Summary
Nous décrivons un protocole pour l'expression spécifique de type cellulaire du capteur génétiquement codé à base de FRET ATeam1.03YEMK dans les cultures de tranches organotypiques du cerveau avant-cerveau de la souris. En outre, nous montrons comment utiliser ce capteur pour l'imagerie dynamique des niveaux d'ATP cellulaire dans les neurones et les astrocytes.
Abstract
L'activité neuronale dans le système nerveux central (SNC) évoque une forte demande d'énergie cellulaire fournie par la dégradation de l'adénosine triphosphate (ATP). Une grande partie de l'ATP est nécessaire pour réinstaller les gradients d'ions à travers les membranes plasmatiques dégradées par la signalisation électrique des neurones. Il existe des preuves que les astrocytes - tout en ne générant pas eux-mêmes des signaux électriques rapides - subissent une production accrue d'ATP en réponse à l'activité neuronale et soutiennent les neurones actifs en leur fournissant des métabolites énergétiques. Le développement récent de capteurs génétiquement codés pour différents métabolites permet maintenant l'étude de telles interactions métaboliques entre les neurones et les astrocytes. Ici, nous décrivons un protocole pour l'expression spécifique de type cellulaire du transfert d'énergie de résonance de fluorescence ATP-sensible -(FRET-) capteur ATeam1.03YEMK dans les cultures de tranche de tissu organotypic de l'hippocampe de souris et du cortex utilisant les vecteurs viraux adéno-associés (AAV). En outre, nous démontrons comment ce capteur peut être employé pour la mesure dynamique des changements dans les niveaux cellulaires d'ATP dans les neurones et les astrocytes sur des augmentations de potassium extracellulaire et suivant l'induction de l'ischémie chimique (c.-à-d., une inhibition du métabolisme d'énergie cellulaire).
Introduction
L'activité électrique excitatrice des neurones est en grande partie basée surle flux de cations telles que le sodium (Na) et le potassium(K)à travers leurs membranes plasmatiques. Le maintien des gradients électrochimiques de ces deux ions est donc nécessaire à la signalisation. Ceci est accompli par le na cellulaire/K-ATPase(NKA), une pompe transmembrane électrogénique omniprésente, qui extrude 3 Na- hors de la cellule en échange de 2 K- de l'espace extracellulaire, nécessitant la consommation d'une molécule d'ATP par cycle de transport1. En plus de la NKA, il y a plusieurs autres transporteurs d'ions consommant de l'ATP, y compris la membrane plasmatique Ca2-ATPase, qui est vitale pour l'homéostasie intracellulaire Ca2 et son exportation suite à l'afflux induit par l'activité2. Dans les vésicules présynaptiques, un vacuolaire de type H-ATPase(v-ATPase) crée le gradient de proton nécessaire à l'utilisation des neurotransmetteurs dans ce compartiment3.
Bien que l'activité des neurones nécessite donc une quantité substantielle d'ATP4, ils ne montrent pas une capacité significative pour le stockage de l'énergie. Au lieu de cela, ils semblent s'appuyer sur des interactions métaboliques avec les astrocytes voisins, les principaux magasins de glycogène dans le cerveau5. Il a été suggéré que le glycogène astrocytique joue en effet un rôle important dans le soutien des besoins énergétiques neuronaux; et un phénomène clé dans ce couplage neuro-métabolique proposé entre les deux types de cellules est la capacité des astrocytes d'augmenter leur production d'ATP en réponse à l'activité neuronale6,7,8. Cette hypothèse, connue sous le nom de navette de lactate d'astrocyte-neurone (ANLS), est toujours en discussion, parce que d'autres travaux ont fourni la preuve que les neurones peuvent également augmenter leur propre taux de glycolyse en réponse à la stimulation9,10, reflétant la nécessité d'autres méthodes et approches pour étudier l'interaction neuro-glia.
L'étude du métabolisme d'énergie cellulaire et des niveaux d'ATP dans les neurones et les astrocytes pour élucider les interactions métaboliques de neuro-glia a longtemps été entravée par l'absence de sondes appropriées pour la détection des changements des concentrations de métabolites dans les cellules vivantes dans le tissu cérébral. La dernière décennie, cependant, a fourni une poussée dans le développement de nouveaux outils et de nouvelles sondes fluorescentes génétiquement codées pour différents métabolites, y compris les capteurs pour l'ATP, lactate, pyruvate et d'autres11,12. À l'aide de ces outils, il est maintenant possible d'aborder directement les questions liées à la consommation d'ATP cellulaire et aux changements des niveaux d'énergie cellulaire au niveau des cellules individuelles et d'une manière spécifique de type cellulaire dans le tissu cérébral intact13.
Dans le présent travail, nous décrivons une procédure pour visualiser la dynamique cytoslique d'ATP sur des neurones et des astrocytes des tranches de cerveau organotypic cultivées. Nous montrons comment employer des vecteurs viraux adéno-associés (AAV) pour l'expression spécifique de type cellulaire de l'ATP-nanocapteur génétiquement codé ATeam1.03YEMK (14) dans les neurones et les astrocytes des tranches de cerveau de souris qui peuvent être maintenus dans la culture cellulaire pendant plusieurs semaines15. Une procédure de la façon d'enlever la cicatrice gliale qui couvre les tranches de tissu cultivé est décrite, ce qui améliore l'accessibilité optique et l'imagerie des cellules dans les couches de tissu organotypique en dessous. Enfin, nous montrons comment ATeam1.03YEMK peut être utilisé pour effectuer l'imagerie basée sur fret des changements dans les niveaux d'ATP cellulaires dans cette préparation. Cette méthode présente les principaux avantages qu'elle ne nécessite pas de procédures chirurgicales du cerveau, fournit des niveaux élevés d'expression du capteur et la spécificité du type cellulaire dans les tranches de cerveau cultivés, réduisant l'invasivité ou le stress dans les cellules par rapport à d'autres méthodes, comme la transfection par électropoction ou transduction avec d'autres vecteurs viraux10,16,17. En outre, ce protocole peut être appliqué à d'autres nanocapteurs basés sur FRET, parmi eux des variantes d'ATeam1.03 qui fournissent une affinité de liaison plus faible pour L'ATP14.
Protocol
La présente étude a été réalisée dans le strict respect des directives institutionnelles de l'Université Heinrich Heine de Dusseldorf ainsi que de la directive du Conseil communautaire européen (2010/63/UE). Toutes les expériences utilisant des cultures de tranches de cerveau organotypiques ont été communiquées et approuvées par le Bureau du bien-être animal à l'Installation de soins et d'utilisation des animaux de l'Université Heinrich Heine de Dusseldorf (numéro d'acte institutionnel : O50/05). Conformément aux recommandations de la Commission européenne18, des animaux jusqu'à 10 jours ont été tués par décapitation.
1. Préparation des cultures organotypiques de tranche de cerveau (OTCs)
- La veille ou au moins 30 minutes avant l'intervention
- Préparer le plat Petri (dans des conditions stériles). Retirez le couvercle de la plaque de 6 puits et placez 800-850 l de milieu de gré à gré dans chaque puits. Garder la plaque dans l'incubateur (37 oC, 5 % CO2/95 % O2) jusqu'à ce que nécessaire.
- Préparer la vaisselle Petri lave (dans des conditions stériles). Ajouter 3 ml de HBSS à chaque plat Petri de 30 mm. Un total de 5 plats par procédure est nécessaire. Placez-les dans l'incubateur (37 oC, 5 % CO2/95 % O2) pendant au moins 30 min — pendant la nuit jusqu'à ce qu'il soit nécessaire.
- Préparer l'ACSF (tableau 1). Gardez la saline sans glucose à 4 oC jusqu'au lendemain.
| Salines et médias - Formulation | ||||
| Nom | Abréviation | Composition | Concentration [mM] | Commentaires |
| Solution artificielle de fluide céphalo-rachidien | ACSF (En) | Nacl | 125 | Bubbled avec 5% CO2/95% O2, pH 7.4 |
| Kcl | 2.5 | Toujours ajouter du glucose juste avant l'utilisation. | ||
| CaCl2 (en) | 2 | Ne pas stocker plus d'une journée avec du glucose | ||
| MgCl2 | 1 | 310 mOsm/L | ||
| NaH2PO4 | 1.25 | |||
| NaHCO3 Annonces | 26 | |||
| Glucose | 20 | |||
| ACSF expérimental | E-ACSF | Nacl | 136 | Bubbled avec 5% CO2/95% O2, pH 7.4 |
| Kcl | 3 | Toujours ajouter du glucose juste avant l'utilisation. | ||
| CaCl2 (en) | 2 | Ne pas stocker plus d'une journée avec du glucose | ||
| MgCl2 | 1 | 320 mOsm/L | ||
| NaH2PO4 | 1.25 | |||
| NaHCO3 Annonces | 24 | |||
| Glucose | 5 | |||
| Lactate | 1 | |||
| Solution chimique d'ischémie | Cis | Nacl | 136 | Bubbled avec 5% CO2/95% O2, pH 7.4 |
| Kcl | 3 | 318 mOsm/L | ||
| CaCl2 (en) | 2 | |||
| MgCl2 | 1 | |||
| NaH2PO4 | 1.25 | |||
| NaHCO3 Annonces | 24 | |||
| 2, 2-Deoxyglucose | 2 | |||
| NaN3 Annonces | 5 | |||
| 8 mM de potassium ACSF | 8 mM Ket ACSF | Nacl | 128 | Bubbled avec 5% CO2/95% O2, pH 7.4 |
| Kcl | 8 | 320 mOsm/L | ||
| CaCl2 (en) | 2 | |||
| MgCl2 | 1 | |||
| NaH2PO4 | 1.25 | |||
| NaHCO3 Annonces | 24 | |||
| Glucose | 5 | |||
| Lactate | 1 | |||
| ACSF tamponné par Hepes | H-ACSF H-ACSF H-ACSF | Nacl | 125 | Ajusté au pH 7.4 avec NaOH |
| Kcl | 3 | Toujours ajouter du glucose juste avant l'utilisation | ||
| CaCl2 (en) | 2 | Ne pas stocker plus d'une journée avec du glucose | ||
| MgSO4 | 2 | 310 mOsm/L (ajusté avec saccharose) | ||
| NaH2PO4 | 125 | |||
| Hepes | 25 | |||
| Glucose | 10 | |||
| La solution de sel équilibrée de Hanks | HBSS (en anglais) | Sigma (numéro de catalogue H9394). | ||
| Saline à phosphate de Dulbecco | DPBS (En anglais) | Gibco (numéro de catalogue 14287-080) | ||
| Milieu de la culture organotypic | Moyen otC | sérum de cheval inactivé par la chaleur | 20% | 34oC, 5 % CO2, pH 7,4, sous l'état de la culture |
| Mem | 79% | 320 mOsm/L | ||
| L-glutamine | 1 | |||
| Insuline | 0,01 mg/mL | |||
| Nacl | 14.5 | |||
| MgSO4 | 2 | |||
| CaCl2 (en) | 1.44 | |||
| Acide ascorbique | 0.00125 % | |||
| D-glucose | 13 |
Tableau 1 : Composition de la solution.
- Le jour de la préparation, ajouter le glucose à l'ACSF, le placer sur la glace et commencer à bouillonner avec 95% O2/5% CO2 pendant au moins 30 min pour entraîner un pH de 7,4.
- Dissection et découpage
- Sacrifiez la souris (BalbC, les deux sexes) aux jours postnatals 6 à 8 par décapitation rapide et placez la tête dans un plat en verre Petri contenant de l'ACSF glacé.
- Exposer le crâne en coupant la peau du dos jusqu'à la pointe postérieure de l'os nasal. Ensuite, couper soigneusement le crâne du magnum foramen à l'aide d'un ciseaux chirurgicaux et exposer le cerveau.
REMARQUE: Vérifier que la procédure est conforme aux directives de l'institution. - Retirez le cerveau et placez-le sur une membrane de filtre dans un plat Petri glacé rempli d'ACSF.
- Séparez les hémisphères et effectuez une coupe parasagittale à un angle de 45 degrés. Fixer un hémisphère au stade du tissu vibratome avec de la superglue. Transférer immédiatement le bloc de tissu dans le bain vibratome contenant de l'ACSF glacé (bulle avec 5% CO2/95% O2). Enfin aligner le tissu. Gardez le deuxième hémisphère dans l'ACSF glacé jusqu'à ce qu'il tranche.
- Ajuster le vibratome pour couper les tranches à 250-400 m. Le découpage à 250 m donnera environ 12 tranches par animal (400 m : 7 tranches).
- Après avoir coupé la tranche (figure 1A),identifier la formation hippocampique en fonction de son aspect morphologique typique (Figure 1) et l'isoler à l'aide d'aiguilles hypodermiques (23 jauges, 1), en gardant la partie du cortex cérébral adjacente à l'hippocampe.
REMARQUE: Préserver le néocortex pendant la culture aide à préserver l'intégrité de l'hippocampe. Cependant, l'hippocampe peut être isolé et cultivé sans cortex si nécessaire. - Placer la tranche sur un maillage dans réchauffé, ACSF (34 oC, bouillonné avec 5% CO2/95% O2) jusqu'à ce que toutes les tranches sont recueillies.
- Transférer les tranches dans l'armoire à débit laminaire pour continuer dans des conditions stériles.
Figure 1 : Images de transmission représentatives des préparations de tranches de cerveau aigues et organotypic. Comparaison d'une tranche de cerveau parasagittal extrêmement isolée (A) et d'une tranche de cerveau organotypic parasagittale maintenue dans la culture pendant 12 jours (B) utilisant la microscopie de translumination de large champ. DG et gyrus denté; CA1/3 - CA1/CA3-région de l'hippocampe; E-CTX - cortex entorhinal; Cortex CTX (néo-) Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
2. Cultiver les tranches
- Transférer délicatement les tranches de l'ACSF dans l'un des plats Petri pré-chauffés remplis de solution de sel stérile Hank à l'aide d'une pipette pasteur en verre stérile inversé.
REMARQUE: La stérilisation du tissu est obtenue par dilution (étape 3.2). Transférer le moins d'ACSF possible sur le plat Petri. - Changer la pipette et transférer les tranches dans le deuxième plat Petri. Répétez le processus 5 fois au total. Transférer le moins de HBSS possible dans les plats Petri suivants.
- Placez délicatement une tranche à la fois sur le dessus de l'insert de culture. Répéter le processus pour chaque tranche. Évitez les turbulences dans la pipette et attendez que la tranche descende à la pointe de la pipette Pasteur. On peut placer jusqu'à 4 tranches sur une seule membrane.
- Retirez soigneusement toute solution excédentaire de Hank du haut de l'insert à l'aide d'une pointe fine.
- Gardez les cultures (figure 2) dans un incubateur à l'interface entre le gaz (carbogen, 95% O2 /5% CO2) et le liquide à 37 oC jusqu'au jour de l'expérience. Remplacer le milieu tous les 2-3 jours.
Figure 2 : Principe de l'imagerie ATP basée sur fret dans les tranches de cerveau organotypiques cultivées à l'aide du capteur génétiquement codé ATeam1.03YEMK. Représentation schématique du protocole présenté dans ce travail. En bref, les tranches organotypic parasagittales, cultivées pendant 1-3 jours, sont transdulées avec un vecteur viral adéno-associé contenant soit, le hGFAP astrocyte-spécifique- ou le neurone spécifique hSyn-promoteur et la séquence pour l'expression de ATeam1.03YEMK. Les aliquots dilués de ces vecteurs (1:2-1:4) sont directement appliqués sur le dessus d'une tranche, qui est maintenue dans des conditions de culture pendant au moins 6 jours de plus. Les changements dans les niveaux d'ATP intracellulaires peuvent alors être visualisés dans les cellules exprimant le capteur en l'excitant à 434 nm et en acquérant simultanément l'émission de fluorescence à 527 (accepteur) et 475 (donneur) nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
3. Expression de capteurs ATP avec un vecteur viral associé à Aadeno (Figure 2)
REMARQUE: Assurez-vous de répondre à toutes les exigences de manipulation d'organismes génétiquement modifiés!
- Pour gérer le vecteur viral, aliquot adeno-associé vecteurs viraux (AAV2/5) à 1-2 L pour éviter la congélation et la décongélation répétées. Conserver les aliquots à -80 oC.
- Placez un flacon contenant 10 % d'eau de Javel sur le banc stérile pour jeter tous les résidus usagés qui étaient en contact avec le vecteur.
- Pour la transduction, préparer une dilution de 1 l du vecteur avec 2-3 L de DPBS. Les solutions de stock présentent normalement un titer physique de l'ordre de 1012 génomes viraux par mL (vg/mL).
- Transférer un insert contenant une tranche cultivée dans le capot stérile.
- Sans toucher le tissu, appliquer 0,5 l du vecteur dilué directement sur le dessus de chaque tranche.
REMARQUE: Une meilleure expression dans les couches plus profondes du tissu est obtenue en transduisant des tranches cultivées à 1-3 jours in vitro (DIV). La transduction des cultures plus anciennes pourrait avoir comme conséquence une expression prédominante des cellules dans la cicatrice gliale environnante ou une basse expression dans des neurones, respectivement. - Enfin, remettre les tranches dans l'incubateur et les conserver pendant au moins 6 jours de plus. Ne changez pas le milieu le jour de la transduction.
4. Enlèvement de la cicatrice gliale(figure 3)
- Juste avant de commencer une expérience, transférer un insert contenant des tranches de culture dans le capot stérile et le placer dans un plat de 30 mm, contenant 1 ml de milieu OCT ou MEM.
- Placer le plat sous le stéréoscope et se concentrer sur la surface de la tranche.
- Utilisez deux aiguilles hypodermiques stériles (23 G, 1 po) pour faire une courte coupe transversale à droite sur les bords étroits d'une tranche choisie (figure 3). Cette procédure libérera la tension dans la surface créée par la cicatrice gliale, ce qui la fera se rétracter, exposant ainsi les couches sous-jacentes (voir Figure 5).
REMARQUE: La première couche de tissu (cicatrice gliale) est principalement formée par des astrocytes réactifs. Dans l'imagerie à champ large, cette couche de tissu dense se traduira par une diffusion supplémentaire de la lumière, résultant en des images floues. L'enlèvement de la cicatrice est donc avantageux pour obtenir une meilleure visibilité des couches plus profondes, qui contiennent le tissu organotypique approprié. Ainsi, veillez à effectuer cette coupe exclusivement sur le bord et dans la couche supérieure de la préparation de la tranche seulement et de ne pas endommager le tissu en dessous. Nous n'avons pas observé de différences entre les données obtenues dans les OTC avec la cicatrice gliale avec ceux des OTC sans cicatrices (données non montrées). - Retirer la tranche préparée de l'insert. À cette fin, utilisez un scalpel stérile et expirez-le en faisant des coupes parallèles droites à la membrane, formant un carré ou un triangle avec la tranche au centre, tout en tenant les bords de la membrane avec des pinces. Si l'insert héberge d'autres tranches, transférez-le dans la plaque d'origine et dans l'incubateur. La tension de surface du milieu empêchera sa fuite sur la surface de la membrane.
Figure 3 : Illustration schématique de l'enlèvement mécanique de la cicatrice gliale. La figure montre une culture de tranche hippocampal qui est couverte par une cicatrice gliale (ellipsoïde bleuâtre). En cisaisonant un peu les pointes de deux aiguilles à seringues au plus petit pôle de la culture et au bord de la cicatrice gliale (ligne en pointillé bleu), la cicatrice se retournera de côté. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
5. Imagerie ATP à base de FRET (Figure 4)
- Avant l'expérience, préparer E-ACSF et le bulle avec 95% O2/5% CO2 pendant au moins 30 min pour obtenir un pH de 7,4. Allumez la source de lumière fluorescente (lampe xénon) du monochromator (figure 4). Démarrer la perfusion juste avant de retirer la tranche de l'incubateur.
REMARQUE: Gardez la bulle saline avec 95% O2 et 5% CO2 pendant toute l'expérience. - Transférer la tranche dans une chambre expérimentale qui est constamment perfused avec E-ACSF fraîchement carbogenated à l'aide d'une pompe péristétique (Figure 4). Ensuite, fixer la tranche avec une grille. Placez la chambre sur le stade du microscope et connectez le système de perfusion. Les tubes de laboratoire à l'épreuve du gaz sont recommandés pour la perfusion.
REMARQUE: Les expériences peuvent être effectuées à température ambiante ou à une température physiologique proche, selon la conception expérimentale. Vérifiez la stabilité et la fiabilité du débit de perfusion afin d'éviter les changements de concentration induits par le mouvement du tissu et/ou les changements dans le stress de cisaillement. Les vitesses de perfusion standard pour le travail des tranches, utilisées par nous et de nombreux autres laboratoires, sont de 1,5 à 2,5 ml/min.
Figure 4 : Configuration de la configuration d'imagerie FRET. (A) Illustration schématique des différents composants et de leur disposition spatiale requise pour la configuration d'imagerie FRET. L'arrangement se compose d'un monochromator avec une lampe au xénon comme source de lumière, d'un microscope à stade fixe droit (1), d'un système de séparation d'image (2), d'un CCD numérique ou d'une caméra CMOS pour l'enregistrement en time-lapse (3), et d'un bain expérimental adapté pour une perfusion constante stable (4). La perfusion de bain est réalisée par une pompe péristtaltique avec le débit réglable. (B) Image de l'espace de travail expérimental. La configuration d'imagerie FRET est montée sur une table amortie par vibration s'accommodé d'un stade de traduction x/y, dans laquelle le bain expérimental est intégré. Nombres: voir (A). (C) Vue schématique de la voie de lumière du monochromator à l'appareil photo numérique. Indiqué est la position des différents filtres et le miroir dichroïque. Nombres: voir (A). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
- Mettre la tranche cultivée au point à l'aide de la lumière de transmission. Identifier la zone où des expériences doivent être effectuées (exemple : région CA1 de l'hippocampe). Avant de commencer les expériences d'imagerie, attendez au moins 15 minutes pour permettre aux tranches de s'adapter aux conditions saline. Pour la configuration de la configuration expérimentale, voir Figure 4.
- Allumez la caméra et le logiciel d'imagerie. Ensuite, sélectionnez le cube de filtre approprié.
- Excitez la protéine fluorescente du donneur (eCFP) à 435/17 nm (435 nm). Définir le temps d'exposition entre 40 et 90 ms.
REMARQUE: Une forte exposition des tranches à la lumière fluorescente peut entraîner des effets phototoxiques. - L'excitation à 435 nm entraîne des émissions à 475 nm (eCFP; donneur) et 527 nm (Vénus; accepteur). Divisez l'émission de fluorescence à 500 nm avec un séparateur d'images d'émission et employez des filtres de passe de bande à 483/32 et 542/27 pour isoler davantage la fluorescence des donneurs et des accepteurs. Une expression forte peut entraîner la saturation des détecteurs. Dans ce cas, vous pouvez utiliser un filtre de densité neutre pour réduire l'intensité de l'excitation.
- Sélectionnez une région d'intérêt (ROI) apparemment dépourvue de fluorescence cellulaire pour la soustraction de fond. Ensuite, créez des ROI délimitant les corps cellulaires.
- Définir la fréquence d'acquisition d'images et le temps d'enregistrement global. Pour les expériences de longue durée(30 min), une fréquence d'acquisition de 0,2 à 0,5 Hz est recommandée pour prévenir la phototoxicité.
- Démarrez l'enregistrement. Il est recommandé d'enregistrer au moins 5 min dans des conditions de base pour assurer la stabilité de la préparation.
REMARQUE: Ajuster la mise au point de la cellule pendant l'enregistrement si nécessaire. - Pour induire des changements dans l'ATP intracellulaire, transférez le tube de perfusion de l'ACSF standard à un salin contenant des inhibiteurs métaboliques (p. ex. CIS, voir le tableau 1 et ci-dessous). Alternativement, utilisez une solution saline avec une concentration élevée de potassium pour imiter la libération de potassium des neurones actifs.
REMARQUE: L'application par perfusion de bain est un processus relativement lent, qui agit globalement sur l'ensemble de la préparation. Prenez note de l'heure à laquelle la nouvelle solution a réellement commencé à entrer dans le bain expérimental. Selon la distance entre la chambre et le réservoir de la solution saline, ainsi que sur la vitesse de la perfusion, un délai doit être pris en considération.
6. Documentation haute résolution de la fluorescence cellulaire d'ateam
- Directement après les enregistrements, transférer la chambre d'enregistrement contenant la culture de la tranche au microscope à balayage laser confocal.
REMARQUE: Faites attention. En raison de photodamage sépuisales potentielles, effectuez cette étape seulement après des expériences. Aux fins de la documentation, on peut échanger l'E-ACSF avec H-ACSF. Par conséquent, un système de perfusion n'est pas nécessairement nécessaire. - Prenez z-stacks à la plus haute résolution z possible à la configuration optique donnée.
- Appliquer un algorithme de déconvolution pour augmenter la résolution de l'image.
Representative Results
Les vecteurs AAV sont un outil fiable pour exprimer sélectivement les gènes étrangers dans les cellules du tissu vivant16. L'application directe des AAV contenant la cassette de séquence de ATeam1.03YEMK et d'un promoteur spécifique donne une expression élevée du capteur dans le type de cellule choisi. À DIV 14 (10 jours après une transduction), les neurones exprimant ATeam sous le promoteur de synapsin humain se trouvent à haute densité dans le néocortex des tranches de tissu cultivé à des profondeurs allant jusqu'à 50 m sous la surface de la tranche (Figure 5A). Des résultats comparables peuvent être obtenus dans l'hippocampe (figure 5B).
Figure 5 : Visualisation des neurones exprimant ATeam1.03YEMK dans les tranches de cerveau organotypic parasagittal cultivées. Les images de gauche correspondent à des projections de mise au point prolongées de 43 sections optiques (1,05 m chacune) de tissu cortical (A) et (B) de 70 sections optiques (0,6 m chacune) de tissu hippocampe. Les images de droite représentent la vue volume d'une même projection. Les cellules sont codées en fonction de leur profondeur par rapport à la surface de la tranche, comme l'indique l'échelle de couleur à droite. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Pour la mesure des niveaux d'ATP dans les astrocytes, ATeam1.03YEMK est exprimé sous le contrôle du promoteur humain de protéine acide fibrillaire glial (GFAP). Il en résulte une transduction efficace des cellules dans le néocortex et l'hippocampe des tranches de tissus cultivés (figure 6). Notamment, deux phénotypes morphologiques différents peuvent être distingués, selon la profondeur par rapport à la surface des préparations de tranches. Dans la première couche superficielle, les cellules sont caractérisées par des processus primaires épais qui sont principalement disposés en parallèle à la surface. Ces cellules présentent des domaines qui se chevauchent fortement, créant un maillage dense d'astrocytes apparemment réactifs (figure 6). Dans les couches plus profondes (30-60 m de la surface), les astrocytes transducés présentent de fines formes cellulaires qui forment des domaines en grande partie sphériques et leur morphologie ressemble à celle des astrocytes in situ comme indiqué précédemment19,20,21 ( Figure6). Pour obtenir une meilleure transduction des astrocytes à couches plus profondes ainsi qu'un meilleur accès optique à ces couches plus profondes, le tissu cicatriciel glial peut être enlevé tel que décrit à l'étape 4.
Figure 6 : Visualisation des astrocytes exprimant ATeam1.03YEMK dans les tranches de cerveau organotypic parasagittal cultivées. L'image de gauche correspond à une projection de mise au point étendue de 191 sections optiques (0,45 m chacune). À des fins d'illustration, la cicatrice gliale a été exclue de la projection des astrocytes. Les images de droite représentent la vue de volume de la même projection avant et après l'enlèvement de la cicatrice gliale. Les cellules sont codées en fonction de leur profondeur par rapport à la surface de la tranche, comme l'indiquent les échelles de couleur à droite. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
L'expression réussie de ATeam1.03YEMK permet la mesure dynamique des changements dans les niveaux d'ATP dans les neurones ou les astrocytes, selon le promoteur utilisé (voir ci-dessus). Des expériences ont été réalisées dans un bain expérimental constamment perfused avec E-ACSF (bulle avec 95% O2/5% CO2). Dans les tranches organotypiques exprimant ATeam1.03YEMK dans les neurones hippocampiques, des régions d'intérêt (ROIs) ont été sélectionnées avant de commencer l'enregistrement, représentant la somata des cellules pyramidales (Figure 7A). De plus, une région pour la soustraction de fond a été choisie (figure 7A). L'émission de Vénus ainsi que la fluorescence eCFP ont ensuite été recueillies pour chacune de ces ROI séparément et représentées comme étant le niveau d'émission de fluorescence au fil du temps (figure 7B). Après avoir enregistré la fluorescence dans des conditions de contrôle pendant plusieurs minutes pour assurer une ligne de base stable, le métabolisme cellulaire a été inhibé en exposant la préparation de la tranche à une saline sans glucose, à laquelle 5 mM d'azide de sodium (NaN3) a été ajouté pendant une minute (figure 7B). Cette manipulation a induit des changements opposés dans l'intensité d'émission de la paire FRET (Figure 7B, panneaux gauches), avec une diminution de Vénus (527 nm) et une augmentation de l'émission eCFP (475 nm). Le calcul du ratio FRET en divisant l'émission de fluorescence de Vénus par celle de l'eCFP (FVenus/FeCFP)a donné lieu à des signaux qui reflètent les changements relatifs dans les niveaux d'ATP intracellulaires, le soi-disant « rapport FRET ateam »(figure 7B, panneau droit). Dans tous les neurones enregistrés (n - 70 cellules en n - 5 tranches), NaN3 a causé une diminution réversible du rapport ATeam FRET, indiquant une diminution réversible des niveaux d'ATP intracellulaires sur l'inhibition du métabolisme cellulaire.
Figure 7 : Démonstration de l'imagerie du ratio FRET ATeam par laps de temps. (A) En haut à gauche : Image de fluorescence à grand champ de la couche pyramidale et du radiatum de strate de la région CA1 d'une tranche hippocampal organotypique cultivée exprimant ATeam1.03YEMK dans les neurones. En haut à droite : Vue élargie de la section en boîte indiquée sur la gauche. Les lignes blanches délimitent les régions d'intérêt (ROIs) 1-3 représentant les corps cellulaires des neurones pyramidaux CA1 choisis pour l'analyse dans (B). BG représente le retour sur investissement choisi pour la correction de fond. En bas : Images pseudo-colorées représentant l'émission de fluorescence de Vénus (vert), eCFP (violet) et le rapport De Vénus/eCFP. (B) Enregistrement de laps de temps dans ROIs 1-3, représentant les corps neuronaux de cellules (voir A). Les traces sur la gauche montrent l'émission normalisée de fluorescence de Vénus (verte) et eCFP (magenta). Les traces de droite montrent le rapport FRET ATeam correspondant. Notez que la perfusion avec 5 mM NaN3 en l'absence de glucose extracellulaire pendant 1 minute (barre grise) induit une diminution réversible du rapport ATeam FRET, indiquant une diminution de la concentration d'ATP intracellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Afin d'assurer la stabilité de la préparation et du capteur dans des conditions d'expérience à long terme, les tranches exprimant l'ATeam dans les neurones ou les astrocytes ont été constamment perfusées avec l'ACSF pendant de longues périodes (50 min; n - 12 cellules chacune, N ' 3 OTC de 3 cerveaux). Dans ces conditions, le ratio FRET a-paroi n'a pas changé (figure 8). L'exposition des préparations au SIC contenant des inhibiteurs métaboliques (« ischémie chimique », voir tableau 1), en revanche, a de nouveau entraîné la baisse prévue du ratio FRET de l'ateam tel qu'observé ci-dessus.
Figure 8 : Expériences de base utilisant ATeam. Imagerie à long terme du ratio FRET ATeam dans 14 cellules différentes dans des conditions de base dans les neurones (en haut) et les astrocytes (en bas). Les données ont été prises dans des conditions comparables à celles d'autres données expérimentales. À la fin de chaque mesure, l'ischémie chimique a été obtenue par perfusion avec CIS comme indiqué par la flèche. REMARQUE : Les ratios FRET ateam de base sont stables au fil du temps dans des conditions de référence. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Ensuite, nous avons analysé les réponses des neurones et des astrocytes exprimant ATeam1.03YEMK à une augmentation de la concentration extracellulaire de potassium. Après avoir établi une ligne de base stable, les neurones ont été perflés avec une saline dans laquelle la concentration de potassium a été augmentée de 3 à 8 mM pendant 3 minutes (figure 9A). Cette manipulation n'a cependant pas entraîné de changement détectable dans le rapport FRET ATeam (n ' 56 cellules en N et 5 tranches). Pour s'assurer que le capteur réagissait à un changement des niveaux d'ATP, les tranches ont ensuite été de nouveau exposées à une période prolongée d'ischémie chimique obtenue en remplaçant e-ACSF par cIS. L'ischémie chimique a entraîné une diminution rapide du ratio FRET de l'ATeam à un nouveau niveau stable, ce qui indique un appauvrissement nominal de l'ATP après 2-3 min (figure 9A).
Figure 9 : Expériences représentatives illustrant les changements dans les niveaux d'ATP dans les neurones et les astrocytes. (A,B) : Des images à gauche montrent la fluorescence ATeam des neurones et des astrocytes situés dans la région hippocampique CA1 de tranches organotypiques. Les traces sur la droite représentent des enregistrements laps de temps du rapport Fret ATeam obtenus à partir d'un retour sur investissement positionné sur un seul corps cellulaire. Dans les deux expériences, les tranches ont d'abord été soumises à une augmentation de la concentration extracellulaire de potassium pendant 3 minutes (voir la barre), suivie d'une exposition finale à l'ischémie chimique. Notez que si les neurones ne répondent pas à l'élévation du potassium extracellulaire (A), les astrocytes réagissent avec une augmentation de l'ATP (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Le même protocole expérimental a été exécuté avec des tranches, dans lesquelles ATeam1.03YEMK a été exprimé dans des astrocytes. Contrairement à ce qui a été observé dans les neurones, les astrocytes ont réagi à l'augmentation du potassium extracellulaire par une augmentation réversible du rapport ATeam FRET, ce qui indique une augmentation des niveaux d'ATP intracellulaires (n - 70 cellules en N - 5 tranches) (Figure 9B). L'exposition subséquente à l'ischémie chimique a entraîné, comme prévu, une baisse importante du ratio FRET de l'ATeam, indicatif de l'épuisement nominal de l'ATP intracellulaire (figure 9B).
Discussion
Ici, nous démontrons une procédure pour l'expression spécifique de type cellulaire d'ATeam1.03YEMK, un nanocapteur génétiquement codé à base de FRET14, pour la mesure des changements dans les niveaux d'ATP dans les astrocytes ou les neurones dans les cultures de tranches de tissu organotypiques du cerveau de souris15. Dans les enregistrements exemplaires, nous montrons qu'une augmentation de la concentration extracellulaire de potassium n'entraîne pas un changement des concentrations d'ATP dans les neurones, tandis que les niveaux d'ATP astrocytiques augmentent en réponse à cette manipulation. En outre, nos résultats démontrent que sur l'inhibition du métabolisme cellulaire, le rapport de FRET deYEMK d'ATeam1.03 diminue rapidement dans les deux types de cellules, indiquant une diminution rapide de l'ATP intracellulaire.
L'expression de ATeam1.03YEMK dans les cultures de tranches organotypiques exige le maintien du tissu dans la culture dans des conditions contrôlées pendant au moins 7-10 jours. Alternativement, ATeam1.03YEMK peut également être employé pour la mesure de l'ATP dans les tranches de tissu cérébral intensément isolées et dans les nerfs optiques des souris13,15. Les mesures dans les tissus très isolés, cependant, nécessitent la génération d'animaux transgéniques ou une application stéréotaxique de vecteurs viraux dans le cerveau, impliquant l'expérimentation animale et des protocoles stricts de soins aux animaux. À cet égard, ATeam1.03YEMK expression dans les cultures de tranches de tissu organotypique représente une alternative utile et précieuse22,23. Depuis de nombreuses années maintenant, les cultures de tranches de tissu organotypiques servent de modèle établi pour étudier les propriétés neuronales, la connectivité et le développement24,25,26. Ils maintiennent non seulement l'architecture et le laminage généraux de tissu (figure 1), mais accueillent également les propriétés préférentielles des cultures cellulaires telles que l'accessibilité supérieure et le contrôle direct des conditions expérimentales. Les cultures de tranches de tissu organotypiques sont également couramment utilisées pour exprimer des gènes étrangers en utilisant des vecteurs viraux27. Plusieurs types de vecteurs viraux ont été rapportés pour livrer des transgènes dans le tissu cérébral16,28. Les vecteurs adénovirins induisent une forte expression dans les cellules gliales, mais pas les neurones hippocampiques16, et pourraient générer une réactivité gliale17. Les vecteurs viraux adéno-associés utilisés ici émergent comme une bonne alternative15, et leur efficacité a également été démontrée in vivo29.
Bien qu'il soit principalement utilisé pour l'étude des propriétés neuronales, des études récentes ont établi que les cultures de tranches de tissu organotypiques peuvent également être utilisées pour l'analyse des astrocytes. Les tranches cultivées sont généralement recouvertes d'une couche d'astrocytes réactifs19,30 (figure 5), mais les astrocytes présentent une morphologie et une cytoarchitecture plus indigènes et non réactives dans des couches plus profondes19,30 (figure 5). Dans la présente étude, nous décrivons une procédure pour l'enlèvement mécanique de la cicatrice gliale externe, qui a comme conséquence une meilleure accessibilité expérimentale et optique des astrocytes indigènes dans les couches oranotypic appropriées de tissu. En outre, son retrait améliore l'efficacité de l'expression dans les couches plus profondes des tranches organotypiques; si la cicatrice gliale n'est pas enlevée, la transduction par les AAV peut avoir tendance à être limitée aux couches cellulaires superficielles.
Plusieurs facteurs mécaniques externes doivent être pris en considération lors de l'exécution d'expériences dans des tranches de tissu. Une variation de la vitesse de perfusion du bain peut induire des mouvements de toute la préparation et/ou induire des changements de mise au point, ce qui entraîne des changements transitoires artificiels du signal du capteur. En outre, les astrocytes et les neurones ont été rapportés pour répondre à la déformation mécanique telle que imposée par des taux élevés de perfusion32,33. Dans nos mains, l'utilisation d'une pompe péristtaltique fiable, ainsi que le maintien de volumes faibles et stables de saline entre le tissu et l'objectif (ménisque) se traduit par un signal FRET stable dans des conditions de base à la vitesse de perfusion utilisée ici (1,5-2,5 mL/min; Figure 8).
Dans la présente étude, nous démontrons également que la formation image basée sur fret avec ATeam1.03YEMK peut être employée pour surveiller des niveaux d'ATP dans les neurones et les astrocytes. Un autre moyen introduit plus tôt pour la mesure de l'ATP cellulaire est le soi-disant test luciferin-luciferase34,35,36,37. Cette approche, cependant, est basée sur l'imagerie de la bioluminescence et ne fournit qu'une résolution temporelle et spatiale plutôt faible en partie en raison de niveaux élevés de bruit de fond. Une autre méthode couramment employée ces dernières années était l'imagerie des changements dans la concentration intracellulaire de magnésium utilisant le fluorophore vert ion-sensible38,39,40. Cette approche se rapporte à l'observation qu'une consommation d'ATP a comme conséquence la libération de son magnésium de co-facteur. L'imagerie avec le vert de magnésium fournit ainsi seulement une estimation secondaire des changements dans des niveaux d'ATP. En outre, le vert magnésium est également sensible aux changements dans le calcium intracellulaire, introduisant une autre difficulté lors de l'interprétation des résultats obtenus avec cette méthode.
Le développement récent de nanocapteurs génétiquement codés pour l'imagerie directe des métabolites cellulaires, par conséquent, a représenté un grand pas en avant11,12. Plusieurs capteurs différents ont été générés qui peuvent être utilisés pour la mesure de l'ATP intracellulaire36,41,42,43. Parmi ceux-ci sont l'indicateur atp fluorescent ratiométrique "QUEEN"41 ainsi que PercevalHR, qui détecte le ratio ATP:ADP42. Bien que cette dernière sonde soit un outil précieux pour l'étude de l'état énergétique des cellules, elle nécessite une mesure simultanée des changements du pH42.
ATeam est un nanocapteur dont plusieurs variantes existent, qui- entre autres - diffèrent dans leur affinité de liaison pour ATP14. In vitro, ATeam1.03YEMK présente un Kd de 1,2 mM à 37 oC, ce qui est proche des niveaux d'ATP cellulaires déterminés dans différents types de cellules neuronales, allant de l'hypothalamus et le cervelet34 à l'hippocampe37,44,45. Dans les mesures de cuvette, l'abaissement de la température de 10 oC a entraîné une diminution significative de l'affinité de liaison de ATeam1.03YEMK à l'ATP, ce qui suggère qu'il pourrait ne pas être idéal pour l'imagerie cellulaire à température ambiante14. Notre étude antérieure15, cependant, a démontré que le comportement et la réponse de ATeam1.03YEMK exprimé dans les neurones et les astrocytes à différentes manipulations est similaire à la température physiologique proche et à la température ambiante, indiquant que le capteur permet une détermination fiable des niveaux d'ATP intracellulaires dans les deux conditions. En outre, nos expériences précédentes ont abordé la sensibilité au pH de ATeam1.03YEMK exprimée à l'intérieur des cellules15, montrant qu'il est insensible aux changements de pH intracellulaire par environ 0.1-0.2 unités de pH. Si le Kd dans la gamme mM basse est une préoccupation, d'autres variantes ATeam pourraient être utilisées14, parmi eux les variantes rouges décalées d'ATeam ("GO-ATeam")43.
Nos expériences utilisant ATeam1.03YEMK démontrent qu'une augmentation de la concentration extracellulaire de potassium de quelques mM seulement (de 3 à 8 mM) entraîne une augmentation transitoire du rapport ATeam1.03YEMK dans les astrocytes dans la culture de tranches organotypiques. Cette observation confirme les études antérieures15,46 et indique clairement que les astrocytes répondent à la libération de potassium par les neurones actifs avec une augmentation de leur production d'ATP, la plupart du temps probablement à la suite d'une stimulation de la Na-/K-ATPaseet le Na /HCO3- cotransporter, respectivement47,48. En revanche, les neurones n'ont pas montré une réponse, qui est en ligne avec les travaux précédents ainsi15. Les deux types de cellules, cependant, rapidement et fortement réagi à l'inhibition de la glycolyse cellulaire et la respiration mitochondriale comme indiqué avant15. Dans des conditions d'ischémie chimique, les rapports De FRET d'ATeam sont tombés à un nouveau niveau stable, indiquant un épuisement nominal de l'ATP cellulaire. Ce dernier résultat suggère que les deux neurones aussi bien que les astrocytes montrent une consommation pertinente d'ATP également dans des conditions stables-sans stimulation supplémentaire par l'activation synaptique ou l'application des neurotransmetteurs. Pris ensemble, nous concluons que l'imagerie basée sur fret avec des nanocapteurs génétiquement codés, parmi eux ATeam1.03YEMK, fournira une approche précieuse pour élucider les processus cellulaires qui sont responsables des changements dans les niveaux d'ATP intracellulaires et la consommation d'ATP cellulaire dans différentes conditions.
Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent. Les auteurs ont reçu un soutien financier permettant la publication en libre accès par Nikon Microscope Solutions, d'Sseldorf, en Allemagne, qui produit des instruments utilisés dans l'article vidéo. La société n'a pas participé à la conception des expériences présentées ici, ni dans leur exécution, ni dans le traitement des données, ni dans l'écriture du manuscrit.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Claudia Roderigo et Simone Durry pour leur assistance technique experte. Nous remercions le Dr Niklas J. Gerkau et M.Sc. Joel Nelson pour leur aide dans la préparation des cultures de tranches organotypiques. La recherche dans le laboratoire de l'auteur a été financée par l'Association allemande de recherche (DFG; POUR 2795: Ro 2327/13-1 et SPP 1757: Ro 2327/8-2 à CRR; et SPP 1757: Young Glia Start-Up funding to RL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-deoxyglucose | Alfa Aesar | L07338 | Non-metabolizable glucose analog |
| 36-IMA-410-019 Argon laser | Melles Griot | 488 nm wavelength argon | |
| Ascorbic acid | Carl Roth | 3525.1 | Antioxidant, Vitamin C |
| band pass filters 483/32 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
| band pass filters 542/27 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
| Beamsplitter T 455 LP | AHF Analysentechnik AG | Excitation dichroic mirror | |
| Beamsplitter T 505 LPXR | AHF Analysentechnik AG | Splitter dichroic | |
| Confocal laser scannig microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system C1 | |
| Data processing Origin Pro 9.0.0 (64-bit) | OriginLab corporation | Scientific graphing and data analysis software | |
| D-glucose monohydrate | Caelo | 2580-1kg | |
| DPBS | GIBCO/Life | 14190250 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse FN1 upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Experimental chamber | custom build | Perfusion chamber for live-cell imaging | |
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
| Hanks' Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H9394 | With Phenol Red for pH monitoring |
| HERAcell 150 | Thermo Scientific | CO2 incubator HERAcell ® 150 with decontamination routine | |
| HERAsafe KS/KSP | Thermo Scientific | Safety Cabinet | |
| Horse serum | GIBCO/Life | 26050088 | Heat inactivated |
| Huygens Professional | SVI Imaging | Deconvolution software | |
| Image J 1.52i | Wayne Rasban national Institute of Health | Image processing Software available in the public domain | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Insulin from bovine pancreas |
| IP serie peristaltic pump | Ismatec | High-precisionmulti-channel pump | |
| Layout software, Illustrator CS6 | Adobe | Vector graphics editor | |
| L-glutamine | GIBCO/Life | 25030024 | |
| Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Vibration microtome. Thermo scientific discontinued the production of the device in the meantime. Any other slicer or tissue chopper siutable for slicing living tissue is fine, too. | |
| Microscope stage | custom build | ||
| Microsoft Excel 16 | Microsoft | Spreadsheet software for basic data processing | |
| Millicell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Hydrophilized PTFE, pore size 0.4 μm |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M7278 | Synthetic cell culture media |
| Monochromator Polychrome V | Thermo Scientific/FEI | Ultra fast switching monochromator | |
| NaN3 (Sodium Azide) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Mitochondrial inhibitor (complex IV inhibitor). CAUTION: Azide is toxic. Be aware not to accidentally ingest or inhale it, and prevent ist absoption through the skin. |
| Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0 | Nikon Microscope Solutions | Water Immersion Microscope Objective | |
| NIS Elements 4.50 advanced Research | Nikon Microscope Solutions | Imaging software. Upgraded version for FRET imaging | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | Digital CMOS camera | |
| Perfusion tubing | Pro Liquid GmbH | Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85) | |
| Photoshop CS 6 Version 13.0 | Adobe | Image processing software | |
| Sodium L-lactate | Sigma-Aldrich | 71718-10G | |
| ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A) | ETH Zürich | v244 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human synapsin 1 promoter fragment hSyn1. |
| ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A) | ETH Zürich | v307 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D. |
| WVIEW GEMINI optic system | Hamamatsu Photonics | Emission Image Splitter |
References
- Sweadner, K. J. Isozymes of the Na+/K+-ATPase. Biochimica et Biophysica Acta. 988, 185-220 (1989).
- Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
- Cotter, K., Stransky, L., McGuire, C., Forgac, M. Recent Insights into the Structure, Regulation, and Function of the V-ATPases. Trends in Biochemical Sciences. 40, 611-622 (2015).
- Harris, J. J., Jolivet, R., Attwell, D. Synaptic energy use and supply. Neuron. 75, 762-777 (2012).
- Brown, A. M., Ransom, B. R. Astrocyte glycogen and brain energy metabolism. Glia. 55, 1263-1271 (2007).
- Hertz, L., et al. Roles of astrocytic Na+,K+-ATPase and glycogenolysis for K+ homeostasis in mammalian brain. Journal of Neuroscience Research. 93, 1019-1030 (2015).
- Allaman, I., Belanger, M., Magistretti, P. J. Astrocyte-neuron metabolic relationships: For better and for worse. Trends in Neurosciences. 34, 76-87 (2011).
- Barros, L. F., Deitmer, J. W. Glucose and lactate supply to the synapse. Brain Research Reviews. 63, 149-159 (2010).
- Diaz-Garcia, C. M., et al. Neuronal Stimulation Triggers Neuronal Glycolysis and Not Lactate Uptake. Cell Metabolism. 26, 361-374 (2017).
- Diaz-Garcia, C. M., et al. Quantitative in vivo imaging of neuronal glucose concentrations with a genetically encoded fluorescence lifetime sensor. Journal of Neuroscience Research. 97, 946-960 (2019).
- Barros, L. F., et al. Current technical approaches to brain energy metabolism. Glia. 66, 1138-1159 (2018).
- Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Optogenetic reporters: Fluorescent protein-based genetically encoded indicators of signaling and metabolism in the brain. Progress in Brain Research. 196, 235-263 (2012).
- Trevisiol, A., et al. Monitoring ATP dynamics in electrically active white matter tracts. eLife. 6, e24241 (2017).
- Imamura, H., et al. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15651-15656 (2009).
- Lerchundi, R., et al. FRET-based imaging of intracellular ATP in organotypic brain slices. Journal of Neuroscience Research. , 1-13 (2018).
- Ehrengruber, M. U., et al. Gene transfer into neurons from hippocampal slices: comparison of recombinant Semliki Forest Virus, adenovirus, adeno-associated virus, lentivirus, and measles virus. Molecular and Cellular Neurosciences. 17, 855-871 (2001).
- Woo, J., et al. Functional Characterization of Resting and Adenovirus-Induced Reactive Astrocytes in Three-Dimensional Culture. Experimental Neurobiology. 26, 158-167 (2017).
- Close, B., et al. Recommendations for euthanasia of experimental animals: Part 2. DGXT of the European Commission. Laboratory Animals. 31, 1-32 (1997).
- Benediktsson, A. M., Schachtele, S. J., Green, S. H., Dailey, M. E. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141, 41-53 (2005).
- Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9, 1623 (2018).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus. The Journal of Comparative Neurology. 462, 241-251 (2003).
- Frotscher, M., Zafirov, S., Heimrich, B. Development of identified neuronal types and of specific synaptic connections in slice cultures of rat hippocampus. Progress in Neurobiology. 45, vii-xxviii (1995).
- Galimberti, I., et al. Long-term rearrangements of hippocampal mossy fiber terminal connectivity in the adult regulated by experience. Neuron. 50, 749-763 (2006).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37, 173-182 (1991).
- Forster, E., Zhao, S., Frotscher, M. Laminating the hippocampus. Nature Reviews. Neuroscience. 7, 259-267 (2006).
- Holopainen, I. E. Organotypic Hippocampal Slice Cultures: A Model System to Study Basic Cellular and Molecular Mechanisms of Neuronal Cell Death, Neuroprotection, and Synaptic Plasticity. Neurochemical Research. 30, 1521-1528 (2005).
- Teschemacher, A. G., et al. Targeting specific neuronal populations using adeno- and lentiviral vectors: applications for imaging and studies of cell function. Experimental Physiology. 90, 61-69 (2005).
- Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Advances in Genetics. 87, 125-197 (2014).
- Mächler, P., et al. In Vivo Evidence for a Lactate Gradient from Astrocytes to Neurons. Cell Metabolism. 23, 94-102 (2016).
- Schreiner, A. E., Berlinger, E., Langer, J., Kafitz, K. W., Rose, C. R. Lesion-Induced Alterations in Astrocyte Glutamate Transporter Expression and Function in the Hippocampus. ISRN Neurology. 2013, 893605 (2013).
- Haber, M., Zhou, L., Murai, K. K. Cooperative astrocyte and dendritic spine dynamics at hippocampal excitatory synapses. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 8881-8891 (2006).
- Neary, J. T., Kang, Y., Tran, M., Feld, J. Traumatic injury activates protein kinase B/Akt in cultured astrocytes: role of extracellular ATP and P2 purinergic receptors. Journal of Neurotrauma. 22, 491-500 (2005).
- Xia, J., et al. Neurons respond directly to mechanical deformation with pannexin-mediated ATP release and autostimulation of P2X7 receptors. The Journal of Physiology. 590, 2285-2304 (2012).
- Ainscow, E. K., Mirshamsi, S., Tang, T., Ashford, M. L., Rutter, G. A. Dynamic imaging of free cytosolic ATP concentration during fuel sensing by rat hypothalamic neurones: evidence for ATP-independent control of ATP-sensitive K+ channels. The Journal of Physiology. 544, 429-445 (2002).
- Arcuino, G., et al. Intercellular calcium signaling mediated by point-source burst release of ATP. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 9840-9845 (2002).
- Rajendran, M., Dane, E., Conley, J., Tantama, M. Imaging Adenosine Triphosphate (ATP). The Biological Bulletin. 231, 73-84 (2016).
- Rangaraju, V., Calloway, N., Ryan, T. A. Activity-driven local ATP synthesis is required for synaptic function. Cell. 156, 825-835 (2014).
- Chatton, J. Y., Pellerin, L., Magistretti, P. J. GABA uptake into astrocytes is not associated with significant metabolic cost: implications for brain imaging of inhibitory transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12456-12461 (2003).
- Magistretti, P. J., Chatton, J. Y. Relationship between L-glutamate-regulated intracellular Na+ dynamics and ATP hydrolysis in astrocytes. Journal of Neural Transmission (Vienna). 112, 77-85 (2005).
- Langer, J., et al. Rapid sodium signaling couples glutamate uptake to breakdown of ATP in perivascular astrocyte endfeet. Glia. 65, 293-308 (2017).
- Yaginuma, H., et al. Diversity in ATP concentrations in a single bacterial cell population revealed by quantitative single-cell imaging. Scientific Reports. 4, 6522 (2014).
- Tantama, M., Martinez-Francois, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nature Communications. 4, 2550 (2013).
- Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. Ca2+ Regulation of Mitochondrial ATP Synthesis Visualized at the Single Cell Level. ACS Chemical Biology. 6, 709-715 (2011).
- Mollajew, R., Toloe, J., Mironov, S. L. Single KATP channel opening in response to stimulation of AMPA/kainate receptors is mediated by Na+ accumulation and submembrane ATP and ADP changes. The Journal of Physiology. 591, 2593-2609 (2013).
- Pathak, D., et al. The Role of Mitochondrially Derived ATP in Synaptic Vesicle Recycling. The Journal of Biological Chemistry. 290, 22325-22336 (2015).
- Karus, C., Mondragao, M. A., Ziemens, D., Rose, C. R. Astrocytes restrict discharge duration and neuronal sodium loads during recurrent network activity. Glia. 63, 936-957 (2015).
- Larsen, B. R., Stoica, A., MacAulay, N. Managing Brain Extracellular K+ during Neuronal Activity: The Physiological Role of the Na+/K+-ATPase Subunit Isoforms. Frontiers in Physiology. 7, 141 (2016).
- Ruminot, I., et al. NBCe1 mediates the acute stimulation of astrocytic glycolysis by extracellular K+. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14264-14271 (2011).
