Vi beskriver en protokoll for celle-type spesifikke uttrykk for genetisk kodet bånd-basert sensor ATeam 1.03YEMK in organotypic skive kulturer av musen forebrain. Videre viser vi hvordan du bruker denne sensoren for dynamisk bildebehandling av mobilnettet ATP nivåer i neurons og astrocytter.
Neuronal aktivitet i sentralnervesystemet (CNS) fremkaller en høy etterspørsel på mobilnettet energi levert av nedbryting av adenosin trifosfat (ATP). En stor andel av ATP er nødvendig for å re-installere ion graderinger på tvers av plasma membraner degradert av elektriske signaler av neurons. Det er bevis for at astrocytter-samtidig ikke generere raske elektriske signaler selv-gjennomgår økt produksjon av ATP som svar på neuronal aktivitet og støtte aktive neurons ved å gi energi metabolitter til dem. Den nylige utviklingen av genetisk kodede sensorer for ulike metabolitter gjør det nå mulig å studere slike metabolske interaksjoner mellom neurons og astrocytter. Her beskriver vi en protokoll for celle-type spesifikke uttrykk for ATP-sensitive fluorescens resonans Energy Transfer-(SLITE-) sensor ATeam 1.03YEMK i organotypic vev skive kulturer av musen hippocampus og cortex bruker adeno-assosiert viral VEKTORER (AAV). Videre viser vi hvordan denne sensoren kan benyttes for dynamisk måling av endringer i cellulære ATP nivåer i neurons og astrocytter ved økninger i ekstracellulære kalium og etter induksjon av kjemiske iskemi (dvs. en hemming av cellulær energi metabolisme).
Eksitatoriske elektriske aktivitet av neurons er i stor grad basert på Flux av spesifikasjoner som natrium (na+) og kalium (K+) på tvers av deres plasma membraner. Vedlikehold av elektrokjemiske graderinger av disse to ioner er dermed nødvendig for signalering. Dette oppnås ved mobilnettet na+/K+-ATPase (NKA), en overalt uttrykt electrogenic transmembrane pumpe, som spyr 3 na+ ut av cellen i bytte for 2 K+ fra ekstracellulære plass, som krever inntak av ett molekyl ATP per transport syklus1. I tillegg til NKA, er det flere andre ATP-forbruker ion transportører inkludert plasma membranen ca2 +-ATPase, som er avgjørende for intracellulære ca2 + homeostase og eksport følgende aktivitet-indusert tilstrømningen2. I presynaptiske nerve blemmer, en vacuolar-type H+-ATPase (v-ATPase) skaper Proton gradient nødvendig for signalstoffet opptak i dette rommet3.
Mens aktiviteten av neurons dermed krever en betydelig mengde av ATP4, de ikke viser en betydelig kapasitet for lagring av energi. I stedet synes de å stole på metabolske interaksjoner med nabo astrocytter, de store glykogen butikker i hjernen5. Det har blitt antydet at astrocytic glykogen faktisk spiller en viktig rolle i å støtte neuronal energibehov; og et viktig fenomen i denne foreslåtte Nevro-metabolsk kopling mellom de to celle typene er kapasiteten til astrocytter å øke sin ATP produksjon som svar på neuronal aktivitet6,7,8. Denne hypotesen, kjent som astrocytt melkesyre shuttle (ANLS), er fortsatt under debatt, fordi annet arbeid har gitt bevis for at neurons kan også øke sin egen rate på Glykolysen som svar på stimulering9,10, reflekterer nødvendigheten av videre metoder og tilnærminger for å studere Nevro-glia interaksjon.
Gransking av cellulær energi metabolisme og ATP nivåer i neurons og astrocytter til belyse Nevro-glia metabolske interaksjoner har lenge vært hemmet av mangelen på egnede sonder for påvisning av endringer i metabolitten konsentrasjoner i levende celler i hjernevevet. Det siste tiåret har imidlertid gitt en økning i utviklingen av nye verktøy og nye genetisk kodede lysrør sonder for ulike metabolitter, inkludert sensorer for ATP, melkesyre, pyruvat og andre11,12. Ved hjelp av disse verktøyene, er det nå mulig å direkte adresse spørsmål knyttet til mobilnettet ATP forbruk og endringer i mobilnettet energi nivå på enkelt cellenivå og i en celle-type spesifikk måte i intakt hjernevev13.
I dagens arbeid, beskriver vi en prosedyre for å visualisere cytosolic ATP dynamikk på neurons og astrocytter av kultivert organotypic hjerne skiver. Vi viser hvordan å ansette adeno-assosiert viral vektorer (AAV) for celle-type spesifikke uttrykk for genetisk kodet ATP-nanosensor ATeam 1.03YEMK (14) i neurons og astrocytter av skiver av mus hjernen som kan opprettholdes i celle kulturen i flere uker15. En fremgangsmåte av hvor å fjerne det gliacellene arr det dekker kultivert tissue skive er beskrevet, hvilke gjøre bedre optisk tilgjengeligheten og tenkelig av celler inne det organotypic tissue lag nedenunder. Til slutt viser vi hvordan ATeam 1.03YEMK kan brukes til å utføre bånd-basert avbildning av endringer i mobilnettet ATP nivåer i dette preparatet. Denne metoden verter de store fordelene at det ikke krever kirurgiske hjerne prosedyrer, gir høye nivåer av uttrykk for sensor og celle type spesifisitet i kultivert hjerne skiver, redusere invasiveness eller stress i cellene sammenlignet med andre metoder, som transfeksjoner av electroporation eller Transduction med andre viral vektorer10,16,17. I tillegg kan denne protokollen brukes til andre bånd basert nanosensors, blant dem varianter av ATeam 1.03 som gir lavere bindende affinitet for ATP14.
Her viser vi en prosedyre for celle-type spesifikke uttrykk for ATeam 1.03YEMK, et bånd-basert, genetisk kodet nanosensor14, for måling av endringer i ATP nivåer i astrocytter eller neurons i organotypic vev skive kulturer av musen hjernen15. I eksemplarisk innspillinger, viser vi at en økning i den ekstracellulære kalium konsentrasjonen ikke resulterer i en endring i ATP konsentrasjoner i neurons, mens astrocytic ATP nivåer stiger som svar på denne manipulasjon. Videre våre resultater viser at ved hemming av cellulære metabolisme, ATeam 1.03YEMK bånd ratio raskt synker i begge celletyper, noe som indikerer en rask nedgang i intracellulære ATP.
Uttrykk for ATeam 1.03YEMK i organotypic skive kulturer krever vedlikehold av vevet i kulturen under kontrollerte forhold i minst 7-10 dager. Alternativt kan Ateam 1.03YEMK også være ansatt for måling av ATP i akutt isolert hjernevev skiver og i optiske nerver av mus13,15. Målinger i akutt isolert vev, men nødvendig generering av transgene dyr eller en stereotactic anvendelse av viral vektorer i hjernen, som involverer dyr eksperimentering og strenge dyr omsorg protokoller. I denne forbindelse Ateam 1.03YEMK uttrykk i organotypic vev skive kulturer representerer en nyttig og verdifullt alternativ22,23. I mange år nå, organotypic tissue skive kulturer tjene som en etablert modell system for å studere neural egenskaper, tilkobling og utvikling24,25,26. De ikke bare opprettholde den generelle vev arkitektur og laminering (figur 1), men også vert for fortrinnsrett egenskaper cellekulturer som overlegen tilgjengelighet og direkte kontroll av eksperimentelle forhold. Organotypic vev skive kulturer er også rutinemessig ansatt for å uttrykke utenlandske gener ved hjelp av viral vektorer27. Flere typer viral vektorer har blitt rapportert å levere transgenes i hjernevevet16,28. Adenoviral vektorer induserer høye uttrykk i gliacellene celler, men ikke hippocampus neurons16, og kan generere gliacellene reaktivitet17. Adeno-assosiert viral vektorer som brukes her fremstå som et godt alternativ15, og deres effektivitet har også vært vist i vivo29.
Mens hovedsakelig brukes til studiet av neuronal egenskaper, nyere studier har fastslått at organotypic vev skive kulturer kan også være ansatt for analyse av astrocytter. Kultivert skiver er vanligvis dekket av et lag av reaktive astrocytter19,30 (figur 5), men astrocytter viser en mer innfødt, ikke-reaktiv morfologi og cytoarchitecture i dypere lag19,30 (figur 5). I denne studien beskriver vi en prosedyre for mekanisk fjerning av ytre gliacellene arr, som resulterer i en bedre eksperimentell og optisk tilgjengelighet av innfødte astrocytter innenfor de riktige organotypic vevs lag. Videre, dens fjerning forbedrer uttrykket effekt i dypere lag av organotypic skiver; Hvis gliacellene arr ikke er fjernet, Transduction av AAVs kan tendens til å være begrenset til overfladiske celle lag.
Flere eksterne mekaniske faktorer må vurderes når du utfører eksperimenter i vev skiver. En variasjon i Bad-hastighet kan indusere bevegelser av hele preparatet og/eller indusere endringer i fokus, noe som resulterer i kunstige forbigående endringer av sensorsignalet. Videre har både astrocytter og neurons blitt rapportert å reagere på mekaniske deformasjon som pålagt av høye takst32,33. I våre hender, ved hjelp av en pålitelig peristaltisk pumpe, sammen med å opprettholde små og stabile volumer av saltvann mellom vevet og målet (menisk) resulterer i et stabilt bånd-signal under Baseline forhold ved bruk av bruk her (1.5-2.5 mL/min; Figur 8).
I denne studien viser vi også at båndbasert avbildning med ATeam 1.03YEMK kan benyttes til å overvåke ATP-nivåer i neurons og astrocytter. En alternativ betyr innført tidligere for måling av Cellular ATP er den såkalte luciferin-luciferase analysen34,35,36,37. Denne tilnærmingen er imidlertid basert på Imaging av bioluminesens og gir bare en ganske lav Temporal og romlig oppløsning delvis på grunn av høy bakgrunnsstøy nivåer. En annen metode rutinemessig ansatt de siste årene var Imaging av endringer i intracellulære magnesium konsentrasjon ved hjelp av ion-sensitive fluoroforen magnesium grønn38,39,40. Denne tilnærmingen er knyttet til observasjon at et forbruk av ATP resulterer i utgivelsen av co-faktor magnesium. Bildebehandling med magnesium grønn gir dermed bare et sekundært estimat av endringer i ATP-nivåer. Videre er magnesium grønn også følsom for endringer i intracellulære kalsium, innføre en annen vanskelighet når tolke resultater oppnådd med denne metoden.
Den nylige utviklingen av genetisk-kodet nanosensors for direkte bildebehandling av cellulære metabolitter, derfor representerte et stort skritt fremover11,12. Flere forskjellige sensorer ble generert som kan benyttes for måling av intracellulære ATP36,41,42,43. Blant dem er de ratiometrisk fluorescerende ATP indikatoren “QUEEN”41 samt PercevalHR, som sanser ATP: ADP ratio42. Mens sistnevnte sonde er et verdifullt verktøy for studiet av energi status av celler, krever det samtidig måling av endringer i pH42.
ATeam er en nanosensor hvorav det finnes flere varianter, som – blant annet – er forskjellige i deres bindings affinitet for ATP14. In vitro, ATeam 1.03YEMK utstillinger en Kd på 1,2 mm ved 37 ° c, som er nær mobilnettet ATP nivåer bestemmes i ulike neuronal celletyper, alt fra hypothalamus og lillehjernen34 tilhippocampus 37,44,45. Ved Cuvette målinger resulterte senke temperaturen med 10 ° c i en signifikant reduksjon i bindings affinitet til ATeam 1.03YEMK til ATP, noe som tyder på at det kanskje ikke er ideelt for cellulær bildebehandling ved romtemperatur14. Våre tidligere studie15, men viste at atferden og responsen av Ateam 1.03YEMK uttrykt i neurons og astrocytter til ulike manipulasjoner ligner på nær fysiologiske og ved romtemperatur, noe som indikerer at sensoren gir pålitelig bestemmelse av intracellulære ATP nivåer under begge forhold. I tillegg adressert våre tidligere eksperimenter pH-følsomheten til ATeam 1.03YEMK uttrykt i cellene15, viser at det er ufølsom for endringer i intracellulære pH med om lag 0,1-0,2 pH-enheter. Hvis Kd i den lave mm-serien er en bekymring, kan alternative ATeam-varianter brukes14, blant dem rød-forskjøvet varianter av ATeam (“Go-ATeam”)43.
Våre eksperimenter bruker ATeam 1.03YEMK demonstrere at en økning i ekstracellulære kalium konsentrasjon av noen få mm bare (fra 3 til 8 mm) resulterer i en forbigående økning i Ateam 1.03YEMK ratio i astrocytter i organotypic Slice kultur. Denne observasjonen bekrefter tidligere studier15,46 og tydelig indikerer at astrocytter svare på utgivelsen av kalium av aktive neurons med en økning i deres ATP produksjon, mest sannsynlig som en konsekvens av en stimulering av na+/K+-ATPase og na+/HCO3– cotransporter, henholdsvis47,48. I motsetning til dette, nevroner ikke viser et svar, som er i tråd med tidligere arbeid så vel15. Begge celle typene reagerte imidlertid raskt og sterkt på hemming av cellulær Glykolysen og mitokondrie åndedrett som vist før15. Under forhold av kjemiske iskemi, ATeam bånd prosenter falt til et nytt stabilt nivå, noe som indikerer en nominell nedbryting av mobilnettet ATP. Sistnevnte resultat antyder at både neurons samt astrocytter viser et relevant forbruk av ATP også under steady-state forhold uten ekstra stimulering av Synaptic aktivering eller anvendelse av nevrotransmittere. Til sammen konkluderer vi med at båndbasert avbildning med genetisk kodet nanosensors, blant dem ATeam 1.03YEMK, vil gi en verdifull tilnærming for å belyse de cellulære prosessene som er ansvarlige for endringer i intracellulære ATP-nivåer og cellulær ATP-forbruk under ulike forhold.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Claudia Rodrigo og Simone Durry for ekspert teknisk assistanse. Vi takker Dr. Niklas J. Gerkau og M.Sc. Joel Nelson for assistanse i utarbeidelsen av organotypic skive kulturer. Forskning i forfatterens laboratorium ble finansiert av den tyske Research Association (DFG; FOR 2795: ro 2327/13-1 og SPP 1757: ro 2327/8-2 til CRR; og SPP 1757: Young Glia oppstart midler til RL).
2-deoxyglucose | Alfa Aesar | L07338 | Non-metabolizable glucose analog |
36-IMA-410-019 Argon laser | Melles Griot | 488 nm wavelength argon | |
Ascorbic acid | Carl Roth | 3525.1 | Antioxidant, Vitamin C |
band pass filters 483/32 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
band pass filters 542/27 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
Beamsplitter T 455 LP | AHF Analysentechnik AG | Excitation dichroic mirror | |
Beamsplitter T 505 LPXR | AHF Analysentechnik AG | Splitter dichroic | |
Confocal laser scannig microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system C1 | |
Data processing Origin Pro 9.0.0 (64-bit) | OriginLab corporation | Scientific graphing and data analysis software | |
D-glucose monohydrate | Caelo | 2580-1kg | |
DPBS | GIBCO/Life | 14190250 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
Eclipse FN1 upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
Experimental chamber | custom build | Perfusion chamber for live-cell imaging | |
EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
Hanks' Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H9394 | With Phenol Red for pH monitoring |
HERAcell 150 | Thermo Scientific | CO2 incubator HERAcell ® 150 with decontamination routine | |
HERAsafe KS/KSP | Thermo Scientific | Safety Cabinet | |
Horse serum | GIBCO/Life | 26050088 | Heat inactivated |
Huygens Professional | SVI Imaging | Deconvolution software | |
Image J 1.52i | Wayne Rasban national Institute of Health | Image processing Software available in the public domain | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Insulin from bovine pancreas |
IP serie peristaltic pump | Ismatec | High-precisionmulti-channel pump | |
Layout software, Illustrator CS6 | Adobe | Vector graphics editor | |
L-glutamine | GIBCO/Life | 25030024 | |
Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Vibration microtome. Thermo scientific discontinued the production of the device in the meantime. Any other slicer or tissue chopper siutable for slicing living tissue is fine, too. | |
Microscope stage | custom build | ||
Microsoft Excel 16 | Microsoft | Spreadsheet software for basic data processing | |
Millicell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Hydrophilized PTFE, pore size 0.4 μm |
Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M7278 | Synthetic cell culture media |
Monochromator Polychrome V | Thermo Scientific/FEI | Ultra fast switching monochromator | |
NaN3 (Sodium Azide) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Mitochondrial inhibitor (complex IV inhibitor). CAUTION: Azide is toxic. Be aware not to accidentally ingest or inhale it, and prevent ist absoption through the skin. |
Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0 | Nikon Microscope Solutions | Water Immersion Microscope Objective | |
NIS Elements 4.50 advanced Research | Nikon Microscope Solutions | Imaging software. Upgraded version for FRET imaging | |
ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | Digital CMOS camera | |
Perfusion tubing | Pro Liquid GmbH | Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85) | |
Photoshop CS 6 Version 13.0 | Adobe | Image processing software | |
Sodium L-lactate | Sigma-Aldrich | 71718-10G | |
ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A) | ETH Zürich | v244 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human synapsin 1 promoter fragment hSyn1. |
ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A) | ETH Zürich | v307 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D. |
WVIEW GEMINI optic system | Hamamatsu Photonics | Emission Image Splitter |