प्यूपल चरणों के दौरान विकासशील ड्रोसोफिला एपिथेलिया में ऊतक अभिविन्यास और विकास गतिशीलता का इमेजिंग और विश्लेषण
Summary
यह प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला पेट एपिथेलिया में सेल ओरिएंटेशन और ऊतक वृद्धि की गतिशीलता के इमेजिंग और विश्लेषण के लिए डिज़ाइन किया गया है क्योंकि फल मक्खी कायापलट से गुजरती है। यहां वर्णित कार्यप्रणाली को ड्रोसोफिला या अन्य मॉडल जीवों में विभिन्न विकासात्मक चरणों, ऊतकों और उपकोशिकीय संरचनाओं के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है।
Abstract
बहुकोशिकीय जीवों के भीतर, परिपक्व ऊतक और अंग अपने घटक कोशिकाओं की स्थानिक व्यवस्थाओं में उच्च क्रम प्रदर्शित करते हैं। संवेदी एपिथेलिया द्वारा एक उल्लेखनीय उदाहरण दिया जाता है, जहां एक ही या विशिष्ट पहचान की कोशिकाओं को सेल-सेल आसंजन के माध्यम से अत्यधिक संगठित प्लानर पैटर्न दिखाते हुए एक साथ लाया जाता है। कोशिकाएं एक ही दिशा में एक-दूसरे के साथ संरेखित होती हैं और बड़ी दूरी पर समकक्ष ध्रुवता प्रदर्शित करती हैं। परिपक्व एपिथेलिया का यह संगठन मॉर्फोजेनेसिस के दौरान स्थापित किया गया है। यह समझने के लिए कि परिपक्व एपिथेलिया की प्लानर व्यवस्था कैसे प्राप्त की जाती है, वीवो में विकास के दौरान उच्च स्थानिक निष्ठा के साथ सेल अभिविन्यास और विकास गतिशीलता को ट्रैक करना महत्वपूर्ण है। स्थानीय-से-वैश्विक संक्रमणों की पहचान और विशेषता के लिए मजबूत विश्लेषणात्मक उपकरण भी आवश्यक हैं। ड्रोसोफिला पिल्ला ओरिएंटेड सेल आकार परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए एक आदर्श प्रणाली है जो एपिथेलियल मॉर्फोजेनेसिस अंतर्निहित है। प्यूपल विकासशील एपिथेलियम स्थिर शरीर की बाहरी सतह का गठन करता है, जिससे अक्षुण्ण जानवरों की दीर्घकालिक इमेजिंग की अनुमति होती है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल को वैश्विक और स्थानीय दोनों स्तरों पर वैश्विक और स्थानीय दोनों स्तरों पर सेल व्यवहार की छवि और विश्लेषण करने के लिए डिज़ाइन किया गया है क्योंकि यह बढ़ता है। वर्णित पद्धति को अन्य विकासात्मक चरणों, ऊतकों, उपकोशिकीय संरचनाओं, या मॉडल जीवों पर कोशिका व्यवहार की इमेजिंग के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
अपनी भूमिकाओं को प्राप्त करने के लिए, एपिथेलियल ऊतक पूरी तरह से अपने सेलुलर घटकों के स्थानिक संगठन पर भरोसा करते हैं। अधिकांश एपिथेलिया में, कोशिकाओं को न केवल एक सटीक कोबलस्टोन परत बनाने के लिए एक दूसरे के खिलाफ पैक किया जाता है बल्कि वे शरीर की कुल्हाड़ियों के सापेक्ष खुद को उन्मुख करते हैं।
सटीक ऊतक संगठन का कार्यात्मक महत्व संवेदी एपिथेलिया में स्पष्ट है, जैसे कशेरुकी आंतरिक कान और रेटिना। पहले मामले में, बाल और सहायक कोशिकाएं ध्वनि और गति1,,2जैसे यांत्रिक आदानों को कुशलतापूर्वक समझने के लिए एक विशिष्ट अक्षीय दिशा में संरेखित होती हैं। इसी तरह, रेटिना3द्वारा इष्टतम ऑप्टिकल गुणों को प्राप्त करने के लिए फोटोरिसेप्टर सेल स्थानिक संगठन आवश्यक है। इस प्रकार उचित शारीरिक कार्य के लिए कोशिका की स्थिति और अभिविन्यास का स्थानिक नियंत्रण विशेष प्रासंगिकता है।
ड्रोसोफिला एक होलोमेटाबोलस कीट है जो कायापलट के माध्यम से अपनी लार्वा शरीर संरचनाओं के पूर्ण परिवर्तन से गुजरती है, जिससे इसके वयस्क ऊतकों को जन्म मिलता है। ड्रोसोफिला पिल्ला विभिन्न गतिशील घटनाओं की नॉनइनवेसिव लाइव इमेजिंग के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है, जिसमें विकासात्मक सेल माइग्रेशन4,सेल डिवीजन और विकास गतिशीलता5,मांसपेशियों का संकुचन6,सेल डेथ7,घाव मरम्मत8और सेल ओरिएंटेशन9शामिल हैं। वयस्क ड्रोसोफिलामें, बाहरी एपिथेलियम उच्च स्तर के आदेश दिखाता है। यह ट्राइहोम (यानी, एकल विशेषण कोशिकाओं से उत्पन्न होने वाले सेल प्रोट्रूशन) की व्यवस्थाओं पर आसानी से मनाया जाता है और फ्लाई के शरीर की सतह10पर संवेदी ब्रिस्टल होते हैं। दरअसल, ट्राइहोम समानांतर पंक्तियों में गठबंधन कर रहे हैं एयरफ्लो11मार्गदर्शन । वयस्क एपिथेलिया का मॉर्फोजेनेसिस और व्यक्तिगत कोशिकाओं की आदेश ित व्यवस्था भ्रूण उत्पत्ति के दौरान शुरू होती है और प्यूपल चरणों के दौरान समापन होती है। जबकि भ्रूण कोशिका विभाजन, इंटरकैलेशन और आकार में सभी ऊतक आदेश12,,13में कमी बदलते हैं, यह विकास के बाद के चरणों में वापस आ जाता है, विशेष रूप से प्यूपल चरणों में, जब फ्लाई परिपक्वता9तक पहुंचती है।
स्थिर ड्रोसोफिला पिल्ला सेल आकार और अभिविन्यास परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए एक आदर्श प्रणाली प्रदान करता है। प्यूपल पेट एपिडर्मिस विशेष लाभ प्रस्तुत करता है। जबकि वयस्क सिर, छाती, जननांग और उपांग के अग्रदूत बढ़ते हैं और लार्वा चरणों से पैटर्न हो जाते हैं, हिस्टोब्लास्ट, जो लार्वा एपिडर्मिस में एकीकृत होते हैं, केवल प्यूरीशन14पर बढ़ना और अंतर करना शुरू करते हैं। यह सुविधा ऊतक आदेश की स्थापना में शामिल सभी स्थानिक घटनाओं की ट्रैकिंग को पूरी तरह से9में ट्रैक करने की अनुमति देती है ।
हिस्टोब्लास्ट प्रत्येक प्रकल्पित पेट खंड में गर्भनिरोधक पदों पर भ्रूणीय विकास के दौरान निर्दिष्ट कर रहे हैं। वयस्क के पृष्ठीय पेट के एपिडर्मिस डोरसोपार्श्व रूप से स्थित हिस्टोब्लास्ट घोंसले से प्राप्त होते हैं जो पूर्वकाल और पीछे के डिब्बों में मौजूद होते हैं15,16। जैसे ही हिस्टोब्लास्ट का विस्तार होता है, लार्वा एपिथेलियल कोशिकाओं (एलईसी) की जगह, कॉन्ट्रालेटरल घोंसले पृष्ठीय मिडलाइन पर फ्यूज करते हैं जो एक शंकुदार शीट बनाते हैं17,,18,,19,,20।
यह काम 1) Drosophila pupae के विच्छेदन, बढ़ते, और दीर्घकालिक लाइव इमेजिंग के लिए एक पद्धति का वर्णन करता है, और 2) उच्च स्थानिक संकल्प पर सेलुलर अभिविन्यास और विकास की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए विश्लेषणात्मक तरीके। यहां एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है, जिसमें प्रारंभिक पिल्ला तैयारी (यानी, मचान और इमेजिंग) से आवश्यक सभी चरणों को विस्तारित करने और दिशात्मकता और अभिविन्यास सुविधाओं के परिमाणीकरण के लिए कवर किया गया है। हम यह भी वर्णन करते हैं कि सेल क्लोन के विश्लेषण से स्थानीय ऊतक गुणों का अनुमान कैसे लगाया जाए। वर्णित सभी चरण न्यूनतम आक्रामक हैं और दीर्घकालिक लाइव विश्लेषण की अनुमति देते हैं। यहां वर्णित तरीकों को आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है और अन्य विकासात्मक चरणों, ऊतकों या मॉडल जीवों पर लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
लंबी दूरी का आदेश अधिकांश कार्यात्मक शारीरिक इकाइयों की एक अनिवार्य विशेषता है। मॉर्फोजेनेसिस के दौरान, उच्च लौकिक और स्थानिक परिशुद्धता के साथ लागू जटिल निर्देशों के एकीकरण के माध्यम से आदेश प्राप?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उपयोगी चर्चाओं के लिए मार्टिन-ब्लैंको प्रयोगशाला के सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम एनआईसी टैपन (क्रिक इंस्टीट्यूट, लंदन, यूके), ब्लूमिंगटन स्टॉक सेंटर (इंडियाना, यूएसए विश्वविद्यालय) और फ्लाईबेस (ड्रोसोफिला जीन एनोटेशन के लिए) का भी शुक्रिया अदा करते हैं। फेडरिका मैंगिओन को जेए-सीएसआईसी प्रीडॉक्टोरल फेलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था। मार्टिन-ब्लैंको प्रयोगशाला को प्रोग्रामा एस्टटाल डी फोमेंटो डी ला इन्स्टिगासिओन सिटिफिफिका वाई टेक्निका डी एक्सेलेंसिया (BFU2014-57019-P और BFU2017-82876-P) से और Fundación रेमोन एरेस से वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Analysis Software | – | ImageJ | Analyzing data |
| Drosophila | Atpa::GFP | – | Strains employed for data collection |
| Drosophila | hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | – | Strains employed for data collection |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter for dissection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting pupae for data collection |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | mounting pupae |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Data collection |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the pupae during dissection |
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