano alzada ImageJ.
- Calcule los parámetros geométricos y de forma utilizando la herramienta Definir medidas de ImageJ en el menú Analizar. Active las opciones Area, Perimeter, Fit Ellipsey Shape Descriptor.
NOTA: Esto permitirá la recuperación de diversos parámetros geométricos, incluyendo el área (suma de los píxeles dentro del clon), el perímetro (suma del píxel del borde del clon), la relación de aspecto (AR, la relación entre los ejes mayor y menor de la elipse Legendre mejor ajustada inscrita en el borde del clon), y el ángulo de orientación (es decir, el ángulo del eje principal del clon en relación con el límite de unterposteri). - El cálculo de las proporciones no dimensionales a partir de estas mediciones recupera los parámetros de la forma. Estos incluyen la redondez (4 x [área]/x [eje principal]2), la rugosidad (solidez - área/área convexa) y la circularidad (4 x [área]/[perímetro]2).
NOTA: Cada uno de los parámetros de forma representa el grado de desviación de los clones de las formas ideales, como un círculo o un casco convexo delimitado, y todos están delimitados entre los valores de 0 y 1. Los valores iguales a 1 indican la simetría máxima (es decir, la complejidad mínima). - Analice estadísticamente los parámetros geométricos y de forma entre diferentes genotipos o condiciones mediante Microsoft Excel y/o PAST. La significación estadística de la diferencia se determina utilizando una prueba t del estudiante de dos colas no parificada para la media igual o la prueba K-S Kolmogorov-Smirnov no para la igualdad de distribucións entre condiciones. Los datos se pueden mostrar gráficamente como se desee (por ejemplo, gráficos de barras, diagramas de cuadros, etc.). Vea la figura 5.
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Representative Results
El protocolo descrito anteriormente abarca la preparación de Drosophila pupae para imágenes en vivo a largo plazo y los procedimientos para el análisis de la orientación celular y la dinámica de crecimiento de la epidermis abdominal. Mediante la aplicación de esta metodología es posible generar películas de alta resolución de las pupas en desarrollo para períodos de hasta 48 h sin fotoblanquido significativo o fototoxicidad. En la Figura 4se muestran instantáneas que representan la epidermis abdominal (por ejemplo, histoblastos y LEC) en diferentes puntos de tiempo y desde pupas orientadas en diferentes ángulos. El posterior análisis de estas películas permite la identificación y cuantificación de la dinámica de los cambios locales y globales en los principales parámetros geométricos y de forma modulados durante la expansión de los histoblastos y la sustitución de los LEC. Estos análisis se pueden realizar en diferentes escenarios y orígenes mutantes específicos. También se pueden emplear para clones en los que se altera la expresión génica, lo que conduce a la pérdida o ganancia autónoma de las condiciones de función. Esto permitiría la exploración de respuestas no autonómicas en las células circundantes, facilitando la identificación de mecanismos de comunicación cruzada o celular (Figura 5). Este enfoque se ha empleado recientemente en la identificación de la vía articulada Fat/Dachsous/Four como un elemento clave que dirige y orienta la alineación de las células durante el despliegue del patrón polar plano de la epidermis abdominal del adulto9.
Figura 1: Disección y montaje de pupas para imágenes en vivo. (A) De izquierda a derecha: vista dorsal de un prepupa a 0 h APF (izquierda) y de una pupa a las 14 h APF antes (medio) y después (derecha) la eliminación del caso de pupa opaca. Se indica la región opercular (puntas de flecha blancas). (B) Se muestra el conjunto de herramientas esencial para la disección. De izquierda a derecha: diapositiva de vidrio, cinta adhesiva de doble cara, un par de fórceps y una placa de fondo de cristal. (C) Las pupas escenificadas se inmovilizan en cinta adhesiva de doble cara en los portaobjetos de vidrio de lado dorsal hacia arriba. El caso pupal de cada pupa se abre desde la región opercular con fórceps quirúrgicos. (D-E) El pelado del caso pupal es gradual. La caja está rota y doblada a los lados pupal desde la cabeza hasta el abdomen. (F-H) La pupa se levanta suavemente del lado ventral con las puntas de los fórceps (G) y se transfiere a un plato de fondo de vidrio sobre una gota mínima de aceite de halocarbono. (I) La pupa está entonces adecuadamente orientada (dorsolateralmente, superior; dorsal, inferior). Se pueden montar varias pupas simultáneamente repitiendo los pasos que se muestran en los paneles CaI. (J) Imagen que muestra el contorno de las células del nido histoblasto dorsal del segmento AIII que expresa el marcador de unión Atp::GFP. La pupa estaba orientada dorsolateralmente y se asolizó a las 14 horas APF. Barra de escala a 22 m. (K) Imagen equivalente a (J) pero desde un punto de vista dorsal. La dinámica del desarrollo tisular se puede visualizar durante varias horas. Vea también la figura 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Generación de mosaicos genéticos a través del sistema FLP/FRT. (A) Una célula heterocigota parental (magenta pálido) lleva un alelo mutante recesivo (rectángulo discontinuo) en un brazo cromosómico y un gen que codifica para un marcador fluorescente (magenta) en el otro brazo cromosómico [el brazo izquierdo del cromosoma 2 (2L) en este ejemplo]. Los sitios FRT (rectángulos naranjas) están diseñados en ambos brazos en las mismas posiciones cromosómicas proximales a los centromere (óvalos grises). (B) La activación de la FLP recombinase por choque térmico en células pausadas en G2 conduce a la recombinación entre los FRT de los cromátidos hermanos 1-1' y 2-2'. Como resultado, se intercambia la región distal a los sitios FRT (FRT40A en 2L). Se muestra una vista ampliada en el panel derecho. (C) Sobre la segregación polar de las regiones reorganizadas (1-1' y 2-2') durante la mitosis, se generan dos células hermanas genéticamente diferentes. Una hija es homocigota para el alelo recesivo y para todo el brazo cromosómico distal al lugar de la recombinación. Esta célula carece del gen que codifica para el marcador fluorescente, marcado negativamente en blanco. La otra célula hija será homocigota para el brazo de tipo salvaje, dando lugar a un punto doble y expresando dos copias de los genes que codifican para el marcador fluorescente (magenta oscuro). Para simplificar, no se muestran las segregaciones de las regiones reorganizadas a polos opuestos de la célula mitótica (es decir, 1 x 2 y 1'-2'). Estos dan lugar a células fenotípicamente indistinguibles de la célula parental (fondo heterocigoto, magenta pálido). (D) Imagen que muestra clones en el compartimiento A generados a través de la recombinación somática FLP/FRT en la tercera etapa de larvas instar y visualizados a 26 h APF. Los clones de células están marcados por la ausencia de RFP.nls (negro) y la expresión homocigota de RFP.nls (magenta brillante, puntos gemelos) en un fondo RFP.nls heterocigoto (magenta oscuro). Se pueden lograr eventos equivalentes para sitios FRT ubicados en otras ubicaciones cromosómicas (2R, 3L, 3R y X). Vea también la figura 5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ilustración de las mediciones de orientación de la celda. Para extraer información sobre las orientaciones de las celdas, primero se establece un sistema de coordenadas planas para relacionar la orientación celular con el eje de tejido (A). En segundo lugar, las orientaciones de celda se extraen de los contornos de celda (B). Por último, las orientaciones celulares y las alineaciones con el eje del tejido se cuantifican (C). (A) A la izquierda, un diagrama de una vista lateral de una pupa orientada según el sistema de coordenadas planas. El sólido rojo y las líneas discontinuas cian definen el plano cartesiano que representa el límite anteroposterior (A/P) y la línea media dorsal respectivamente. En el centro, una imagen invertida que muestra una vista dorsolateral de los histoblastos en expansión a 26 h APF delineado por el marcador de unión Atp::GFP (imagen de entrada). La posición del contorno A/P se resalta con una línea roja. A la derecha, una brújula axial que muestra el código de color aplicado para describir las orientaciones del borde de celda (polígonos) o las orientaciones de celda promediadas (barras). (B) Visualización del menúPlugins/OrientationJ y la ventana Distribución OrientationJ. (B') Visualización de la ventana Distribución OrientationJ que muestra la configuración de los parámetros empleados para obtener el mapa de orientación del borde de celda a la derecha. (B'') Ilustración de los contornos de celda codificados por colores en celdas idealizadas. Un círculo no muestra ningún color preferido. (C) Visualización de la ventana Medida OrientationJ. (C') Capturas de pantalla secuenciales de la ventana OrientationJ Measure que muestra cómo medir la orientación local y la coherencia en ROI consecutivos de peso uniforme. El ángulo de orientación local y la coherencia de cada región se muestran como elipsoides. (C'') Representación de los resultados finales de la medición de orientación. Los elipsoides muestran visualmente la orientación (es decir, el ángulo del eje más largo del elipsoide con respecto al límite A/P) y la coherencia (es decir, la relación entre el eje más largo y el más corto del elipsoide). Los valores numéricos de ambos parámetros se guardan en una hoja de cálculo para análisis posteriores. (C''') Ilustración de los contornos de celda codificados por colores y la orientación de celda promediada (barras) en celdas idealizadas. Un círculo no muestra ninguna orientación preferida. (C'''') Representación de la orientación local preferida de cada ROI (mapa de orientación promediado localmente). Los colores resaltan la orientación de cada región. Anterior está a la izquierda. Barra de escala a 22 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes en vivo a largo plazo de epitelia abdominal en crecimiento. (A) Instantáneas representativas de películas de imágenes a largo plazo desde fases tempranas hasta las últimas de la expansión histoblast. Arriba: Vistas esquemáticas de una pupa orientada a imágenes dorsolaterales a 16 h y 26 h APF. El territorio ocupado por los nidos visibles desde el lado dorsolateral de la pupa se resalta en gris oscuro a las 16 y 26 h APF. Inferior: Imágenes que muestran los contornos de celda de histoblastos y LEC etiquetados por la expresión omnipresente del marcador de unión Atp::GFP. El límite de A/P se encuentra entre los dos compartimentos resaltados (células de color falsas en azul, compartimento anterior; verde, compartimentos posteriores). (B) Instantáneas representativas de películas de imágenes a largo plazo desde fases tempranas hasta las últimas de los nidos confluencia. Arriba: Vista esquemática de una pupa orientada a imágenes dorsales a 32 h y 48 h APF. Inferior: Contornos de celda (etiquetados y coloreados como en A). Tenga en cuenta que el marcador Atp::GFP permite delinear la forma de las células epiteliales individuales a lo largo del tiempo con alta resolución. Barra de escala a 22 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Propiedades del tejido extraídas del análisis clonal. (A) Ejemplos de clones de tipo salvaje en el compartimiento A marcados por la ausencia de RFP.nls (negro) y sus puntos gemelos (magenta brillante) a 26 h APF. Los clones se alargan a lo largo de los límites segmentarios. Los clones gemelos se organizan en paralelo o en tándem. Barra de escala a 22 m. (B) Superior: imágenes que ilustran los parámetros cuantificados a partir de los contornos del clon. Abajo: Tabla de resumen que informa de los valores medios de los parámetros indicados para animales de tipo salvaje (n a 29). (C) Morfología de un clon de tipo salvaje a 26 h (izquierda) y 47 h (derecha) APF. El clon muestra una morfología fronteriza compleja en ambas etapas. (D) Cuadro y bigote gráfica para parámetros geométricos a 26 h (amarillo claro) y 47 h APF (amarillo oscuro). El área promediada y el perímetro aumentan significativamente en esta ventana de tiempo. (E) Gráficas polares que representan la orientación de los clones (tamaño de la bandeja 18o, abundancia proporcional al área). La orientación se mantiene durante la expansión y remodelación. (F) El cuadro y el bigote trazan para los parámetros de forma a 26 h (amarillo claro) y 47 h APF (amarillo oscuro). La rugosidad (solidez), la redondez y la circularidad apenas cambian. Los valores medios se muestran con una línea horizontal roja y los bigotes se extienden a los valores mínimo y máximo de la distribución. Las estadísticas se realizaron con pruebas K-SM o W (p < 0.0001****, p > 0.05 no significativas). Anterior está a la izquierda, dorsal está arriba. Barra de escala a 16 m. El genotipo es hsflp1.22; FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El orden de largo alcance es una característica esencial de la mayoría de las unidades fisiológicas funcionales. Durante la morfogénesis, el orden se logra mediante la integración de instrucciones complejas implementadas con alta precisión temporal y espacial. Las restricciones múltiples y multinivel se integran en los arreglos de tejidos estereotipados.
La polaridad y la direccionalidad son fundamentales para ordenar la disposición espacial durante el desarrollo. La polaridad implica la ruptura de la simetría durante el desarrollo. La consecución de la asimetría es necesaria para la determinación de los ejes anteroposterior embrionario (A/P) y dorsoventral (D/V) y la organización adulta26. Más allá de este papel inicial, las asimetrías locales son esenciales para la diversidad morfológica a todos los niveles. La direccionalidad es un complemento esencial de la asimetría y la polaridad durante la morfogénesis. El orden global se implementa mediante la capacidad de las células para detectar y transmitir señales localmente en una base de celda a celda con un sentido u orientación preciso. Las asimetrías de células individuales armonizan de forma cooperativa a lo largo del tiempo orientando posiciones o movimientos dentro de direcciones particulares en el espacio. La comunicación celular implica factores secretos, contactos de celdas y entradas mecánicas. Las señales actúan en campos de celdas que primero localmente y luego modifican globalmente sus comportamientos27.
Este trabajo presenta una manera sencilla de analizar los comportamientos coordinados de las células individuales, incluyendo su orientación plana y parámetros de crecimiento durante el desarrollo del orden tisular. La morfogénesis del abdomen adulto de Drosophila durante la pupación presenta una serie de ventajas técnicas sobre otros modelos equivalentes como la extensión/retracción de la banda germinal28 o el cierre dorsal29 durante la embriogénesis mosca, la morfogénesis del ala Drosophila ex vivo30,el recinto ventral en Caenorhabditis elegans31,o la fusión palatal en ratones32,entre otros.
En primer lugar, la morfogénesis del abdomen constituye un proceso que se puede seguir en su totalidad in vivo. Las imágenes en vivo continuas de la sustitución de los LEC por los histoblastos se pueden realizar a partir de 12 h APF, cuando se forma la pupa, hasta la finalización de la morfogénesis epitelial adulta. En segundo lugar, permite analizar un conjunto completo de comportamientos celulares como la migración celular, la división, los cambios de forma, la delaminación y la intercalación. Por último, es susceptible a interferencias genéticas y análisis clonal. Los efectos autónomos y no autónomos de la pérdida y la ganancia de las actividades de función se pueden controlar en vivo mediante el empleo de marcadores adecuados. Sin embargo, la pupa como sistema modelo presenta algunas limitaciones menores. Debido a su forma ovoide, no es posible realizar imágenes simultáneas en vivo de eventos laterales y dorsales con alta resolución. Este problema se puede superar mediante la realización de imágenes secuenciales en pupas orientadas de forma dorsolateral y dorsal o mejor, mediante el empleo de múltiples ángulos de microscopía de iluminación selectiva de plano (SPIM) de lámina de luz. Otro inconveniente es la presencia de dos poblaciones celulares diferentes de diferentes tamaños en los análisis (es decir, LECs poliploides e histoblastos diploideos). Esto puede hacer que la segmentación de imágenes sea compleja y las dos poblaciones de celdas deben analizarse por separado.
En el futuro, las imágenes a largo plazo de Drosophila pupae se pueden adaptar fácilmente para estudiar una gama completa de fenómenos morfogenéticos, incluyendo la coordinación del desarrollo epidérmico, muscular y neuronal durante la metamorfosis en condiciones de tipo salvaje y mutantes. Además, los algoritmos y plugins en uso pueden ser empleados para estudiar la organización, el patrón y la dinámica de muchos otros tejidos.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a los miembros del laboratorio Martín-Blanco por los debates útiles. También damos las gracias a Nic Tapon (The Crick Institute, Londres, Reino Unido), el Bloomington Stock Center (Universidad de Indiana, EE. UU.) y FlyBase (por la anotación del gen Drosophila). Federica Mangione recibió el apoyo de una beca predoctoral JAE-CSIC. El laboratorio Martín-Blanco fue financiado por el Programa Estatal de Fomento de la Investigación Científica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P y BFU2017-82876-P) y de la Fundación Ramón Areces.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis Software | - | ImageJ | Analyzing data |
| Drosophila | Atpa::GFP | - | Strains employed for data collection |
| Drosophila | hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | - | Strains employed for data collection |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter for dissection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting pupae for data collection |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | mounting pupae |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Data collection |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the pupae during dissection |
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