Summary
פרוטוקול זה מיועד הדמיה וניתוח של הדינמיקה של כיוון התאים ואת צמיחת רקמות בתוך הבטן הדרוזולה epithelia כמו זבוב הפרי עובר מטמורפוזה. המתודולוגיה המתוארת כאן ניתנת להחלה על חקר שלבים, רקמות ומבנים תת-סלולאריים שונים בדרוזופילה או באורגניזמים אחרים במודל.
Abstract
בתוך אורגניזמים רב-תאיים, רקמות בוגרות ואיברים להציג דרגות גבוהות של סדר בהסדרים מרחביים של התאים המרכיבים שלהם. דוגמה יוצאת דופן ניתנת על ידי epithelia חושי, שבו תאים של זהות זהה או ברור מובאים באמצעות הדבקה תא תא מראה דפוסי מישורי מאורגן מאוד. תאים מתיישרים אחד לשני באותו כיוון ומציגים קוטביות שוות ערך על מרחקים גדולים. ארגון זה של אפיתאליה בוגרת מוקם במהלך הורפוגנזה. כדי להבין כיצד ההסדר מישורי של epithelia בוגרת מושגת, זה חיוני כדי לעקוב אחר כיוון התא ואת הדינמיקה הצמיחה עם נאמנות זמן זמני גבוהה במהלך הפיתוח ב vivo. כלים אנליטיים חזקים גם הם חיוניים כדי לזהות ולאפיין מעברים מקומיים לגלובליים. הגולם הוא מערכת אידיאלית להערכת צורה מכוונת של תאים שינויים בבסיס האפיתל. גולמי פיתוח אפיתל מהווה את המשטח החיצוני של הגוף משותק, המאפשר הדמיה ארוכת טווח של בעלי חיים שלמים. הפרוטוקול המתואר כאן נועד לצלם ולנתח התנהגויות תא ברמות הכללית והמקומית באפידרמיס הבטן גולמי כפי שהוא גדל. המתודולוגיה תיאר ניתן להתאים בקלות הדמיה של התנהגויות תא בשלבים התפתחותיים אחרים, רקמות, מבנים subcellular, או מודל אורגניזמים.
Introduction
כדי להשיג את תפקידם, רקמות אפיתל להסתמך באופן מלא על הארגון המרחבי של הרכיבים הסלולריים שלהם. ברוב epithelia, תאים הם לא רק ארוזים אחד נגד השני כדי ליצור שכבת האבנים מדויק, אבל הם האוריינט עצמם ביחס צירי הגוף.
החשיבות הפונקציונלית של ארגון הרקמה המדויקת ברורה באפיליה הסנסורית, כגון האוזן הפנימית של בעלי החוליות והרשתית. במקרה הראשון, השיער והתאים התומכים מתיישרים בכיוון צירית מסוים כדי לחוש ביעילות כניסות מכניות כגון קול ותנועה1,2. באופן דומה, גוף תא קולט אור הארגון המרחבי חיוני להשגת מאפיינים אופטיים אופטימליים על ידי הרשתית3. השליטה המרחבית של מיקום התא והתמצאות היא ובכך של רלוונטיות מיוחדת לתפקוד פיזיולוגי תקין.
דרוזופילה הוא חרק מholometabolous העובר טרנספורמציה מלאה של מבנה גוף הזחל שלה באמצעות מטמורפוזה, ומעורר את הרקמות הבוגרים שלה. הגולם הוא מודל מצוין עבור הדמיה חיה לא פולשנית של מגוון רחב של אירועים דינמיים, כולל הגירה תא התפתחותית4, מחלקת תאים ודינמיקה הצמיחה5, שריר התכווצות6, מוות התא7, פצע תיקון8, ותא כיוון9. בבית האדם המבוגר,האפיתל החיצוני מראה רמה גבוהה של הסדר. זה ניתן לצפות בקלות על הסדרים של trichomes (כלומר, בליטות תא שמקורם בתאים אפיתל יחיד) ו זיפים חושים בכל רחבי פני הגוף של הזבוב10. אכן, trichomes מיושרים בשורות מקבילות המנחה את זרימת אוויר11. הורפוגנזה של אפיתאליה למבוגרים וההסדר הסדור של התאים הבודדים מתחיל במהלך embryogenesis ולהגיע לשיאו במהלך שלבים גולמי. בעוד שבחטיבות תאים של העוברים, האינטרקלציות והצורה משנות את כל הסדר הקטן של הרקמה12,13, זה בחזרה בשלבים מאוחרים יותר של פיתוח, במיוחד בשלבי גולמי, כאשר הזבוב מתקרב לבגרות9.
מערכת Drosophila מושלמת להערכת צורת תא והתמצאות. האפידרמיס הבטן גולמי מציג יתרונות מיוחדים. בעוד הסמנים של הראש המבוגר, בית החזה, אברי המין, ואת התוספות לצמוח ולקבל תבנית מתוך שלבי זחל, היסטריפיצוצים, אשר משולבים לתוך האפידרמיס זחל, להתחיל לצמוח ולהבדיל רק על הפפריציה14. תכונה זו מאפשרת מעקב אחר כל האירועים הטמפורלית המעורבים בהקמת סדר הרקמה בשלמותו9.
היסטלפיצוצים מצוינים במהלך התפתחות עובריים בתנוחות מושרות בכל פלח בטן שוערת. האפידרמיס הבטן האחורי של המבוגר נובע מdorsolaterally ממוקם קנים היסטורית להציג בתוך התאים הקדמי והאחוריים15,16. כמו מתרחבים היסטראקס, החלפת התאים האפיתל בזחל (lecs), מרעום הקנים הצלעות בלקו האמצע היוצר גיליון קונרהוט17,18,19,20.
עבודה זו מתארת 1) מתודולוגיה להדמיה, הרכבה והדמיה חיה ארוכת טווח של הגלמים של דרוזוהילה , ו -2 שיטות אנליטיות לחקר הדינמיקה של אוריינטציה תאית וצמיחה ברזולוציה גבוהה ביותר. פרוטוקול מפורט מסופק כאן, ומכסה את כל הצעדים הנדרשים מהכנת הגלמים הראשוניים (כלומר, היערכות והדמיה) להפקת וכימות של תכונות כיווניות וכיוון. אנו גם לתאר כיצד להסיק תכונות רקמה מקומית מניתוח של שיבוטים תא. כל השלבים המתוארים הם פולשניים מינימלית ומאפשרים ניתוחים לטווח ארוך. השיטות המתוארות כאן ניתן להתאים בקלות וליישם בשלבים התפתחותיים אחרים, רקמות, או אורגניזמים מודל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: פרוטוקול זה מחולק לחמישה שלבים: (1) הכנת הגלמים, (2) להכין את הגלמים להדמיה, (3) הדמיה חיה של אפיליה הגוברת הבטן, (4) הדור של פסיפסים גנטיים, (5) עיבוד נתונים וניתוח (כולל סעיפים המתארים כיצד לנתח דינמיקה של כיוון התא מקווי המתאר
1 . היערכות הגלמים לפני הדמיה
- התרבות זבובים של גנוטיפ המתאים על בינוני רגיל בבקבוקי פלסטיק ב 25 ° c עבור 5 ימים (± 12 h) לאחר הנחת ביצים (ח. א.).
הערה: הגלגול מתחיל בתוך הכליאה של הזחלים השלישי לתוך המקרה גולמי ב 120 h לפני 0 h לאחר היווצרות puparium (apf). מעבר זה ניתן לזיהוי בקלות, כי הזחלים מפסיקים להאכיל ולנוע והאזור המבצע נוצר (איור 1א) ב 0-12 h apf. הפופריום בתחילה רך ולבן, אך מתקשה ושיזוף בהדרגה. - העברת הגלמים הלבנים (0 h APF) לבקבוקון פלסטיק טרי באמצעות מברשת צבע מויסטן. בעלי חיים יכולים להישמר בטמפרטורות שונות, בהתאם לניסוי המתוכנן עד לגיל הרצוי.
הערה: היווצרות הגולם (כלומר, pupation) מתרחש ב-12 h APF, כאשר הראש והתוספות של הזבוב המבוגר הם לגמרי everted (איור 1א). בשלב זה, המקרה גולמי מופרד לחלוטין מן הגולם, ומאפשר הסרהמלאה(איור 1א).
2. הכנת גלמים להדמיה חיה
הערה: לאחר ההיערכות, הגלמים ממופרשים ומורכבים כמתואר להלן (ראו גם איור 1).
- להסיר גלמים מבוים מהקיר של הבקבוקון בעזרת מלקחיים.
- הדבק את הצד הגחוני של כל גולם על שקופית זכוכית מכוסה בנייר דביק דו צדדי. הברז בעדינות על נושפות הראש (כלומר, אזור האופרקוללי) והמשטח הפנימי של הגולם עם קצות המלקחיים כדי להבטיח את הדבקה של המקרה גולמי לקלטת (איור 1א, ב).
הערה: על פני השטח החלק הפנימי להקל על הניתוח של הנרתיק ועל החזרת הגולם. - התחילו בניתוח מתחת לstereomicroscope על ידי הסרת האופרציה מתוך הפופריום עם הלקחיים (איור 1ג).
- הכניסו קצה אחד של הלקחיים בזווית רדודה בין המארז הפופל לבין משטח הגולם דרך הפתח המבצע. קורעים את הנרתיק מראש לזנב בתנופה אחת או יותר, תוך הימנעות מצביעת הגולם (איור 1ד). מקפלים בחזרה את המקרה גולמי סדוק לצדדים לרוחב כפי שאתה ממשיך להמשיך את הקצה האחורי (איור 1E).
הערה: המקרה גולמי הוא נוקשה למדי וסדקים בקלות. במקרה של לחות גבוהה או ברקע genotypic מסוים, המקרה גולמי הופך רך יותר והקרע קשה יותר. במקרים אלה, סדיקה של המקרה גולמי ניתן לסייע על ידי החירור הקצוות שלה חופשי עם שני קצות המלקחיים. - הסר את הגולם מהמקרה הפתוח גולמי על ידי החדרת בזהירות מלקחיים מתחת לבעל החיים בעדינות מושך (איור 1F). הגולם יהיה דבוק לקצה הלקחיים (איור 1ג'י-י).
- העבר את הגולם בעזרת הלקחיים לצלחת הזכוכית התחתונה והכנס אותו על טיפה קטנה של שמן הלוגן חדיר גז (איור 1I). החזק את הגולם בעדינות על ידי הצד הגחוני כדי למנוע נזק אפשרי לרקמות.
הערה: הירידה של שמן ההלוקרבון חייבת להיות קטנה, עם קוטר של פחות ממחצית אורכו של הגולם. סכום כזה מספיק כדי לדבוק בגולם לזכוכית על ידי קפילריות ולתקן את האופטיקה למטרות טבילה בשמן. - מגלגלים פיסת נייר טישו רטוב בקצות המנה כדי לשמור על לחות. מכסים את הצלחת כדי למנוע התייבשות של הגלמים במהלך ההדמיה.
הערה: ניתן לנצל גם את הגלמים הנקביים והזכרים להדמיה. אנו ממליצים להעסיק את מגזרי הבטן השלישית (AIII) כמו metamere בטן התייחסות מכיוון שהוא זהה כמעט בשני המינים במונחים של גודל, צורה, ו הפנינג.
3. הדמיה חיה של הגוברת אפיתליה הבטן
הערה: לייזר הפוך סריקת מיקרוסקופ קונפוקלית וקד מצויד במטרה טבילה בשמן 40x/1.3 NA שימש הגלמים התמונה בשלבים התפתחותיים שונים.
- מכוון את הגולם על טיפת הנפט על הצלחת הזכוכית בתחתית לפי התחום ואת התהליך להיות מוערך (g. dorsolaterally לטווח ארוך הדמיה חיה של התרחבות מוקדם של קני הראש, או דורסלי לדמות שיפוץ מאוחר רקמות שלהם התרחבות). ראה איור 1J, K ואיור 4.
- העבר את המנה התחתונה לזכוכית המכילה את הגלמים הנטענים לשלב המיקרוסקופ והתמקד על פני השטח של אזור הבטן באמצעות האור המשודר.
הערה: גם אם פרוטוקול זה ממוטב לדימות על מיקרוסקופים הפוכים, ניתן גם לבצע דימות על מיקרוסקופ זקוף. במקרה זה, המדגם ממוקם על במת המיקרוסקופ עם המשטח התחתון זכוכית פונה כלפי מעלה. שמן ההלו-פחמן מחזיק כל גולם על מניסקוס. - הגדר את פרמטרי הרכישה: 1) מספר הפרוסות של Z הוא בדרך כלל בין 20 ל-40 כדי לאפשר שחזור דו-מימדי מתאים (2D) של האפידרמיס הבטני; 2) גודל המדרגה בין פרוסה (לדוגמה, 1 מיקרון); 3) מרווח זמן להקלטה (מרווח של 5 דקות מתאים לניתוח בנאמנות גבוהה של דינמיקת כיוון התא); ו-4) רזולוציית מסגרת (לדוגמה, 1024 x 1024).
- הפעל את לייזרים המתאים (כלומר, 488 nm ו 561 nm כדי להמחיש את GFP ו-RFP fluorophores בהתאמה) ולהתאים את כוח הלייזר ולהשיג/לקזז הגדרות כדי להמחיש את התאים המסומנים. השתמש בכוח הלייזר הנמוך ביותר האפשרי (בטווח 5%-20%) כדי למזער את הלבנת התמונות והתמונות.
- הגדר באופן ידני את המיקום ואת המגבלות המתאימות של מחסנית Z עבור גלמים מרובים באמצעות השלב המונע המצורף והמיקרוסקופ מרובה מיקום תוכנה הרכישה.
4. הדור של פסיפסים גנטיים לעקוב אחר התנהגויות של שיבוטים תא
הערה: אנו מעסיקים mitotic רקומבינציה כדי לגרום פסיפסים גנטיים באפיתל הבטן דרך שילוב ספציפי לאתר (FLP/frt21מערכת 21,22) (איור 2).
- הנקבות הבתולה לחצות נושאת הלם חום-inducible מעבר בזלזול (hs-FLP), יעד זיהוי FLP (FRT) באתר גנומית ספציפי (למשל, האתר FRT במיקום 40A בזרוע L של כרומוזום 2), ו סמן הסלולר לזיהוי (למשל, Ubi-RFP. nls או Ubi-GFP. nls) המרוחק לאתר FRT, לזכרים מוטנטים נושאת אתר FRT במיקום גנומי שווה ערך (איור 2a-g).
הערה: השפעות אוטונומיות ושאינן אוטונומיות בתוך או מחוץ שיבוטים עבור כל הפסד גנטי של הפונקציה ניתן ללמוד העסקת השימוש הספציפי האלולים מסוים באתר FRT. - צור FLP/FRT שיבוטים סומטיים ב היסטריפיצוצים על ידי טיפול בהלם חום בשלב השלישי הזחל הגוף של צאצאי הצלב. הדבר מבוצע על ידי מיזוג משנה את מבחנות פלסטיק המכיל את החיות באמבט מים ב 37 ° c עבור 45 דקות עד 1 h בשלב הזחלים הנודדים (LIII).
הערה: התקופה הרגישה עבור שילוב mitotic חוזר היא השלב של G2 במחזור התאים. במהלך כל התפתחות הזחל. - ניקוד שיבוטים תאומים עבור היעדרות (כלומר, תאי מוטציה) או משופר (כלומר, סוג פראי תאים ספוט התאום) רמות של סמן חלבון פלורסנט מ 16 h APF ואילך (איור 2ד).
הערה: בממוצע, 45 דקות עד 1 h בשעה 37 ° c מספקת רק 2-3 שיבוטים תאומים לאזור הריבית (למשל, קטע הבטן). הגלמים מציגים צפיפות גבוהה מדי של שיבוט (למשל, יותר מארבעה שיבוטים תאומים לכל פלח) יש להיפטר מניתוחים כמותיים נוספים. - עם זיהוי שיבוט, התמונה גלמים החיים בשלב הרצוי ולמשך הזמן הרצוי כפי שמתואר בסעיף הקודם.
5. עיבוד וניתוח נתונים
הערה: הנתונים מעובדים באמצעות ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).
- הבחנה בין דינמיקת כיוון התא לקווי מתאר של צומת תאים.
- השתמשו בפרוסות ' מחסנית Z ' שנרכשו על-ידי מיקרוסקופ משני בתלת-ממד בעזרת הפונקציה ' הקרנת עוצמה מרבית ' (mip) של imagej.
הערה: מספר הפרוסות לכל מחסנית יש לשמור על מינימום כדי למנוע מתוך רעש מיקוד שנוצר על ידי מקרופאגים המסיירים תחת האפידרמיס. - הגדר מערכת קואורדינטות מישורי המזהה ציוני דרך אמינים של רקמה (למשל, A/תא הגבול) לניתוח של כל ערכת נתונים (איור 3א).
הערה: השימוש באותן הפניות מישורי מידע עבור כל ערכת נתונים יאפשר להשוות מספר מדידות. - השתמש בתוסף orientationj (bigwww.epfl.ch/demo/orientation/) של imagej23,24 על קצות תאים מקומיים כדי לקבל ערכי אוריינטציה איכותיים וכמותיים. התוסף מעניק שכבות מקודדות בצבע על תמונות קלט המבוססות על הכיוונים המקומיים ומספק ערכים מספריים כאשר הם משמשים במצב כמותי (איור 3b-b ' ' ו-' באיור c-c ' ').
הערה: תוסף orientationj מבוסס על מבנה המבנה, 2 x 2 מטריקס של ערכי ערכים נגזרים הדרגתי וכיווניות23(ראההפניות 23,24 עבור תיאור מפורט). - השתמש באפשרות הפצת Orientationj כדי להתאים את הכיוונים לקצות התאים של קוד הצבע ביחס למערכת קואורדינטות מישורי (כלומר, מפות כיוון קצה התא) (איור 3b). אפשרות ההפצה נמצאת תחת תפריט התוסף ב-imagej. ההגדרות הקיימות הן: החלון סיגמא-סיגמה = 1 פיקסל; Spline מעוקב = הדרגתי; מינימום קוהרנטיות = 20%; אנרגיה מינימלית = 1%. כיוון ההדפסה של התאים מוצגים כתמונה מקודדת בצבע העושה שימוש באפשרות סקר הצבע של התוסף (Hue = אוריינטציה; רוויה = בקוהרנטיות; ובהירות = תמונת קלט).
הערה: אזורים המכילים פלואורסצנטית רקע אינם מספקים מידע כיווני ויש לכלול אותם באופן ידני מהניתוח. הגדרות הסף הגבוה מפחיתות את הפיקסלים הנחשבים בתמונות המעובדות. - השתמש באפשרות מדידה Orientationj כדי לכמת את הכיוונים הסלולריים ואת היישור תא תא התא (כלומר, התאמה) (איור 3ג). האפשרות ' מדידה ' נמצאת תחת תפריט התוסף ב-imagej. צור אזורים קטנים סמוכים שאינם חופפים של ריבית (rois) של משקל אחיד (64 x 64 פיקסלים, כ 20 יקרומטר x 20 יקרומטר) בתוך האזור הכבוש את היסטתקיעות (איור 3ג).
- חשב את הכיוון המקומי הדומיננטי (כלומר, את הכיוון הממוצע בין התאים השכנים-ממוצעי הקצוות התא כיוון הממוצע) וקוהרנטיות מן ROIs. התוכנה מחשבת את הכיוון השולט וקוהרנטיות מקומיות בתוך כל ROI (איור 3ג).
הערה: הערכים הגדולים והקטנים ביותר של המבנה טנסור המשוער על ידי Orientationj מועסקים כדי לחשב קוהרנטיות כיחס בין ההבדל שלהם ואת הסכום שלהם. האפשרות ' קוהרנטיות ' חסומה בין ערכים של 0-1. ערך של 1 מציין אחידות יישור מלאה, בעוד שערך 0 מציין אזורים איזוטרופיים ללא יישור. - מבחינה סטטיסטית מנתחים את האוריינטציה המחושבת ואת ערכי הקוהרנטיות מתמונות מרובות באמצעות חבילות תוכנה חופשית כגון העבר25. נתוני ציר הזמן, כגון ערכי כיוון (במעלות), מתוארים כראוי על-ידי סטטיסטיקות כיווניות.
- באמצעות התוכנה, חשב את הכיוון הממוצע והשונות המעגלית עבור כל ערכה של הפצות כיוון. המשמעות הסטטיסטית של ההפרש בין התפלגות הכיוונים בין ה-גנוסוגים או התנאים השונים נקבעת באמצעות מבחן מרידיה-ווטסון-וילר (W-test) עבור הפצות שוות.
- לחשב את המשמעות הסטטיסטית של ההפרש בקוהרנטיות החלת מבחן הקולמוגואז הלא פרמטרית (K-S test). הצגת נתונים באופן גרפי בהתאם לצורך (חלקות קוטביות, תרשימי עמודות, מחלקות תיבות, וכו ').
- השתמשו בפרוסות ' מחסנית Z ' שנרכשו על-ידי מיקרוסקופ משני בתלת-ממד בעזרת הפונקציה ' הקרנת עוצמה מרבית ' (mip) של imagej.
- הדינמיקה הצמיחה של שיבוטים התא
הערה: השלבים הבאים מאפשרים אחזור פרמטרים גיאומטריים וצורות עבור תאים מתמונות MIP של 2D המכילות את השכפול (ים) של ריבית. להשוואות בין שיבוטים מרובים, יש לרכוש תמונות עם אותן הגדרות.- אזורי שיבוט של פלח על-ידי ציור קווי המתאר שלהם בעזרת הכלי בחירה חופשית באמצעות imagej.
- חישוב פרמטרי גיאומטריות וצורות באמצעות הכלי ' קביעת מדידות ' של imagej בתפריט ' ניתוח '. הפעל את אפשרויות מתארי האזור, ההיקף, ההתאמהוהצורה.
הערה: הדבר יאפשר אחזור של פרמטרים גיאומטריים מגוונים, כולל האזור (סכום הפיקסלים בתוך השכפול). היקף (סכום הפיקסל של גבול השכפול), יחס הגובה-רוחב (AR, היחס בין הצירים העיקריים והקטנים של האליפסה הגדולה ביותר המתאימה ביותר שחרוט לתוך גבול השכפול) וזווית הכיוון (כלומר, זווית הציר העיקרי של השכפול יחסית לגבול הanteroposterior). - חישוב יחסי לא ממדיים ממידות אלה מאחזר פרמטרי צורה. אלה כוללים מעוגלות (4 x [אזור]/π x [ציר גדול]2), חספוס (אזור האחידות/אזור קמור), ומעגליות (4π x [אזור]/[היקף]2).
הערה: כל אחד מפרמטרי הצורה מייצג את דרגת הסטייה של המשובטים מצורות אידיאליות כגון עיגול או גוף קמור מתוחם, וכולם מוגבלים בין ערכים של 0 ו-1. ערכים השווים ל -1 מצביעים על סימטריה מרבית (כלומר, מורכבות מינימלית). - מבחינה סטטיסטית מנתחים פרמטרי גיאומטריות וצורות בין גנוטיפים או תנאים שונים באמצעות Microsoft Excel ו/או בעבר. המשמעות הסטטיסטית של ההפרש נקבעת באמצעות מבחן t דו-זנבי של סטודנט שאינו משויך לממוצע שווה או לא פרמטרית קולמוגורוב-סמירנוף K-S-מבחן עבור הפצות שוות בין תנאים. נתונים יכולים להיות מוצגים באופן גרפי כנדרש (למשל, תרשימי עמודות, מגרשים תיבת, וכו '). ראה איור 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול המתואר לעיל מכסה את הכנת הגלמים של דרוזוהילה להדמיה ארוכת טווח והליכים לניתוח כיוון התאים והדינמיקה של האפידרמיס בבטן. על-ידי החלת מתודולוגיה זו ניתן ליצור סרטים ברזולוציה גבוהה של הגלמים המתפתחים לתקופות של עד 48 h ללא הלבנת שמות משמעותית או הרעלת תמונות. תמונות המתארות את האפידרמיס הבטני (למשל, היסטלקס ו-LECs) בנקודות זמן שונות ומגלמים מכוונים בזוויות שונות מוצגים באיור 4. הניתוח הבא של סרטים אלה מאפשר זיהוי וכימות של הדינמיקה של שינויים מקומיים וגלובליים בפרמטרי גיאומטרי וצורה העיקרי מאופנן במהלך התפשטות היסטונטים והחלפת LECs. ניתן לבצע ניתוחים אלה בתרחישים שונים וברקעים מוטנטים ספציפיים. הם יכולים גם להיות מועסק עבור שיבוטים שבו ביטוי הגנים שונה, המוביל לאובדן אוטונומי או הרווח של תנאי תפקוד. זה יאפשר חקירה של תגובות שאינן אוטונומיות בתאים הסמוכים, הקלה על זיהוי של שיחה צולבת או מנגנוני תקשורת תא (איור 5). גישה זו כבר הועסק לאחרונה בזיהוי של שומן/כלדסו/ארבע מסלול גמיש כמו אלמנט מפתח בימוי ויישור תאים במהלך הפריסה של דפוס הקוטב מישורי של האפידרמיס הבטן של המבוגר9.
איור 1: מתנגדים והרכבה של גלמים להדמיה חיה. (א) משמאל לימין: מבט אל מעבר לגולם ב-0 h apf (משמאל) וגולם בגיל 14 h apf לפני (באמצע) ואחרי (מימין) להסרת המקרה האטום של גולמי. האזור המבצע מצוין (ראשי חץ לבנים). (ב) ערכת הכלים החיונית לניתוח מוצגת. משמאל לימין: שקופית זכוכית, סרט דביק דו צדדי, זוג מלקחיים וצלחת זכוכית תחתית. (ג) הגלמים המבווים מעוקרים על קלטת דביקה דו-צדדית על מגלשות הזכוכית שבצד השני. הנרתיק הגולמי של כל גולם נפתח מהאזור המבצע עם מלקחיים כירורגיים. (ד-ה) קילוף המארז הגולמי הוא הדרגתי. התיק קרוע ומקופל לצדדים הפופל מהראש ועד הבטן. (ו'-ח') הגולם מוסר בעדינות מהצד הגחמני עם קצות המלקחיים (G) ומועבר לצלחת הזכוכית הקרקעית על טיפה מינימלית של שמן הלוקרבון. (I) הגולם מכוון אז כראוי (dorsolaterally, עליון; דורסלי, למטה). ניתן להרכיב בו מספר גלמים על-ידי חזרה על השלבים המוצגים בפאנלים C-I. (J) תמונה המציגה את קו המתאר של התאים של הקן היסטארסט של קטע aiii המבטא את Junctional Marker Atpα:: gfp. הגולם הונחה כdorsolaterally והוא מוקרן ב -14 שעות. סרגל בקנה מידה = 22 μm. (K) תמונה שווה ערך (J) אבל מנקודת מבט. הדינמיקה של פיתוח רקמות יכול להיות מדמיין במשך כמה שעות. ראה גם איור 4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הדור של פסיפסים גנטיים באמצעות מערכת FLP/FRT. (א) תא heterozygous הורים (מגנטה חיוור) נושאת אלל מוטציה רצסיבי (מלבןמקווקו) על זרוע אחת כרומוזום וקידוד גנים עבור סמן פלורסנט (מגנטה) בזרוע כרומוזום אחרים [הזרוע השמאלית של כרומוזום 2 (2l) בדוגמה זו]. אתרים FRT (מלבנים כתומים) מהונדסים בשתי הזרועות באותה מעמדות כרומוזומבית למרכז (אליפסות אפורות). (ב) הפעלת FLP recombinase על ידי הלם חום בתאים מושהה G2 מוביל את השילוב בין frts של האחות chromatids 1-1 ' ו 2-2 '. כתוצאה מכך מוחלפים האזור המרוחק לאתרי FRT (FRT40A על 2L). תצוגה מוגדלת מוצגת בלוח הימני. (ג) על ההפרדה הקוטבי של אזורים מחדש (1-1 ' ו 2-2 ') במהלך mitosis, שני תאים שונים מבחינה גנטית האחות מופקים. בת אחת היא homozygous עבור אלל רצסיבי ועל הזרוע כרומוזום כולו באתר של שילוב מחדש. התא הזה חסר את הגן המקודד עבור סמן הפלורסנט, מסומן לרעה בלבן. תא הבת השני יהיה homozygous עבור הזרוע סוג פראי, מעניקה לנקודה תאומה וביטוי שני עותקים של קידוד הגנים עבור סמן פלורסנט (כהה מגנטה). לפשטות, הטיות של אזורים שאורגנו מראש לקטבים מנוגדים של התא הmitotic (כלומר, 1-2 ו-1-2) אינם מוצגים. אלה מעניקים פנפנותאים שאינם זהים לתא הורי (heterozygous רקע, מגנטה חיוור). (ד) תמונה המציגה שיבוטים בתא A שנוצר באמצעות FLP/frt שילוב מחדש של הזחלים בשלב שלישי הרימות ודמיינו ב 26 h apf. שיבוטים של תאים מסומנים על-ידי העדר RFP. nls (שחור) ו homozygous ביטוי של RFP. nls (מגנטה בהיר, כתמים תאומים) ברקע heterozygous RFP. nls (עמום מגנטה). ניתן להשיג אירועים שווי ערך עבור אתרי FRT הממוקמים במיקומים כרומוזומאחרים (2R, 3L, 3L, ו-X). ראה גם איור 5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: איור של מדידות כיוון התא. כדי לחלץ מידע על כיווני תאים, תחילה מערכת קואורדינטות מישורי לקשר כיוון התא עם ציר הרקמה מוגדרת (a). שנית, כיוון התא מופק מקווי מתאר של תאים (B). אחרון, הכיוונים התאים והמערכים עם ציר הרקמה הם כימות (C). (א) משמאל, דיאגרמה של מבט לרוחב של גולם בהתאם למערכת הקואורדינטות המוסכתיות. מוצק אדום וקווים מקווקווים ציאן להגדיר את המישור הקרטזי המייצג את הגבול anteroposterior (A/P) ואת קו האמצע בהתאמה. באמצע, התמונה הפוכה מראה השקפה שצלעות שיניים של היסטולטוס מתרחב ב 26 h APF מחולקת על ידי junctional marker Atpα:: GFP (תמונת קלט). המיקום של גבול ה-A/P מודגש בקו אדום. מימין, מצפן צירית המציג את קוד הצבע המוחל כדי לתאר את הכיוון של קצוות התא (פוליגונים) או כיוון תאים הממוצע (סרגלים). (ב) הצגת התפריט תוספים/orientationj וחלון ההפצה orientationj . (ב) תצוגה של חלון הפצת Orientationj המציגה את ההגדרות של הפרמטרים המועסקים כדי להשיג את מפת הכיוון של הקצה התא מימין. (ב') איור של קווי מתאר של תאים מקודדים בצבע על תאים אידאלית. עיגול אינו מראה שום צבע מועדף. (ג) להציג את החלון מדידה הorij . (ג) צילומי מסך רציפים של חלון מדידה Orientationj מראה כיצד למדוד אוריינטציה מקומית וקוהרנטיות ברציפות rois של משקל אחיד. זווית האוריינטציה המקומית והקוהרנטיות עבור כל אזור מוצגות כאליפסואידים. (ג ' ') ייצוג התוצאות הסופיות של מדידת האוריינטציה. אליפסואידים מציגים באופן חזותי את הכיוון (כלומר, זווית הציר הארוך ביותר ביחס לגבול ה-A/P) וקוהרנטיות (כלומר, היחס בין הציר הארוך והקצר של האליפסואיד). הערכים המספריים של שני הפרמטרים נשמרים בגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נוסף. (ג' ' ') איור של קווי מתאר תא מקודד צבע וכיוון התא הממוצע (בארים) על תאים אידאלית. עיגול אינו מראה כיוון מועדף. (ג' ' ' ') ייצוג הכיוון המקומי המועדף של כל ROI (מפת אוריינטציה מקומית). הצבעים מדגישים את הכיוון של כל אזור. . הקדמי הוא משמאל סרגל קנה מידה = 22 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של epithelia הבטן גדל. (א) תמונות מייצגות מסרטי הדמיה ארוכת טווח משלב מוקדם ועד מאוחר של הרחבת היסטלפיצוץ. למעלה: השקפות סכמטית של גולם מונחה להדמיה בשנת 16 h ו-26 h APF. השטח שנכבש על ידי הקנים הגלויים מהצד הדורסוללי של הגולם מודגש באפור כהה בגיל 16 ו-26 מעלות APF. למטה: תמונות המציגות קווי מתאר של תאים משני היסטולקס ומחשבי LECs המסומנים על-ידי הביטוי הנפוץ ביותר של junctional marker Atpα:: GFP. גבול A/P נמצא בין שני התאים המסומנים (תאים בצבע מזויפים בכחול = תא קדמי; ירוק = תאים אחוריים). (ב) תמונות מייצגות מסרטי הדמיה לטווח ארוך משלב מוקדם ועד סוף המפגש של הקנים. למעלה: תצוגה סכמטית של גולם מונחה להדמיה בשנת 32 h ו-48 h APF. למטה: קווי מתאר של תאים (מסומנים וצבועים כ-A). שים לב כי Atpα:: GFP סמן מאפשר תיחום הצורה של תאים אפיתל בודדים לאורך זמן עם רזולוציה גבוהה. סרגל קנה מידה = 22 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: מאפייני רקמות שחולצו מניתוח שבטים. (א) דוגמאות של שיבוטים מסוג פראי ב תא A מסומן על ידי העדר rfp. nls (שחור) וכתמים תאומים שלהם (בהיר מגנטה) ב 26 h apf. המשובטים מהאריך לאורך. הגבולות הסגליים שיבוטים תאומים לסדר במקביל או במשולב. סרגל קנה מידה = 22 μm. (ב) למעלה: תמונות הממחישות את הפרמטרים המשוכמת מקווי המתאר של המשובטים. למטה: טבלת סיכום מדווחת על הערכים הממוצעים עבור הפרמטרים המצוינים עבור חיות טיפוס פראי (n = 29). (ג) מורפולוגיה של שיבוט סוג פראי ב 26 h (משמאל) ו 47 h (מימין) apf. השיבוט מציג מורפולוגיה של גבולות מורכבים בשני השלבים. (ד) ומגרשים הויקר לפרמטרים גיאומטריים ב -26 שעות (צהוב בהיר) ו-47 h apf (צהוב כהה). אזור הממוצע וההיקף מגבירים באופן משמעותי בחלון זמן זה. (ה) מגרשים קוטביים המייצגים את כיוון המשובטים (bin גודל 18 °, שפע ביחס לאזור). האוריינטציה מתמשכת במהלך התרחבות ושיפוץ. (ו) ו מגרשים הקצקר עבור פרמטרי צורה ב 26 h (צהוב בהיר) ו 47 h apf (צהוב כהה). חספוס (אחידות), מעוגלות ומעגליות בקושי משתנים. הערכים החצריים מוצגים עם קו אופקי אדום, והשפם מרחיב את ערכי המינימום והמקסימום של ההתפלגות. הסטטיסטיקה בוצעה עם מבחן K-SM או W-בדיקות (p < 0.0001 * * * *, p > 0.05 לא משמעותי). , הקדמי הוא משמאל. הקודם למעלה סרגל בקנה מידה = 16 μm. גנוטיפ הוא hsflp 1.22; FRT40A/FRT40A Ubi. RFP. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הסדר הארוך טווח הוא מאפיין חיוני של היחידות הפיסיולוגיים התפקודית ביותר. במהלך הורפוגנזה, מושגת ההזמנה באמצעות שילוב של הוראות מורכבות המיושמת עם דיוק בזמן התיכון והמרחב. מגביל מרובה ומדורגת משולבים הסדרים רקמות סטריאומוקלדות.
קוטביות וכיווניות הינן קריטיות לסידור מרחבי במהלך הפיתוח. קוטביות מרמזת על שבירת. סימטריה במהלך הפיתוח השגת סימטריה היא הכרחית לקביעת הanteroposterior העובריים (A/P) ו-dorsoventral (D/V) צירים וארגון מבוגר26. מעבר לתפקיד מוקדם זה, האסימטריות המקומיים חיוניים לגיוון מורפולוגיים בכל הרמות. הכיווניות היא השלמה חיונית של סימטריה וקוטביות במהלך הורפוגנזה. סדר גלובלי מיושם על ידי היכולת של תאים כדי לחוש ולשדר אותות באופן מקומי על בסיס תא אל התא עם תחושה מדויקת או אוריינטציה. תאים בודדים אסימטריות הרמוניה בשיתוף עם הזמן על ידי עמדות או תנועות בתוך כיוונים מסוימים בחלל. תקשורת סלולרית מקשר גורמים מופרשים, אנשי קשר תא תא וכניסות מכניות. אותות פועלים על שדות של תאים הראשונים באופן מקומי ולאחר מכן ברחבי העולם לשנות את התנהגותם27.
עבודה זו מציגה דרך פשוטה לנתח את התנהגויות מתואם של תאים בודדים, כולל כיוון מישורי שלהם פרמטרים הצמיחה במהלך הפיתוח של סדר הרקמה. מורורגנזה של הבטן הבוגרת של drosophila ילה במהלך תגלמות מציג סדרה של יתרונות טכניים על פני מודלים שווי ערך אחרים כגון הארכת להקת נבט/הנסיגה28 או הסגר מחדש29 במהלך לטוס embryogenesis, האגף drosophila ילה לשעברvivo30, מארז הגחוני ב caenorhabditis tis מור32
ראשית, הבטן מורפוגנזה מהווה תהליך שניתן לעקוב אחריו בשלמותו בvivo. הדמיה חיה רציפה של החלפת ה-LECs על ידי היסטורפיצוצים ניתן לבצע מ 12 h APF, כאשר הגולם הוא נוצר, עד להשלמת האפיתל מבוגר מורפולגנזה. שנית, היא מאפשרת ניתוח של קבוצה מלאה של התנהגויות תא כגון העברת תאים, חלוקה, שינויי צורה, הדלאמציה, ו-intercalation. אחרון, זה נוטה להפרעה גנטית ניתוח שבטים. השפעות אוטונומיות ושאינן אוטונומיות של אובדן והגברה של פעילויות פונקציה ניתן לנטר חיים על-ידי שימוש בסמנים מתאימים. עם זאת, הגולם כמערכת מודל מציג כמה מגבלות משניות. בשל צורתו האוחלל, לא ניתן לבצע הדמיה בו בו של אירועים לרוחב ולמעלה עם רזולוציה גבוהה. בעיה זו ניתן להתגבר על ידי ביצוע הדמיה רציפה ב dorsolaterally ו דורסלי מונחה הגלמים או טוב יותר, על ידי העסקת מספר זוויות האור גיליון סלקטיבי מיקרוסקופית תאורה מיקרוסקופ (SPIM) מיקרוסקופ. חיסרון נוסף הוא נוכחות של שתי אוכלוסיות תאים שונות בגדלים שונים בניתוחים (כלומר, פוליפואיד lecs ו דיפלואידי היסטולאיד). דבר זה יכול להפוך את מורכבות התמונה למורכבת ואת שתי אוכלוסיות התא יש לנתח בנפרד.
בעתיד, ניתן להתאים בקלות את הדמיה ארוכת הטווח של הגלמים הדרוזובית ללימוד מגוון רחב של תופעות מורפולגנטיות, כולל תיאום של התפתחות באפידרמיס, שרירים ועצביים במהלך הגלגול בתנאי פראי ומוטציה. יתר על כן, האלגוריתמים והתוספים הנמצאים בשימוש עשויים להיות מועסקים כדי ללמוד את הארגון, הסדר והדינמיקה של רקמות רבות אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
ברצוני להודות לחברי מעבדת מרטין בלאנקו לדיונים מועילים. אנו מודים גם לניק טפפון (מכון קריק, לונדון, בריטניה), מרכז המניות של בלומינגטון (אוניברסיטת אינדיאנה, ארה ב) ו-FlyBase (עבור הביאור הגן של דרוזוהילה ). פדרצה נג נתמך על ידי מלגת מקדם-הדוקטורט ג'אי-CSIC. מעבדת מרטין-בלאנקו ממומנת מתוך הפרוגרמה האסטיילית מפואטדה (BFU2014-57019-P ו-BFU2017-82876-P) ומתוך מועצת הקסם רמון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis Software | - | ImageJ | Analyzing data |
| Drosophila | Atpa::GFP | - | Strains employed for data collection |
| Drosophila | hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | - | Strains employed for data collection |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter for dissection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting pupae for data collection |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | mounting pupae |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Data collection |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the pupae during dissection |
References
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Deans, M. R. A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae. Seminars in Cellular and Developmental Biology. 24, 490-498 (2013).
- Stell, W. K. The structure and morphologic relations of rods and cones in the retina of the spiny dogfish, Squalus. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Comparative Physiology. 42, 141-151 (1972).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bosveld, F., et al. Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway. Science. 336, 724-727 (2012).
- Puah, W. C., Wasser, M. Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis. Methods. 96, 103-117 (2016).
- Teng, X., Qin, L., Le Borgne, R., Toyama, Y. Remodeling of adhesion and modulation of mechanical tensile forces during apoptosis in Drosophila epithelium. Development. 144, 95-105 (2017).
- Weavers, H., et al. Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient. Current Biology. 26, 1975-1989 (2016).
- Mangione, F., Martin-Blanco, E. The Dachsous/Fat/Four-Jointed Pathway Directs the Uniform Axial Orientation of Epithelial Cells in the Drosophila Abdomen. Cell Reports. 25, 2836-2850 (2018).
- Casal, J., Struhl, G., Lawrence, P. A. Developmental compartments and planar polarity in Drosophila. Current Biology. 12, 1189-1198 (2002).
- Wootton, R. How flies fly. Nature. 400, 112-113 (1999).
- Zallen, J. A., Wieschaus, E. Patterned gene expression directs bipolar planar polarity in Drosophila. Developmental Cell. 6, 343-355 (2004).
- Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epithelia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. Journal of Morphology. 59, 351-399 (1936).
- Mandaravally Madhavan, M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 183, 269-305 (1977).
- Kornberg, T. Compartments in the abdomen of Drosophila and the role of the engrailed locus. Developmental Biology. 86, 363-372 (1981).
- Garcia-Bellido, A., Merriam, J. R. Clonal parameters of tergite development in Drosophila. Developmental Biology. 26, 264-276 (1971).
- Roseland, C. R., Schneiderman, H. A. Regulation and metamorphosis of the abdominal histoblasts of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 186, 235-265 (1979).
- Madhavan, M. M., Madhavan, K. Morphogenesis of the epidermis of adult abdomen of Drosophila. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 60, 1-31 (1980).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Fonck, E., et al. Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries. Stroke. 40, 2552-2556 (2009).
- Rezakhaniha, R., Fonck, E., Genoud, C., Stergiopulos, N. Role of elastin anisotropy in structural strain energy functions of arterial tissue. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 10, 599-611 (2011).
- Hammer, Ø, Harper, D. A., Ryan, P. D. PAST: paleontological statistics software package for education and data analysis. Palaeontologia electronica. 4, 1-9 (2001).
- Gray, R. S., Roszko, I., Solnica-Krezel, L. Planar cell polarity: coordinating morphogenetic cell behaviors with embryonic polarity. Developmental Cell. 21, 120-133 (2011).
- Vogg, M. C., Wenger, Y., Galliot, B. How Somatic Adult Tissues Develop Organizer Activity. Current Topics in Developmental Biology. 116, 391-414 (2016).
- Collinet, C., Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Local and tissue-scale forces drive oriented junction growth during tissue extension. Nature Cell Biology. 17, 1247-1258 (2015).
- Martin-Blanco, E., et al. puckered encodes a phosphatase that mediates a feedback loop regulating JNK activity during dorsal closure in Drosophila. Genes and Development. 12, 557-570 (1998).
- Dye, N. A., et al. Cell dynamics underlying oriented growth of the Drosophila wing imaginal disc. Development. 144, 4406-4421 (2017).
- Williams-Masson, E. M., Malik, A. N., Hardin, J. An actin-mediated two-step mechanism is required for ventral enclosure of the C. elegans hypodermis. Development. 124, 2889-2901 (1997).
- Ferguson, M. W. Palate development. Development. 103, Suppl . 41-60 (1988).
