在此，我们描述了一种简单且可重复的小鼠感染模型实验方案，用于评估基因修饰菌株的减毒特性 铜绿假单胞菌 与美国食品药品监督管理局（FDA）批准的 大肠杆菌 用于商业用途。
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本文内容
摘要
摘要
微生物具有丰富的遗传多样性和变异性，已成为许多商业产品和生物制药的重要来源。尽管其中一些产品可由生物体天然产生，但其他产品则需要对生物体进行基因工程改造以提高产量。减毒的Escherichia coli菌株传统上是生产生物制药的首选细菌种类；然而，某些产品难以由E. coli有效生产。因此，其他细菌种类的减毒菌株可能为某些商业产品的生产提供有用的替代方案。Pseudomonas aeruginosa是一种常见且研究充分的革兰氏阴性细菌，可作为E. coli的合适替代选择。然而，P. aeruginosa是一种机会性人类病原体。本文详细介绍了一种利用pEX100T-NotI质粒通过连续基因组缺失生成非致病性P. aeruginosa菌株的方法。该方法的主要优势在于可获得无标记基因的菌株。该方法可用于构建高度减毒的P. aeruginosa菌株，以用于商业产品的生产，或设计用于其他特定用途的菌株。我们还描述了一种简单且可重复的小鼠细菌系统性感染模型，通过腹腔注射经验证的测试菌株，以评估基因工程菌株的减毒效果，并与美国食品药品监督管理局（FDA）批准的E. coli BL21菌株进行比较。
引言
铜绿假单胞菌 是一种机会性细菌病原体，可在人类中引起危及生命的疾病，尤其是在免疫功能低下者中。该病原体的致病性 P. aeruginosa 是由于表达多种毒力因子，包括蛋白酶和脂多糖，以及其形成保护性生物膜的能力1由于其能够产生毒力因子并在人类中引发疾病，使用 P. aeruginosa 用于商业产品时存在安全问题。非致病性菌株 E. coli 传统上已被用于生物工程化开发供人类使用的医药和商业产品。然而，某些产品对于 E. coli 以进行生产，且许多产物会形成包涵体，导致提取过程繁琐耗时。能够合成并分泌特定产物的基因工程菌株极具应用价值，因为分泌表达有望提高产量并简化纯化流程。因此，其他细菌物种中的非致病性菌株（例如具有更多分泌途径的物种）可能为 E. coli我们最近报道了一种菌株的开发 P. aeruginosa，PGN5，其中该生物体的致病性和毒性显著减弱2重要的是，该菌株仍能大量产生多糖海藻酸盐，这是一种具有商业价值的成分 P. aeruginosa 生物膜
PGN5 菌株是利用 pEX100T-NotI 质粒通过两步等位基因交换方法构建的，依次删除了五个已知参与该生物体致病性的基因（toxA、plcH....
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方案
在开始动物实验之前，所采用的实验方案必须获得机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。本实验方案已获得马歇尔大学（美国西弗吉尼亚州亨廷顿）机构动物照护与使用委员会的批准。
1. 质粒设计
- 使用 pEX100T-NotI 质粒构建基因缺失时，需克隆目标缺失序列上下游的DNA片段，并将其插入质粒的 NotI 限制性酶切位点。插入片段应包含约500个核苷酸的靶序列上游区域，紧邻约500个核苷酸的靶缺失序列下游区域。此外，插入片段的5'和3'末端应包含NotI识别序列（GCGGCCGC）（图1B）。
2. 质粒制备
- 方案1：采用传统克隆方法。通过PCR扩增目的基因上下游的基因组区域，随后进行重叠PCR9,10以连接所获得的片段，对PCR产物和质粒进行限制性内切酶消化，并进行连接11（图1B,C）。
- 方案2：在计算机中设计好缺失序列后，委托公司从头合成该序列并插入至质粒pEX100T-NotI中。许....
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结果
如图2所示，可通过使用特异性引物进行菌落PCR来确认靶向基因组缺失，这些引物可扩增目标区域。携带基因组缺失的菌落与野生型菌落相比，会产生更短的PCR条带。通常对10–12个菌落进行PCR筛选，足以检测到至少一个携带靶向缺失的菌落。若经过多轮筛选仍未检测到缺失，应从接合步骤开始重复实验。若缺失仍无法实现，可能需要通过测序确认质粒插入片段，或重新设计插入片段，或该缺失可能是致死性的。通过PCR验证基因缺失后，需进一步通过测序确认缺失。所得菌株可重复进行该操作，以实现连续的基因组修饰。
如图所示 图3，减毒株腹腔注射相关的死亡率 P. aeruginosa PGN5（+mucE）为0%，相当于观察到的死亡率 E. coli BL21。另一方面，亲本菌株（VE2）经腹腔注射后导致80%的小鼠死亡。这些结果是.......
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讨论
pEX100T-Not1 质粒是一种高效的介导工具，可用于实现无标记且保持读码框的连续基因组缺失。在构建减毒细菌菌株时，相较于引入点突变，完全删除基因序列可降低回复突变为强毒表型的可能性。此外，每缺失一个致病性基因，病原体的毒力会进一步减弱，从而增强减毒的稳定性。
通过简单修改质粒插入片段的设计，该方法也可用于产生除缺失以外的其他基因组修饰，例如点突变和插入。对于改造具有修饰代谢途径的细菌而言，这类修饰可能比整个基因的缺失更具实用性。连续的基因组修饰在构建适用于科研和工业特定用途的定制化细菌菌株方面具有重要意义。已有其他方法被用于在细菌中实现所需的无标记基因组修饰15,16,17,18。与所有基因组编辑方法一样，对基因组关键区域进行的修饰尝试可能是致死性的，因而无法成功。在这些情况下，需要鉴定不同的遗传修饰或其他候选基因，以获得.......
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披露
作者 Hongwei D. Yu 是 Progenesis Technologies, LLC 的首席科学官兼联合创始人。
致谢
本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目R44GM113545和P20GM103434的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2 mL 平盖离心管 | ThermoScientific | AB-0620 | 通过 Fisher Scientific 购买 |
| 1 mL 注射器 | BD | 22-253-260 | 通过 Fisher Scientific 购买 |
| 1.5 mL 一次性聚苯乙烯比色皿 | Fisher Scientific | 14955127 | |
| 1.5 mL 微量离心管 | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 mL 冻存管 | Corning | 430659 | 通过 Fisher Scientific 购买 |
| 27G 针头 | BD | 14-821-13B | 通过 Fisher Scientific 购买 |
| 50 mL 离心管 | Fisher Scientific | 05-539-13 | 通过 Fisher Scientific 购买 |
| Accu block 数字干浴器 | Labnet | NC0205808 | 通过 Fisher Scientific 购买 |
| 台式离心机 5804R | Eppendorf | 04-987-372 | 通过 Fisher Scientific 购买 |
| 台式微量离心机 | Sorvall | 75-003-287 | 通过 Fisher Scientific 购买 |
| 培养箱 | VWR | 1540 | |
| 羧苄青霉素二钠盐 | Fisher Scientific | BP2648250 | |
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| E.Z.N.A. Cycle Pure 试剂盒（50 次） | Omega bio-tek | D6493-01 | 或选用其他方法/供应商 |
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参考文献
- Gellatly, S. L., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).
- Valentine, M. E., et al. Generation of a highly attenuate....
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