Summary
在这里,我们描述了一个简单和可重复的小鼠感染模型协议,以评估与美国食品和药物管理局(FDA)批准的大肠杆菌用于商业用途的假单抗病毒的遗传改性菌株的衰减。
Abstract
微生物具有遗传多样性和多样性,已成为许多商业产品和生物制药的主要来源。虽然其中一些产品是有机体自然生产的,但其他产品需要生物体的遗传工程来提高产量。大肠杆菌的阿维性菌株历来是生产生物制药的首选细菌品种;然而,有些产品很难生产大肠杆菌。因此,其他细菌物种的阿维规则菌株可以为生产某些商业产品提供有用的替代品。假单抗是一种常见且经过深入研究的革兰氏阴性细菌,可提供大肠杆菌的合适替代品。然而,阿鲁吉诺萨是一种机会性人类病原体。在这里,我们详细介绍了一个程序,可用于通过使用pEX100T-NotI质粒通过顺序基因组删除来生成P.aeruginosa的非致病菌株。此方法的主要优点是产生无标记应变。该方法可用于生成用于生产商业产品的高衰减P. aeruginosa菌株,或为其他特定用途设计菌株。我们还描述了一个简单和可重复的小鼠模型细菌系统感染通过腹内注射经验证的测试菌株,以测试基因工程菌株的衰减相比,FDA批准的BL21菌株的大肠杆菌。
Introduction
假单核菌是一种机会性细菌病原体,可引起人类威胁生命的疾病,特别是在免疫功能低下。P. aeruginosa的致病性是由于许多毒性因素的表达,包括蛋白酶和脂多糖,以及它的能力,形成保护性生物膜1。由于其能够产生毒性因子和在人类中引起疾病,使用P.aeruginosa使商业产品存在安全问题。非致病性大肠杆菌菌株传统上用于生物工程医疗和商业产品供人类使用。然而,有些产品很难为大肠杆菌制造,而且许多产品被包装在内含物体中,使得提取费力。具有制造和分泌特定产品的工程细菌菌株是非常可取的,因为分泌可能会增加产量和简化纯化过程。因此,其他细菌种类的非致病菌株(例如,利用更多分泌途径的物种)可能为大肠杆菌提供有用的替代品。我们最近报道了P.aeruginosa,PGN5菌株的发展,其中生物体的致病性和毒性高度衰减2。重要的是,这种菌株仍然产生大量的多糖藻酸盐,这是P.aeruginosa生物膜中一种商业上有趣的成分。
PGN5菌株是使用pEX100T-NotI质粒的两步等位交换程序产生的,顺序删除五个已知有助于生物体的致病性的基因(毒体、plcH、phzM、wapR、aroA)。 pEX100T-NotI是在赫伯特·施韦泽的实验室3、4中开发的,通过将SmaI更改为TI限制酶识别位点,在质粒pEX100T的多个克隆位点内产生。与SmaI相比,限制性酶NotI的识别位点是一种罕见的DNA序列,在克隆序列中出现的可能性较小,因此更便于克隆。质粒携带允许选择的基因,包括bla基因,该基因编码β-乳糖酶,并产生对卡比西林的抗药性,B.subtilissacB基因,赋予蔗糖的敏感性(图1A)。质粒还带有与大肠杆菌相容的复制(ori)的来源,以及允许通过结合从大肠杆菌转移到伪多尼纳斯物种的转移(或或T)的来源。然而,质粒缺乏与伪多尼萨兼容的复制来源,因此无法在伪多尼纳斯物种中复制(即,它是一个伪多尼纳斯自杀载体)。这些特性使pEX100T-NotI成为定位从伪多尼纳斯染色体遗传缺失的理想选择。疟原虫克隆步骤使用大肠杆菌进行,由此产生的质粒通过转化或结合转移到伪多尼氏。然后,通过同源重组事件和选择性步骤,生成目标帧内删除,无标记。这种从P.aeruginosa染色体上按顺序删除基因组区域的方法可用于产生高度衰减的伪多尼纳斯菌株,如PGN5,或设计用于其他特定用途的菌株(例如,质粒繁殖的内分酶缺乏菌株或缺乏蛋白酶的菌株,用于生产感兴趣的蛋白质)。
细菌菌株的整体毒性受生长条件和阶段的影响,在此期间突变频繁发生。因此,测量基因工程菌株的安全性可能具有挑战性。为了评估细菌分离物的系统性毒性,我们采用了以前公布的C57BL/6小鼠腹内注射感染方案。我们修改了这个程序,使用冷冻细菌储存注射,这允许精确的给给和使用的菌株验证。在此模型中,经FDA批准生产生物制药的大肠杆菌菌株BL21被用作控制安全标准,用于确定该菌株6、7、8的相对发病机制。使用此方法的主要优点是,它是可重复的,并最大限度地减少变异源,因为感染菌株在感染之前和之后都验证细菌细胞数、表型和遗传标记。通过这些受控步骤,所需的动物数量会减少。在此模型中,导致C57BL/6小鼠死亡率等于或低于大肠杆菌BL21的P.aeruginosa菌株在注射腹内时可被视为衰减。这种简单的小鼠感染模型也可用于评估其他物种的遗传工程菌株的衰减致病性,以FDA批准的大肠杆菌菌株为参考。步骤1-7详细介绍了P.aeruginosa(图1)中连续基因组缺失的生成,步骤8-12详细介绍了使用小鼠模型来测试P.aeruginosa菌株的致病性。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
在开始动物实验之前,要使用的协议必须获得机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准。通过马歇尔大学(美国加利福尼亚州亨廷顿)的IACUC获得了上述协议的批准。
1. 质粒设计
- 要使用pEX100T-NotI质粒生成遗传缺失,克隆DNA区域侧翼所需的删除序列,并插入质粒的NotI限制位点。质粒插入物应包含目标序列上游约500个核苷酸,直接与目标删除序列下游约500个核苷酸相邻。此外,刀片应包含 5' 和 3' 端处的 NotI 识别序列 (GCGGCCGC) (图 1B)。
2. 质粒制备
- 备选案文1:利用传统的克隆程序。使用PCR放大基因组区域上游和下游感兴趣的基因,然后交叉PCR9,10加入生成的片段,限制PCR产物和质粒的内切酶消化,并结扎11(图1B,C)。
- 选项 2:在硅胶中设计删除序列后,与一家合成它的公司签订合同,将其插入质粒 pEX100T-NotI 中。许多公司已经简化了克隆过程,以快速有效地产生感兴趣的质粒。此外,序列在分娩前验证质粒无突变。
3.大肠杆菌转化
- 根据制造商的建议,使用质粒转换电能大肠杆菌。使用无菌接种回路,将分离菌落的转化反应的条纹10μL排到预加热的Luria Broth(LB)琼脂板上,辅以100μg/mL的卡比西林,并在37°C下孵育过夜。
注:所有用于培养细菌的设备和媒体应按照机构的安全准则进行处理。 - 通过两次。
- 从培养箱中取出板并识别孤立的菌群。使用无菌接种回路,拿起菌落,并条纹预加热的LB琼脂板,补充100μg/mL的卡比西林为孤立的殖民地。在37°C下孵育过夜。再次重复此步骤以生成纯区域性。
- 使用无菌接种回路,用最终琼脂板的单一菌位接种 5 mL 的 LB。将培养体置于37°C的摇动培养箱中过夜。第二天,将这种培养的1mL与1mL的5%在低温中混合,并储存在-80°C,产生冷冻的菌株。
4. 细菌应变制备和三亲结合
- 使用从以下菌株的琼脂板中分离的菌群,接种肉汤培养物,并在37°C的摇孵化器中过夜。
- 将大肠杆菌pEX100T-NotI 加入 5 mL 的 LB 中,辅以 100 μg/mL 的卡比西林。
- 将P. aeruginosa菌株 PAO1 添加到 5 mL 的伪单一族隔离球 (PIB)。
- 将大肠杆菌prk2013 加入 5 mL 的 LB 中,辅以 50 μg/mL 的卡那霉素。
注:prk2013质粒是一种帮助质粒,在大肠杆菌中复制,但不在大肠杆菌中复制;它携带的转作用转移基因,将pEX100T-NotI质粒从大肠杆菌捐赠者调动到P.aeruginosa受体12。Aeruginosa是一种生物安全 2 级 (BSL-2) 病原体。使用 BSL-2 生物时,请遵循该机构的安全准则。
- 第二天,从培养箱中取出过夜培养物,并将每种培养物的0.5 mL添加到1.5 mL微离心管中。在6000 x g下离心5分钟,丢弃上清液,将细胞颗粒悬浮在50-100 μL的LB中。
- 将整个细胞悬浮液放在一个液滴中,放到预加热的LB琼脂板上。让滴干燥。然后反转板并在37°C孵育4-6小时。
- 孵育后,使用无菌接种回路在微离心管中将细胞收集到1mL的LB中。上下移液以混合细胞。
- 使用细胞扩张器,将细胞均匀地条纹到干燥预加热的伪单胞菌隔离琼脂(PIA)板上,辅以300微克/mL的卡比西林。在细胞混合物体积增加时,可分片多个板(例如,10 μL、100 μL、500 μL)。在37°C下孵育过夜。
5. P. aeruginosa单交叉重组的检测
- 从培养箱中取出板,并检查有无分离的耐卡比西林菌落。由于pEX100T-NotI质粒不能在P.aeruginosa中复制,在甲虫素补充的板中生长的菌落应该来自质粒并入染色体的细胞。
- 选择至少4个这些菌落和条纹隔离到PIA的预加热板,辅以300微克/mL的卡比西林。在37°C下孵育板过夜。
- 从培养箱中取出板并检查生长情况。耐Carbenicillin的菌落应该是单交叉重组体(即,它们通过质粒插入的同源区和P.aeruginosa的染色体之间的重组事件将质粒合并到染色体中)。
- 贴片 8 或更多菌落与无菌牙签到预加热板: 1) PIA 补充 300 μg/mL 的卡比西林和 2) PIA 补充 300 μg/mL 的卡比西林和 10% 蔗糖 (不含甘油)。
- 如果步骤5.1没有获得菌群生长,则重复结合并增加步骤4.5中条纹的细胞混合物的体积。如果出现过多增长,则重复结合并减少条纹的体积。
- 如果结合反复失败,制备P.aeruginosa菌株的电能细胞,并直接使用pEX100T-NotI质粒进行转化。准备电能P.aeruginosa和转换的详细协议可在13、14别的地方找到。
- 在37°C过夜孵育板。
- 从培养箱中取出板并检查生长。真正的单交叉重组剂将是耐卡比西林和蔗糖敏感(即,在PIA上生长的菌落,辅以甲苯,但没有生长在PIA上,辅之以卡比西林和蔗糖)。
- 选择 4 种或更多真正的单交叉重组剂,并接种每个到 5 mL 的 LB 中,无需选择。在37°C的摇动孵化器中孵育过夜。
- 如果未检测到单交叉重组剂,则重复结合。
6. 检测P.aeruginosa的双交叉重组剂
- 对于每种肉汤培养,将10μL的培养接种到PIA的预加热板上,辅以10%蔗糖(不含甘油)和分离菌落的条纹。在37°C下孵育板过夜。
- 第二天,从培养箱中取出板,检查它们的生长情况。抗蔗糖的菌落应该是双交叉重组体(即,通过质粒插入的另一个同源区和P.aeruginosa染色体之间的重组事件从染色体上去除质粒)。
- 修补至少20个菌落与无菌牙签到预加热板:1)PIA,2)PIA补充10%蔗糖(不含甘油),和3)PIA补充300微克/mL的卡比西林。
- 在37°C下孵育板过夜。
- 从培养箱中取出板并检查它们的生长情况。真正的双交叉重组剂将是对卡比西林敏感和抗蔗糖(即,在PIA和PIA上生长的菌落,辅以蔗糖,但没有在PIA上生长,并辅以卡比西林)。
7. 通过菌落PCR进行基因删除确认
- 准备 10-20 个菌落,用于 PCR 的删除屏幕。
- 用无菌牙签从可疑的双交叉重组中恢复生长,并在 50 μL 的 1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中悬浮细胞。在100°C下煮沸悬浮10分钟,在13,000 x g下离心3分钟,然后放在冰上。
- 执行 PCR 以筛选菌落以进行目标删除。
- 在25μL PCR反应中使用1μL的上清液作为模板,以确认删除感兴趣的基因。
- 使用基因特异性引源,放大基因组删除区域。使用扩增基因组缺失区域加上上行和下游序列侧翼100-200 bp的引基。
- 准备与母菌株(例如 PAO1)的单独对照 PCR 反应。
注: 热循环器条件将因引物对的最佳退火温度、使用的聚合酶鸡尾酒以及要放大的区域长度而异。
- 对PCR产品执行胶质电泳。已删除感兴趣区域的殖民地产生的放大产物比缺少删除的殖民地要小(图2)。
- 选择一个或多个具有 PCR 确认删除的菌落。将分离菌落的条纹划到预热的PIA板上,并在37°C孵育过夜。
- 至少再通过一次。从培养箱中取出板,并确定孤立的菌群。使用无菌接种回路,拿起菌落,并条纹一个预加热的PIA琼脂板为孤立的菌落。在37°C下孵育过夜。
- 从每个最终板中选择一个菌群,用于接种 5 mL 的 PIB。在37°C的摇动培养箱中过夜。
- 将 1 mL 的这种培养液与 1 mL 的 5% 脱脂牛奶混合在冷冻中,并储存在 -80°C 下,生成菌株的库存。
- 使用这种培养物,从菌株制备基因组DNA(例如,使用DNA纯化试剂盒)。使用特定于感兴趣的区域的 PCR 和引注放大基因组删除区域。
- 纯化这些PCR产物(例如,使用DNA纯化试剂盒或苯酚氯仿提取),并直接用基因特异性引物测序或结合成载体,用质粒特异性引物测序。
- 通过测序确认基因缺失后,用新的删除菌株重复此过程,以连续生成大量无标记基因组删除。生成所需菌株时,使用全基因组测序来验证目标缺失,并检测整个过程中发生的基因组的其他变化(与参考菌株(例如 PAO1)相比。对基因进行点音后,将序列存入GenBank并记录加入编号。
8. 动物试验用细菌菌株的准备
- 要测试P.aeruginosa菌株的衰减致病性,首先准备经过验证的培养物和库存。准备感兴趣的P.aeruginosa菌株、一种野生型的P.aeruginosa(毒性)和FDA批准的大肠杆菌菌株(例如BL21),作为非致病性安全控制。
- 从测序和验证的冷冻库存中,将被测试的细菌菌株分到选择性琼脂上。在37°C孵育过夜。
- 使用无菌接种回路,从每个菌株和条纹中再次拾取单个菌落,以分离菌落到选择性介质上。在37°C孵育过夜。
- 从培养箱中取出板。对于每个菌株,选择单个菌群和条纹,以隔离到LB板上。
- 在37°C下生长24小时后,接种含有250 mL LB的500 mL烧瓶,从每个菌株中分离出单个菌落。
- 验证步骤:使用同一菌群的残留物,使用PCR和应变特异性引物和/或引物验证菌株是否存在基因修饰。使用下面的引注验证所呈现的示例中的菌株:
大肠杆菌BL21:
T7 聚合酶 F:TGGCTATATATATATTTTTTTTTTTTT
T7 聚合酶 R:TTACGACGCGAAGTCC
VE2 和 PGN5:
阿罗阿F: 全球加理事会AAAAGC
阿罗阿R: ATCTGGCTCGGATGCCGCC
- 验证步骤:使用同一菌群的残留物,使用PCR和应变特异性引物和/或引物验证菌株是否存在基因修饰。使用下面的引注验证所呈现的示例中的菌株:
- 在160 rpm和37°C的摇动培养箱中孵育培养物,直到它们达到对数相生长(即,在分光光度计上进行 0.4-0.6 的 OD600测量)。
- 使用达到对数阶段时获得的 OD600值,计算每 mL 产生 2.5 x 109菌群形成单元 (CFU) 所需的肉汤量。在 50 mL 管中以 4,500 x g计算的肉汤体积 10 分钟。
- 丢弃上清液,用 50 mL 的 1x PBS 将颗粒重新悬浮在一管中,以洗涤细胞。在 4,500 x g下再次离心 10 分钟。
- 丢弃上清液,在 1x PBS 中重新悬浮在 25 mL 的 5% 脱脂牛奶中。
- 验证步骤:使用 25 mL 重悬浮的样本执行可行的板计数,以确定 CFU/mL 的数量。
- 在 2 mL 冷冻液中,将 25 mL 脱脂牛奶培养剂重新悬浮到 2 mL 培养液中。在液氮中闪冻,并在使用前至少一夜之间储存在-80°C。
9. 用于动物试验的储存量和应变的验证。
- 对于要测试的每个菌株,从-80°C储存中去除至少3个冷冻液,并在4°C下解冻2-4小时。如果任何冷冻库存仍然存在,在 37 °C 时短暂加热。
- 从每个冷冻液中抽取小样本,以验证每个菌株。
- 执行可行的板计数以确定 CFU/mL 的数量。由于一些细菌细胞死亡,冷冻后CFU/mL较少是正常的。
- 使用 PCR 和应变特异性底漆验证每种菌株。
- 将每个应变压到选择性介质上以验证表型。
- 确认菌株为正确基因型和表型,并验证CFU/mL后,进行动物试验。
10. 注射用细菌菌株接种动物
- 在注射的早晨,去除被检测的细菌菌株的冷冻,并在4°C下解冻3-4小时。每只将注射的小鼠解冻0.5 mL。解冻后将小瓶放在冰上,并在2小时内注射小鼠。
- 解冻后,将每个冷冻液转移到新的2 mL管中,以4,500 x g离心10分钟,丢弃上清液,并在1x PBS的1 mL中重新悬浮细胞颗粒。
- 再次在4,500 x g下离心10m.丢弃上清液,并在1xPBS中重新悬浮颗粒,最终浓度为2.5 x 109 CFU/mL。要确定重新悬浮所需的 1x PBS 量,请使用步骤 2.2.1 中从冷冻库存的可行板计数中获得的 CFU/mL 数据。使用 1x PBS 的确切量在菌株之间会略有不同。
- 从每个菌株的最终悬浮液中抽取3个样本,以验证CFU/mL、基因型和表型,如上所述。
- 对于每株,将1.5 mL的PBS/细胞悬浮液等量放入每5只小鼠的2 mL管中,以限制进入该管的次数。此外,准备1x PBS管进行控制注射。
- 收集小鼠(本实验每组10只雄性和10只雌性C57BL/6)和注射所需的材料(注射器、针头、尖刀容器、记号笔和纸张等)。搬到无菌动物手术室用消毒抹布擦拭所有表面。
- 为了消除实验者的痛苦和受伤风险,一次只带一组小鼠和实验组小鼠到手术室(例如,一组10只雄性小鼠感染了某种菌株)。戴两副乳胶手套,如果被咬伤,可消除手套的穿刺。佩戴实验室外套、安全眼镜和面罩,以免受到污染。
- 使用 1x PBS 开始注射对照组。这将确定是否任何不利影响是由单独注射造成的。
- 从笼子中取出鼠标。一次只删除一个鼠标。
- 称量鼠标,用永久标记标记其尾巴,以跟踪注射后减肥情况。
- 打开新的 1 mL 注射器和 27 G 针头(为每只小鼠使用新的注射器和针头以消除污染),然后注射 200 μL 无菌 1x PBS。
- 用拇指和食指抓住耳朵后面。捏在颈部的褶皱处形成皮肤褶皱,以固定 - 更紧密的褶皱可减少颈部运动,并在注射过程中被咬伤的风险。用小号将尾巴固定到手掌中,以在几乎没有运动时将鼠标平放。
- 将鼠标翻过来,以 30° 角将针头插入中线的左侧或右侧的围套。插入后稍微抬起针头,以确保针头插入腹内区域,而不是插入器官。缓慢地注射PBS,然后拔下针头。
- 将用过的针头放入指定的生物危害锐化容器中。请勿重复使用注射器或针头。注射部位的喷剂是典型的。
- 注射后,将鼠标移到单独的笼子。
- 使用下一个鼠标重复此过程。注射了一个笼子的所有小鼠后,立即将它们返回到原来的笼子。
- 注射对照组后,开始注射菌株悬浮液,按照相同的程序进行测试。
- 注射200μL的细胞悬浮液。当开始于 2.5 x 109 CFU/mL 的电池悬浮液时,每只鼠标接收 5 x 108 CFU。
注:这些浓度通过初步动物研究进行了优化,以确定每种菌株的致命剂量。其他菌株/品种可能需要调整给给的用。
- 注射200μL的细胞悬浮液。当开始于 2.5 x 109 CFU/mL 的电池悬浮液时,每只鼠标接收 5 x 108 CFU。
- 一旦所有注射完成,将小鼠送回住房室以减轻痛苦。用消毒湿巾清洁工作区。
- 通过每3小时检查72小时和10天每12小时检查死老鼠的笼子,监测注射后动物的死亡率。每12小时记录老鼠的体重,以确定因病而减肥。
- 在注射后几小时内记录不良行为,如姿势不同、缺乏梳理或挖洞、不动或呼吸变化。因注射而死亡的小鼠将表现出不良行为,并在注射后迅速死亡。另一方面,因感染而死亡的小鼠直到18小时后才会开始出现不良行为或死亡。任何确实表现出不良行为或广泛发病迹象的小鼠,包括快速或劳累的呼吸、不动、驼背姿势、凹陷的眼睛、严重脱水或其他,应实施安乐死,以减少不必要的痛苦(符合我们的要求)批准的 IACUC 协议)。然而,在我们的实验中,实验期间不需要任何小鼠使用安乐死。存活的小鼠在完成试验10天后被安乐死。
- 在10天的监测期后,让剩余的动物完全恢复,并清除在测试期间施用的任何感染。按照IACUC程序对动物实施安乐死。
11. 动物死亡率统计分析
- 使用绘图软件执行统计分析。任何能够生成图形和执行统计分析的软件都是合适的。
- 要绘制死亡率数据,请使用 X 列表示时间 (h) 和 Y 列来表示测试的组。
- 使用代码 = 0(零)或代码 = 1 表示研究中的每只鼠标或主题,分别表示生存或死亡。
- 对于每只死亡的动物,在死亡时在X列上将1放在该组的Y列中。如果组中的单个时间点有多个死亡,则可以将该时间点的副本放在 X 列中。例如,如果组中的三个主体在 3 小时时死亡,则 3 小时时间点将在 X 列中出现三次。
- 对于组内所有幸存的动物,在测量的最后一个时间点处 Y 列中放置零。例如,如果四个小鼠存活下来,在 X 列中放置四个结束时间点,在 Y 列中标有四个零。
- 为所有组输入动物数据后,使用生存图模板生成生存图。
- 将默认编码保留为 0 和 1。
- 将图形的参数设置为百分比。
- 选择生存曲线的参数后,使用曼特尔-考克斯(日志排名)测试执行统计分析。
- 使用统计数据格式化卡普兰-迈尔绘图。
注:表现出低于或等于母菌株和FDA批准的菌株(如大肠杆菌BL21)的菌株可被视为衰减。
12. 生物发光感染的可视化
- 为了可视化感染的进展,在PGN5和VE2菌株测试中插入染色体生物发光操作子(luxCDABE)。用于标记这些菌株的质粒和方案是在施魏策尔实验室开发的,可能与所有种类/菌株13不兼容。重要的是,感染的可视化是可选的;因此,这种操作本的基因组插入是执行上述死亡率研究所必需的。
- 使用上述方法准备和验证菌株。此外,在每个验证步骤中检查标记菌株中的生物发光。
- 制备菌株后,按照上述步骤将动物以生物发光菌株分给10组动物注射。
- 使用能够生物发光的动物成像系统,每 3 小时对动物进行 24 小时成像。
- 首先,通过设置摄像机参数并为动物加热舞台来准备成像器。还将氧气流量设置为每分钟 1.5 升(或按照制造商的建议)。
- 在成像器和阶段稳定后,在注射后立即将一只小鼠放入麻醉室,并在O2流中将3.5%的子胶注射到腔室中约4分钟。麻醉方法可能因使用的腔室和/或麻醉剂而异;遵循制造商的建议。通过戒断反射测试确定适当的麻醉。
- 将鼠标移到温度稳定阶段。将鼠标放在其背上,伸出手臂,用鼻锥将鼠标放入,在整个成像过程中为小鼠进行 2.5% 的配子糖的管用。
- 关上门,拍摄生物发光图像和鼠标X光片。
- 完成成像后,将鼠标返回到笼子并监控它。鼠标应在3-5分钟内恢复知觉。
- 继续每 3 小时对鼠标进行 24 小时成像,每次使用每个组不同的鼠标。不要在24小时内重新成像鼠标,因为可能由于重新暴露于麻醉中产生不利影响。每只鼠标每24-36小时只接受一剂麻醉。在成像时间点之间关闭成像器。
注:无论注射的菌株如何,生物发光都会消退。生物发光的强度和寿命会因许多因素而异,包括注射的细菌数量、小鼠菌株、细菌菌株等。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
如图2所示,靶向基因组删除可以用具有特定引能的菌群PCR来确认,从而放大感兴趣的区域。与野生型菌落相比,携带基因组删除的菌落将产生较短的PCR波段大小。10-12个菌落的PCR屏幕通常足以检测至少一个带有目标删除的菌群。如果多次屏幕后未检测到删除操作,请从合并开始重复该过程。如果删除仍然失败,质粒插入可能需要通过测序确认,重新设计,或删除可能是致命的。通过PCR验证基因删除后,通过测序确认删除。由此产生的菌株可能反复接受程序,以产生顺序基因组修饰。
如图3所示,与P.aeruginosa PGN5(+mucE)减毒菌株的腹内注射相关的死亡率为0%,相当于大肠杆菌BL21观察到的死亡率。另一方面,母性菌株(VE2)的腹内注射对80%的小鼠是致命的。这些结果通过广泛的步骤得到验证注射的菌株。虽然这些小鼠的确切死因不明,但至少部分归因于从衰减的PGN5菌株中删除的母菌株中的毒力因子的表达。使用标有生物致发光标记的父菌株和衰减菌株跟踪感染进展的差异。衰减应变在注射部位保持局部,直到生物发光消退(图4)。感染的清除很可能与生物发光的消退同时发生。注射后24小时未检测到生物发光,小鼠在注射后生存数周直至牺牲,未观察到不良反应。
图1:使用pEX100T-NotI在P.aeruginosa中生成基因缺失。(A) pEX100T-NotI 质粒的映射.(B) 生成由感兴趣区域(ROI)的上游(黄色)和下游(蓝色)区域组成的构造,两侧为NotI限制酶识别位点。首先,PCR-放大上游和下游区域独立与特定的引物,添加5'NotI消化位(例如,NotI-aroA F CGCGGCGCTGAAGCTCTCTCTATAGGGGGCTCT和NotIRGCGGGGGGGGGGGGGGCTT.和3'重叠同源区,如所示。 aroA- 交叉 F CTCCAGGCGGGGGGGGGGGGGGGGGCACGCCGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGAGAA 和aroA交叉 RTGTTCTCCACCGCGGGGGGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCGCCCGCGGGAG。然后,使用含有NotI的引基器将PCR与第一次PCR反应中生成的上游和下游产品联接在一起。(C) pEX100T-NotI 质粒,武装并准备就绪。将 NotI 消化的交叉 PCR 产品放入 NotI 消化质粒中。(D) 使用 pEX100T-NotI 质粒从P. aeruginosa染色体中删除基因组区域的过程的流程图。在确认并纯化所需的缺失后,可以通过重复程序从染色体中删除其他基因组区域来进行产生的菌株。当获得所需的菌株时,对整个基因组进行测序,以确认染色体的缺失和其他变化。然后,可以使用《议定书》第二部分概述的程序在小鼠身上测试该菌株的致病性。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:从电离器缺失的屏幕中产生带菌PCR产物的凝胶电泳,以产生衰减的P.aeruginosa菌株PGN5。殖民地PCR产品运行在车道2-5和8-11表示殖民地与野生型阿罗阿。在通道 6 和 7 上运行的殖民地 PCR 产品携带aaroA基因删除,由较小的 PCR 产品(黄色星号)指示。特别使用的引物扩增了包含aroA基因的基因组区域:aroA-F:GCGAACGCCGCCGATAAAGC,aroA-R:ATCTGGGCGATGCCGGGCGGCCC。 野生型菌落的预期PCR产品尺寸为2,548核苷酸(nt)。在具有 aroA删除的菌落中,预期 PCR 产品尺寸为 307 nt。DNA梯子在1号车道和12号车道上运行。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:注射致病性P.aeruginosa菌株(VE2)、衰减的P.aeruginosa菌株(PGN5_mucE)和FDA控制大肠杆菌菌株(BL21)的小鼠总体死亡率。只有注射致病性母性菌株的小鼠的死亡率为80%。衰减的Aeruginosa菌株和FDA控制大肠杆菌菌株表现出0%的死亡率。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:小鼠3小时注射后携带生物发光标记物的P.aeruginosa PGN5_mucE衰减菌株的图像。生物发光细菌在注射后18-24小时前可检测到。在此期间,生物发光仍留在注射部位,表明细菌保持局部化到注射部位。这种鼠标完全恢复,没有副作用。请点击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
pEX100T-Not1 质粒是无标记和框架内连续基因组缺失的有效中介。当工程细菌菌株衰减毒性时,删除整个基因序列,而不是产生点突变,会减少回归到毒性表型的可能性。此外,每个致病基因缺失可进一步减轻病原体,增强衰减的稳定性。
此方法还可用于生成除了删除以外的基因组修饰,如点突变和插入,只需修改质粒插入的设计。例如,这些类型的修饰可能比整个基因删除对具有修饰代谢的工程细菌更有用。顺序基因组修饰具有产生设计细菌菌株的巨大潜力,以满足研究和工业中的特定用途。其他在细菌中产生所需的无标记基因组修饰的方法已经描述15,16,17,18。与所有基因组编辑方法一样,尝试修改基本基因组区域可能是致命的,因此不成功。在这些情况下,需要识别不同的基因修饰或其他候选基因才能产生感兴趣的细菌菌株。
鉴于整个协议中每个菌落的复制事件和通道,基因组的意外变化将发生对产生的菌株。确切的基因组变化可以通过全基因组测序来识别。但是,这些更改的影响很难确定。当为特定目的工程细菌时,不会对生物体或靶向途径的生长产生负面影响的基因组变化是可以容忍的。根据产生的应变,可以确定"读出",以确保应变仍可用于其预期用途。例如,使用 PGN5 时,目标是创建衰减应变,以保留产生大量藻酸盐的能力。在删除5个致病性基因后,测定PGN5产生的藻酸盐的量和组成与其他产华藻菌株相当。因此,藻酸盐的产生不受五个基因缺失的影响,也不受PGN5开发过程中发生的意外基因组变化的影响。
使用腹内小鼠注射模型来确定与母菌株和大肠杆菌BL21相比,工程菌株是否衰减,而大肠杆菌BL21是FDA批准用于生产生物制药的菌株。在动物试验过程中采取的最重要步骤是制备和验证冷冻细菌储存。制备和使用冷冻细菌培养物注射小鼠比使用连续培养更可取,因为它减少了细菌种群中自然发生的突变数量19。此外,冷冻文化应维持多年。可行的板块计数显示,CFU/mL在准备库存后和准备后三个月内直接存在显著差异。在整个过程中使用多个验证步骤可确保该方法可重现,并且结果不会因污染细菌而扭曲。此外,由于采取了许多预防措施来确保可重复性,需要的动物更少。使用FDA批准用于生物制药生产的细菌菌株作为控制(如大肠杆菌菌株BL21),这种方法可用于测试其他基因工程菌株P.aeruginosa或其他种类的细菌的衰减。
使用生物发光作为标记,可额外验证注入的细菌菌株,因为标记可以在注射部位可视化。生物发光标记插入细菌染色体是生物发光成像所必需的,但如果使用不相容的菌株/物种,则可能无法插入。然而,用生物发光标记菌株不需要测试衰减。本研究中测试的菌株被标记为生物发光,这使得在整个感染过程中菌株之间的定位差异得以可视化。我们观察到,致病菌株通过小鼠体内传播,但非致病菌株仍留在注射部位。虽然这个实验只测试了两个非常密切相关的P.aeruginosa菌株,但它表明细菌传播与毒性有关,至少在P.aeruginosa中是这样。因此,这种用生物发光标记以可视化感染进展的过程,将来可用于快速评估工程菌株的衰减。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者余红卫是Pro创世科技有限公司的首席科学官和联合创始人。
Acknowledgments
这项工作得到了国家卫生研究院(NIH)授予R44GM113545和P20GM103434的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.2 mL tubes with flat caps | ThermoScientific | AB-0620 | via Fisher Scientific |
1 mL Syringe | BD | 22-253-260 | via Fisher Scientific |
1.5 mL disposable polystyrene cuvette | Fisher Scientific | 14955127 | |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
27G needle | BD | 14-821-13B | via Fisher Scientific |
50 mL tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
Benchtop Centrifuge 5804R | Eppendorf | 04-987-372 | via Fisher Scientific |
Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
Carbenicillin disodium salt | Fisher Scientific | BP2648250 | |
Culture Test Tube, Polystyrene | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
Dneasy UltraClean Microbial Kit (50) | Qiagen | 12224-50 | or preferred method/vendor |
E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50) | Omega bio-tek | D6493-01 | or preferred method/vendor |
EcoRI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3101L | |
Electroporation Cuvettes | Bulldog Bio | NC0492929 | via Fisher Scientific |
FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
GoTaq G2 Colorless Master Mix | Promega | M7833 | via Fisher Scientific |
Isothesia Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System | Perkins and Elmer | CLS136340 | |
Kanamycin monosulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | |
Noble agar, ultrapure | Affymetris/USB | AAJ10907A1 | via Fisher Scientific |
NotI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3189 | |
One Shot TOP10 Electrocomp E. coli | Invitrogen | C404052 | via Fisher Scientific |
Phosphate buffered saline powder | Sigma | P3813-10PAK | Sigma-Aldrich |
Prism 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
Pseudomonas isolation broth | Alpha Biosciences | P16-115 | Custom made batch |
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A24811 | |
Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
Toothpicks, round | Diamond | Any brand of toothpicks, autoclaved | |
TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing | Invitrogen | 45-0030 | |
XAF-8 Anesthesia System Filters | Perkins and Elmer | 118999 | |
XGI 8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/Xenogen |
References
- Gellatly, S. L., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).
- Valentine, M. E., et al. Generation of a highly attenuated strain of Pseudomonas aeruginosa for commercial production of alginate. Microbial Biotechnology. , (2019).
- Schweizer, H. P., Hoang, T. T. An improved system for gene replacement and xylE fusion analysis in Pseudomonas aeruginosa. Gene. 158 (1), 15-22 (1995).
- Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis. Journal of Bacteriology. 191 (7), 2285-2295 (2009).
- Yu, H., Boucher, J. C., Hibler, N. S., Deretic, V. Virulence properties of Pseudomonas aeruginosa lacking the extreme-stress sigma factor AlgU (sigmaE). Infection and Immunity. 64 (7), 2774-2781 (1996).
- Baeshen, M. N., et al. Production of Biopharmaceuticals in E. coli: Current Scenario and Future Perspectives. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (7), 953-962 (2015).
- Marisch, K., Bayer, K., Cserjan-Puschmann, M., Luchner, M., Striedner, G. Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during high-level SOD protein production. Microbial Cell Factories. 12, 58 (2013).
- Ferrer-Miralles, N., Domingo-Espin, J., Corchero, J. L., Vazquez, E., Villaverde, A. Microbial factories for recombinant pharmaceuticals. Microbial Cell Factories. 8, 17 (2009).
- Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 8 (5), 528-535 (1990).
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Figurski, D. H., Helinski, D. R. Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (4), 1648-1652 (1979).
- Choi, K. H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nature Protocols. 1 (1), 153-161 (2006).
- Choi, K. H., Kumar, A., Schweizer, H. P. A 10-min method for preparation of highly electrocompetent Pseudomonas aeruginosa cells: application for DNA fragment transfer between chromosomes and plasmid transformation. Journal of Microbiological Methods. 64 (3), 391-397 (2006).
- Liang, R., Liu, J. Scarless and sequential gene modification in Pseudomonas using PCR product flanked by short homology regions. BMC Microbiology. 10, 209 (2010).
- Martinez-Garcia, E., de Lorenzo, V. Engineering multiple genomic deletions in Gram-negative bacteria: analysis of the multi-resistant antibiotic profile of Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 13 (10), 2702-2716 (2011).
- Song, C. W., Lee, S. Y. Rapid one-step inactivation of single or multiple genes in Escherichia coli. Biotechnology Journal. 8 (7), 776-784 (2013).
- Yan, M. Y., et al.
CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering in Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 83 (17), (2017). - Prakash, O., Nimonkar, Y., Shouche, Y. S. Practice and prospects of microbial preservation. FEMS Microbiology Letters. 339 (1), 1-9 (2013).