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Immunology and Infection

Generación de mutantes de eliminación de genes en el marco en Pseudomonas aeruginosa y pruebas para la atenuación de la virulencia en un modelo simple de infección de ratón

Published: January 8, 2020 doi: 10.3791/60297
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Progenesis Technologies, LLC, 2Department of Biomedical Sciences, Pediatrics, Joan C. Edwards School of Medicine at Marshall University

Summary

Aquí, describimos un protocolo simple y reproducible del modelo de ratón de infección para evaluar la atenuación de las cepas modificadas genéticamente de Pseudomonas aeruginosa en comparación con la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) aprobada por escherichia coli para aplicaciones comerciales.

Abstract

Los microorganismos son genéticamente versátiles y diversos y se han convertido en una fuente importante de muchos productos comerciales y biofarmacéuticos. Aunque algunos de estos productos son producidos naturalmente por los organismos, otros productos requieren ingeniería genética del organismo para aumentar los rendimientos de la producción. Las cepas avirulentes de Escherichia coli han sido tradicionalmente la especie bacteriana preferida para la producción de productos biofarmacéuticos; sin embargo, algunos productos son difíciles de producir para E. coli. Por lo tanto, las cepas avirulentes de otras especies bacterianas podrían proporcionar alternativas útiles para la producción de algunos productos comerciales. Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram-negativa común y bien estudiada que podría proporcionar una alternativa adecuada a E. coli. Sin embargo, P. aeruginosa es un patógeno humano oportunista. Aquí, detallamos un procedimiento que se puede utilizar para generar cepas no patógenas de P. aeruginosa a través de deleciones genómicas secuenciales utilizando el plásmido pEX100T-NotI. La principal ventaja de este método es producir una cepa sin marcadores. Este método se puede utilizar para generar cepas P. aeruginosa altamente atenuadas para la producción de productos comerciales, o para diseñar cepas para otros usos específicos. También describimos un modelo de ratón simple y reproducible de infección sistémica bacteriana a través de la inyección intraperitoneal de cepas de prueba validadas para probar la atenuación de la cepa genéticamente diseñada en comparación con la cepa BL21 aprobada por la FDA de E. coli.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa es un patógeno bacteriano oportunista que puede causar enfermedades potencialmente mortales en humanos, especialmente en los inmunocomprometidos. La patogenicidad de P. aeruginosa se debe a la expresión de muchos factores de virulencia, incluyendo proteasas y lipopolisacáridos, así como su capacidad para formar una biopelícula protectora1. Debido a su capacidad para producir factores de virulencia y causar enfermedades en los seres humanos, el uso de P. aeruginosa para hacer productos comerciales presenta problemas de seguridad. Cepas no patógenas de E. coli se han utilizado tradicionalmente para bioingeniero productos médicos y comerciales para uso humano. Sin embargo, algunos productos son difíciles de hacer para E. coli, y muchos se empaquetan en cuerpos de inclusión, lo que hace que la extracción sea laboriosa. Las cepas bacterianas diseñadas con la capacidad de fabricar y secretar productos específicos son altamente deseables, ya que la secreción probablemente aumentaría el rendimiento y facilitaría los procesos de purificación. Por lo tanto, cepas no patógenas de otras especies de bacterias (por ejemplo, especies que utilizan más vías de secreción) pueden proporcionar alternativas útiles a E. coli. Recientemente informamos del desarrollo de una cepa de P. aeruginosa,PGN5, en la que la patogenicidad y toxicidad del organismo está altamente atenuada2. Es importante destacar que esta cepa todavía produce grandes cantidades de alginato polisacárido, un componente comercialmente interesante de la biopelícula de P. aeruginosa.

La cepa PGN5 se generó utilizando un procedimiento de intercambio alélico de dos pasos con el plásmido pEX100T-NotI para eliminar secuencialmente cinco genes (toxA, plcH, phzM, wapR, aroA) conocido por contribuir a la patogenicidad del organismo. pEX100T-NotI se generó cambiando el SmaI a un sitio de reconocimiento de enzimas de restricción NotI dentro del sitio de clonación múltiple del plásmido pEX100T, que fue desarrollado en el laboratorio de Herbert Schweizer3,4. El sitio de reconocimiento de la enzima de restricción NotI es una secuencia de ADN más rara en comparación con SmaI y menos probable que esté presente en secuencias que se clonan, por lo que es más conveniente para fines de clonación. El plásmido lleva genes que permiten la selección, incluido el gen bla, que codifica la lactamasa y confiere resistencia a la carenicilina, y el gen B. subtilissacB, que confiere sensibilidad a la sacarosa (Figura 1A). El plásmido también tiene un origen de replicación (ori) compatible con E. coli,y un origen de transferencia (oriT) que permite la transferencia de plásmido de E. coli a las especies de Pseudomonas a través de la conjugación. Sin embargo, el plásmido carece de un origen de replicación compatible con Pseudomonas,y por lo tanto no puede replicarse dentro de las especies de Pseudomonas (es decir, es un vector suicida pseudomonas). Estas características hacen que pEX100T-NotI sea ideal para atacar deleciones genéticas del cromosoma Pseudomonas. Los pasos de clonación plásmidos se llevan a cabo utilizando E. coli y el plásmido resultante se transfiere a Pseudomonas por transformación o conjugación. A continuación, a través de eventos de recombinación homóloga y pasos selectivos, se genera la eliminación en trama objetivo, sin marcadores. Este método de eliminación secuencial de regiones genómicas del cromosoma de P. aeruginosa podría utilizarse para generar cepas de Pseudomonas altamente atenuadas, como PGN5, o para diseñar cepas para otros usos específicos (por ejemplo, cepas deficientes en endonucleases para la propagación de plásmidos o cepas deficientes en proteasas para la producción de proteínas de interés).

La virulencia general de las cepas de bacterias se ve afectada por las condiciones de crecimiento y las fases, durante las cuales las mutaciones ocurren con frecuencia. Por lo tanto, medir la seguridad de las cepas genéticamente diseñadas puede ser un desafío. Para evaluar los aislados bacterianos para la virulencia sistémica, adaptamos un protocolo de infección previamente publicado por inyección intraperitoneal de ratones C57BL/65. Modificamos este procedimiento para utilizar existencias bacterianas congeladas para inyección, lo que permitió una dosificación precisa y una fácil validación de las cepas utilizadas. En este modelo, la cepa E. coli BL21, que ha sido aprobada por la FDA para la producción de biofarmacéuticos, se utilizó como un estándar de seguridad de control para determinar la patogénesis relativa de la cepa6,7,8. La principal ventaja de utilizar este método es que es reproducible y minimiza las fuentes de variación, ya que las cepas infectantes se validan para el número de células bacterianas, fenotipo, y marcadores genéticos antes y después de la infección. Con estos pasos controlados, se reduce el número de animales requeridos. En este modelo, las cepas de P. aeruginosa que dan como resultado tasas de mortalidad murina C57BL/6 iguales o inferiores a E. coli BL21 cuando se inyectan por vía intraperitoneal pueden considerarse atenuadas. Este modelo simple de infección de ratón también se puede utilizar para evaluar la patogenicidad atenuada de cepas genéticamente diseñadas de otras especies utilizando la cepa E. coli aprobada por la FDA como referencia. Los pasos 1-7 detallan la generación de deleciones genómicas secuenciales en P. aeruginosa (Figura 1) y los pasos 8-12 detallan el uso de un modelo de ratón para probar la patogenicidad de las cepas de P. aeruginosa.

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Protocol

Antes de comenzar los experimentos con animales, el protocolo que se utilizará debe ser aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC). La aprobación para el protocolo descrito se obtuvo a través de la IACUC en la Universidad Marshall (Huntington, WV, EE.UU.).

1. Diseño de plásmido

  1. Para generar una eliminación genética utilizando el plásmido pEX100T-NotI, clonar las regiones de ADN flanqueando la secuencia de eliminación deseada e insertar en el sitio de restricción NotI del plásmido. La plaquita de plásmido debe contener unos 500 nucleótidos aguas arriba de la secuencia de destino directamente adyacentes a unos 500 nucleótidos aguas abajo de la secuencia de eliminación objetivo. Además, la plaquita debe contener la secuencia de reconocimiento NotI (GCGGCCGC) en sus extremos de 5' y 3'(Figura 1B).

2. Preparación del plásmido

  1. Opción 1: Utilice los procedimientos de clonación tradicionales. Utilizar PCR para amplificar las regiones genómicas aguas arriba y aguas abajo del gen de interés, seguido de pcR9cruzado,10 para unir los fragmentos generados, restricción de la digestión del producto y plásmido de PCR, y ligadura11 (Figura 1B,C).
  2. Opción 2: Después de diseñar la secuencia de eliminación en silico, contratar una empresa que de novo la sintetiza para insertarla en el plásmido pEX100T-NotI. Muchas empresas han simplificado el proceso de clonación para generar rápida y eficientemente el plásmido de interés. Además, la secuencia verifica que los plásmidos estén libres de mutaciones antes del parto.

3. Transformación de E. coli

  1. Transforme E. coli electrocompetente con el plásmido de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Usando un lazo inoculante estéril, la raya 10 l de la reacción de transformación para las colonias aisladas en una placa de agar de luria (LB) precalentada complementada con 100 g/ml de carbenicilina e incubación durante la noche a 37 oC.
    NOTA: Todos los equipos y medios utilizados para cultivar bacterias deben tratarse de acuerdo con las pautas de seguridad de la institución.
  2. Pasaje dos veces.
    1. Retire la placa de la incubadora e identifique una colonia aislada. Usando un lazo inoculante estéril, recoja la colonia y raye una placa de agar LB precalentada complementada con 100 g/ml de carbenicilina para colonias aisladas. Incubar durante la noche a 37oC. Repita este paso una vez más para generar una referencia cultural pura.
  3. Usando un lazo inoculante estéril, inocular 5 ml de LB con una sola colonia de la placa de agar final. Coloque el cultivo en una incubadora de temblores a 37 oC durante la noche. Al día siguiente, mezclar 1 ml de este cultivo con 1 mL de 5% en un criovial y almacenar a -80 oC para generar un stock congelado de la cepa.

4. Preparación de la tensión bacteriana y conjugación triparental

  1. Utilice una única colonia aislada a partir de placas de agar de las siguientes cepas para inocular cultivos de caldo y colocar en una incubadora de temblores durante la noche a 37 oC.
    1. Añadir E. coli pEX100T-NotI en 5 ml de LB complementado con 100 g/ml de carbenicilina.
    2. Añadir la cepa de P. aeruginosa PAO1 en 5 mL de caldo de aislamiento Pseudomonas (PIB).
    3. Añadir E. coli prk2013 en 5 mL de LB complementado con 50 g/ml de kanamicina.
      NOTA: El plásmido prk2013 es un plásmido auxiliar que se replica en E. coli pero no en P. aeruginosa; lleva los genes de transferencia de acción trans que movilizan el plásmido pEX100T-NotI del donante E. coli al receptor de P. aeruginosa 12. P. aeruginosa es un patógeno de nivel 2 de bioseguridad (BSL-2). Siga las pautas de seguridad de la institución cuando trabaje con organismos BSL-2.
  2. Al día siguiente, retire los cultivos nocturnos de la incubadora y agregue 0,5 ml de cada cultivo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrífuga a 6.000 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y suspenda el pellet celular en 50-100 l de LB.
  3. Pipetear toda la suspensión celular en una gota sobre una placa de agar LB precalentada. Deje que la gota se seque. A continuación, invierta la placa e incubar a 37oC durante 4-6 h.
  4. Después de la incubación, utilice un bucle de inoculación estéril para recoger las células en 1 ml de LB en un tubo de microcentrífuga. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar las células.
  5. Usando un esparcidor de células, las células de la raya se extienden uniformemente sobre una placa seca precalentada de agar de aislamiento Pseudomonas (PIA) complementada con 300 g/ml de carbenicilina. Rayar varias placas con volúmenes crecientes de la mezcla celular (p. ej., 10 l, 100 l, 500 l). Incubar durante la noche a 37oC.

5. Detección de recombinantes de un solo cruce de P. aeruginosa

  1. Retire las placas de la incubadora e inspeccione si hay colonias aisladas resistentes a la carenicilina. Debido a que el plásmido pEX100T-NotI no puede replicarse en P. aeruginosa, las colonias que crecieron en placas suplementadas con carbenicilina deberían haber surgido de células en las que el plásmido se integró en el cromosoma.
    1. Elija al menos 4 de estas colonias y la raya para el aislamiento en placas precalentadas de PIA suplementadas con 300 g/ml de carbenicilina. Incubar placas durante la noche a 37oC.
  2. Retire las placas de la incubadora e inspeccione el crecimiento. Las colonias resistentes a la carbenicilina deben ser recombinantes de un solo cruce (es decir, han incorporado el plásmido al cromosoma a través de un evento de recombinación entre una región homóloga del inserto plásmido y el cromosoma de P. aeruginosa).
    1. Parche 8 o más colonias con palillos de dientes estériles en placas precalentadas de: 1) PIA suplementada con 300 g/ml de carbenicilina y 2) PIA suplementada con 300 g/ml de carbenicilina y 10% sacarosa (sin glicerol).
    2. Si no se obtuvo crecimiento de colonia del paso 5.1, repita la conjugación y aumente el volumen de la mezcla celular rayada en el paso 4.5. Si se produjo demasiado crecimiento, repita la conjugación y disminuya el volumen rayado.
    3. Si la conjugación falla repetidamente, prepare células electrocompetentes de la tensión P. aeruginosa y transforme directamente con el plásmido pEX100T-NotI. Los protocolos detallados para la preparación de P. aeruginosa electrocompetente y transformación están disponibles en otros lugares13,14.
  3. Incubar placas a 37oC durante la noche.
  4. Retire las placas de la incubadora e inspeccione el crecimiento. Los verdaderos recombinantes de un solo cruce serán resistentes a la carenicilina y sensibles a la sacarosa (es decir, las colonias que crecieron en PIA suplementadas con carbenicilina, pero no crecieron en PIA complementado con carbenicilina y sacarosa).
    1. Elija 4 o más verdaderos recombinantes de un solo cruce e inocular cada uno en 5 ml de LB sin selección. Incubar en una incubadora de temblores a 37oC durante la noche.
    2. Si no se detectaron recombinantes de un solo cruce, repita la conjugación.

6. Detección de recombinantes cruzados dobles de P. aeruginosa

  1. Para cada cultivo de caldo, inocular 10 ml de cultivo en un plato precalentado de PIA complementado con 10% de sacarosa (sin glicerol) y una veta para colonias aisladas. Incubar placas durante la noche a 37oC.
  2. Al día siguiente, retire las placas de la incubadora e inspeccione si hay crecimiento. Las colonias resistentes a la sacarosa deben ser recombinantes de doble cruce (es decir, han eliminado el plásmido del cromosoma mediante un evento de recombinación entre la otra región homóloga del inserto plásmido y el cromosoma P. aeruginosa).
    1. Parche al menos 20 colonias con palillos de dientes estériles en placas precalentadas de: 1) PIA, 2) PIA complementado con 10% sacarosa (sin glicerol), y 3) PIA complementado con 300 g/ml de carbenicilina.
  3. Incubar placas durante la noche a 37oC.
  4. Retire las placas de la incubadora y examínelas para el crecimiento. Los verdaderos recombinantes de doble cruz serán sensibles a la carenicilina y resistentes a la sacarosa (es decir, las colonias que crecieron en PIA y PIA suplementadas con sacarosa, pero no crecieron en PIA complementado con carbenicilina).

7. Confirmación de eliminación de genes a través de Colony PCR

  1. Prepare 10-20 colonias para una pantalla de eliminación con PCR.
    1. Recoger el crecimiento de un presunto recombinante de doble cruz con un palillo de dientes estéril y suspender las células en 50 l de 1 x salina tamponada de fosfato (PBS). Hervir la suspensión a 100 oC durante 10 minutos, centrífuga durante 3 min a 13.000 x g,y luego colocar sobre hielo.
  2. Realice PCR para examinar las colonias para la eliminación de destino.
    1. Utilice 1 l del sobrenadante como plantilla en una reacción de PCR de 25 ml para confirmar la deleción del gen de interés.
    2. Utilice imprimaciones específicas genéticas que amplifican la región de la eliminación genómica. Utilice imprimadores que amplifican la región de la eliminación genómica más 100-200 bp de flanqueo de secuencias aguas arriba y aguas abajo.
    3. Prepare una reacción de PCR de control independiente con la cepa padre (por ejemplo, PAO1).
      NOTA: Las condiciones del termociclador variarán dependiendo de la temperatura de recocido óptima para los pares de imprimación, el cóctel de polimerasa utilizado y la longitud de la región a amplificar.
  3. Realice la electroforesis de gel de agarosa en los productos PCR. Las colonias en las que se ha suprimido la región de interés producen productos de amplificación más pequeños que las colonias que carecen de la eliminación(Figura 2).
  4. Elija una o más colonias con la eliminación confirmada por PCR. La racha de colonias aisladas en una placa(s) PIA precalentada(s) e incubar a 37oC durante la noche.
  5. Pasaje al menos una vez más. Retire las placas de la incubadora e identifique una colonia aislada. Usando un bucle inoculante estéril, recoja la colonia y raye una placa de agar PIA precalentada para colonias aisladas. Incubar durante la noche a 37oC.
  6. Elija una colonia de cada placa final y úsela para inocular 5 ml de PIB. Colocar en una incubadora de temblores a 37 oC durante la noche.
    1. Mezclar 1 ml de este cultivo con 1 ml de leche desnatada al 5% en un criovial y almacenar a -80 oC para generar un stock de la cepa.
    2. Usando este cultivo, prepare el ADN genómico de la cepa (por ejemplo, usando un kit de purificación de ADN). Amplificar la región de eliminación genómica utilizando PCR e imprimaciones específicas para la región de interés.
      1. Purifique estos productos de PCR (por ejemplo, con un kit de purificación de ADN o extracción de fenol-cloroformo) y realice una secuencia directa con las imprimaciones específicas del gen o se convierta en un vector para la secuenciación con imprimaciones específicas de plásmidos.
  7. Después de que la deleción del gen se confirme mediante la secuenciación, repita este procedimiento con la nueva cepa de eliminación para generar secuencialmente numerosas deleciones genómicas sin marcadores. Cuando se genere la cepa deseada, utilice la secuenciación del genoma completo para verificar las eliminaciones dirigidas y para detectar otros cambios en el genoma (en comparación con la cepa de referencia, por ejemplo, PAO1) que se produjeron a lo largo del proceso. Después de anotar los genes, deposite la secuencia en GenBank y registre los números de adhesión.

8. Preparación de la tensión bacteriana para ensayos en animales

  1. Para comprobar la patogenicidad atenuada de cepas de P. aeruginosa, primero prepare cultivos y poblaciones validados. Preparar las cepas de interés de P. aeruginosa, una cepa de tipo silvestre de P. aeruginosa (virulenta) y una cepa de E. coli aprobada por la FDA (por ejemplo, BL21) para servir como un control de seguridad no patógeno.
  2. Raya las cepas de las bacterias que se prueban en el agar selectivo de las existencias congeladas secuenciadas y validadas. Incubar a 37oC durante la noche.
  3. Con un bucle inoculante estéril, recoja una sola colonia de cada cepa y la racha de colonias aisladas en medios selectivos de nuevo. Incubar a 37oC durante la noche.
  4. Retire las placas de la incubadora. Para cada cepa, elija una sola colonia y una raya para el aislamiento en las placas LB.
  5. Después de 24 h de crecimiento a 37oC, inocular un matraz de 500 ml que contenga 250 ml de LB con un único aislado de colonia de cada cepa.
    1. Paso de validación: utilizando los restos de la misma colonia, validar la cepa utilizando PCR y imprimaciones específicas de cepa, y/o imprimaciones para verificar la presencia de modificaciones genéticas hechas a la cepa. Utilice las imprimaciones siguientes para la verificación de las cepas en el ejemplo presentado:
      E. coli BL21:
      T7 polimerasa F:TGGCTATCGCTAATGGTCTTACG
      T7 polimerasa R:TTACGCGAACGCGAAGTCC

      VE2 y PGN5:
      aroA F: GCGAACGCCAACAGCCGATAAGC
      aroA R: ATCTGGCTCGCGATGCCGGTCC
  6. Incubar los cultivos en una incubadora de temblores a 160 rpm y 37 oC hasta alcanzar el crecimiento de la fase log (es decir, la medición de600 OD de 0,4-0,6 en un espectrofotómetro).
  7. Utilizando el valor OD600 obtenido cuando se logró la fase log, calcule el volumen de caldo necesario para producir 2,5 x 109 unidades formadoras de colonias (CFU) por ml. Pellet el volumen de caldo calculado en tubos de 50 ml a 4.500 x g durante 10 min.
  8. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en un tubo usando 50 ml de 1x PBS para lavar las células. Centrífuga de nuevo a 4.500 x g durante 10 min.
  9. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 25 ml de leche desnatada al 5% en 1pbS.
    1. Paso de validación: Utilice una muestra de la resuspensión de 25 ml para realizar recuentos de placas viables para determinar el número de CFU/ml.
  10. Aliquot la resuspensión del cultivo de leche desnatada de 25 ml en 2 ml de stock de cultivo en crioviales de 2 ml. Congelación del flash en nitrógeno líquido y almacenar a -80 oC al menos durante la noche antes de su uso.

9. Validación del Crecimiento y La Tensión de las Poblaciones Almacenadas para Ensayos Con Animales.

  1. Para que cada cepa sea probada, retire al menos 3 crioviales de caldo congelado de -80 oC de almacenamiento y descongele a 4 oC durante 2-4 h. Si queda algún material congelado, caliente brevemente a 37 oC.
  2. Tome pequeñas muestras de cada criovial para validar cada cepa.
    1. Realice recuentos de placas viables para determinar el número de CFU/ml. Es normal tener menos CFU/ml después de la congelación, debido a la muerte de algunas células bacterianas.
    2. Utilice PCR y imprimaciones específicas de tensión para validar cada cepa.
    3. Raya cada cepa sobre medios selectivos para verificar el fenotipo.
  3. Después de confirmar que las cepas son del genotipo y fenotipo correctos, y validar la CFU/ml, proceder a pruebas con animales.

10. Inoculación de animales con cepas bacterianas por inyección

  1. En la mañana de las inyecciones, eliminar los crioviales de las cepas bacterianas que se están probando y descongelar a 4 oC durante 3-4 h. Descongelar 0,5 ml por cada ratón que se inyectará. Conservar los viales en hielo después de descongelar e inyectar ratones dentro de las 2 h.
  2. Después de descongelar, transfiera cada criovial a un nuevo tubo de 2 ml y centrífuga a 4.500 x g durante 10 minutos, deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en 1 ml de 1pbS.
  3. Centrífuga de nuevo a 4.500 x g durante 10 m. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 1pbS a una concentración final 2,5 x 109 CFU/ml. Para determinar la cantidad de 1 x PBS necesaria para la resuspensión, utilice los datos de CFU/ml obtenidos a partir de recuentos de placas viables en las existencias congeladas en el paso 2.2.1. La cantidad exacta de 1x PBS utilizado variará ligeramente entre las cepas.
    1. Tome 3 muestras de la suspensión final de cada cepa para validar la CFU/ml, el genotipo y el fenotipo como se ha descrito anteriormente.
  4. Para cada cepa, la alícuota 1,5 ml de suspensión de PBS/célula en un tubo de 2 ml por 5 ratones para limitar el número de veces que se introduce el tubo. Además, prepare tubos de 1x PBS para las inyecciones de control.
  5. Reunir ratones (10 machos y 10 hembras C57BL/6 por grupo para este experimento) y materiales necesarios para las inyecciones (jeringas, agujas, contenedores de objetos punzantes, marcadores, pluma y papel,etc.). Muévanse a la sala de cirugía de animales estériles. Limpie todas las superficies con toallitas desinfectantes.
    1. Para eliminar la angustia y el riesgo de lesiones al experimentador, solo lleve un grupo sexual y experimental de ratones a la sala quirúrgica a la vez (por ejemplo, un grupo de 10 ratones machos que se infectarán con una cepa en particular). Use dos pares de guantes de látex para eliminar la punción de guantes si se muerden. Use bata de laboratorio, gafas de seguridad y máscara facial para evitar la contaminación.
  6. Comience las inyecciones del grupo de control con 1x PBS. Esto determinará si los efectos adversos resultan de la inyección por sí solo.
    1. Retire un ratón de la jaula. Solo quite un ratón a la vez.
    2. Pesar el ratón y marcar su cola con marcador permanente para realizar un seguimiento de la pérdida de peso después de la inyección.
    3. Abra una jeringa nueva de 1 ml y una aguja de 27 G (utilice una jeringa y una aguja nuevas para cada ratón para eliminar la contaminación) e inyecte 200 ml de 1x PBS estéril.
      1. Coge el ratón detrás de sus orejas usando el pulgar y el dedo índice. Pinch para crear pliegue de piel en la nuca para sujetar - un pliegue más apretado reduce el movimiento del cuello y el riesgo de ser mordido durante la inyección. Asegure la cola en la palma de la mano usando el meñique para mantener el ratón plano con poco movimiento.
      2. Gire el ratón e inserte la aguja en un ángulo de 30o en la cavidad peritoneal en el lado izquierdo o derecho de la línea media. Levante la aguja ligeramente una vez insertada para asegurarse de que se insertó en el área intraperitoneal y no en los órganos. Inyecte lentamente el PBS y luego retire la aguja.
      3. Coloque la aguja usada en un recipiente designado para objetos punzantes de riesgo biológico. No vuelva a utilizar la jeringa ni la aguja. Un bolo en el lugar de la inyección es típico.
    4. Después de la inyección, mueva el ratón a una jaula separada.
    5. Repita el procedimiento con el siguiente ratón. Después de inyectar todos los ratones de una jaula, devuélvelos a su jaula original inmediatamente.
  7. Después de inyectar el grupo de control, comience a inyectar suspensiones de cepas que se probarán siguiendo el mismo procedimiento.
    1. Inyectar 200 l de la suspensión celular. Al comenzar con suspensiones celulares de 2,5 x 109 CFU/ml, cada ratón recibe 5 x 108 CFU.
      NOTA: Estas concentraciones se optimizaron con la investigación preliminar en animales para determinar las dosis letales de cada cepa. Es posible que sea necesario ajustar la dosificación para otras cepas/especies.
  8. Una vez completadas todas las inyecciones, devuelva los ratones a la sala de alojamiento para aliviar la angustia. Limpie el área de trabajo con toallitas desinfectantes.
  9. Controlar la mortalidad de los animales después de la inyección revisando las jaulas en busca de ratones muertos cada 3 h durante 72 h y cada 12 h durante 10 días. Registre el peso de los ratones cada 12 h para determinar la pérdida de peso debido a una enfermedad.
  10. Registre el comportamiento adverso en las horas siguientes a la inyección, como la diferencia en la postura, la falta de aseo o madriguera, la inmovilidad o los cambios en la respiración. Los ratones que fallan por lesión asociada con la inyección exhibirán un comportamiento adverso y morirán rápidamente después de la inyección. Por otro lado, los ratones que deperalen de la infección no comenzarán a exhibir comportamiento adverso o muerte hasta después de las 18 h. Cualquier ratones que presenten comportamiento adverso o signos extensos de morbilidad, incluyendo respiración rápida o trabajada, inmovilidad, postura encorvada, ojos hundidos, deshidratación severa u otros deben ser eutanasiados para reducir el sufrimiento innecesario (como cumplimiento en nuestro protocolos IACUC aprobados). Sin embargo, en nuestros experimentos, la eutanización no era necesaria para ningún ratón durante el experimento. Los ratones supervivientes fueron eutanasiados 10 días después de la finalización de las pruebas.
  11. Después del período de monitoreo de 10 días, permita que los animales que permanecen se recuperen completamente y queden alejados de cualquier infección administrada durante la prueba. Eutanizar animales siguiendo el procedimiento de la IACUC.

11. Análisis estadístico de la mortalidad animal

  1. Realice análisis estadísticos utilizando software de gráficos. Cualquier software capaz de producir gráficos y realizar análisis estadísticos es adecuado.
  2. Para trazar los datos de mortalidad, utilice la columna X para representar el tiempo (h) y la columna Y para representar los grupos probados.
  3. Representar a cada ratón o sujeto en el estudio utilizando el código 0 (cero) o el código 1, indicando supervivencia o muerte, respectivamente.
    1. Para cada animal que muera, coloque un 1 en la columna Y de ese grupo en el momento de la muerte en la columna X. Si hay varias muertes en un único punto de tiempo dentro de un grupo, se puede colocar una copia de ese punto de tiempo en la columna X. Por ejemplo, si tres sujetos dentro de un grupo mueren a 3 h, el punto de tiempo de 3 h aparecerá tres veces en la columna X.
    2. Para todos los animales supervivientes dentro de un grupo, coloque un cero en la columna Y en el punto de tiempo final medido. Por ejemplo, si cuatro ratones sobreviven, coloque cuatro puntos de tiempo final en la columna X marcada con cuatro ceros en la columna Y.
  4. Después de introducir datos de animales para todos los grupos, utilice una plantilla de gráfico de supervivencia para producir un gráfico de supervivencia.
    1. Deje la codificación predeterminada como 0 y 1.
    2. Establezca los parámetros para el gráfico como porcentaje.
  5. Una vez seleccionados los parámetros para la curva de supervivencia, realice un análisis estadístico utilizando una prueba Mantel-Cox (rango de registro).
  6. Formatee las gráficas de Kaplan-Meier utilizando datos estadísticos.
    NOTA: Las cepas que presentan tasas de mortalidad menores o iguales que la cepa principal y la cepa aprobada por la FDA (por ejemplo, E. coli BL21) pueden considerarse atenuadas.

12. Visualización de la infección por bioluminiscencia

  1. Para visualizar el progreso de la infección, inserte un operon bioluminiscente cromosómico (luxCDABE) en la cepa PGN5 y VE2 probada. Los plásmidos y el protocolo utilizados para etiquetar estas cepas fueron desarrollados en el laboratorio Schweizer y pueden no ser compatibles con todas las especies / cepas de bacterias13. Es importante destacar que la visualización de la infección es opcional; por lo tanto, la inserción genómica de este operón no es necesaria para realizar el estudio de mortalidad descrito anteriormente.
  2. Preparar y validar las cepas utilizando el método descrito anteriormente. Además, compruebe si hay bioluminiscencia en cepas etiquetadas en cada paso de validación.
  3. Después de preparar las cepas, inyectar los animales en grupos de 10 con las cepas bioluminiscentes siguiendo los pasos anteriores.
  4. Imagen de los animales cada 3 h durante 24 h utilizando un sistema de imágenes de animales capaz de bioluminiscencia.
    1. Primero prepare el imager ajustando los parámetros de la cámara y calentando el escenario para los animales. También ajuste el flujo de oxígeno a 1,5 L por minuto (o siguiendo las recomendaciones del fabricante).
    2. Después de estabilizar la cámara de imágenes y la etapa, coloque un ratón en la cámara de anestesia inmediatamente después de la inyección y administre 3,5% de isoflurano en la cámara con flujo De2 durante aproximadamente 4 minutos. Los métodos de anestesia pueden variar dependiendo de la cámara y/o agente anestésico utilizado; seguir las recomendaciones del fabricante. Determinar la anestesia adecuada a través de la prueba de reflejo de abstinencia.
    3. Mueva el ratón a la etapa estabilizada de temperatura. Coloque el ratón sobre su espalda con los brazos extendidos y coloque el ratón con un cono nasal para la administración del 2,5% de isoflurano durante todo el procedimiento de diagnóstico por imágenes.
    4. Cierre la puerta y tome imágenes bioluminiscentes y rayos X del ratón.
    5. Una vez finalizada la toma de imágenes, devuelva el ratón a su jaula y monitoríquelo. El ratón debe recuperar la conciencia dentro de 3-5 min.
    6. Continúe fotocaniando ratones cada 3 h durante 24 h, cada vez usando un ratón diferente de cada grupo. No vuelva a crear una imagen de un ratón dentro de las 24 horas debido a la posibilidad de efectos adversos debido a la reexposición a la anestesia. Un solo ratón solo debe recibir una dosis de anestesia cada 24-36 h. Limpie la plataforma de imágenes después de crear una imagen de cada ratón. Desactive el imager entre puntos de tiempo de imagen.
      NOTA: La bioluminiscencia se desvanecerá, independientemente de la tensión inyectada. La intensidad y la longevidad de la bioluminiscencia variarán dependiendo de muchos factores, incluyendo el número de bacterias inyectadas, la cepa de ratón, la cepa bacteriana, etc.

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Representative Results

Como se muestra en la Figura 2,la eliminación genómica dirigida se puede confirmar utilizando PCR de colonia con imprimaciones específicas que amplifican la región de interés. Las colonias que llevan una eliminación genómica producirán un tamaño de banda de PCR más corto en comparación con las colonias de tipo salvaje. Una pantalla PCR de 10-12 colonias suele ser suficiente para detectar al menos una colonia que lleve la eliminación dirigida. Si no se detecta ninguna eliminación después de varias rondas de pantallas, repita el procedimiento comenzando con la conjugación. Si la eliminación sigue fallando, es posible que sea necesario confirmar la plaquita de plásmido mediante la secuenciación, el rediseño o la eliminación puede ser letal. Tras la verificación de una deleción genética a través de LA PCR, confirme la eliminación mediante la secuenciación. La cepa resultante puede someterse al procedimiento repetidamente para generar modificaciones genómicas secuenciales.

Como se muestra en la Figura 3, la mortalidad asociada con la inyección intraperitoneal de la cepa atenuada de P. aeruginosa PGN5 (+mucE) fue del 0%, lo que equivale a la mortalidad observada con E. coli BL21. Por otro lado, la inyección intraperitoneal de la cepa primaria (VE2) fue mortal para el 80% de los ratones. Estos resultados se obtuvieron con amplios pasos para validar las cepas inyectadas. Aunque se desconoce la causa exacta de la muerte en estos ratones, al menos en parte puede atribuirse a la expresión de factores de virulencia en la cepa padre que se eliminaron de la cepa PGN5 atenuada. Se realizaron un seguimiento de las diferencias en la progresión de la infección utilizando cepas parentales y atenuadas marcadas con bioluminiscencia. La cepa atenuada permaneció localizada en el lugar de la inyección hasta que la bioluminiscencia se desvaneció(Figura 4). El aclaramiento de la infección probablemente coincidió con el desvanecimiento de la bioluminiscencia. No se detectó bioluminiscencia 24 h después de la inyección y los ratones vivieron durante semanas después de la inyección hasta que se sacrificaron, sin efectos adversos observados.

Figure 1
Figura 1: Generación de deleciones genéticas en P. aeruginosa con pEX100T-NotI. (A) Mapa del plásmido pEX100T-NotI. (B) Generación de una construcción compuesta por regiones directamente aguas arriba (amarillo) y aguas abajo (azul) de la región de interés (ROI), flanqueadas con sitios de reconocimiento de enzimas de restricción NotI. En primer lugar, PCR-amplify regiones aguas arriba y aguas abajo independientemente con imprimaciones específicas que añaden sitios de digestión NotI de 5' (por ejemplo, NotI-aroA F CGCGGCCGCTAGAGGTCCCCGcTCCTATCCTCCAAAGcGG-AGCGCT y NotI-aroA R GCGGCCGCAGTTGGGTTGTTCTGCGATGG CGCCAGGCA) y 3' regiones homólogas superpuestas como se muestra (por ejemplo, aroA-crossover F CTCCAGGCGCTGGGCAAGGTGCTGGCGCGGCGAGGCGCCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCGCCCCCGCGCCCCCGCGCGCGCCCGCGCGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCGCGCCCCCGCGCGCGCGCCCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCCCCCGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCGGAGAACA y aroA-crossover R TGTTCTCCACGGCGCGACCCGTGACCTCAGTCATGCGCCACCACCTGCCCAGCGCCTGGAG. A continuación, utilice los primers que contienen el PCR withNotI para unirse a los productos ascendentes y descendentes generados en la primera reacción PCR. (C) El plásmido pEX100T-NotI, armado y listo. Ligar el producto PCR cruzado digerido notI en el plásmido digerido por NotI. (D) Diagrama de flujo del proceso para eliminar regiones genómicas del cromosoma P. aeruginosa utilizando el plásmido pEX100T-NotI. Después de que la eliminación deseada haya sido confirmada y purificada, la cepa resultante se puede tomar a través del procedimiento repetidamente para eliminar otras regiones genómicas del cromosoma. Cuando se obtenga la cepa deseada, secuenciar todo el genoma para confirmar las deleciones y otros cambios en el cromosoma. La patogenicidad de la cepa puede probarse en ratones utilizando el procedimiento descrito en la Parte II del Protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Electroforesis de gel de productos de PCR de colonia según una pantalla para la eliminación de aroA para generar la cepa atenuada P. aeruginosa, PGN5. Los productos de PCR de colonias funcionan en los carriles 2-5 y 8-11 indican colonias con aroAde tipo salvaje. Los productos de PCR de colonias funcionan en los carriles 6 y 7 llevan la deleción del gen aroA, indicada por el producto PCR más pequeño (asteriscos amarillos). Los imprimadores utilizados amplificaron específicamente la región genómica que contiene el gen aroA: aroA-F: GCGAACGCCAACAGCCGATAAGC, y aroA-R: ATCTGGCTCGCGATGCCGGTCC. El tamaño esperado del producto PCR en colonias de tipo salvaje fue de 2.548 nucleótidos (nt). El tamaño esperado del producto PCR en colonias con eliminación de aroA fue de 307 nt. Una escalera de ADN se ejecutó en los carriles 1 y 12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Mortalidad general de ratones inyectados con cepa patógena de P. aeruginosa (VE2), cepa atenuada de P. aeruginosa (PGN5+mucE) y cepa de E. coli de control de la FDA (BL21). Sólo los ratones inyectados con cepa parental patógena mostraron mortalidad en el 80%. La cepa Atenuada De P. aeruginosa y la cepa de control de E. coli de la FDA presentaron una mortalidad del 0%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Imagen del ratón 3 h después de la inyección de cepa atenuada de P. aeruginosa PGN5+mucE que lleva un marcador bioluminiscente. Las bacterias bioluminiscentes fueron detectables hasta 18-24 h después de la inyección. Durante este período, la bioluminiscencia permaneció en el lugar de la inyección indicando que las bacterias permanecieron localizadas en el lugar de inyección. Este ratón totalmente recuperado sin efectos adversos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El plásmido pEX100T-Not1 es un mediador eficiente de eliminaciones genómicas secuenciales que están libres de marcadores y en fotograma. Cuando se diseñan cepas bacterianas para la virulencia atenuada, la eliminación de secuencias genéticas enteras en lugar de generar mutaciones puntuales disminuye la probabilidad de reversión a un fenotipo virulento. Además, cada deleción del gen de la patogenicidad atenúa aún más al patógeno, reforzando la estabilidad de la atenuación.

Este método también se puede utilizar para generar modificaciones genómicas distintas de las deleciones, como mutaciones puntuales e inserciones, simplemente modificando el diseño de la plaquita plásmido. Estos tipos de modificaciones pueden ser más útiles que las deleciones genéticas completas para la ingeniería de bacterias con metabolismo modificado, por ejemplo. La modificación genómica secuencial tiene un potencial significativo para generar cepas bacterianas de diseño para adaptarse a propósitos específicos en la investigación y la industria. Se han descrito otros métodos para generar las modificaciones genómicas deseadas libres de marcadores en bacterias15,16,17,18. Al igual que con todos los métodos de edición del genoma, los intentos de modificación en las regiones genómicas esenciales pueden ser letales y, por lo tanto, infructuosos. En estos casos, se requiere la identificación de diferentes modificaciones genéticas u otros genes candidatos para generar la cepa bacteriana de interés.

Dados los numerosos eventos de replicación y pasajes de cada colonia a lo largo de este protocolo, se producirán cambios involuntarios en el genoma a la cepa generada. Los cambios genómicos exactos se pueden identificar mediante la secuenciación del genoma completo. Sin embargo, el impacto de estos cambios es más difícil de determinar. Cuando la ingeniería de bacterias para un propósito específico, los cambios genómicos que no afectan negativamente el crecimiento del organismo o la vía o las vías objetivo son tolerables. Dependiendo de la cepa que se genere, puede ser posible identificar una "lectura" para asegurarse de que la cepa sigue siendo útil para su propósito previsto. Por ejemplo, con PGN5, el objetivo era crear una cepa atenuada que retuviera la capacidad de producir grandes cantidades de alginato. Después de la eliminación de cinco genes de patogenicidad, se midió la cantidad y composición de alginato producido por la PGN5 y se determinó que era comparable a otras cepas productoras de alginato. Por lo tanto, la producción de alginato no se vio afectada por las cinco deleciones genéticas, ni por los cambios genómicos no intencionales que ocurrieron durante el desarrollo de la PGN5.

Se utilizó un modelo de inyección intraperitoneal de ratón para determinar si se atenuó una cepa de ingeniería en comparación con la cepa madre y E. coli BL21, una cepa aprobada por la FDA para la producción de biofarmacéuticos. Las medidas más importantes adoptadas durante este procedimiento de ensayo con animales fueron la preparación y validación de las poblaciones bacterianas congeladas. La preparación y el uso de cultivos bacterianos congelados para inyectar ratones es preferible al uso de cultivos continuos, ya que reduce el número de mutaciones que se producen naturalmente en las poblaciones bacterianas19. Además, los cultivos congelados deben seguir siendo viables durante años. Los recuentos de placas viables no mostraron ninguna diferencia significativa entre la CFU/ml directamente después de que se prepararon las existencias y tres meses después de la preparación. El uso de múltiples pasos de validación a lo largo de este procedimiento aseguró que el método era reproducible y los resultados no estaban sesgados por bacterias contaminantes. Además, con el número de medidas de precaución adoptadas para garantizar la reproducibilidad, se necesitaban menos animales. Utilizando una cepa bacteriana que está aprobada por la FDA para la producción biofarmacéutica como el control (como la cepa de E. coli BL21), este método podría utilizarse para probar la atenuación de otras cepas genéticamente diseñadas de P. aeruginosa,u otras especies de bacterias.

El uso de la bioluminiscencia como marcador proporciona una validación adicional de las cepas bacterianas inyectadas, ya que el marcador se puede visualizar en el lugar de inyección. La inserción del marcador de bioluminiscencia en el cromosoma bacteriano es necesaria para la toma de imágenes de bioluminiscencia, pero puede no ser posible si se trabaja con cepas/especies incompatibles. Sin embargo, no es necesario marcar las cepas con bioluminiscencia para comprobar la atenuación. Las cepas probadas en este estudio se marcaron con bioluminiscencia, lo que permitió la visualización de las diferencias de localización entre cepas a lo largo de la infección. Observamos que la cepa patógena se disemina a través del cuerpo del ratón, pero la cepa no patógena permanecía en el lugar de la inyección. Mientras que este experimento sólo probó dos cepas muy estrechamente relacionadas de P. aeruginosa, sugiere que la diseminación bacteriana está vinculada a la virulencia, al menos en P. aeruginosa. Por lo tanto, este procedimiento de etiquetado con bioluminiscencia para visualizar la progresión de la infección podría utilizarse en el futuro para evaluar rápidamente la atenuación de cepas de bacterias diseñadas.

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Disclosures

El autor Hongwei D. Yu es el Director Científico y Cofundador de Progenesis Technologies, LLC.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) R44GM113545 y P20GM103434.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL tubes with flat caps ThermoScientific AB-0620 via Fisher Scientific
1 mL Syringe BD 22-253-260 via Fisher Scientific
1.5 mL disposable polystyrene cuvette Fisher Scientific 14955127
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 05-408-129
2.0 mL Cryogenic Vials Corning 430659 via Fisher Scientific
27G needle BD 14-821-13B via Fisher Scientific
50 mL tubes Fisher Scientific 05-539-13 via Fisher Scientific
Accu block Digital Dry Bath Labnet NC0205808 via Fisher Scientific
Benchtop Centrifuge 5804R Eppendorf 04-987-372 via Fisher Scientific
Benchtop Microcentrifuge Sorvall 75-003-287 via Fisher Scientific
Cabinet Incubator VWR 1540
Carbenicillin disodium salt Fisher Scientific BP2648250
Culture Test Tube, Polystyrene Fisher Scientific 14-956-6D via Fisher Scientific
Diposable Inoculation Loops Fisher Scientific 22-363-597
Dneasy UltraClean Microbial Kit (50) Qiagen 12224-50 or preferred method/vendor
E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50) Omega bio-tek D6493-01 or preferred method/vendor
EcoRI-HF, restriction endonuclease New England BioLabs R3101L
Electroporation Cuvettes Bulldog Bio NC0492929 via Fisher Scientific
FastLink II DNA Ligation Kit Epicentre Technologies LK6201H via Fisher Scientific
Gentamycin Sulfate Fisher Scientific BP918-1
Glycerol Fisher Scientific BP229-4
GoTaq G2 Colorless Master Mix Promega M7833 via Fisher Scientific
Isothesia Isoflurane Henry Schein Animal Health 29405
IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System Perkins and Elmer CLS136340
Kanamycin monosulfate Fisher Scientific BP906-5
LE agarose Genemate 3120-500 via Fisher Scientific
Luria Broth Difco 240230 via Fisher Scientific
MicroPulser Electroporator BioRad 1652100
Noble agar, ultrapure Affymetris/USB AAJ10907A1 via Fisher Scientific
NotI-HF, restriction endonuclease New England BioLabs R3189
One Shot TOP10 Electrocomp E. coli Invitrogen C404052 via Fisher Scientific
Phosphate buffered saline powder Sigma P3813-10PAK Sigma-Aldrich
Prism 7 GraphPad https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
Pseudomonas isolation agar Difco 292710 via Fisher Scientific
Pseudomonas isolation broth Alpha Biosciences P16-115 Custom made batch
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) Qiagen 27106 or preferred method/vendor
Shaking Incubator New Brunswick Scientific Innova 4080 shake at 200 rpm
SimpliAmp Thermal Cycler Applied Biosystems A24811
Skim Milk Difco DF0032-17-3 via Fisher Scientific
Small Plates (100 O.D. x 10 mm) Fisher Scientific FB0875713
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 or preferred method/vendor
Sucrose Fisher Scientific S5-500
Toothpicks, round Diamond Any brand of toothpicks, autoclaved
TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing Invitrogen 45-0030
XAF-8 Anesthesia System Filters Perkins and Elmer 118999
XGI 8 Gas Anesthesia System Caliper Life Sciences/Xenogen

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References

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Valentine, M. E., Kirby, B. D., Yu, H. D. Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (155), e60297, doi:10.3791/60297 (2020).

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