在伪单体中生成帧内基因删除突变体，并在简单小鼠感染模型中测试病毒衰减
Summary
在这里，我们描述了一个简单和可重复的小鼠感染模型协议，以评估与美国食品和药物管理局（FDA）批准的大肠杆菌用于商业用途的假单抗病毒的遗传改性菌株的衰减。
Abstract
微生物具有遗传多样性和多样性，已成为许多商业产品和生物制药的主要来源。虽然其中一些产品是有机体自然生产的，但其他产品需要生物体的遗传工程来提高产量。大肠杆菌的阿维性菌株历来是生产生物制药的首选细菌品种;然而，有些产品很难生产大肠杆菌。因此，其他细菌物种的阿维规则菌株可以为生产某些商业产品提供有用的替代品。假单抗是一种常见且经过深入研究的革兰氏阴性细菌，可提供大肠杆菌的合适替代品。然而，阿鲁吉诺萨是一种机会性人类病原体。在这里，我们详细介绍了一个程序，可用于通过使用pEX100T-NotI质粒通过顺序基因组删除来生成P.aeruginosa的非致病菌株。此方法的主要优点是产生无标记应变。该方法可用于生成用于生产商业产品的高衰减P. aeruginosa菌株，或为其他特定用途设计菌株。我们还描述了一个简单和可重复的小鼠模型细菌系统感染通过腹内注射经验证的测试菌株，以测试基因工程菌株的衰减相比，FDA批准的BL21菌株的大肠杆菌。
Introduction
假单核菌是一种机会性细菌病原体，可引起人类威胁生命的疾病，特别是在免疫功能低下。P. aeruginosa的致病性是由于许多毒性因素的表达，包括蛋白酶和脂多糖，以及它的能力，形成保护性生物膜1。由于其能够产生毒性因子和在人类中引起疾病，使用P.aeruginosa使商业产品存在安全问题。非致病性大肠杆菌菌株传统上用于生物工程医疗和商业产品供人类使用。然而，有些产品很难为大肠杆菌制造，而且许多产品被包装在内含物体中，使得提取费力。具有制造和分泌特定产品的工程细菌菌株是非常可取的，因为分泌可能会增加产量和简化纯化过程。因此，其他细菌种类的非致病菌株（例如，利用更多分泌途径的物种）可能为大肠杆菌提供有用的替代品。我们最近报道了P.aeruginosa，PGN5菌株的发展，其中生物体的致病性和毒性高度衰减2。重要的是，这种菌株仍然产生大量的多糖藻酸盐，这是P.aeruginosa生物膜中一种商业上有趣的成分。
PGN5菌株是使用pEX100T-NotI质粒的两步等位交换程序产生的，顺序删除五个已知有助于生物体的致病性的基因（毒体、plcH、phzM、wapR、aroA）。 pEX100T-NotI是在赫伯特·施韦泽的实验室3、4中开发的，通过将SmaI更改为TI限制酶识别位点，在质粒pEX100T的多个克隆位点内产生。与SmaI相比，限制性酶NotI的识别位点是一种罕见的DNA序列，在克隆序列中出现的可能性较小，因此更便于克隆。质粒携带允许选择的基因，包括bla基因，该基因编码β-乳糖酶，并产生对卡比西林的抗药性，B.subtilissacB基因，赋予蔗糖的敏感性（图1A）。质粒还带有与大肠杆菌相容的复制（ori）的来源，以及允许通过结合从大肠杆菌转移到伪多尼纳斯物种的转移（或或T）的来源。然而，质粒缺乏与伪多尼萨兼容的复制来源，因此无法在伪多尼纳斯物种中复制（即，它是一个伪多尼纳斯自杀载体）。这些特性使pEX100T-NotI成为定位从伪多尼纳斯染色体遗传缺失的理想选择。疟原虫克隆步骤使用大肠杆菌进行，由此产生的质粒通过转化或结合转移到伪多尼氏。然后，通过同源重组事件和选择性步骤，生成目标帧内删除，无标记。这种从P.aeruginosa染色体上按顺序删除基因组区域的方法可用于产生高度衰减的伪多尼纳斯菌株，如PGN5，或设计用于其他特定用途的菌株（例如，质粒繁殖的内分酶缺乏菌株或缺乏蛋白酶的菌株，用于生产感兴趣的蛋白质）。
细菌菌株的整体毒性受生长条件和阶段的影响，在此期间突变频繁发生。因此，测量基因工程菌株的安全性可能具有挑战性。为了评估细菌分离物的系统性毒性，我们采用了以前公布的C57BL/6小鼠腹内注射感染方案。我们修改了这个程序，使用冷冻细菌储存注射，这允许精确的给给和使用的菌株验证。在此模型中，经FDA批准生产生物制药的大肠杆菌菌株BL21被用作控制安全标准，用于确定该菌株6、7、8的相对发病机制。使用此方法的主要优点是，它是可重复的，并最大限度地减少变异源，因为感染菌株在感染之前和之后都验证细菌细胞数、表型和遗传标记。通过这些受控步骤，所需的动物数量会减少。在此模型中，导致C57BL/6小鼠死亡率等于或低于大肠杆菌BL21的P.aeruginosa菌株在注射腹内时可被视为衰减。这种简单的小鼠感染模型也可用于评估其他物种的遗传工程菌株的衰减致病性，以FDA批准的大肠杆菌菌株为参考。步骤1-7详细介绍了P.aeruginosa（图1）中连续基因组缺失的生成，步骤8-12详细介绍了使用小鼠模型来测试P.aeruginosa菌株的致病性。
Protocol
Representative Results
Discussion
pEX100T-Not1 质粒是无标记和框架内连续基因组缺失的有效中介。当工程细菌菌株衰减毒性时，删除整个基因序列，而不是产生点突变，会减少回归到毒性表型的可能性。此外，每个致病基因缺失可进一步减轻病原体，增强衰减的稳定性。
此方法还可用于生成除了删除以外的基因组修饰，如点突变和插入，只需修改质粒插入的设计。例如，这些类型的修饰可能比整个基因删除对?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家卫生研究院（NIH）授予R44GM113545和P20GM103434的支持。
Materials
| 0.2 mL tubes with flat caps | ThermoScientific | AB-0620 | via Fisher Scientific |
| 1 mL Syringe | BD | 22-253-260 | via Fisher Scientific |
| 1.5 mL disposable polystyrene cuvette | Fisher Scientific | 14955127 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 27G needle | BD | 14-821-13B | via Fisher Scientific |
| 50 mL tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Centrifuge 5804R | Eppendorf | 04-987-372 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbenicillin disodium salt | Fisher Scientific | BP2648250 | |
| Culture Test Tube, Polystyrene | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| Dneasy UltraClean Microbial Kit (50) | Qiagen | 12224-50 | or preferred method/vendor |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50) | Omega bio-tek | D6493-01 | or preferred method/vendor |
| EcoRI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3101L | |
| Electroporation Cuvettes | Bulldog Bio | NC0492929 | via Fisher Scientific |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| GoTaq G2 Colorless Master Mix | Promega | M7833 | via Fisher Scientific |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System | Perkins and Elmer | CLS136340 | |
| Kanamycin monosulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | |
| Noble agar, ultrapure | Affymetris/USB | AAJ10907A1 | via Fisher Scientific |
| NotI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3189 | |
| One Shot TOP10 Electrocomp E. coli | Invitrogen | C404052 | via Fisher Scientific |
| Phosphate buffered saline powder | Sigma | P3813-10PAK | Sigma-Aldrich |
| Prism 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation broth | Alpha Biosciences | P16-115 | Custom made batch |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A24811 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Toothpicks, round | Diamond | Any brand of toothpicks, autoclaved | |
| TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing | Invitrogen | 45-0030 | |
| XAF-8 Anesthesia System Filters | Perkins and Elmer | 118999 | |
| XGI 8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/Xenogen |
References
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