Summary

Imagerie et analyse de l’orientation tissulaire et de la dynamique de croissance dans l’épithélie de drosophile en développement pendant les stades pupal

Published: June 02, 2020
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Summary

Ce protocole est conçu pour l’imagerie et l’analyse de la dynamique de l’orientation cellulaire et de la croissance des tissus dans l’épithélie abdominale Drosophila que la mouche des fruits subit une métamorphose. La méthodologie décrite ici peut être appliquée à l’étude de différents stades de développement, tissus et structures subcellulaires dans Drosophila ou d’autres organismes modèles.

Abstract

Dans les organismes multicellulaires, les tissus et les organes matures affichent des degrés élevés d’ordre dans les arrangements spatiaux de leurs cellules constitutives. Un exemple remarquable est donné par l’épithélia sensorielle, où les cellules des mêmes identités ou distinctes sont réunies par l’adhérence cellulaire montrant des modèles planaires très organisés. Les cellules s’alignent les unes sur les autres dans la même direction et affichent une polarité équivalente sur de grandes distances. Cette organisation de l’épithélia mature est établie au cours de la morphogenèse. Pour comprendre comment l’arrangement planaire de l’épithélia mature est atteint, il est crucial de suivre l’orientation cellulaire et la dynamique de croissance avec une fidélité spatiotemporal élevée pendant le développement in vivo. Des outils d’analyse robustes sont également essentiels pour identifier et caractériser les transitions locales à mondiales. La pupe Drosophila est un système idéal pour évaluer les changements orientés de forme cellulaire sous-jacents morphogenèse épithéliale. L’épithélium en développement du pupal constitue la surface externe du corps immobile, permettant l’imagerie à long terme des animaux intacts. Le protocole décrit ici est conçu pour imager et analyser les comportements cellulaires aux niveaux mondial et local dans l’épiderme abdominal pupal à mesure qu’il grandit. La méthodologie décrite peut être facilement adaptée à l’imagerie des comportements cellulaires à d’autres stades de développement, tissus, structures subcellulaires, ou organismes modèles.

Introduction

Pour atteindre leurs rôles, les tissus épithéliaux s’appuient pleinement sur l’organisation spatiale de leurs composants cellulaires. Dans la plupart des épithéliales, les cellules sont non seulement emballées les unes contre les autres pour créer une couche pavée précise, mais elles s’orientent par rapport aux axes du corps.

L’importance fonctionnelle de l’organisation précise des tissus est évidente dans l’épithélia sensorielle, comme l’oreille interne vertébré et la rétine. Dans le premier cas, les cheveux et les cellules de soutien s’alignent dans une direction axial spécifique pour détecter efficacement les entrées mécaniques telles que le son et le mouvement1,2. De même, l’organisation spatiale des cellules photoréceptrices est essentielle pour atteindre des propriétés optiques optimales par la rétine3. Le contrôle spatial de la position et de l’orientation cellulaires est donc d’une pertinence particulière pour une fonction physiologique appropriée.

Drosophila est un insecte holometabolous qui subit une transformation complète de ses structures corporelles larvaires par métamorphose, donnant naissance à ses tissus adultes. La pupe Drosophila est un excellent modèle pour l’imagerie en direct non invasive d’une variété d’événements dynamiques, y compris la migration des cellules développementales4, la division cellulaire et la dynamique de croissance5, contraction musculaire6, la mort cellulaire7, la réparation de la plaie8, et l’orientation cellulaire9. Dans l’adulte Drosophila, l’épithélium externe montre un haut degré d’ordre. Ceci est facilement observé sur les arrangements des trichomes (c.-à-d. les protubérances cellulaires provenant de cellules épithéliales simples) et les poils sensoriels sur toute la surface du corps de la mouche10. En effet, les trichomes sont alignés dans des rangées parallèles guidant le flux d’air11. La morphogénèse de l’épithélie adulte et l’arrangement ordonné des cellules individuelles commence pendant l’embryogenèse et culminent pendant les stades pupal. Alors que dans les divisions cellulaires des embryons, les intercalations, et les changements de forme tous diminuer l’ordre des tissus12,13, cela est retourné à des stades ultérieurs de développement, en particulier à des stades pupal, lorsque la mouche approche de la maturité9.

La pupe immobile Drosophila fournit un système idéal pour évaluer la forme cellulaire et les changements d’orientation. L’épiderme abdominal pupal présente des avantages spéciaux. Tandis que les précurseurs de la tête, du thorax, des organes génitaux et des appendices adultes se développent et obtiennent modelés à partir des stades larvaires, les histoblastes, qui sont intégrés dans l’épiderme larvaire, commencent à croître et à se différencier seulement à la pupariation14. Cette fonctionnalité permet le suivi de tous les événements spatiotemporal impliqués dans l’établissement de l’ordre tissulaire dans son intégralité9.

Les histoblastes sont spécifiés pendant le développement embryonnaire aux positions contralatérales dans chaque segment abdominal présumé. L’épiderme abdominal dorsale de l’adulte dérive des nids d’histoblaste situés de façon dorsolaterale présent dans les compartiments antérieurs et postérieurs15,16. Au fur et à mesure que les histoblastes se développent, remplaçant les cellules épithéliales larvaires (LEC), les nids contralatéraux fusionnent à la ligne médiane dorsale formant une feuille confluente17,18,19,20.

Ce travail décrit 1) une méthodologie pour la dissection, le montage, et l’imagerie vivante à long terme de la pupe de Drosophila, et 2) méthodes analytiques pour étudier la dynamique de l’orientation et de la croissance cellulaires à la résolution spatiotemporal élevée. Un protocole détaillé est fourni ici, couvrant toutes les étapes requises depuis la préparation initiale des pupes (c.-à-d. la mise en scène et l’imagerie) jusqu’à l’extraction et la quantification des caractéristiques de directionnalité et d’orientation. Nous décrivons également comment déduire les propriétés tissulaires locales de l’analyse des clones cellulaires. Toutes les étapes décrites sont peu invasives et permettent des analyses en direct à long terme. Les méthodes décrites ici peuvent être facilement adaptées et appliquées à d’autres stades de développement, tissus ou organismes modèles.

Protocol

REMARQUE : Ce protocole est divisé en cinq étapes : (1) la mise en scène de la pupe, (2) préparant la pupe pour l’imagerie, (3) l’imagerie en direct de l’épithélia abdominale croissante, (4) génération de mosaïques génétiques, (5) le traitement et l’analyse des données (y compris les sections décrivant comment analyser la dynamique d’orientation cellulaire à partir des contours de jonction cellulaire et la dynamique de croissance des clones cellulaires). 1. Mise en scène…

Representative Results

Le protocole décrit ci-dessus couvre la préparation des pupes de Drosophila pour l’imagerie vivante à long terme et les procédures pour l’analyse de l’orientation cellulaire et de la dynamique de croissance de l’épiderme abdominal. En appliquant cette méthodologie, il est possible de générer des films haute résolution des pupes en développement pour des périodes allant jusqu’à 48 h sans photoblachage significatif ou phototoxicité. Des instantanés représen…

Discussion

L’ordre à longue portée est une caractéristique essentielle de la plupart des unités physiologiques fonctionnelles. Pendant la morphogenèse, l’ordre est atteint grâce à l’intégration d’instructions complexes mises en œuvre avec une grande précision temporelle et spatiale. Les contraintes multiples et multiniveau sont intégrées dans les arrangements tissulaires stéréotypés.

La polarité et la directionnalité sont essentielles à l’arrangement spatial ordonné pendant l…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Martin-Blanco pour des discussions utiles. Nous remercions également Nic Tapon (The Crick Institute, Londres, Royaume-Uni), le Bloomington Stock Center (Université de l’Indiana, Etats-Unis) et FlyBase (pour l’annotation des gènes Drosophila). Federica Mangione a été soutenue par une bourse prédoctorale JAE-CSIC. Le laboratoire Martin-Blanco a été financé par la Programa Estatal de Fomento de la Investigacion Cient-fica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P et BFU2017-82876-P) et de la Fondation Ramon Ramon Areces.

Materials

Analysis Software ImageJ Analyzing data
Drosophila Atpa::GFP Strains employed for data collection
Drosophila hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls Strains employed for data collection
Dumont 5 Forceps FST 11251-20 1.5 mm diameter for dissection
Glass Bottom Plates Mat Tek P35G-0.170-14-C Mounting pupae for data collection
Halocarbon Oil 27 Sigma-Aldrich 9002-83-9 mounting pupae
Inverted Confocal microscope Zeiss LSM700 Data collection
Stereomicroscope Leica DFC365FX Visualization of the pupae during dissection

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Cite This Article
Mangione, F., Martin-Blanco, E. Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages. J. Vis. Exp. (160), e60282, doi:10.3791/60282 (2020).

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