Summary
ここでは、市販品に対する米国食品医薬品局(FDA)承認の大腸菌と比較して、緑膿菌の遺伝子組み換え株の減衰を評価する感染のマウスモデルの簡単かつ再現性の高いプロトコルについて説明する。
Abstract
微生物は遺伝的に汎用性が高く多様であり、多くの市販品やバイオ医薬品の主要な供給源となっています。これらの製品のいくつかは、生物によって自然に生産されますが、他の製品は、生産の収量を増加させるために生物の遺伝子工学を必要とします。大腸菌のアビドロン酸株は、伝統的にバイオ医薬品を生産するための好ましい細菌種であった;しかし、大腸菌が生産しにくい製品もある。したがって、他の細菌種のアビトリュント株は、いくつかの市販品の生産に有用な代替手段を提供することができる。緑膿菌は、大腸菌に代わる適切な代替を提供できる一般的でよく研究されたグラム陰性細菌である。しかしながら、P.アルギノーサは日和見ヒト病原体である。ここでは、pEX100T-NotIプラスミドを用いた逐次ゲノム欠失を介してP.アルギノーサの非病原性株を生成するために使用できる手順を詳述する。この方法の主な利点は、マーカーフリー株を生成することです。この方法は、市販品の製造のための高度に減衰したP.アルギノーサ株を生成するために、または他の特定の用途のための株を設計するために使用され得る。我々はまた、大腸菌のFDA承認BL21株と比較して遺伝子操作された株の減衰をテストするために検証された試験株の腹腔内注射を介して細菌全身感染の単純かつ再現可能なマウスモデルを記述する。
Introduction
緑膿菌は、ヒト、特に免疫不全において生命を脅かす疾患を引き起こす可能性のある日和見細菌病原体である。P.エルギノーサの病原性は、プロテアーゼおよびリポ多糖を含む多くの毒性因子の発現、ならびに保護バイオフィルム1を形成する能力に起因する。病原性因子を産生し、ヒトに疾患を引き起こす能力のために、P.アルギノーサを使用して市販品を安全上の懸念を提示する。大腸菌の非病原性株は、伝統的に人間の使用のためのバイオエンジニアリング医療および商業製品に使用されてきました。しかし、大腸菌が作るのが難しい製品もあれば、封入体に包装されている製品も多く、抽出に手間がかかるものもあります。特定の製品を作り、分泌する能力を持つ操作された細菌株は、分泌が収率を増加させ、精製プロセスを容易にする可能性が高いので、非常に望ましいです。したがって、細菌の他の種の非病原性株(例えば、より多くの分泌経路を利用する種)は、大腸菌に有用な代替手段を提供し得る。我々は最近、生物の病原性及び毒性が高く減衰するP.アルギノーサ、PGN5の株の開発を報告した2.重要なことに、この株はまだ多糖アルギン酸塩を大量に生成し、P.エルギノーサバイオフィルムの商業的に興味深い成分である。
PGN5株は、pEX100T-NotIプラスミドとの2段階のアレル交換手順を用いて生成され、生物の病原性に寄与することが知られている5つの遺伝子(toxA、plcH、phzM、wapR、aroA)を順次削除した。 pEX100T-NotIは、ハーバート・シュバイツァーの研究室3、4で開発されたプラスミドpEX100Tの多重クローニング部位内のNotI制限酵素認識部位にSmaIを変更することによって生成された。制限酵素NotIの認識部位は、SmaIに比べて稀なDNA配列であり、クローン化される配列中に存在する可能性が低いため、クローニングの目的でより便利である。プラスミドは、β-ラクタマーゼをコードし、カルベニシリンに対する耐性を付与するブラ遺伝子や、スクロースに対する感受性を付与するB.サチリサッカB遺伝子を含む、選択を可能にする遺伝子を運ぶ(図1A)。プラスミドはまた、大腸菌と互換性のある複製(ori)の起源、および結合を介して大腸菌からシュードモナス種へのプラスミド移動を可能にする転写(oriT)の起源を運ぶ。しかし、プラスミドはシュードモナスと互換性のある複製の起源を欠いているため、シュードモナス種内で複製することはできません(すなわち、シュードモナス自殺ベクターです)。これらの特性は、シュードモナス染色体からの遺伝的欠失を標的とするのにpEX100T-NotIを理想的にする。プラスミドクローニング工程は大腸菌を用いて行われ、得られたプラスミドは形質転換または結合によってシュードモナスに移される。そして、相同組換えイベントおよび選択的ステップを介して、標的化されたフレーム内欠失が生成され、マーカーフリーである。P.アルギノーサの染色体からゲノム領域を順次削除するこの方法は、PGN5のような高度に減衰したシュードモナス株を生成するために、または他の特定の用途のための株を設計するために使用することができる(例えば、プラスミド伝播のためのエンドヌクレアーゼの株欠乏またはプロテアーゼの株欠乏)。
細菌株の全体的な毒性は、突然変異が頻繁に起こる増殖条件および相の影響を受ける。したがって、遺伝子組み換え株の安全性を測定することは困難な場合があります。全身性毒性に対する細菌分離株を評価するために、C57BL/6マウス5の腹腔内注射による感染の以前に公表されたプロトコルを適応させた。注射に冷凍細菌ストックを使用するようにこの手順を変更し、正確な検査と使用する株の簡単な検証を可能にしました。このモデルでは、バイオ医薬品の製造に対してFDA承認されている大腸菌株BL21を、株6、7、8の相対病因を決定するための制御安全基準として用いた。この方法を使用する主な利点は、感染株が感染の前後の両方の細菌細胞数、表現型、および遺伝マーカーについて検証されるため、再現性があり、変動の原因を最小限に抑えるということです。これらの制御されたステップによって、必要な動物の数は減少する。このモデルでは、P.アルギノーサ株は、腹腔内注射時にC57BL/6マウス死亡率が大腸菌BL21以下をもたらすと考えられ得る。この単純なマウスモデルの感染は、FDA承認大腸菌株を基準として、他の種由来の遺伝子操作株の減衰病原性を評価するためにも使用され得る。ステップ1~7は、P.アルギノーサにおける逐次ゲノム欠失の生成を詳細に説明し(図1)、ステップ8~12は、P.アルギノーサ株の病原性を試験するためのマウスモデルの使用について詳述する。
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Protocol
動物実験を開始する前に、使用するプロトコルは、機関動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されなければなりません。記載されたプロトコルの承認は、マーシャル大学(ハンティントン、WV、米国)のIACUCを通じて得られました。
1. プラスミドデザイン
- pEX100T-NotIプラスミドを用いて遺伝的欠失を生成するために、所望の欠失配列を横切るDNAの領域をクローン化し、プラスミドのNotI制限部位に挿入する。プラスミド挿入物は、標的欠失配列の下流約500ヌクレオチドに直接隣接する標的配列の上流に約500ヌクレオチドを含むべきである。さらに、挿入には、5' および 3' の端に NotI 認識シーケンス (GCGGCCGC) が含まれている必要があります (図 1B)。
2. プラスミド製剤
- オプション 1: 従来のクローン作成手順を利用します。PCRを使用して目的の遺伝子の上流および下流のゲノム領域を増幅し、続いてクロスオーバーPCR9、10が生成されたフラグメントに結合し、PCR産物およびプラスミドのエンドヌクレアーゼ消化を制限し、ライゲーション11(図1B,C)を行う。
- オプション2:silicoで削除シーケンスを設計した後、デノボがプラスミドpEX100T-NotIに挿入するためにそれを合成する会社を契約します。多くの企業は、クローニングのプロセスを合理化し、関心のあるプラスミドを迅速かつ効率的に生成しています。さらに、配列は、分娩の前にプラスミドが突然変異を含まないことを確認する。
3.大腸菌変換
- メーカーの推奨事項に従ってプラスミドで電気コンピテント大腸菌を変換します。無菌接種ループを使用して、カルベニシリンを100μg/mLで補充した予備温めルリアブロス(LB)寒天プレート上の単離コロニーの変換反応の10°Lをストリークし、37°Cで一晩インキュベートします。
注:細菌の培養に使用されるすべての機器と媒体は、機関の安全ガイドラインに従って処理する必要があります。 - 通路は2回。
- インキュベーターからプレートを取り出し、隔離されたコロニーを特定します。無菌接種ループを使用して、コロニーをピックアップし、単離されたコロニーのためのカルベニシリンの100 μg/mLを補った事前に温めたLB寒天プレートをストリーク。37°Cで一晩インキュベートする。この手順をもう一度繰り返して、純粋なカルチャを生成します。
- 無菌接種ループを用いて、最終寒天プレートから単一コロニーでLBの5mLを接種する。一晩37°Cで振るインキュベーターに培養物を入れます。翌日、この培養物の1mLを1mLと5%の凍結に混ぜ、-80°Cで保存して、株の凍結ストックを生成する。
4. 細菌株の調製とトリペアレンタル
- 以下の株の寒天プレートから単一の単離コロニーを使用して、ブロス培養物を接種し、37°Cで一晩振とうインキュベーターに入れます。
- カルベニシリン100μg/mLを添加したLBの5mLに大腸菌pEX100T-NotIを加えます。
- P.エルギノーサ株PAO1をシュードモナスアイソレーションブロス(PIB)の5mLに添加する。
- 大腸菌prk2013を5mLのLBに加え、カナマイシン50μg/mLを加えた。
注:prk2013プラスミドは、大腸菌で複製するヘルパープラスミドですが、P.アルギノーサではありません。大腸菌ドナーからP.アルギノーサレシピノサレシピエント12にpEX100T-NotIプラスミドを動員するトランス作用性転写遺伝子を運ぶ。P. エルギノーザは、バイオセーフティレベル2(BSL-2)病原体である。BSL-2生物を扱う場合は、安全に関する機関のガイドラインに従ってください。
- 翌日、インキュベーターから一晩培養物を取り出し、1.5mLマイクロ遠心管に各培養物の0.5mLを加える。6,000 x gで5分間遠心分離剤を廃棄し、LBの50〜100°Lで細胞ペレットを中断します。
- 1滴で細胞懸濁液全体を、予め温めたLB寒天板にピペットします。液滴を乾かします。その後、プレートを反転し、4-6時間37°Cでインキュベートします。
- インキュベーション後、滅菌接種ループを使用して、マイクロ遠心管内のLBの1 mLに細胞を収集します。ピペット上下にピペットは、細胞を混合します。
- 細胞拡散剤を使用して、300μg/mLのカルベニシリンを補充した乾燥した予備温めシュードモナスアイソレーション寒天(PIA)プレート上に均等に細胞をストリーク。細胞混合物の体積が増加する複数のプレート(例えば、10°L、100°L、500°L)をストリークします。37°Cで一晩インキュベートする。
5. P.アルギノーサのシングルクロスオーバー組換え剤の検出
- インキュベーターからプレートを取り出し、孤立したカルベニシリン耐性コロニーを検査します。pEX100T-NotIプラスミドはP.アルギノーザでは複製できないため、カルベニシリン補充プレート上で成長したコロニーは、プラスミドが染色体に統合された細胞から生じるべきである。
- これらのコロニーの少なくとも4を選択し、カルベニシリンの300 μg/mLを補充したPIAの事前温めプレートに分離します。37°Cで一晩プレートをインキュベートする。
- インキュベーターからプレートを取り出し、成長を検査します。カルベニシリン耐性コロニーは、シングルクロスオーバー組換え(すなわち、プラスミドインサートの相同領域とP.アルギノーサの染色体との相同領域との再結合事象を介してプラスミドを染色体に組み込んだ)である必要があります。
- 無菌の爪楊枝をあらかじめ温めたプレートにパッチ8以上のコロニー:1)カルベニシリンの300μg/mLと2)PIAを補う300μg/mLのカルベニシリンと10%スクロース(グリセロールなし)を補充した。
- ステップ5.1からコロニー増殖が得られない場合は、コンジュゲーションを繰り返し、ステップ4.5でストリークした細胞混合物の体積を増加させる。あまりにも多くの成長が発生した場合は、活用を繰り返し、ストリークボリュームを減らします。
- 結合が繰り返し失敗した場合は、P.アルギノーサ株の電気コンピテントセルを調製し、pEX100T-NotIプラスミドで直接変換します。電気有能なP.アルギノーサおよび変換の調製のための詳細なプロトコルは、他の場所で利用可能です13,14.
- 一晩37°Cでプレートをインキュベートします。
- インキュベーターからプレートを取り出し、成長を検査します。真のシングルクロスオーバー組換えは、カルベニシリン耐性およびスクロース感受性(すなわち、カルベニシリンを補充したPIAで成長したが、カルベニシリンとスクロースを補充したPIAで成長しなかったコロニー)である。
- 4つ以上の真のシングルクロスオーバー組換えを選択し、選択せずにLBの5 mLにそれぞれ接種します。37°Cで一晩振るインキュベーターでインキュベートする。
- シングルクロスオーバー組換えが検出されなかった場合は、コンジュゲーションを繰り返します。
6. P.アルギノーサの二重クロスオーバー組換え剤の検出
- 各ブロス培養について、10%のスクロース(グリセロールなし)と単離されたコロニーのストリークを加えたPIAの予温プレートに10μLの培養物を接種する。37°Cで一晩プレートをインキュベートする。
- 翌日、インキュベーターからプレートを取り出し、成長を調べます。スクロース耐性コロニーは、ダブルクロスオーバー組換え(すなわち、プラスミドインサートとP.アルギノーサ染色体の他の相同領域との再結合イベントを介して染色体からプラスミドを除去した)である必要があります。
- 無菌の爪楊枝をあらかじめ温めたプレートに少なくとも20コロニーをパッチ:1)PIA、2)PIAは10%スクロース(グリセロールなし)を補充し、3)PIAはカルベニシリンの300μg/mLを補充した。
- 37°Cで一晩プレートをインキュベートする。
- インキュベーターからプレートを取り出し、成長を調べます。真のダブルクロスオーバー組換えは、カルベニシリン感受性およびスクロース耐性(すなわち、スクロースを補充したPIAおよびPIAで成長したコロニーが、カルベニシリンを補充したPIAで成長しなかった)であろう。
7. コロニーPCRによる遺伝子欠失確認
- PCRで削除画面の10-20コロニーを準備します。
- 無菌の爪楊枝で疑われる二重クロスオーバー組換えから成長をピックアップし、1xリン酸緩衝生理食塩酸(PBS)の50°Lで細胞を中断します。懸濁液を100°Cで10分間沸騰させ、遠心分離機を13,000×gで3分間沸騰させ、氷の上に置きます。
- PCR を実行して、対象の削除のコロニーをスクリーニングします。
- 目的の遺伝子の欠失を確認するために、25μL PCR反応の鋳物として上清の1μLを使用する。
- ゲノム欠失の領域を増幅する遺伝子特異的プライマーを使用する。ゲノム欠失の領域に加えて、上流および下流のシーケンスの100〜200 bpを増幅するプライマーを使用してください。
- 親株(例えば、PAO1)との別の対照PCR反応を準備する。
注:サーモサイカーの状態は、プライマーペアの最適なアニーリング温度、使用されるポリメラーゼカクテル、および増幅される領域の長さによって異なります。
- PCR産物に対してアガロースゲル電気泳動を行う。対象領域が削除されたコロニーは、削除を欠いているコロニーよりも小さい増幅産物を生み出す(図2)。
- PCR 確認による削除を含む 1 つ以上のコロニーを選択します。単離されたコロニーを予め温めたPIAプレートにストリークし、一晩で37°Cでインキュベートする。
- 少なくとももう一度は通路。インキュベーターからプレートを取り出し、隔離されたコロニーを特定します。無菌接種ループを使用して、コロニーをピックアップし、単離されたコロニーのための事前に温めたPIA寒天プレートをストリーク。37°Cで一晩インキュベートする。
- 各最終プレートからコロニーを選択し、PIBの5 mLを接種するために使用します。37°Cで一晩振るインキュベーターに入れます。
- この培養物の1mLを凍結乳中に5%スキムミルク1mLと混ぜ、-80°Cで保存して株のストックを生成します。
- この培養物を用いて、株からゲノムDNAを調製する(例えば、DNA精製キットを用いた)。目的領域に特異的なPCRおよびプライマーを用いてゲノム欠失領域を増幅する。
- これらのPCR産物(例えば、DNA精製キット、またはフェノールクロロホルム抽出)を精製し、遺伝子特異的プライマーで直接配列するか、プラスミド特異的プライマーでシーケンシングするためのベクターに連結する。
- 遺伝子の欠失がシーケンシングによって確認された後、新しい欠失株でこの手順を繰り返し、多数のマーカーフリーゲノム欠失を順次生成します。所望の株が生成されたら、全ゲノムシーケンシングを使用して標的の欠失を検証し、プロセス全体を通して発生したゲノム(例えばPAO1と比較して)に対する他の変化を検出します。遺伝子にコメントした後、GenBankに配列をデポジットし、アクセス番号を記録します。
8. 動物実験用細菌株の調製
- P.アルギノーサ株の減衰病原性を試験するには、まず検証済みの培養物やストックを調製する。目的のP.アルギノーサ株、P.アルギノーサの野生型株(毒性)、およびFDA承認型大腸菌株(例えばBL21)を非病原性安全制御として機能するように準備する。
- 試験中の細菌の菌株を、配列および検証された凍結ストックから選択的寒天にストリークする。37°Cで一晩インキュベートする。
- 無菌接種ループで、各株から単一のコロニーをピックアップし、再び選択的な媒体に隔離されたコロニーのためのストリーク。37°Cで一晩インキュベートする。
- インキュベーターからプレートを取り外します。各株のために、LBプレートに分離するための単一のコロニーとストリークを選択します。
- 37°Cで24時間成長した後、各株から単一コロニー分離して250mLのLBを含む500mLフラスコを接種する。
- 検証ステップ:同じコロニーの残骸を使用して、PCRおよび株特異的プライマー、および/またはプライマーを使用して株を検証し、株に対して行われた遺伝子改変の存在を検証する。提示された例のひずみの検証には、以下のプライマーを使用してください。
大腸菌BL21:
T7ポリメラーゼ F:TGGCTATCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCtG
T7ポリメラーゼ R:TTACGCGAACGAGTCC
VE2 および PGN5:
アロアF: GCGAACGCCAACAGCCATAAAGC
アロアR: ATCTCTCTCTGCGGCCCC
- 検証ステップ:同じコロニーの残骸を使用して、PCRおよび株特異的プライマー、および/またはプライマーを使用して株を検証し、株に対して行われた遺伝子改変の存在を検証する。提示された例のひずみの検証には、以下のプライマーを使用してください。
- 160 rpmおよび37°Cで揺れるインキュベーターで培養物をインキュベートし、それらが対数相成長に達するまで(すなわち、分光光度計で0.4〜0.6のOD600測定)。
- 対数位相達成時に得られたOD600値を用いて、mLあたり2.5 x109コロニー形成単位(CFU)を得るために必要なブロスの体積を計算する。4,500 x gで50mLチューブで10分間計算したスープの体積をペレット。
- 上清を廃棄し、1x PBSの50 mLを使用して1本のチューブにペレットを再サスペンドし、細胞を洗浄します。再び4,500 x gで10分間遠心分離。
- 上清を捨て、1x PBSで5%スキムミルクの25 mLでペレットを再サスペンドします。
- 検証ステップ: 25 mL リサスペンションのサンプルを使用して、実行可能プレート数を実行し、CFU/mL の数を決定します。
- アリコートは25mLスキムミルク培養液を2mLのクライオビアルで2mL培養株にリサスペンションする。液体窒素中のフラッシュ凍結と使用前に少なくとも一晩-80°で保存します。
9. 動物実験用に貯蔵された株の成長とひずみの検証
- 試験する各株について、-80°Cの貯蔵から冷凍ストックの少なくとも3つの凍結を取り除き、2〜4時間4°Cで解凍します。凍結したストックが残っている場合は、37°Cで短時間暖かくします。
- 各菌株から小さなサンプルを採取して、各菌株を検証します。
- 実行可能プレート数を実行して、CFU/mL の数を決定します。いくつかの細菌細胞の死のために、凍結後のCFU/mLの数が少ないのが正常です。
- PCRおよびひずみ固有のプライマーを使用して、各ひずみを検証します。
- 各ひずみを選択的な媒体に引き込み、表現型を検証する。
- 株が正しい遺伝子型と表現型であることを確認した後、CFU/mLを検証し、動物実験に進みます。
10. 注射による細菌株による動物の接種
- 注射の朝に、試験中の細菌株の凍結膜を取り除き、注射されるマウスごとに3-4時間Thaw 0.5 mLの4°Cで解凍します。解凍後はバイアルを氷の上に置き、2時間以内にマウスを注入してください。
- 解凍後、各凍結管を新しい2mLチューブに移し、4,500 x gで10分間遠心分離機を移し、上清を廃棄し、細胞ペレットを1x PBSの1mLで再サーデレントする。
- 10 mの4,500 x gで再び遠心分離剤を1x PBSで廃棄し、ペレットを最終濃度2.5 x 109 CFU/mLに再サスペンドします。再サスペンションに必要な1x PBSの量を決定するには、ステップ2.2.1で凍結ストックの実行可能プレート数から得られたCFU/mLデータを使用します。使用される1x PBSの正確な量は、株間でわずかに異なります。
- 上記のように、各株の最終懸濁液から3サンプルを採取し、CFU/mL、遺伝子型、表現型を検証します。
- 各株について、5匹のマウスにつき1つの2mLチューブにPBS/細胞懸濁液のアリコート1.5mLを、チューブが入力される回数を制限する。また、コントロール注射用に1x PBSのチューブを用意します。
- マウス(この実験のために1グループあたり10人の男性と10人の女性C57BL/6)と注射に必要な材料(注射器、針、鋭い容器、マーカー、ペンおよび紙など)を収集する。無菌動物手術室に移動します。消毒ワイプですべての表面を拭きます。
- 実験者の苦痛と傷害のリスクを排除するために、一度に1つの性別および実験グループのマウスを手術室に持ち込む(例えば、特定の株に感染する10匹の雄マウスのグループ)。噛まれた場合は手袋の穿刺を排除するためにラテックス手袋の2ペアを着用してください。汚染を避けるため、ラボコート、安全メガネ、フェイスマスクを着用してください。
- 1x PBSで対照群の注入を開始します。これは、注射のみから何らかの副作用が生じるかどうかを確認します。
- ケージからマウスを取り外します。一度に 1 つのマウスのみを削除します。
- マウスの重量を量り、その尾に永久マーカーをマークして、減量後の注入を追跡します。
- 新しい1 mLシリンジと27 G針(汚染を排除するために各マウスに新しい注射器と針を使用)を開き、滅菌1x PBSの200 μLを注入します。
- 親指と人差し指を使用して、耳の後ろにマウスをつかみます。つまみは、首のうなじで皮膚の折り目を作成し、保持する - タイトな折り目は、首の動きと注射中に噛まれるリスクを軽減します。ピンキーを使用して手のひらに尾を固定し、ほとんど動かしてマウスを平らに保持します。
- マウスを裏返し、30°の角度で針を中間線の左側または右側の腹腔に挿入します。針を一度挿入したら、臓器ではなく腹腔内領域に挿入されていることを確認します。PBSをゆっくりと注入し、針を引き出します。
- 使用済み針を指定されたバイオハザードシャープス容器に入れます。注射器や針を再利用しないでください。注射部位のボーラスは典型的である。
- 注射後、マウスを別のケージに移動します。
- 次のマウスで手順を繰り返します。1つのケージのすべてのマウスを注入した後、すぐに元のケージに戻します。
- 対照群を注入した後、同じ手順に従って試験する株の懸濁液の注入を開始する。
- 細胞懸濁液の200μLを注入する。2.5 x 109 CFU/mL のセル懸濁液から始めると、各マウスは 5 x 108 CFU を受け取ります。
注:これらの濃度は、各株の致死量を決定するために予備的な動物研究で最適化されました。他の株/種のためにドーピングを調整する必要があるかもしれません。
- 細胞懸濁液の200μLを注入する。2.5 x 109 CFU/mL のセル懸濁液から始めると、各マウスは 5 x 108 CFU を受け取ります。
- すべての注射が完了したら、苦痛を軽減するためにハウジングルームにマウスを戻します。消毒ワイプ付きのクリーンワークエリア。
- 72時間ごとに3時間毎、12時間ごとに10日間、死んだマウスのケージをチェックして、注射後の死亡率を動物に監視します。病気による体重減少を判定するために、12時間ごとにマウスの体重を記録します。
- 姿勢の違い、グルーミングや穴埋めの欠如、不動、呼吸の変化など、注射後の時間に有害な行動を記録する。注射に伴う傷害で死亡したマウスは、有害な行動を示し、注射後すぐに死ぬ。一方、感染死したマウスは、18時間後まで有害な行動や死亡を示し始めないだろう。急速または労力の呼吸、不動、腰痛、目のくぼみ、重度の脱水症状、その他を含む有害な行動または罹患率の広範な徴候を示すマウスは、不必要な苦しみを軽減するために安楽死させるべきである(当社に準拠している)。承認された IACUC プロトコル)。しかし、我々の実験では、実験中のマウスに安楽死は必要なかった。生存マウスは、試験終了後10日後に安楽死させた。
- 10日間のモニタリング期間の後、残りの動物が完全に回復し、検査中に投与された感染が明らかになるようにする。IACUC手順に従って動物を安楽死させる。
11. 動物死亡率の統計分析
- グラフ作成ソフトウェアを使用して統計解析を実行します。グラフを生成し、統計分析を実行できるソフトウェアは、いずれも適しています。
- 死亡率データをプロットするには、X 列を使用して時間 (h) を表し、Y 列を使用してテストされたグループを表します。
- サンプル内の各マウスまたは被験者を、それぞれ生存または死亡を示すコード = 0 (ゼロ) またはコード = 1 を使用して表します。
- 死ぬ動物ごとに、死亡時にその群のY列に1をX列に置きます。グループ内の 1 つの時点で複数の死亡がある場合は、その時点のコピーを [X] 列に配置できます。たとえば、グループ内の 3 つの被験者が 3 時間で死亡した場合、3 時間の時点は X 列に 3 回表示されます。
- グループ内で生き残っているすべての動物について、測定した最終時点の Y 列にゼロを配置します。たとえば、4匹のマウスが生き残った場合は、[Y] 列に 4 つのゼロが付いた X 列に 4 つの終了時間ポイントを配置します。
- すべてのグループの動物データを入力した後、生存グラフテンプレートを使用して生存グラフを作成します。
- 既定のコーディングは 0 と 1 のままにします。
- グラフのパラメータをパーセンテージで設定します。
- 生存曲線のパラメータを選択したら、マンテルコックス(ログランク)検定を使用して統計解析を実行します。
- 統計データを使用してカプラン・マイヤープロットをフォーマットします。
注:親株およびFDA承認株(例えば、大腸菌BL21)以下の死亡率を示す株は減衰していると考えられる。
12. 生物発光感染の可視化
- 感染の進行状況を可視化するために、試験したPGN5およびVE2株に染色体生物発光オペロン(luxCDABE)を挿入する。これらの株を標識するために使用されるプラスミドおよびプロトコルは、シュバイツァーラボで開発され、細菌13のすべての種/株と互換性がないかもしれない。重要なことに、感染の可視化は任意です。したがって、このオペロンのゲノム挿入は、上述した死亡率研究を行う必要はない。
- 上記の方法を使用して、ひずみを準備し、検証します。さらに、各検証ステップで標識株の生物発光をチェックします。
- 株が調製された後、上記の手順に従って生物発光株を有する10のグループで動物を注入する。
- 生物発光が可能な動物イメージングシステムを用いて、3時間毎に動物を24時間画像化する。
- まず、カメラパラメータを設定し、動物のためのステージを加熱することにより、イメージャーを準備します。また、酸素の流れを 1 分あたり 1.5 L に設定します (または製造元の推奨事項に従います)。
- イメージャーとステージが安定化した後、注射直後に1本のマウスを麻酔室に入れ、約4分間O2フローでチャンバーに3.5%のアイオフランを投与する。麻酔方法は、使用するチャンバーおよび/または麻酔薬によって異なる場合があります。製造元の推奨事項に従ってください。離脱反射検査で適切な麻酔を決定する。
- マウスを温度安定化ステージに移動します。腕を伸ばして背中にマウスを置き、イメージング手順全体を通して2.5%のアイソフルランを投与するために、マウスをノーズコーンでフィットさせます。
- ドアを閉め、生物発光画像とマウスのX線を撮ります。
- イメージングが完了したら、マウスをケージに戻して監視します。マウスは3-5分以内に意識を取り戻す必要があります。
- 24時間毎に3時間毎にマウスを画像化し続け、毎回各群とは異なるマウスを使用する。麻酔への再暴露による悪影響の可能性があるため、24時間以内にマウスを再画像化しないでください。1匹のマウスは、24~36時間ごとに1回の麻酔を受ける必要があります。イメージングタイムポイント間のイメージャーの電源を切ります。
注:バイオルミネッセンスは、注入されたひずみを問わず消えます。生物発光の強度と寿命は、注入される細菌の数、マウス株、細菌株など、多くの要因によって異なります。
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Representative Results
図2に示すように、標的ゲノム欠失は、目的領域を増幅する特定のプライマーを有するコロニーPCRを用いて確認することができる。ゲノム欠失を伴うコロニーは、野生型コロニーに比べてPCRバンドサイズが短くなります。10-12コロニーのPCRスクリーンは、通常、標的欠失を運ぶ少なくとも1つのコロニーを検出するのに十分である。画面の複数のラウンド後に削除が検出されない場合は、コンジュゲーションから手順を繰り返します。それでも削除が失敗する場合は、プラスミド挿入物をシーケンシング、再設計、または削除が致死的であることを確認する必要があります。PCRを介した遺伝子欠失の検証に際して、シーケンシングによる欠失を確認する。得られた株は、逐次ゲノム修飾を生成する手順を繰り返し行って行われ得る。
図3に示すように、P.アルギノーサPGN5(+mucE)の減衰株の腹腔内注射に伴う死亡率は0%であり、これは大腸菌BL21で観察された死亡率に相当した。一方、親株(VE2)の腹腔内注射はマウスの80%に致命的であった。これらの結果は、注入された株を検証するための広範なステップで得られた。これらのマウスにおける死亡の正確な原因は不明であるが、少なくとも部分的には減衰PGN5株から削除された親株における毒性因子の発現に起因することができる。感染の進行の違いは、生物発光マーク付き親および減衰株を用いて追跡された。減衰した株は、生物発光が薄れるまで注射部位に局在したままであった(図4)。感染のクリアランスは、生物発光の退色と最も可能性が高い。生物発光は注射後24時間検出されず、マウスは注射後数週間生き延び、犠牲になるまで何週間も生き、悪影響は認められなかった。
図1:pEX100T-NotIを用いたP.アルギノーサにおける遺伝子欠失の生成(A) pEX100T-NotIプラスミドの地図。(B)目的領域(ROI)の直流(黄色)及び下流(青)の領域からなる構成体の生成を、NotI制限酵素認識部位と並べた。まず、PCR-増幅アップストリームおよび下流領域は、5' NotI消化部位を追加する特定のプライマー(例えば、NotI-aroA F CGCCCCCGCGCCCCCCCCCCCGAAGCGTTCTおよびNotI-aroA R GCGGCCAGTGTGTGTGTGTGTGTGTC GCCAGGCA)と3'重なり合う相同領域(例えば、アロア-クロスオーバーF CTCCAGGCGCGCGCGGGGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCTGCTGCTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG CCGTGGAGACAとアロア-クロスオーバーRTGTTCTCCACGGCGACCGGTGTGTGTGTGTGTCTCATGCGCCAGCCAGCCGCGCGCGCGCGGG.次に、PCR with NotI 含有プライマーを使用して、最初の PCR 反応で生成された上流および下流の製品に参加します。(C) pEX100T-NotI プラスミドは、武装して準備ができている。NotI消化クロスオーバーPCR製品をNotI消化プラスミドにリゲートします。(D)pEX100T-NotIプラスミドを用いてP.緑膿菌染色体からゲノム領域を削除するプロセスのフロー図。所望の欠失が確認され、精製された後、得られた株は、染色体から他のゲノム領域を削除する手順を繰り返し行うことができる。所望の株が得られたら、ゲノム全体を配列して染色体の欠失やその他の変化を確認する。株の病原性は、プロトコルの第2部で概説された手順を使用してマウスで試験することができる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:アロア欠失のためのスクリーンからのコロニーPCR産物のゲル電気泳動は、減衰したP.アルギノーサ株、PGN5を生成する。コロニーPCR製品はレーン2-5および8-11で実行され、野生型のアロAを有するコロニーを示す。コロニーPCR産物は、レーン6および7で実行され、より小さいPCR産物(黄色のアスタリスク)によって示されるアロA遺伝子欠失を運ぶ。アロア遺伝子を含むゲノム領域を特異的に増幅して使用するプライマー:アロア-F:GCGAACGCCAACCCGATAAGC、およびアロア-R:ATCTGGCTGCGGCCCCCCCC。野生型コロニーにおける予想PCR産物サイズは2,548ヌクレオチド(nt)であった。アロA欠失を伴うコロニーにおける期待されるPCR産物サイズは307 ntであった。DNAはしごはレーン1と12で走っていた。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:病原性P.アルギノーサ株(VE2)、減衰P.アルギノーサ株(PGN5+mucE)、およびFDA制御大腸菌株(BL21)を注射したマウスの全体的な死亡率。病原性親株を注射したマウスのみが80%で死亡率を示した。減衰P.アルギノーサ株およびFDA対腸菌株は0%死亡率を示した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:生物発光マーカーを担うP.エルギノーサPGN5+mucEの減衰株のマウス3h後注入の画像。生物発光細菌は、注射後18〜24時間まで検出可能であった。この期間中、生物発光は、細菌が注射部位に局在したままであることを示す注射部位にとどまった。このマウスは、悪影響を及ぼさなかった完全に回復しました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
pEX100T-Not1プラスミドは、マーカーフリーでフレーム内の逐次ゲノム欠失の効率的なメディエーターです。減衰した毒性に対する細菌株を工学的に行う場合、点突然変異を発生させるのではなく、遺伝子配列全体を欠失すると、毒性表現型への復帰の可能性が減少する。さらに、各病原性遺伝子欠失は、さらに病原体を減衰させ、減衰の安定性を強化する。
この方法は、プラスミド挿入物の設計を改変するだけで、点突然変異や挿入などの欠失以外のゲノム修飾を生成するためにも使用できる。これらのタイプの修飾は、例えば、改変代謝を有する細菌を工学するための遺伝子欠失全体よりも有用である可能性がある。逐次ゲノム修飾は、研究および産業における特定の目的に合わせてデザイナー細菌株を生成する大きな可能性を有する。細菌における所望のマーカーフリーゲノム修飾を生成する他の方法は、15、16、17、18に記載されている。すべてのゲノム編集方法と同様に、本質的なゲノム領域に対する試みによる改変は致死的であり、したがって失敗する可能性があります。これらの場合、異なる遺伝子改変または他の候補遺伝子の同定は、目的の細菌株を生成するために必要とされる。
このプロトコル全体を通じて各コロニーの多数の複製イベントと通路を考えると、ゲノムに対する意図しない変化が生成された株に対して起こります。正確なゲノム変化は、全ゲノムシーケンシングを通じて同定することができる。ただし、これらの変更の影響を判断することは困難です。特定の目的のために細菌を工学化する場合、生物の増殖や標的経路に悪影響を及ぼさないゲノム変化は許容できる。生成されるひずみに応じて、「読み出し」を識別して、そのひずみが意図した目的に対して依然として有用であることを確認できる場合があります。例えば、PGN5では、大量のアルギン酸塩を産生する能力を保持する減衰株を作成することが目標でした。5つの病原性遺伝子を欠失した後、PGN5によって産生されるアルギン酸塩の量および組成を測定し、他のアルギン酸産生株に匹敵すると判断した。したがって、アルギン酸産生は、5つの遺伝子欠失、およびPGN5の開発中に生じた意図しないゲノム変化の影響を受けなかった。
腹腔内マウス注射のモデルは、バイオ医薬品の製造のためにFDAによって承認された株である親株および大腸菌BL21と比較して、工学的ひずみが減衰したかどうかを判断するために使用された。この動物実験手順の間に取られた最も重要なステップは、凍結された細菌ストックの調製と検証でした。マウスを注入する冷凍細菌培養物の調製および使用は、細菌集団19で自然に生じる数の突然変異を減少させるので、連続培養を用いることが好ましい。さらに、凍結された文化は何年も存続可能であるべきです。生存可能プレート数は、株式調製直後および準備後3ヶ月後のCFU/mLとの間に有意差を示さなかった。この手順を通じて複数の検証ステップを使用することで、この方法が再現可能であり、その結果が細菌を汚染することによって歪められることがないようにしました。さらに、再現性を確保するための予防措置の数に伴い、必要な動物の数は少なくなりました。コントロールとしてバイオ医薬品の生産のためにFDA承認されている細菌株(大腸菌株BL21など)を使用して、この方法は、P.緑の生類、または細菌の他の種の他の遺伝子操作株の減衰をテストするために使用することができる。
マーカーとして生物発光を使用すると、マーカーが注射部位で可視化できるため、注入された細菌株の追加検証が可能となる。細菌染色体への生物発光マーカーの挿入は、生物発光イメージングに必要であるが、互換性のない株/種で作業する場合は不可能な場合があります。しかし、生物発光を有するマーキング株は、減衰を試験する必要はない。この研究でテストされた株は生物発光でマークされ、感染の過程を通じて株間の局在化の違いを可視化することができました。我々は、病原性株がマウスの体内を通して広がっていることを観察したが、非病原性株は注射部位に残った。この実験は、P.アルギノーサの2つの非常に密接に関連する株をテストしただけであるが、細菌の播種は、少なくともP.アルギノーサにおいて、毒性に関連していることを示唆している。したがって、感染の進行を可視化するために生物発光で標識するこの手順は、細菌の操作された株の減衰を迅速に評価するために将来的に使用することができる。
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Disclosures
著者のホンウェイ・D・ユーは、創世記テクノロジーズ合同会社の最高科学責任者兼共同創設者です。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所(NIH)助成金R44GM113545およびP20GM103434によって支えられた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL tubes with flat caps | ThermoScientific | AB-0620 | via Fisher Scientific |
| 1 mL Syringe | BD | 22-253-260 | via Fisher Scientific |
| 1.5 mL disposable polystyrene cuvette | Fisher Scientific | 14955127 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 27G needle | BD | 14-821-13B | via Fisher Scientific |
| 50 mL tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Centrifuge 5804R | Eppendorf | 04-987-372 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbenicillin disodium salt | Fisher Scientific | BP2648250 | |
| Culture Test Tube, Polystyrene | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| Dneasy UltraClean Microbial Kit (50) | Qiagen | 12224-50 | or preferred method/vendor |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50) | Omega bio-tek | D6493-01 | or preferred method/vendor |
| EcoRI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3101L | |
| Electroporation Cuvettes | Bulldog Bio | NC0492929 | via Fisher Scientific |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| GoTaq G2 Colorless Master Mix | Promega | M7833 | via Fisher Scientific |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System | Perkins and Elmer | CLS136340 | |
| Kanamycin monosulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | |
| Noble agar, ultrapure | Affymetris/USB | AAJ10907A1 | via Fisher Scientific |
| NotI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3189 | |
| One Shot TOP10 Electrocomp E. coli | Invitrogen | C404052 | via Fisher Scientific |
| Phosphate buffered saline powder | Sigma | P3813-10PAK | Sigma-Aldrich |
| Prism 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation broth | Alpha Biosciences | P16-115 | Custom made batch |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A24811 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Toothpicks, round | Diamond | Any brand of toothpicks, autoclaved | |
| TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing | Invitrogen | 45-0030 | |
| XAF-8 Anesthesia System Filters | Perkins and Elmer | 118999 | |
| XGI 8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/Xenogen |
References
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