Summary
Här beskriver vi en preklinisk djurmodell för att studera patofysiologin av ischemia-reperfusion skada i rekonstruktiv mikrokirurgi. Denna fria hudflikar modell baserad på den ytliga caudal epigastriska fartyg i råtta kan också möjliggöra utvärdering av olika terapier och föreningar för att motverka ischemia-reperfusion skada-relaterade skador.
Abstract
Ischemia-reperfusion skada är den främsta orsaken till klaffen misslyckande i rekonstruktiv mikrokirurgi. Råttan är den föredragna prekliniska djur modellen inom många områden av biomedicinsk forskning på grund av dess kostnadseffektivitet och dess översättning till människor. Detta protokoll beskriver en metod för att skapa en preklinisk fri hud klaffen modell hos råttor med ischemia-reperfusion skada. Den beskrivna 3 cm x 6 cm råtta fri hud klaffen modell är lätt erhålls efter placeringen av flera vaskulära ligaturer och den del av den vaskulära pedicle. Sedan, 8 h efter den ischemiska förolämpningen och slutförandet av den mikrokirurgiska anastomos, den fria huden luckan utvecklar vävnadsskadan. Dessa ischemia-reperfusion skada-relaterade skador kan studeras i denna modell, vilket gör det till en lämplig modell för utvärdering av terapeutiska medel för att ta itu med denna patofysiologiska processen. Dessutom beskrivs två huvudsakliga övervakningstekniker i protokollet för bedömning av denna djurmodell: Transit-tid ultraljud teknik och laser speckle kontrast analys.
Introduction
Mikrokirurgi har blivit en vanlig kirurgisk teknik för återuppbyggnad som möjliggör interventioner (t. ex. fria vävnads överföringar) för att återställa komplexa vävnads defekter, replantation av amputerade armar och ben, och även sammansatta vävnad allotransplantationer.
Mikrokirurgiska rekonstruktioner är idealiska för en mängd olika defekter orsakade av traumatiska skador, brännskador, eller onkologiska resektion. Det finns dock en låg andel av fri klaff misslyckande, bland vilka ischemia-reperfusion (I/R) skada är en av de viktigaste ansvarsfulla faktorerna. Alla microsurgically överförda vävnader uthärda en obligatorisk period av ischemi följt av reperfusion. Denna period av primär ischemi är vanligtvis tolereras väl; Sålunda, andelen framgångsrika mikrokirurgiska ingrepp överstiger 90%1,2. Men endast 63,7% av klaffar som kräver kirurgisk revision kan vara helt Sparad3. Dessutom, i fall av replantation av finger avulsion skador, framgången är 66%4; och i fall av sammansatt vävnad allotransplantation lidande I/r skada, avvisande procentsatser ökas sedan i/r-skada aktiverar medfödd immunitet5,6.
Därför är studiet av detta patofysiologiska fenomen av intresse. Djurmodeller är nödvändiga för att undersöka fysiologiska mekanismer och bedöma nya terapier innan de kan appliceras på människor7. Fartygets anatomi och fysiologiska likheter mellan råttor och människor gör råttor en idealisk modell för utredning av biologiska processer såsom I/R-skada.
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för skapandet av en råtta fri hudflikar modell med I/R skada, samt olika möjligheter för intra-och postoperativa bedömningar. Det övergripande målet med denna metod är att beskriva en användbar preklinisk modell för att studera I/R-skada och möjliga behandlingar för att minska dess skador.
Protocol
Alla förfaranden genomfördes i enlighet med den etiska kommittén för Jesús Usón minimalinvasiv kirurgi Center och välfärds riktlinjerna för den regionala regeringen som bygger på europeisk lagstiftning.
1. prekirurgisk och kirurgisk beredning
- Hus Wistar råttor som väger 290 – 350 g i burar vid 22 – 25 ° c med fri tillgång till mat och vatten. Acclimate för 1 vecka före operationen för att förhindra stressinducerade problem.
- Placera en råtta i en bedövnings kammare, leverera 5 min syre (0.5-1 L/min), och använda en spridare att leverera 5% sevofluran att inducera anestesi.
- Ta ut råttan ur kammaren när anestesi induceras. Placera inhalationsfacemask på råtta och ge en flödeshastighet på 2% sevofluran för att bibehålla anestesi. Kontrollera om det saknas svar på en tå nypa.
- Använd en ögonskydd salva för att förhindra korneal torkning och skador.
- Övervaka djuret under narkos enligt följande: placera en rektal termometer (35,9-37.5 ° c), kontrollera slemhinnan färg, och placera en gnagare pulsoximeter för att kontrollera om O2 -mättnad (> 95%) och hjärtfrekvens (250 – 450 BPM).
- Använd en värme stöd (elektriska värmedynor eller cirkulerande vatten filtar) för att undvika hypotermi och förbättra efter procedurmässig anestesi återhämtning.
- Injicera 5 mL varm subkutan fysiologisk saltlösning för att bibehålla ordentlig återfuktning.
- Ge analgetiska och antiinflammatoriska läkemedel (meloxikam 1 mg/kg/dag) och Profylaktisk antibiotika (enrofloxacin 7,5 mg/kg/dag) subkutant före ingreppet och för 5 dagar postoperativt.
- Raka djurets buk-och ljumsk områden.
- Applicera aktuell povidon-jod, följt av 70% etanol. Täck djuret med en steril draperi.
2. gratis hudflikar modell kirurgi
- Med hjälp av en kirurgisk markör, dra en 3 cm x 6 cm flik som matchar en av de 6 cm sidorna med buken mittlinjen. Nästa, gör en 6 cm hud snitt på mittlinjen av buken och två vinkelräta 3 cm snitt på den övre och nedre delen av 6 cm mittlinjen snitt.
- För att börja dissekera den designade 3 cm x 6 cm hud klaffen, använd sax och Adson pinpett att höja luckan (snarare än en skalpell) på grund av hudens rörlighet.
- Dra försiktigt luckan från kraniala området mot caudal området för att hjälpa till med dissektion och identifiera epigastrisk BLOMSTJÄLK omgiven av riklig lös bindväv.
- Dissekera fliken BLOMSTJÄLK utan att röra den eller genom att gripa adventitia så lite som möjligt för att undvika att skada kärlväggen.
- Använd 8/0 nylon suturer till ockludera genom ligaturer de proximala kaudala femorala kärlen, laterala cirkumflex femorala kärl och saphenösa kärl. Därmed, den perfusion av klaffen tillhandahålls av femorala artären och fortsätter direkt genom den ytliga caudal epigastrisk artär, medan den venösa dränering utförs av den ytliga caudal epigastrisk ven mot lår bens ven.
- Klämma den vaskulära BLOMSTJÄLK och sedan klippa den för att starta 8 h ischemi period. Under förfarandet använder elektriska filtar för att bibehålla temperaturen. Två 5 ml injektioner av varm (25 ° c) 0,9% saltlösning administreras subkutant. Den första administrationen utförs 2 h efter början av förfarandet; och den andra i slutet av förfarandet för att få en ordentlig återhämtning av djuret.
- Använd hepariniserad saltlösning (100 U/mL) för att parfymera luckan och ta bort det stillastående blodet från mikrocirkulationen.
- Använd 10/0 nylon suturer att utföra mikrokirurgiska anastomoser.
- Efter 8 h av ischemia, reperfuse luckan genom att ta bort mikrovaskulära klämmor och kontrollera vaskulär patency som beskrivs nedan.
3. intraoperativ bedömning
- Utför en manuell patency test (tom och refill test) för venen och artären. För att göra detta, använda två mikrokirurgisk forceps, placera dem distala till anastomos och utföra mjölkningen. Släpp närmaste pinps till anastomos plats först. Om blodflödet fortsätter efter en vaskulär sektion töms, då anastomos är patent.
- Utvärdera blodflödet med hjälp av en transit-tid ultraljud flödesmätare och mikrokirurgisk sonder.
- Mät diametern på BLOMSTJÄLK fartygen för att välja rätt storlek för flödes sonderna.
Anmärkning: En 0,7 mm flödes sond kan mäta fartyg som sträcker sig från 0,4 mm till 0,7 mm; en 1,0 mm flödes sond kan mäta fartyg som sträcker sig från 0,7 mm till 1,0 mm; en 1,5 mm flödes sond kan mäta fartyg som sträcker sig från 1,0 mm till 1,5 mm. - Placera mål kärlet i ultraljudsavkännings fönstret (mellan reflektorn och givarna) på flödes sonden för att kvantifiera flödesvolymen.
Anmärkning: Håll sonden neutral till fartygets plan, för att undvika spänningar eller drag. - Kontrollera kvaliteten på den akustiska kopplingen genom att Observera att alla staplar är gröna på displayen.
Anmärkning: Om det är svårt att få bra akustisk koppling, Använd ultraljud gel eller fysiologisk saltlösning topiskt. - När bra koppling uppnås och fartyget placeras i akustiskt fönster utan någon spänning, klicka på inspelnings knappen på displayen för att lagra data.
Anmärkning: För att få en tillförlitlig och korrekt mätning, se till att vågform mönstret är ständigt repeterbara.
- Mät diametern på BLOMSTJÄLK fartygen för att välja rätt storlek för flödes sonderna.
- När detta är gjort, använda Polyglykolsyra (PGA) 4-0 absorberbara flätade suturer (16mm 3/8 triangulär nål) för att stänga huden. Använd ett enkelt avbrutet mönster för att bibehålla styrka och vävnads position om en del av suturen är biten av råttan postoperativt.
- Bedöm flikens mikrocirkulation med hjälp av laser speckle kontrast analys (LASCA).
- Gör en ny inspelning för varje djur och för varje uppföljning av studien. För detta, klicka på Arkiv/ny inspelning. Ett nytt fönster öppnas och inställningspanelen visas. Redigera sedan informationen för projektets namn, ämne, operatör och inspelnings namn.
- För maximal reproducerbarhet ska följande parametrar standardiseras: arbetsavstånd, mätområde, punktdensitet, bildrutehastighet och omgivningsljus förhållanden.
- Justera arbetsavståndet genom att flytta lasern i förhållande till vävnaden. Zooma in eller ut laserhuvudet mot vävnaden av intresse. Om du vill kontrollera det uppmätta värdet klickar du på bildinställning. Här, inställd på 12,0 cm.
- Standardisera mätområdet genom att ange önskad Bredd och höjd vid bildinställningen. Den konstruerade klaffen mäter 3 cm x 6 cm. För detta mått, Välj en bredd på 4,0 cm och en höjd av 7,0 cm för att ha lite extra utrymme.
- Ställ in punkt tätheten som hög i bildinställningarna. Hög, medel och låg är de tre alternativen.
- Vid bild Tagnings inställningen väljer du bildrutefrekvensen (10 bilder/s) för inspelningen och varaktigheten (1 min) för inspelningen.
Anmärkning: Har samma omgivningsljus tillstånd i operationssalen under drift eller utförande av bedömningarna. - Klicka på inspelningsknappen för att starta inspelningen. Inställningspanelen ersätts av inspelningspanelen. Data sparas automatiskt. Ta ögonblicksbilder under proceduren för att möjliggöra ytterligare jämförelse.
Anmärkning: Per fusions skalan kan ändras för att förbättra visualiseringen (klicka på verktyg | Filter och färgskalor | Per fusions skala | Manuell 0-150), men de uppmätta per fusions värdena kommer inte att påverkas. Före och efter inspelningen, olika regioner av intresse (ROIs) kan skapas för att mäta perfusion inom dem. Här utvärderade vi bara området för den övade klaffen (3 cm x 6 cm).
- Använd ImageJ programvara för att mäta överlevnad och nekros områden.
- Leta reda på en linjal vid sidan av luckan och ta sedan kontroll bilder för makroskopiska mätningar av flikens överlevnads område.
- För att utvärdera bilder, öppna ImageJ användargränssnitt. Klicka på Arkiv och Öppna bilden som ska mätas.
- Välj rak linje i verktygslådan och rita en rak linje över 1 cm av linjalen. Klicka på analysera | Ställ skala och införa i textrutan för kända avstånd värdet av 1 cm.
- Klicka på Polygonmarkerings verktyget och rita polygonlinjerna över fliken för att beräkna det lönsamma området. Ytterst, klicka på analysera | Mät värdet för att erhålla områdes värde.
- Placera ett postoperativt förband på djuret före huset för att förhindra självstympning av det kirurgiska området. Efter de förfaranden, djuren är inhysta i burar individuellt, i ett rum med temperaturkontroll (22 ° c till 25 ° c).
4. postoperativ bedömning och vävnads provtagning
- Anesthetize råtta vid 7 postoperativa dagar för flik bedömning och vävnads provtagning genom att följa samma steg som tidigare beskrivits i detta protokoll (steg 1,2 och 1,3). Kontrollera om djupet av anestesi av bristen på svar på tå nypa.
- Fotografera det kirurgiska området för att möjliggöra makroskopiska mätningar av flikens överlevnad och nekros områden. Gör de postoperativa makroskopiska mätningarna enligt samma steg i den Intraoperativa bedömning som har förklarats tidigare i protokollet (steg 3,5).
Anmärkning: Var uppmärksam när du använder Polygonvals verktyget genom att rita linjerna på fliken och avgränsa det livskraftiga området (mätt i cm2). Den procentuella andelen av det livskraftiga området kan beräknas som (cm2 av livskraftigt område/cm2 av total flik område) × 100. - Bedöma flikens mikrocirkulation med LASCA-tekniken (steg 3,4) för att visualisera och kvantifiera per fusions skillnader
- Efter makroskopisk analys, ta bort 4/0 suturer och stiga luckan för att ompröva den vaskulära BLOMSTJÄLK blodflödet genom att använda transit-tid ultraljud.
-
Utför vävnads provtagning genom att dela upp fliken i två delar av 1,5 cm x 6 cm.
- Doppa en del i en biopsi behållare med 4% PARAFORMALDEHYD vid rumstemperatur för ytterligare histologiska analyser.
- Introducera den andra delen av vävnaden i ett kryopreservrör, sänk ned den i flytande kväve och frys sedan röret genom att förvara det vid-80 ° c för framtida molekylära analyser.
- Euthanize råtta under allmän inhalationsanestesi med hjälp av en snabb intrakardiell injektion av 2 M KCL/kg enligt etiska kommitténs rekommendationer.
Representative Results
Omedelbart efter skapandet av den mikrokirurgiska anastomoser, fick vi högre blod flödesvolymer än de minimiflöden som rekommenderas i litteraturen8; Således var alla mikrokirurgisk anastomoser patent 1 vecka efter operationen (figur 1).
Figur 1: bedömning av blodflödet vid transit tid ultraljud. (A) mikrokirurgisk flödes sondens position för att bedöma blodflödet. B) blodflödesmönster och kvantifiering som erhålls från de anastomoserade kärlen i locket. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Observation av mikrocirkulatorisk berövande av blodflödet under den ischemiska förolämpningen var möjligt med LASCA teknik, inklusive omedelbar Hyper perfusion under fliken reperfusion, och, perioperatively, de olika områden med mindre perfusion och en högre risk för postoperativ klaffen nekros som verkligen necrotized 7 dagar efter utgången av studien (figur 2).
Bild 2: laser speckle kontrast analysteknik. (A) visualisering av mikrocirkulatorisk blod perfusion i fysiologiskt tillstånd. (B) visualisering av mikrocirkulatorisk blod perfusion under ischemi. (C) visualisering av mikrocirkulatorisk vävnad blod perfusion omedelbart efter reperfusion. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Den flik överlevnad område efter 8 h av ischa och dess efterföljande reperfusion var runt 40%. Tidigare publicerade resultat9 visade statistiskt signifikanta skillnader när denna modell jämfördes med klaffar där ingen ischemisk förolämpning tillfogats.
Discussion
Microsurgical fri vävnad överföringar har blivit den metod som val för rekonstruera stora defekter. En period av ischa uppstår under sådana fria vävnads överföringar. När denna period överskrider vävnadens tolerans, kan I/R skada orsaka fel på övade fri flik9. Beskrivningen av metoden för att utveckla en kostnadseffektiv och translationell preklinisk modell för att studera i/R-skada i rekonstruktiv mikrokirurgi kan bidra till att leda studiet av olika föreningar för att motverka denna patofysiologiska process.
I den beskrivna djur modellen, efter de vaskulära ligaturer placerades och den fria luckan höjdes, ingen bakbenet blodflödet kompromisser noterades, eller smärta eller halta. Som Kochi et al.10 beskrev, vår modell lämnade också tre säkerheter vägar genom intramuskulär nätverk.
Övervakning av fria klaffar är av stor betydelse11, som bärgning är omvänt relaterad till varaktigheten mellan ischemi debut och dess kliniska erkännande. För detta ändamål bör fria klaffar studeras intra-och postoperativt.
Intraoperativt, det allmänt använda Tom-och påfyllnings testet eller den akustiska Doppleren möjliggör identifiering men inte kvantifiering av flödes närvaro eller frånvaro genom en anastomos12. Av denna anledning använde vi transit-tid ultraljud teknik, en ny metod som gör att kirurger att kvantifiera blodflödet av mikrokirurgiska anastomoser13. I vår studie, alla mikrokirurgiska anastomoser var patent efter 8 h av ischemisk förolämpning samt i slutet av studien. Omedelbart efter skapandet av den mikrokirurgiska anastomoser, noterade vi högre blod flödesvolymer än de miniminivåer som rekommenderas i litteraturen8. Detta förutspådde bra BLOMSTJÄLK perfusion i slutet av studien, visar att resultaten inte påverkades av den mikrokirurgiska tekniken utan snarare av i/R skada kaskad av händelser. Denna teknik är dock inte fri från begränsningar. För att få pålitliga resultat måste de mikrokirurgiska sonderna hållas neutrala till fartygets plan, inte dra eller skapa någon spänning. En bra akustisk koppling behövs för att få en ordentlig signal, som kan uppnås med hjälp av ultraljud gel eller saltlösning. En hög kvalitet kopplings signal, som tillhandahålls av utrustningen, är en viktig parameter att beakta under mätningarna.
Vi har använt LASCA, även känd som laser speckle kontrast Imaging eller laser speckle Imaging, postoperativt14. Denna teknik utgör en värdefull teknik för semi-kvantitativ realtid kartläggning av flödet inom fria klaffar som verifieras här. En av begränsningarna är att resultaten tillhandahålls i godtyckliga enheter och inte är direkt relaterade till faktiska flödesvärden. I denna mening behövs ytterligare forskning för att validera detta samband. Laser Doppler flowmetry är vanligare men begränsas av det faktum att det bara mäter perfusion i en enda punkt i luckan, medan LASCA tillåter detektion av regionala förändringar i huden perfusion inom fliken15. Dessutom visade en färsk studie16 att lasca kan perioperativt förutsäga regioner med hög risk för postoperativ klaff nekros. Våra resultat tyder på att LASCA är en lovande teknik för peri-och postoperativ övervakning av fria klaffar.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Forskningsprojektet utfördes på Jesús Usón minimalinvasiv kirurgi Center (CCMIJU), en del av IKT Nanbiosis. Studien utfördes med hjälp av följande Nanbiosis enheter: U21, experimentell operationssalen; U22, djur hus; och U14, cellterapi. Detta arbete stöddes av ISCIII-projektet PI16/02164. Finansiär hade ingen roll i studiens utformning, datainsamling och analys, beslut om att publicera eller manuskript beredning. Särskilt tack utvidgas till María Pérez för att förbereda siffrorna och Fernanda Carrizosa för att ständigt uppmuntra och stödja den vetenskapliga bibliografin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AureFlo Unit | Transonic (Ithaca, USA) | N/A | Transit-time ultrasound flowmeter equipment |
| Commbined Basic Hand- and Reconstructive Surgery Set (round handle) | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | RHR-SET. Art.No.00795 | Set of microsurgical instruments |
| FLOW-i | Maquet Critical Care AB (Solna, Sweeden) | N/A | Anesthesia Delivery System |
| Micro clamps ABB-1 | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | 00408V | Double microvascular clamp with frame |
| Micro clamps ABB-11 | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | 00414V | Double microvascular clamp without frame |
| Micro clamps B-1 | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | 00396V | Sigle microvascular clamp |
| Nylon suture 10/0 | Laboratorio Aragó (Barcelona, Spain) | 19921 | Microsurgical suture |
| OPMI Pentero 800 | Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) | N/A | Surgical microscope |
| PeriCam PSI System | Perimed AB (Järfälla, Sweden) | N/A | Laser speckle contrast analysis equipment |
| Philips Intellivue MX450 | Philips Medizin Systeme (Böblingen, Germany) | N/A | Monitoring system |
| Protector posoperatorio para roedores | Fundación Centro de Cirugía de Mínima Invasión Jesús Usón (Cáceres, Spain) | P201400272 | Postoperative protector for rodents |
References
- Siemionow, M., Arslan, E. Ischemia/reperfusion injury: a review in relation to free tissue transfers. Microsurgery. 24 (6), 468-475 (2004).
- Wang, W. Z., Baynosa, R. C., Zamboni, W. A. Update on ischemia-reperfusion injury for the plastic surgeon: 2011. Plastic and Reconstructive Surgery. 128 (6), 685-692 (2011).
- Chen, K. T., et al. Timing of presentation of the first signs of vascular compromise dictates the salvage outcome of free flap transfers. Plastic and Reconstructive Surgery. 120 (1), 187-195 (2007).
- Sears, E. D., Chung, K. C. Replantation of finger avulsion injuries: a systematic review of survival and functional outcomes. The Journal of Hand Surgery. 36 (4), 686-694 (2011).
- Caterson, E. J., Lopez, J., Medina, M., Pomahac, B., Tullius, S. G. Ischemia-reperfusion injury in vascularized composite allotransplantation. The Journal of Craniofacial Surgery. 24 (1), 51-56 (2013).
- Amin, K. R., Wong, J. K. F., Fildes, J. E. Strategies to Reduce Ischemia Reperfusion Injury in Vascularized Composite Allotransplantation of the Limb. The Journal of Hand Surgery. 42 (12), 1019-1024 (2017).
- Barre-Sinoussi, F., Montagutelli, X. Animal models are essential to biological research: issues and perspectives. Future Science OA. 1 (4), (2015).
- Shaughness, G., Blackburn, C., Ballestin, A., Akelina, Y., Ascherman, J. A. Predicting Thrombosis Formation in 1-mm-Diameter Arterial Anastomoses with Transit-Time Ultrasound Technology. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (6), 1400-1405 (2017).
- Ballestin, A., et al. Ischemia-reperfusion injury in a rat microvascular skin free flap model: A histological, genetic, and blood flow study. PloS One. 13 (12), 0209624 (2018).
- Kochi, T., et al. Characterization of the Arterial Anatomy of the Murine Hindlimb: Functional Role in the Design and Understanding of Ischemia Models. PloS One. 8 (12), (2013).
- Smit, J. M., Zeebregts, C. J., Acosta, R., Werker, P. M. Advancements in free flap monitoring in the last decade: a critical review. Plastic and Reconstructive Surgery. 125 (1), 177-185 (2010).
- Krag, C., Holck, S. The value of the patency test in microvascular anastomosis: Correlation between observed patency and size of intraluminal thrombus: An experimental study in rats. British Journal of Plastic Surgery. 34, 64-66 (1981).
- Selber, J. C., et al. A prospective study of transit-time flow volume measurement for intraoperative evaluation and optimization of free flaps. Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (2), 270-281 (2013).
- Briers, D., et al. Laser speckle contrast imaging: theoretical and practical limitations. Journal of Biomedical Optics. 18 (6), 066018 (2013).
- Zotterman, J., Bergkvist, M., Iredahl, F., Tesselaar, E., Farnebo, S. Monitoring of partial and full venous outflow obstruction in a porcine flap model using laser speckle contrast imaging. Journal of Plastic, Recontructive and Aesthetic Surgery. 69 (7), 936-943 (2016).
- Zotterman, J., Tesselaar, E., Farnebo, S. The use of laser speckle contrast imaging to predict flap necrosis: An experimental study in a porcine flap model. Journal of Plastic, Recontructive and Aesthetic Surgery. 72 (5), 771-777 (2019).
