Imaging och analys av vävnadsorientering och tillväxtdynamik i utvecklande Drosophila Epithelia under pupal stadier
Summary
Detta protokoll är utformat för avbildning och analys av dynamiken i cellorientering och vävnad tillväxt i Drosophila buken epithelia som fruktflugan genomgår metamorfos. Den metod som beskrivs här kan tillämpas på studier av olika utvecklingsstadier, vävnader och subcellulära strukturer i Drosophila eller andra modellorganismer.
Abstract
Inom flercelliga organismer uppvisar mogna vävnader och organ höga ordningsgrader i de rumsliga arrangemangen av deras beståndsdelar. Ett anmärkningsvärt exempel ges av sensorisk epithelia, där celler av samma eller distinkta identiteter förs samman via cell-cell vidhäftning visar mycket organiserade plana mönster. Cellerna anpassar sig till varandra i samma riktning och visar motsvarande polaritet över stora avstånd. Denna organisation av den mogna epithelia är etablerad under loppet av morphogenesis. För att förstå hur den mogna epithelias plana arrangemang uppnås är det viktigt att spåra cellorientering och tillväxtdynamik med hög spatiotemporal trohet under utveckling in vivo. Robusta analysverktyg är också nödvändiga för att identifiera och karakterisera lokala till globala övergångar. Drosophila pupa är ett idealiskt system för att utvärdera orienterade cell form förändringar underliggande epitelial morphogenesis. Den pupal utvecklande epitel utgör den yttre ytan av den orörliga kroppen, vilket möjliggör långsiktig avbildning av intakta djur. Protokollet som beskrivs här är utformat för att avbilda och analysera cellbeteenden på både globala och lokala nivåer i pupal abdominal epidermis som växer. Den metod som beskrivs kan enkelt anpassas till avbildning av cellbeteenden i andra utvecklingsstadier, vävnader, subcellulära strukturer eller modellorganismer.
Introduction
För att uppnå sina roller, epitelvävnader helt förlita sig på den rumsliga organisationen av sina cellulära komponenter. I de flesta epithelia, celler är inte bara packade mot varandra för att skapa en exakt kullersten lager men de orienterar sig i förhållande till kroppen axlar.
Den funktionella betydelsen av exakt vävnad organisation är uppenbart i sensorisk epithelia, såsom ryggradsdjur innerörat och näthinnan. I det första fallet, hår och stödjande celler anpassa i en specifik axiell riktning för att effektivt känna av mekaniska ingångar såsom ljud och rörelse1,2. På samma sätt är fotoreceptorcellens rumsliga organisation nödvändig för att uppnå optimala optiska egenskaper vid näthinnan3. Rumslig kontroll av cellens position och orientering är därför av särskild betydelse för korrekt fysiologisk funktion.
Drosophila är en holometabolous insekt som genomgår en fullständig omvandling av dess larvkroppsstrukturer genom metamorfos, vilket ger upphov till dess vuxna vävnader. Den Drosophila pupa är en utmärkt modell för noninvasive levande bildbehandling av en mängd olika dynamiska händelser, inklusive utvecklingscell migration4, celldelning och tillväxtdynamik5, muskelkontraktion6, celldöd7, sår reparation8, och cell orientering9. I den vuxna Drosophilavisar den yttre epitelen en hög grad av ordning. Detta observeras lätt på arrangemangen av trichomes (dvs. cell utsprång som härrör från enstaka epitelceller) och sensoriska borst över hela flugan kroppsyta10. Faktum är att trichomes är i linje i parallella rader vägledande luftflödet11. Den morphogenesis av den vuxna epithelia och den beställda arrangemang av de enskilda cellerna börjar under embryogenesis och kulminerar under pupal stadier. Även i embryon cell divisioner, intercalations, och form förändringar alla minska vävnad ordning12,13, detta återgått i senare utvecklingsstadier, särskilt i pupal stadier, när flugan närmar mognad9.
Den orörliga Drosophila puppan ger ett idealiskt system för att utvärdera cellens form och orientering förändringar. Pupal abdominal epidermis presenterar speciella fördelar. Medan prekursorer av vuxna huvudet, bröstkorgen, könsorganen, och bihang växa och få mönstrad från larv stadier, histoblaster, som är integrerade i larv epidermis, börja växa och skilja endast på pupariation14. Denna funktion gör det möjligt att spåra alla spatiotemporal händelser som deltar i inrättandet av vävnad ordning i sin helhet9.
Histoblasts anges under embryonal utveckling på kontralateral positioner i varje presumtiva buken segmentet. Den dorsala buken epidermis av den vuxna härrör från dorsolaterally ligger histoblast bon närvarande vid främre och bakre fack15,16. Som histoblaster expandera, ersätter larv epitelceller (LECs), kontralaterala bon säkring vid dorsala mittlinjen bildar en konfluent ark17,18,19,20.
Detta arbete beskriver 1) en metodik för dissekering, montering och långsiktig live imaging av Drosophila pupae och 2) analytiska metoder för att studera dynamiken i cellulär orientering och tillväxt vid hög spatiotemporal upplösning. Ett detaljerat protokoll finns här, som omfattar alla de steg som krävs från den ursprungliga puppor beredning (dvs. mellanstationer och bildbehandling) till extraktion och kvantifiering av riktning och orientering funktioner. Vi beskriver också hur man kan härleda lokala vävnadsegenskaper från analys av cell kloner. Alla de beskrivna stegen är minimalt invasiva och tillåter långsiktiga liveanalyser. De metoder som beskrivs här kan enkelt anpassas och tillämpas på andra utvecklingsstadier, vävnader eller modellorganismer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Långväga ordning är en viktig egenskap hos de flesta funktionella fysiologiska enheter. Under morfogenesis uppnås ordning genom integration av komplexa instruktioner som genomförs med hög tidsmässig och rumslig precision. Flera och multilevel begränsningar är integrerade i stereotypa vävnad arrangemang.
Polaritet och riktning är avgörande för ordnade rumsliga arrangemang under utveckling. Polaritet innebär symmetribrott under utveckling. Uppnåendet av asymmetri är nödvändigt …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka medlemmarna i Martín-Blanco-laboratoriet för hjälpsamma diskussioner. Vi tackar också Nic Tapon (The Crick Institute, London, Storbritannien), Bloomington Stock Center (University of Indiana, USA) och FlyBase (för Drosophila genanteckning). Federica Mangione stöddes av en JAE-CSIC predocstipendium. Laboratoriet Martín-Blanco finansierades genom Programmeta Estatal de Fomento de la Investigación Científica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P och BFU2017-82876-P) och från Fundación Ramón Areces.
Materials
| Analysis Software | – | ImageJ | Analyzing data |
| Drosophila | Atpa::GFP | – | Strains employed for data collection |
| Drosophila | hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | – | Strains employed for data collection |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter for dissection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting pupae for data collection |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | mounting pupae |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Data collection |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the pupae during dissection |
References
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Deans, M. R. A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae. Seminars in Cellular and Developmental Biology. 24, 490-498 (2013).
- Stell, W. K. The structure and morphologic relations of rods and cones in the retina of the spiny dogfish, Squalus. Comparative Biochemistry and Physiology – Part A: Comparative Physiology. 42, 141-151 (1972).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bosveld, F., et al. Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway. Science. 336, 724-727 (2012).
- Puah, W. C., Wasser, M. Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis. Methods. 96, 103-117 (2016).
- Teng, X., Qin, L., Le Borgne, R., Toyama, Y. Remodeling of adhesion and modulation of mechanical tensile forces during apoptosis in Drosophila epithelium. Development. 144, 95-105 (2017).
- Weavers, H., et al. Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient. Current Biology. 26, 1975-1989 (2016).
- Mangione, F., Martin-Blanco, E. The Dachsous/Fat/Four-Jointed Pathway Directs the Uniform Axial Orientation of Epithelial Cells in the Drosophila Abdomen. Cell Reports. 25, 2836-2850 (2018).
- Casal, J., Struhl, G., Lawrence, P. A. Developmental compartments and planar polarity in Drosophila. Current Biology. 12, 1189-1198 (2002).
- Wootton, R. How flies fly. Nature. 400, 112-113 (1999).
- Zallen, J. A., Wieschaus, E. Patterned gene expression directs bipolar planar polarity in Drosophila. Developmental Cell. 6, 343-355 (2004).
- Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epithelia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. Journal of Morphology. 59, 351-399 (1936).
- Mandaravally Madhavan, M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux’s archives of Developmental Biology. 183, 269-305 (1977).
- Kornberg, T. Compartments in the abdomen of Drosophila and the role of the engrailed locus. Developmental Biology. 86, 363-372 (1981).
- Garcia-Bellido, A., Merriam, J. R. Clonal parameters of tergite development in Drosophila. Developmental Biology. 26, 264-276 (1971).
- Roseland, C. R., Schneiderman, H. A. Regulation and metamorphosis of the abdominal histoblasts of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux’s archives of Developmental Biology. 186, 235-265 (1979).
- Madhavan, M. M., Madhavan, K. Morphogenesis of the epidermis of adult abdomen of Drosophila. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 60, 1-31 (1980).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Fonck, E., et al. Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries. Stroke. 40, 2552-2556 (2009).
- Rezakhaniha, R., Fonck, E., Genoud, C., Stergiopulos, N. Role of elastin anisotropy in structural strain energy functions of arterial tissue. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 10, 599-611 (2011).
- Hammer, &. #. 2. 1. 6. ;., Harper, D. A., Ryan, P. D. PAST: paleontological statistics software package for education and data analysis. Palaeontologia electronica. 4, 1-9 (2001).
- Gray, R. S., Roszko, I., Solnica-Krezel, L. Planar cell polarity: coordinating morphogenetic cell behaviors with embryonic polarity. Developmental Cell. 21, 120-133 (2011).
- Vogg, M. C., Wenger, Y., Galliot, B. How Somatic Adult Tissues Develop Organizer Activity. Current Topics in Developmental Biology. 116, 391-414 (2016).
- Collinet, C., Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Local and tissue-scale forces drive oriented junction growth during tissue extension. Nature Cell Biology. 17, 1247-1258 (2015).
- Martin-Blanco, E., et al. puckered encodes a phosphatase that mediates a feedback loop regulating JNK activity during dorsal closure in Drosophila. Genes and Development. 12, 557-570 (1998).
- Dye, N. A., et al. Cell dynamics underlying oriented growth of the Drosophila wing imaginal disc. Development. 144, 4406-4421 (2017).
- Williams-Masson, E. M., Malik, A. N., Hardin, J. An actin-mediated two-step mechanism is required for ventral enclosure of the C. elegans hypodermis. Development. 124, 2889-2901 (1997).
- Ferguson, M. W. Palate development. Development. 103, 41-60 (1988).
