Generatie van in-frame Gendeletie mutanten in Pseudomonas aeruginosa en testen op virulentie demping in een eenvoudig muis model van infectie

Summary

Hier beschrijven we een eenvoudig en reproduceerbaar Protocol van muismodel van infectie om de verzwakking van de genetisch gemodificeerde stammen van Pseudomonas aeruginosa te evalueren in vergelijking met de Amerikaanse Food and Drug ADMINISTRATION (FDA)-goedgekeurde Escherichia coli voor commerciële toepassingen.

Abstract

Micro-organismen zijn genetisch veelzijdig en divers en zijn uitgegroeid tot een belangrijke bron van vele commerciële producten en Biopharmaceuticals. Hoewel sommige van deze producten natuurlijk worden geproduceerd door de organismen, vereisen andere producten genetische manipulatie van het organisme om de productie opbrengsten te verhogen. Avirulente stammen van Escherichia coli zijn van oudsher de voorkeur bacteriesoorten voor de productie van Biopharmaceuticals; echter, sommige producten zijn moeilijk voor E. coli te produceren. Zo kunnen Avirulente stammen van andere bacteriesoorten nuttige alternatieven bieden voor de productie van sommige commerciële producten. Pseudomonas aeruginosa is een veel voorkomende en goed bestudeerde gram-negatieve bacterie die een geschikt alternatief voor E. colizou kunnen bieden. Echter, P. aeruginosa is een opportunistisch humaan pathogeen. Hier, we gedetailleerd een procedure die kan worden gebruikt voor het genereren van niet-pathogene stammen van P. aeruginosa door sequentiële genomische verwijderingen met behulp van de PEX100T-noti plasmide. Het belangrijkste voordeel van deze methode is om een marker-vrije stam te produceren. Deze methode kan worden gebruikt voor het genereren van sterk verzwakte P. aeruginosa stammen voor de productie van commerciële producten, of voor het ontwerpen van stammen voor andere specifieke toepassingen. We beschrijven ook een eenvoudig en reproduceerbaar muismodel van bacteriële systemische infectie via intraperitoneale injectie van gevalideerde test stammen om de verzwakking van de genetisch gemanipuleerde stam te testen in vergelijking met de door de FDA goedgekeurde BL21 stam van E. coli.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa is een opportunistisch bacteriële pathogeen dat levensbedreigende ziekten bij de mens kan veroorzaken, vooral in de immuungecompromitteerde. De pathogeniteit van P. aeruginosa is te wijten aan de expressie van vele virulentie factoren, waaronder proteasen en lipopolysaccharide, evenals het vermogen om een beschermende biofilm¹te vormen. Vanwege zijn vermogen om virulentie factoren te produceren en ziekte bij de mens veroorzaken, het gebruik van P. aeruginosa om commerciële producten te maken geeft veiligheidsproblemen. Niet-pathogene stammen van E. coli zijn van oudsher gebruikt om bio-ingenieur medische en commerciële producten voor menselijk gebruik. Echter, sommige producten zijn moeilijk voor E. coli te maken, en velen zijn verpakt in inclusie organen, waardoor extractie bewerkelijk. Ontwikkelde bacteriële stammen met de mogelijkheid om te maken en afscheiden van specifieke producten is zeer wenselijk, als afscheiding zou waarschijnlijk verhogen opbrengst en vergemakkelijken zuiveringsprocessen. Zo kunnen niet-pathogene stammen van andere soorten bacteriën (bijv. soorten die meer secretie trajecten gebruiken) nuttige alternatieven bieden voor e. coli. Onlangs rapporteerden we de ontwikkeling van een stam van P. aeruginosa, PGN5, waarbij de pathogeniteit en de toxiciteit van het organisme sterk verzwakte². Belangrijk is dat deze stam nog steeds grote hoeveelheden van de polysaccharide alginaat produceert, een commercieel interessant onderdeel van de P. aeruginosa biofilm.

De PGN5 stam werd gegenereerd met behulp van een twee-stappen allel uitwisseling procedure met de pEX100T-noti plasmide om opeenvolgend verwijderen van vijf genen (Toxa, Plch, phzm, wapr, aroA) bekend om bij te dragen aan de pathogeniteit van het organisme. pEX100T-noti werd gegenereerd door de smai te veranderen in een noti restrictie enzym herkennings locatie binnen de meervoudige kloon site van de plasmide pEX100T, die werd ontwikkeld in het laboratorium van Herbert Schweizer^3,4. De herkennings locatie voor het beperkings enzym NotI is een zeldzamer DNA-sequentie vergeleken met SmaI en is minder waarschijnlijk aanwezig in sequenties die gekloond worden, dus het is handiger voor kloon doeleinden. Het plasmide draagt genen die het mogelijk maken om te selecteren, met inbegrip van het bla -gen, dat ß-lactamase codeert en resistentie verleent aan carbenicillin, en het b. subtilissacB -gen, dat de gevoeligheid voor sucrose toekent (Figuur 1A). Het plasmide heeft ook een oorsprong van replicatie (ori) compatibel met E. coli, en een oorsprong van overdracht (orit) die het mogelijk maakt voor plasmide overdracht van E. coli naar Pseudomonas soorten via conjugatie. Echter, het plasmide mist een oorsprong van replicatie verenigbaar met Pseudomonas, en dus kan niet repliceren binnen Pseudomonas soorten (dat wil zeggen, het is een Pseudomonas Suicide vector). Deze kenmerken maken pEX100T-NotI ideaal voor het targeten van genetische verwijderingen van het Pseudomonas -chromosoom. Plasmide klonen stappen worden uitgevoerd met behulp van E. coli en de resulterende plasmide wordt overgebracht naar Pseudomonas door transformatie of conjugatie. Vervolgens wordt, via homologeuze recombinatie gebeurtenissen en selectieve stappen, de beoogde verwijdering in het frame gegenereerd, vrij van markeringen. Deze methode voor het sequentieel verwijderen van genomische gebieden uit het chromosoom van P. aeruginosa kan worden gebruikt voor het genereren van sterk verzwakte Pseudomonas stammen, zoals PGN5, of voor het ontwerpen van stammen voor andere specifieke toepassingen (bijv. stammen tekort aan enzym voor plasmide vermeerdering of stammen tekort aan proteasen voor de productie van eiwitten van belang).

De algehele virulentie van bacteriestammen wordt beïnvloed door groeiomstandigheden en-fasen, waarbij mutaties vaak voorkomen. Daarom kan het meten van de veiligheid van genetisch gemanipuleerde stammen een uitdaging zijn. Om bacteriële isolaten te evalueren voor systemische virulentie, hebben we een eerder gepubliceerd Protocol van infectie aangepast door intraperitoneale injectie van C57BL/6 muizen⁵. We hebben deze procedure gewijzigd om bevroren bacteriële voorraden voor injectie te gebruiken, wat een precieze dosering en eenvoudige validering van de gebruikte stammen toestaat. In dit model, de E. coli stam BL21, die is goedgekeurd door de FDA voor de productie van Biopharmaceuticals, werd gebruikt als een controle veiligheidsstandaard voor het bepalen van de relatieve pathogenese van de stam^6,7,8. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van deze methode is dat het reproduceerbaar is en minimaliseert bronnen van variatie, als infecterende stammen worden gevalideerd voor bacteriële cel nummer, fenotype, en genetische markers zowel voor als na infectie. Met deze gecontroleerde stappen wordt het aantal benodigde dieren verlaagd. In dit model, P. aeruginosa stammen die resulteren in C57BL/6 Murine sterftecijfers gelijk aan of minder dan E. coli BL21 wanneer geïnjecteerd intraperitoneaal kan worden beschouwd als verzwakte. Dit eenvoudige muismodel van infectie kan ook worden gebruikt om de verzwakte pathogeniteit van genetisch gemanipuleerde stammen van andere soorten te beoordelen met behulp van de door de FDA goedgekeurde E. coli -stam als referentie. Stappen 1-7 detail het genereren van sequentiële genomische verwijderingen in p. aeruginosa (Figuur 1) en stappen 8-12 detail het gebruik van een muismodel om de pathogeniteit van p. aeruginosa stammen te testen.

Protocol

Vóór het begin van de dierproeven moet het te gebruiken protocol worden goedgekeurd door het Comité voor dierenverzorging en-gebruik (IACUC). De goedkeuring van het beschreven protocol werd verkregen via de IACUC aan de Marshall University (Huntington, WV, VS).

1. plasmide ontwerp

1. Voor het genereren van een genetische deletie met behulp van de pEX100T-NotI plasmide, kloon de gebieden van het DNA flaneren van de gewenste verwijdering sequentie en invoegen in de NotI restrictie plaats van de plasmide. De plasmide insert moet bevatten ongeveer 500 nucleotiden stroomopwaarts van de doel sequentie direct grenzend aan ongeveer 500 nucleotiden stroomafwaarts van de doel verwijdering sequentie. Bovendien moet de insert de NotI-herkennings volgorde (GCGGCCGC) op de 5 ' en 3 ' uiteinden bevatten (Figuur 1B).

2. voorbereiding van plasmide

1. Optie 1: gebruik traditionele kloon procedures. Gebruik PCR om genomische gebieden stroomopwaarts en stroomafwaarts van het gen van belang te versterken, gevolgd door crossover PCR^9,10 om deel te nemen aan de gegenereerde fragmenten, restrictie-endonuclease vertering van het PCR-product en plasmide, en ligatie¹¹ (Figuur 1B, C).
2. Optie 2: na het ontwerpen van de verwijderings sequentie in silico, contracteren een bedrijf dat de Novo het synthetiseert om in te voegen in de plasmide pEX100T-NotI. Veel bedrijven hebben het proces van klonen gestroomlijnd om snel en efficiënt de belangstelling van het plasmide te genereren. Bovendien controleren sequentie de plasmiden om mutatie vrij te zijn voordat ze worden geleverd.

3. E. coli transformatie

1. Transformeer elektrocompetente E. coli met het plasmide volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Met behulp van een steriele inoculerende lus, streak 10 μL van de transformatie reactie voor geïsoleerde kolonies op een voorverwarmde Luria Bouillon (LB) agar-plaat aangevuld met 100 μg/mL carbenicilineen en incuberen 's nachts bij 37 ° c.
   Opmerking: alle apparatuur en media die worden gebruikt om bacteriën te kweken, moeten worden behandeld volgens de veiligheidsrichtlijnen van de instelling.
2. Passage twee keer.
   1. Verwijder de plaat uit de incubator en Identificeer een geïsoleerde kolonie. Met behulp van een steriele inoculerende lus, pick-up van de kolonie en streak een pre-warmed LB agar plaat aangevuld met 100 μg/mL van carbenicilinin voor geïsoleerde kolonies. Inincuberen 's nachts bij 37 °C. Herhaal deze stap nogmaals om een zuivere cultuur te genereren.
3. Gebruik een steriele inoculerende lus, inoculeren 5 mL LB met een enkele kolonie uit de uiteindelijke agar-plaat. Plaats de cultuur in een schud incubator bij 37 °C 's nachts. De volgende dag, meng 1 mL van deze cultuur met 1 mL van 5% in een cryovial en bewaar bij-80 °C om een bevroren voorraad van de stam te genereren.

4. voorbereiding van bacteriële stam en Triparentale conjugatie

1. Gebruik één geïsoleerde kolonie van de agar-platen van de volgende stammen om de Bouillon culturen te inoculeren en plaats in een schud incubator 's nachts bij 37 °C.
   1. Voeg E. coli PEX100T-noti toe in 5 ml lb aangevuld met 100 μg/ml carbenicilinin.
   2. Voeg P. aeruginosa stam PAO1 toe aan 5 ml Pseudomonas isolatie Bouillon (PIB).
   3. Voeg E. coli prk2013 toe aan 5 ml lb aangevuld met 50 μg/ml kanamycine.
      Opmerking: de prk2013 plasmide is een helper plasmide die repliceert in E. coli , maar niet P. aeruginosa; het draagt de trans-werkende overdracht genen die de pEX100T-NotI plasmide te mobiliseren van de E. coli donor aan de P. aeruginosa ontvanger¹². P. aeruginosa is een bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2) pathogeen. Volg de richtlijnen van de instelling voor veiligheid bij het werken met BSL-2-organismen.
2. De volgende dag, verwijder nachtelijke culturen uit de incubator en Voeg 0,5 mL van elke cultuur toe aan een 1,5 mL micro centrifugebuis. Centrifugeer bij 6.000 x g gedurende 5 min. Gooi de supernatant weg en onderbreek de celpellet in 50-100 μL lb.
3. Pipetteer de volledige celsuspensie in één druppel op een voorverwarmde LB agar-plaat. Laat de druppel drogen. Keer vervolgens de plaat om en inincuberen bij 37 °C gedurende 4-6 uur.
4. Na de incubatie, gebruik een steriele inoculatie loop om de cellen in 1 mL LB in een micro centrifugebuis te verzamelen. Pipetteer omhoog en omlaag om de cellen te mengen.
5. Met behulp van een cel spreider, streak cellen gelijkmatig op een droge pre-warmed Pseudomonas Isolation agar (PIA) plaat aangevuld met 300 μg/ml van carbenicilinaan. Streak meerdere platen met toenemende volumes van het celmengsel (bijv. 10 μL, 100 μL, 500 μL). Inincuberen 's nachts bij 37 °C.

5. detectie van single-crossover pokken van P. aeruginosa

1. Verwijder platen uit de incubator en Inspecteer voor geïsoleerde carbenicillaire-resistente kolonies. Omdat de pEX100T-NotI plasmide niet kan repliceren in P. aeruginosa, zouden kolonies die groeiden op carbenicillin-aangevuld platen moeten zijn voortgekomen uit cellen waarin het plasmide in het chromosoom werd geïntegreerd.
   1. Kies ten minste 4 van deze kolonies en streak voor isolatie op pre-warmed platen van PIA aangevuld met 300 μg/mL van carbenicileen. Incuberen de platen 's nachts bij 37 °C.
2. Verwijder de platen uit de incubator en Inspecteer de groei. Carbenicillinresistente kolonies moeten single-crossover pokken zijn (d.w.z., ze hebben het plasmide in het chromosoom opgenomen via een recombinatie gebeurtenis tussen een homologe regio van het plasmide INSERT en het chromosoom van P. aeruginosa).
   1. Patch 8 of meer kolonies met steriele tanden stokjes op voorverwarmde platen van: 1) PIA aangevuld met 300 μg/mL carbenicileen en 2) PIA aangevuld met 300 μg/mL carbenicileen en 10% sucrose (zonder glycerol).
   2. Als er geen kolonie groei werd verkregen uit stap 5,1, herhaalt u de conjugatie en verhoogt u het volume van het celmengsel in stap 4,5. Als er te veel groei is opgetreden, herhaalt u de conjugatie en verlaagt u het volume.
   3. Als de conjugatie herhaaldelijk faalt, bereiden elektrocompetente cellen van de P. aeruginosa stam en transformeren rechtstreeks met de PEX100T-noti plasmide. Gedetailleerde protocollen voor de bereiding van elektrocompetente P. aeruginosa en transformatie zijn beschikbaar elders^13,14.
3. Incuberen de platen bij 37 °C 's nachts.
4. Verwijder platen uit de incubator en Inspecteer op groei. Echte single-crossover pokken zal carbenicillaire-resistente en sucrose-gevoelige (dat wil zeggen, kolonies die groeide op PIA aangevuld met carbenicillin, maar niet groeien op PIA aangevuld met carbenicillin en sucrose).
   1. Kies 4 of meer echte single-crossover pokken en beënten elk in 5 ml lb zonder selectie. Incuberen in een schud incubator bij 37 °C 's nachts.
   2. Als er geen single-crossover pokken zijn gedetecteerd, herhaalt u de conjugatie.

6. detectie van dubbele crossover pokken van P. aeruginosa

1. Inoculeren voor elke Bouillon cultuur 10 μL cultuur op een voorverwarmde plaat van PIA, aangevuld met 10% sucrose (zonder glycerol) en streep voor geïsoleerde kolonies. Incuberen de platen 's nachts bij 37 °C.
2. De volgende dag, verwijder de platen uit de incubator en Inspecteer ze op groei. Sucrose-resistente kolonies moeten dubbel-crossover pokken zijn (d.w.z. hebben het plasmide van het chromosoom verwijderd via een recombinatie gebeurtenis tussen de andere homologe regio van het plasmide INSERT en het P. aeruginosa -chromosoom).
   1. Pleister ten minste 20 kolonies met steriele tandenstoker op voorverwarmde platen van: 1) PIA, 2) PIA aangevuld met 10% sucrose (zonder glycerol), en 3) PIA aangevuld met 300 μg/mL carbeniciline.
3. Incuberen de platen 's nachts bij 37 °C.
4. Verwijder de platen uit de incubator en onderzoek ze op groei. Echte Double-crossover pokken zal carbenicillaire-gevoelige en sucrose-resistente (dat wil zeggen, kolonies die groeide op PIA en PIA aangevuld met sucrose, maar niet groeien op PIA aangevuld met carbenicilin).

7. bevestiging van gendeletie via Colony PCR

1. Bereid 10-20 kolonies voor op een verwijderings scherm met PCR.
   1. Haal de groei op van een vermoedelijke dubbelkruisende recombinant met een steriele tandenstoker en onderbreek cellen in 50 μL 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Kook suspensie bij 100 °C gedurende 10 minuten, Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 13.000 x gen plaats vervolgens op ijs.
2. Voer PCR uit voor scherm kolonies voor de beoogde verwijdering.
   1. Gebruik 1 μL van het supernatant als sjabloon in een PCR-reactie van 25 μL om de verwijdering van het gen van belang te bevestigen.
   2. Gebruik genspecifieke primers die de regio van de genomische deletie versterken. Gebruik primers die de regio van de genomische deletie plus 100-200 BP van flankerende stroomopwaarts en downstream sequenties versterken.
   3. Bereid een afzonderlijke controle-PCR-reactie met de ouderstam (bijv. PAO1).
      Opmerking: Thermocycler-condities zullen variëren afhankelijk van de optimale gloeien temperatuur voor primer paren, de polymerase cocktail gebruikt, en de lengte van de regio te worden versterkt.
3. Voer agarose-gel elektroforese uit op de PCR-producten. Kolonies waarin het gebied van belang is verwijderd, leveren kleinere versterkings producten op dan kolonies die de verwijdering missen (Figuur 2).
4. Kies een of meer kolonies met de door PCR bevestigde verwijdering. Streak voor geïsoleerde kolonies op een voorverwarmde PIA plaat (en) en incuberen bij 37 °C 's nachts.
5. Doorgang ten minste één keer. Verwijder de plaat (en) uit de incubator en Identificeer een geïsoleerde kolonie. Gebruik een steriele inoculerende lus, pak de kolonie en streak een voorverwarmde PIA agar plaat voor geïsoleerde kolonies. Inincuberen 's nachts bij 37 °C.
6. Kies een kolonie van elke eindplaat en gebruik deze om 5 mL PIB te inoculeren. Plaats in een schud incubator bij 37 °C 's nachts.
   1. Meng 1 mL van deze cultuur met 1 mL van 5% magere melk in een cryoflacon en bewaar bij-80 °C om een stam bestand te genereren.
   2. Gebruik deze cultuur om genomisch DNA uit de stam te bereiden (bijv. met behulp van een DNA-zuiverings pakket). Versterk de genomische verwijderings regio met behulp van PCR en primers die specifiek zijn voor het interessegebied.
      1. Reinig deze PCR-producten (bijv. met een DNA-zuiverings pakket of fenol-chloroform-extractie) en volg ze direct met de genspecifieke primers of geligeerd in een vector voor sequencing met plasmide-specifieke primers.
7. Nadat de gendeletie is bevestigd door middel van sequentiëren, herhaalt u deze procedure met de nieuwe verwijderings stam om opeenvolgend talrijke marker-vrije genomische verwijderingen te genereren. Wanneer de gewenste stam wordt gegenereerd, gebruik dan hele genoom volgordebepaling om de beoogde verwijderingen te controleren en andere veranderingen in het genoom te detecteren (vergeleken met de referentiestam, bijv. PAO1) die tijdens het proces optrad. Na het annoeren van de genen, deponeert u de sequentie aan GenBank en registreert u de toetredings nummers.

8. bereiding van de bacteriestam voor dierproeven

1. Om te testen op verzwakte pathogeniteit van P. aeruginosa stammen, eerst voor te bereiden gevalideerde culturen en voorraden. Bereid de p. aeruginosa stammen van belang, een wild-type stam van P. aeruginosa (virulent), en een FDA-goedgekeurde stam van E. coli (bv., BL21) om te dienen als een niet-pathogene veiligheidscontrole.
2. Streep de stammen van de bacteriën die worden getest op selectieve agar van gesequenced en gevalideerde bevroren voorraden. Incuberen bij 37 °C 's nachts.
3. Met een steriele inoculterende lus, pick-up een enkele kolonie van elke stam en streak voor geïsoleerde kolonies op selectieve media weer. Incuberen bij 37 °C 's nachts.
4. Verwijder de platen uit de incubator. Voor elke stam, kies een enkele kolonie en streak voor isolatie op LB platen.
5. Na 24 uur groei bij 37 °C, wordt een kolf van 500 mL met 250 mL LB met één kolonie isolaat van elke stam inoculeren.
   1. Validerings stap: het gebruik van de overblijfselen van dezelfde kolonie, valideren van de stam met behulp van PCR en strain-specifieke primers, en/of primers om te controleren of de aanwezigheid van genetische wijzigingen aangebracht in de stam. Gebruik de primers hieronder voor de verificatie van stammen in het voorbeeld gepresenteerd:
      E. coli BL21:
      T7 polymerase F:TGGCTATCGCTAATGGTCTTACG
      T7 polymerase R:TTACGCGAACGCGAAGTCC
      
      VE2 en PGN5:
      aroA F: GCGAACGCCAACAGCCGATAAAGC
      aroA R: ATCTGGCTCGCGATGCCGGTCC
6. Incureren de culturen in een schud incubator bij 160 rpm en 37 °C totdat ze de groei van de log fase bereiken (d.w.z. OD₆₀₀ meting van 0,4-0,6 op een spectrofotometer).
7. Bereken met behulp van de OD₆₀₀ -waarde die is verkregen bij het bereiken van de log-fase het volume van de Bouillon die nodig is om 2,5 x 10⁹ kolonie vormende eenheden (CFU) per ml te leveren. Pellet het volume van de Bouillon berekend in 50 mL buizen bij 4.500 x g gedurende 10 min.
8. Gooi de supernatant weg en regeer de pellet in één buis met 50 mL 1x PBS om de cellen te wassen. Centrifugeer nogmaals bij 4.500 x g gedurende 10 min.
9. Gooi de supernatant weg en regeer de pellet in 25 mL van 5% magere melk in 1x PBS.
   1. Validerings stap: gebruik een monster van de 25 mL resuspensie om levensvatbare plaattellingen uit te voeren om het aantal CFU/mL te bepalen.
10. Aliquot de 25 mL skim melk kweek resuspensie in 2 mL kweek voorraden in 2 mL cryoflesjes. Flash bevriezen in vloeibare stikstof en bewaren bij-80 °C ten minste 's nachts voor gebruik.

9. validering van de groei en de stam van de voorraden opgeslagen voor dierproeven.

1. Verwijder voor elke te testen stam ten minste 3 cryoflacons bevroren voorraden van-80 °C opslag en ontdooien bij 4 °C gedurende 2-4 uur. Als er een bevroren voorraad overblijft, warm dan kort op 37 °C.
2. Neem kleine monsters van elke cryovial om elke stam te valideren.
   1. Voer levensvatbare plaattellingen uit om het aantal KVE/mL te bepalen. Het is normaal om minder kve/mL na het invriezen, als gevolg van de dood van sommige bacteriële cellen.
   2. Gebruik PCR-en strain-specifieke primers om elke stam te valideren.
   3. Streep elke druk op selectieve media om het fenotype te controleren.
3. Nadat is bevestigd dat stammen van het juiste genotype en fenotype zijn en CFU/mL valideren, gaat u verder met dierproeven.

10. inoculatie van dieren met bacteriële stammen door injectie

1. Op de ochtend van de injecties, verwijder cryoflacons van de bacteriestammen die worden getest en ontdooien bij 4 °C voor 3-4 h. ontdooien 0,5 mL voor elke muis die wordt geïnjecteerd. Bewaar de injectieflacons op het ijs na het ontdooien en Injecteer muizen binnen 2 uur.
2. Breng na het ontdooien elke cryoflacon over naar een nieuwe 2 mL Tube en Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4.500 x g , gooi het supernatant weg en hervat de celpellet in 1 ml 1x PBS.
3. Centrifugeer opnieuw bij 4.500 x g gedurende 10 m. Gooi supernatant en respendeer pellet in 1x PBS om tot een eindconcentratie 2,5 x 10⁹ kve/ml. Om de hoeveelheid 1x PBS te bepalen die nodig is voor resuspensie, gebruikt u de CFU/mL-gegevens die zijn verkregen uit levensvatbare plaattellingen op bevroren voorraden in stap 2.2.1. De exacte hoeveelheid 1x PBS die wordt gebruikt, varieert enigszins tussen de stammen.
   1. Neem 3 monsters van de definitieve suspensie van elke stam om CFU/mL, genotype en fenotype te valideren zoals hierboven beschreven.
4. Voor elke stam, aliquot 1,5 mL PBS/cel suspensie in één 2 mL buis per 5 muizen om het aantal keren dat de buis wordt ingevoerd te beperken. Maak ook buizen van 1x PBS voor controle injecties.
5. Verzamel muizen (10 man en 10 vrouwelijke C57BL/6 per groep voor dit experiment) en materialen die nodig zijn voor injecties (spuiten, naalden, naaldencontainers, markers, pen en papier, enz.). Ga naar de steriele dier chirurgische ruimte. Veeg alle oppervlakken schoon met reinigingsdoekjes.
   1. Om de nood en het risico op letsel te elimineren, brengt u slechts één geslacht en experimentele groep muizen tegelijkertijd naar de chirurgische ruimte (bijv. een groep van 10 mannelijke muizen die met een bepaalde stam besmet zijn). Draag twee paar latex handschoenen om de punctie van handschoenen te elimineren als ze gebeten zijn. Draag een Labcoat, veiligheidsbril en gezichtsmasker om verontreiniging te voorkomen.
6. Start de injecties van de controlegroep met 1x PBS. Dit zal nagaan of eventuele nadelige effecten alleen het gevolg zijn van een injectie.
   1. Verwijder een muis uit de kooi. Verwijder slechts één muis tegelijk.
   2. Weeg de muis en markeer de staart met permanente marker om te sporen voor gewichtsverlies na de injectie.
   3. Open een nieuwe spuit van 1 mL en een naald van 27 G (gebruik een nieuwe spuit en naald voor elke muis om besmetting te elimineren) en Injecteer 200 μL steriele 1x PBS.
      1. Grijp de muis achter de oren met de duim en wijsvinger. Knijpen om huidplooi te maken op nek van de nek om op te houden-een strakkere vouw vermindert nek beweging en het risico van wordt gebeten tijdens de injectie. Bevestig de staart in de Palm met de Pinky om de muis plat te houden met weinig beweging.
      2. Draai de muis om en steek de naald in een hoek van 30 ° in de peritoneale holte aan de linker-of rechterkant van de middenlijn. Til de naald lichtjes eenmaal ingebracht om ervoor te zorgen dat deze in het intraperitoneale gebied is ingebracht en niet in organen. Injecteer de PBS langzaam en trek de naald vervolgens terug.
      3. Plaats de gebruikte naald in een speciale Biohazard naaldencontainer. Gebruik de spuit of naald niet opnieuw. Een bolus op de injectieplaats is typisch.
   4. Beweeg de muis na de injectie naar een aparte kooi.
   5. Herhaal de procedure met de volgende muis. Nadat alle muizen van één kooi zijn geïnjecteerd, keert u ze onmiddellijk terug naar hun oorspronkelijke kooi.
7. Na het injecteren van de controlegroep, beginnen met het injecteren van suspensies van stammen worden getest volgens dezelfde procedure.
   1. Injecteer 200 μL van de celsuspensie. Bij aanvang met celsuspensies van 2,5 x 10⁹ kve/ml, ontvangt elke muis 5 x 10⁸ kve.
      Opmerking: deze concentraties werden geoptimaliseerd met voorbereidend dierlijk onderzoek om dodelijke doses van elke stam te bepalen. De dosering moet mogelijk worden aangepast voor andere stammen/soorten.
8. Zodra alle injecties zijn voltooid, keert u muizen terug naar de huis kamer om de nood te verlichten. Schoon werkgebied met ontsmettingsdoekjes.
9. Volg de dieren voor sterfte na de injectie door het controleren van kooien voor dode muizen elke 3 h voor 72 h en elke 12 h voor 10 dagen. Noteer het gewicht van muizen elke 12 h om gewichtsverlies te bepalen als gevolg van ziekte.
10. Registreer schadelijk gedrag in de uren na de injectie, zoals een verschil in houding, gebrek aan verzorging of begraving, immobiliteit of veranderingen in de ademhaling. Muizen die overlijden aan letsel in verband met injectie vertonen een negatief gedrag en sterven snel na de injectie. Aan de andere kant, muizen die overlijden aan infectie zal niet beginnen te vertonen nadelige gedrag of de dood tot na 18 h. Alle muizen die wel schadelijk gedrag vertonen of uitgebreide tekenen van morbiditeit, met inbegrip van snelle of moeizame ademhaling, immobiliteit, opgejakte houding, gezonken ogen, ernstige uitdroging of andere, moeten worden geëbaliseerd om onnodig lijden te verminderen (als conform in onze goedgekeurde IACUC-protocollen). Echter, in onze experimenten was euthanisatie niet nodig voor muizen tijdens het experiment. Overlevende muizen werden 10 dagen na voltooiing van de tests geëlektriseerd.
11. Na de bewakingsperiode van 10 dagen kunnen de dieren nog steeds volledig worden hersteld en wordt de tijdens de test toegediende infectie duidelijk. Euthanitering van dieren na de IACUC-procedure.

11. statistische analyse van dierlijke sterfte

1. Voer een statistische analyse uit met behulp van grafische-software. Alle software die grafieken kan produceren en statistische analyses uitvoert, is geschikt.
2. Als u de sterfte gegevens wilt uitzetten, gebruikt u de kolom X om tijd (h) en Y-kolom weer te geven om de geteste groepen weer te geven.
3. Vertegenwoordig elke muis of onderwerp in de studie met behulp van code = 0 (nul) of code = 1, die de overleving of de dood aangeeft.
   1. Voor elk dier dat sterft, plaats een 1 in de Y-kolom van die groep op het moment van overlijden op de X-kolom. Als er meerdere sterfgevallen zijn op een enkel tijdstip binnen een groep, kan een kopie van dat tijdspunt in de X-kolom worden geplaatst. Als drie onderwerpen binnen een groep bijvoorbeeld sterven bij 3 uur, wordt het tijdspunt van 3 uur drie keer in de X-kolom weergegeven.
   2. Plaats voor alle overlevende dieren binnen een groep een nulpunt in de Y-kolom op het laatste gemeten tijdstip. Als vier muizen bijvoorbeeld overleven, plaatst u vier eindtijd punten in de X-kolom met vier nullen in de Y-kolom.
4. Nadat diergegevens voor alle groepen zijn ingevoerd, gebruikt u een overlevings grafieksjabloon om een overlevings grafiek te maken.
   1. Laat standaardcodering als 0 en 1.
   2. Stel de parameters voor de grafiek in als percentage.
5. Zodra parameters voor overlevings curve zijn geselecteerd, voert u een statistische analyse uit met behulp van een mantel-Cox (log Rank) test.
6. Format teren van Kaplan-Meier plots met behulp van statistische gegevens.
   Opmerking: stammen die sterftecijfers vertonen die kleiner zijn dan of gelijk zijn aan de ouderstam en de door de FDA goedgekeurde stam (bijv. e. coli BL21) kunnen als verzwakte worden beschouwd.

12. visualisatie van de infectie met bioluminescentie

1. Om de voortgang van de infectie te visualiseren, plaatst u een chromosomale bioluminescente operon (Luxcdabe) in de geteste PGN5 en VE2 stam. De plasmiden en het protocol dat gebruikt werd om deze stammen te labelen werden ontwikkeld in het Schweizer Lab en zijn mogelijk niet compatibel met alle soorten/stammen van bacteriën¹³. Belangrijk, visualisatie van de infectie is optioneel; Daarom is genomische inbrengen van deze operon niet nodig om de hierboven beschreven sterfte studie uit te voeren.
2. Bereid en valideer stammen met behulp van de hierboven beschreven methode. Bovendien controleren op Bioluminescentie in gelabelde stammen bij elke validatiestap.
3. Nadat de stammen zijn bereid, Injecteer de dieren in groepen van 10 met de bioluminescente stammen volgens de bovenstaande stappen.
4. Afbeelding van de dieren elke 3 h voor 24 h met behulp van een dierlijke Imaging systeem geschikt voor bioluminescentie.
   1. Maak eerst de imager klaar door de camera parameters in te stellen en het podium voor de dieren te verwarmen. Stel ook de zuurstof stroom in op 1,5 L per min (of de volgende aanbevelingen van de fabrikant).
   2. Nadat de imager en het podium zijn gestabiliseerd, plaatst u een muis onmiddellijk na de injectie in de anesthesie kamer en beheert u 3,5% Isofluraan in de kamer met O₂ -stroom gedurende ongeveer 4 minuten. De anesthesie methoden kunnen variëren afhankelijk van de kamer en/of verdovingsmiddel gebruikt; Volg de aanbevelingen van de fabrikant. Bepaal de juiste anesthesie via Terugtrekking reflex test.
   3. Beweeg de muis naar de temperatuur gestabiliseerde fase. Plaats de muis op zijn rug met gestrekte armen en monteer de muis met een neuskegel voor toediening van 2,5% Isofluraan gedurende de beeldvormings procedure.
   4. Sluit de deur en neem bioluminescente beelden en X-stralen van de muis.
   5. Wanneer Imaging is voltooid, keert u de muis terug naar de kooi en controleert u deze. De muis moet opnieuw bewustzijn krijgen binnen 3-5 min.
   6. Doorgaan naar beeld muizen elke 3 h voor 24 h, elke keer met behulp van een andere muis uit elke groep. Niet Reimage een muis binnen 24 h vanwege de mogelijkheid van nadelige effecten als gevolg van re-blootstelling aan anesthesie. Een enkele muis mag slechts één dosis anesthesie elke 24-36 h. Reinig het Imaging platform nadat elke muis is afgebeeld. Schakel de imager tussen Imaging tijdpunten.
      Opmerking: bioluminescentie zal vervagen, ongeacht de geïnjecteerde stam. De intensiteit en de levensduur van bioluminescentie zal variëren afhankelijk van vele factoren, met inbegrip van het aantal geïnjecteerd bacteriën, muis stam, bacteriële stam, enz.

Representative Results

Zoals weergegeven in Figuur 2, kan de beoogde genomische verwijdering worden bevestigd met behulp van kolonie PCR met specifieke primers die het gebied van belang versterken. Kolonies die een genomische deletie dragen, zullen een kortere PCR-band grootte opleveren in vergelijking met wild-type kolonies. Een PCR-scherm van 10-12 kolonies is meestal voldoende om ten minste één kolonie te detecteren die de beoogde verwijdering draagt. Als er na meerdere rondes van schermen geen verwijderingen worden gedetecteerd, herhaalt u de procedure die begint met de conjugatie. Als de verwijdering nog steeds mislukt, moet de plasmide insert mogelijk worden bevestigd door middel van sequentiëren, opnieuw ontworpen of de verwijdering kan dodelijk zijn. Bevestig bij de verificatie van een gendeletie via PCR de verwijdering via sequencing. De resulterende stam kan herhaaldelijk aan de procedure worden onderworpen om sequentiële genomische modificaties te genereren.

Zoals weergegeven in Figuur 3, was de sterfte geassocieerd met intraperitoneale injectie van de verzwakte stam van P. aeruginosa PGN5 (+ muce) 0%, wat equivalent was aan de sterfte waargenomen met E. coli BL21. Aan de andere kant was intraperitoneale injectie van de ouderstam (VE2) fataal tot 80% van de muizen. Deze resultaten werden verkregen met uitgebreide stappen om de geïnjecteerde stammen te valideren. Hoewel de precieze doodsoorzaak bij deze muizen onbekend is, kan het op zijn minst gedeeltelijk worden toegeschreven aan de uitdrukking van virulentie factoren in de stam die werden verwijderd uit de verzwakte PGN5 stam. Verschillen in de progressie van de infectie werd bijgehouden met behulp van bioluminescentie-gemarkeerde bovenliggende en verzwakte stammen. De verzwakte stam bleef gelokaliseerd op de plaats van injectie totdat bioluminescentie vervaagde (Figuur 4). De klaring van de infectie viel hoogstwaarschijnlijk samen met de vervaging van de Bioluminescentie. Bioluminescentie werd niet gedetecteerd 24 h na injectie en muizen leefden weken na de injectie totdat geofferd, zonder nadelige effecten waargenomen.

Figuur 1: genereren van gendeleties in P. aeruginosa met PEX100T-noti. A) kaart van het PEX100T-noti plasmide. B) het genereren van een constructie die bestaat uit gebieden die direct stroomopwaarts (geel) en stroomafwaarts (blauw) van het gebied van belang (ROI), geflankeerd met noti-beperkings enzym herkennings locaties. Ten eerste, PCR-amplificeren upstream-en downstreamregio's onafhankelijk van specifieke primers die 5 "NotI-vergistings locaties" toevoegen (bijv. NotI-Aroa F CGCGGCCGCTGAAGGTCCTGGGCTCCTATCCGAAAGCGGTGCTCT en noti-AROA R GCGGCCGCAGTTGGGTTGTTCTGCGATGGCGCCAGGCA) en 3 ' overlappende homologe gebieden zoals afgebeeld (bijvoorbeeld AROA-crossover F CTCCAGGCGCTGGGCAAGGTGCTGGCGCATGACTGAGGTCACGCCGGTCGCCGTGGAGAACA en aroA-crossover R TGTTCTCCACGGCGACCGGCGTGACCTCAGTCATGCGCCAGCACCTTGCCCAGCGCCTGGAG. Gebruik vervolgens PCR withNotI-bevattende primers om deel te nemen aan de upstream-en downstream-producten die in de eerste PCR-reactie worden gegenereerd. C) de PEX100T-noti plasmide, gewapend en klaar. Ligate het door de NotI verteerde PCR-product in het met NotI verteerde plasmide. D) stroomdiagram van het proces voor het verwijderen van genomische gebieden uit het P. aeruginosa -chromosoom met behulp van het pEX100T-noti-plasmide. Nadat de gewenste verwijdering is bevestigd en gezuiverd, kan de resulterende stam herhaaldelijk door de procedure worden genomen om andere genomische gebieden uit het chromosoom te verwijderen. Wanneer de gewenste stam wordt verkregen, volg dan het hele genoom om verwijderingen en andere veranderingen in het chromosoom te bevestigen. De pathogeniteit van de stam kan vervolgens bij muizen worden getest aan de hand van de in deel II van het protocol beschreven procedure. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: gel elektroforese van kolonie PCR-producten van een scherm voor aroA deletie om de verzwakte P. aeruginosa stam te genereren, PGN5. Colony PCR producten lopen in Lanes 2-5 en 8-11 geven kolonies met wild-type aroA. Kolonie PCR-producten lopen in de Lanes 6 en 7, dragen de aroA -gendeletie, aangegeven door het kleinere PCR-product (gele asterisken). Primers gebruikt specifiek versterkt de genomische regio met het aroA -gen: Aroa-F: GCGAACGCCAACAGCCGATAAAGC, en AROA-R: ATCTGGCTCGCGATGCCGGTCC. Verwachte PCR-product grootte in wild-type kolonies was 2.548 nucleotiden (NT). Verwachte PCR-product grootte in kolonies met aroA -verwijdering was 307 NT. Een DNA-ladder werd uitgevoerd in de Lanes 1 en 12. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: algehele sterfte van muizen geïnjecteerd met pathogene p. aeruginosa stam (VE2), verzwakte p. AERUGINOSA stam (PGN5 + muce), en FDA controle E. coli stam (BL21). Alleen muizen geïnjecteerd met pathogene ouderstam tentoongesteld sterfte op 80%. Verzwakte P. aeruginosa stam en FDA controle E. coli stam tentoongesteld 0% sterfte. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: afbeelding van muis 3 h na injectie van verzwakte stam van P. aeruginosa PGN5 + muce met een bioluminescente marker. De bioluminescente bacteriën detecteerbaar tot 18-24 h na injectie. Gedurende deze periode bleef de Bioluminescentie op de injectieplaats staan, wat aangeeft dat de bacteriën gelokaliseerd bleven op de injectieplaats. Deze muis volledig hersteld zonder nadelige effecten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

De pEX100T-Not1 plasmide is een efficiënte bemiddelaar van sequentiële genomische deleties die marker-vrij en in-frame zijn. Bij het ontwerpen van bacteriële stammen voor verzwakte virulentie, vermindert het verwijderen van volledige genen sequenties in plaats van het genereren van puntmutaties de kans op reversie naar een virulente fenotype. Bovendien verzwakt elke genetische verwijdering van pathogeniteit de pathogenen verder, wat de stabiliteit van de verzwakking versterkt.

Deze methode kan ook worden gebruikt voor het genereren van genomische wijzigingen anders dan verwijderingen, zoals puntmutaties en inserties, simpelweg door het ontwerp van de plasmide insert te wijzigen. Dit soort modificaties kan nuttiger zijn dan volledige gen deleties voor engineering bacteriën met gemodificeerde metabolisme, bijvoorbeeld. Sequentiële genomische modificatie heeft een significant potentieel voor het genereren van Designer bacteriestammen voor specifieke doeleinden in onderzoek en industrie. Andere methoden voor het genereren van gewenste marker-vrije genomische modificaties in bacteriën zijn beschreven^15,16,17,18. Zoals bij alle genoom bewerkingsmethoden, kunnen pogingen tot wijziging van essentiële genomische regio's dodelijk zijn en dus niet succesvol. In deze gevallen is identificatie van verschillende genetische modificaties of andere kandidaatgenen vereist om de bacteriestam van belang te genereren.

Gezien de talrijke replicatiegebeurtenissen en passages van elke kolonie in dit protocol, zullen onbedoelde veranderingen in het genoom optreden bij de gegenereerde stam. De precieze genomische veranderingen kunnen worden geïdentificeerd door middel van Whole-genoom volgordebepaling. De impact van deze veranderingen is echter moeilijker te bepalen. Wanneer technische bacteriën voor een specifiek doel, genomische veranderingen die geen negatieve invloed hebben op de groei van het organisme of het beoogde traject (en) zijn draaglijk. Afhankelijk van de stam die wordt gegenereerd, kan het mogelijk zijn om een "uitlezen" te identificeren om ervoor te zorgen dat de stam nog steeds nuttig is voor het beoogde doel. Bijvoorbeeld, met PGN5, het doel was om een verzwakte stam te creëren die de mogelijkheid om grote hoeveelheden alginaat te produceren behouden. Na verwijdering van vijf pathogeniciteitsgenen werd de hoeveelheid en samenstelling van alginaat, geproduceerd door PGN5, gemeten en vastgesteld om vergelijkbaar te zijn met andere alginaatproducerende stammen. Zo werd de productie van alginaat niet beïnvloed door de vijf gendeleties, noch door de onbedoelde genomische veranderingen die plaatsvonden tijdens de ontwikkeling van PGN5.

Een model van intraperitoneale muis injectie werd gebruikt om te bepalen of een gemanipuleerde stam werd verzwakt in vergelijking met de ouderstam en E. coli BL21, een stam goedgekeurd door de FDA voor de productie van Biopharmaceuticals. De belangrijkste stappen die tijdens deze dier testprocedure zijn ondernomen, waren de voorbereiding en validering van bevroren bacteriële bestanden. Voorbereiding en gebruik van bevroren bacteriële culturen om muizen te injecteren verdient de voorkeur om continue cultuur te gebruiken, omdat het aantal mutaties vermindert die van nature voorkomen bij bacteriële populaties¹⁹. Daarnaast moeten bevroren culturen al jaren levensvatbaar blijven. Levensvatbare plaattellingen toonden geen significant verschil tussen de CFU/mL direct nadat de voorraden waren voorbereid en drie maanden na bereiding. Het gebruik van meerdere validerings stappen gedurende deze procedure zorgde ervoor dat de methode reproduceerbaar was, en de resultaten werden niet scheefgetrokken door contaminerende bacteriën. Bovendien waren er minder dieren nodig om het aantal voorzorgsmaatregelen te nemen om de reproduceerbaarheid te waarborgen. Met behulp van een bacteriestam die is goedgekeurd door de FDA voor biofarmaceutische productie als de controle (zoals E. coli stam BL21), deze methode kan worden gebruikt voor het testen van de verzwakking van andere genetisch gemanipuleerde stammen van P. aeruginosa, of andere soorten bacteriën.

Het gebruik van bioluminescentie als marker zorgt voor extra validatie van de geïnjecteerde bacteriestammen, aangezien de marker op de injectieplaats kan worden gevisualiseerd. Het inbrengen van de Bioluminescentie marker in het bacteriële chromosoom is nodig voor bioluminescentie beeldvorming, maar is mogelijk niet mogelijk als het werkt met onverenigbare stammen/soorten. Er zijn echter geen markerings stammen met bioluminescentie nodig om te testen op demping. De in deze studie geteste stammen waren gemarkeerd met bioluminescentie, die het mogelijk maakten om lokalisatie verschillen tussen stammen in de loop van de infectie te visualiseren. We hebben geconstateerd dat de pathogene stam verspreid door het lichaam van de muis, maar de niet-pathogene stam bleef op de plaats van injectie. Terwijl dit experiment alleen getest twee zeer nauw verwante stammen van p. aeruginosa, het suggereert dat bacteriële verspreiding is gekoppeld aan virulentie, althans in P. aeruginosa. Dus, deze procedure van labeling met bioluminescentie om de progressie van de infectie te visualiseren, kan in de toekomst worden gebruikt om snel de verzwakking van de ontwikkelde stammen van bacteriën te evalueren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL tubes with flat caps	ThermoScientific	AB-0620	via Fisher Scientific
1 mL Syringe	BD	22-253-260	via Fisher Scientific
1.5 mL disposable polystyrene cuvette	Fisher Scientific	14955127
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	05-408-129
2.0 mL Cryogenic Vials	Corning	430659	via Fisher Scientific
27G needle	BD	14-821-13B	via Fisher Scientific
50 mL tubes	Fisher Scientific	05-539-13	via Fisher Scientific
Accu block Digital Dry Bath	Labnet	NC0205808	via Fisher Scientific
Benchtop Centrifuge 5804R	Eppendorf	04-987-372	via Fisher Scientific
Benchtop Microcentrifuge	Sorvall	75-003-287	via Fisher Scientific
Cabinet Incubator	VWR	1540
Carbenicillin disodium salt	Fisher Scientific	BP2648250
Culture Test Tube, Polystyrene	Fisher Scientific	14-956-6D	via Fisher Scientific
Diposable Inoculation Loops	Fisher Scientific	22-363-597
Dneasy UltraClean Microbial Kit (50)	Qiagen	12224-50	or preferred method/vendor
E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50)	Omega bio-tek	D6493-01	or preferred method/vendor
EcoRI-HF, restriction endonuclease	New England BioLabs	R3101L
Electroporation Cuvettes	Bulldog Bio	NC0492929	via Fisher Scientific
FastLink II DNA Ligation Kit	Epicentre Technologies	LK6201H	via Fisher Scientific
Gentamycin Sulfate	Fisher Scientific	BP918-1
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-4
GoTaq G2 Colorless Master Mix	Promega	M7833	via Fisher Scientific
Isothesia Isoflurane	Henry Schein Animal Health	29405
IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System	Perkins and Elmer	CLS136340
Kanamycin monosulfate	Fisher Scientific	BP906-5
LE agarose	Genemate	3120-500	via Fisher Scientific
Luria Broth	Difco	240230	via Fisher Scientific
MicroPulser Electroporator	BioRad	1652100
Noble agar, ultrapure	Affymetris/USB	AAJ10907A1	via Fisher Scientific
NotI-HF, restriction endonuclease	New England BioLabs	R3189
One Shot TOP10 Electrocomp E. coli	Invitrogen	C404052	via Fisher Scientific
Phosphate buffered saline powder	Sigma	P3813-10PAK	Sigma-Aldrich
Prism 7	GraphPad		https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
Pseudomonas isolation agar	Difco	292710	via Fisher Scientific
Pseudomonas isolation broth	Alpha Biosciences	P16-115	Custom made batch
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	or preferred method/vendor
Shaking Incubator	New Brunswick Scientific	Innova 4080	shake at 200 rpm
SimpliAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems	A24811
Skim Milk	Difco	DF0032-17-3	via Fisher Scientific
Small Plates (100 O.D. x 10 mm)	Fisher Scientific	FB0875713
SmartSpec Plus Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	or preferred method/vendor
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500
Toothpicks, round	Diamond		Any brand of toothpicks, autoclaved
TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing	Invitrogen	45-0030
XAF-8 Anesthesia System Filters	Perkins and Elmer	118999
XGI 8 Gas Anesthesia System	Caliper Life Sciences/Xenogen