Generation af in-frame-Gensletnings mutanter i Pseudomonas aeruginosa og testning for virulens dæmpning i en simpel muse model af infektion
Summary
Her beskriver vi en enkel og reproducerbar protokol af musemodel af infektion til at evaluere dæmpning af de genetisk modificerede stammer af Pseudomonas aeruginosa i forhold til USA Food and Drug Administration (FDA)-godkendt Escherichia coli til kommercielle applikationer.
Abstract
Mikroorganismer er genetisk alsidige og forskelligartede og er blevet en vigtig kilde til mange kommercielle produkter og Biopharmaceuticals. Selv om nogle af disse produkter produceres naturligt af organismer, andre produkter kræver genteknologi af organismen til at øge udbyttet af produktionen. Avirulente stammer af Escherichia coli har traditionelt været de foretrukne bakteriearter til fremstilling af biofarmaceutiske; Men, nogle produkter er vanskelige for E. coli til at producere. Således kan Avirulente stammer af andre bakteriearter give nyttige alternativer til produktion af nogle kommercielle produkter. Pseudomonas aeruginosa er en almindelig og velstuderet gram-negativ bakterie, der kan udgøre et egnet alternativ til E. coli. P. aeruginosa er imidlertid et opportunistisk humant patogen. Her, vi detaljeret en procedure, der kan bruges til at generere ikke-patogene stammer af P. aeruginosa gennem sekventielle genomer sletninger ved hjælp af PEX100T-noti plasmid. Den største fordel ved denne metode er at producere en markør-fri stamme. Denne metode kan anvendes til at generere stærkt svækkede P. aeruginosa -stammer til fremstilling af kommercielle produkter eller til at designe stammer til andre specifikke anvendelser. Vi beskriver også en enkel og reproducerbar musemodel af bakteriel systemisk infektion via intraperitoneal injektion af validerede test stammer for at teste dæmpningen af den genetisk fremstillede stamme i forhold til den FDA-godkendte BL21 stamme af E. coli.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa er et opportunistisk bakterie patogen, der kan forårsage livstruende sygdomme hos mennesker, især i immunkompromitterede. Patogeniciteten af P. aeruginosa skyldes ekspression af mange virulensfaktorer, herunder proteaser og lipopolysaccharid, samt dets evne til at danne en beskyttende biofilm1. På grund af sin evne til at producere virulensfaktorer og forårsage sygdom hos mennesker, ved hjælp af P. aeruginosa at gøre kommercielle produkter præsenterer sikkerhedsmæssige betænkeligheder. Ikke-patogene stammer af E. coli har traditionelt været anvendt til bioingeniør medicinske og kommercielle produkter til human brug. Men, nogle produkter er vanskelige for E. coli at gøre, og mange er pakket i inklusion organer, hvilket gør udvinding besværlig. Manipuleret bakteriestammer med evnen til at foretage og udskiller specifikke produkter er meget ønskværdigt, da sekretionen sandsynligvis ville øge udbyttet og lette rensnings processerne. Således, ikke-patogene stammer af andre arter af bakterier (f. eks arter, der udnytter flere sekretions veje) kan give nyttige alternativer til e. coli. Vi rapporterede for nylig om udviklingen af en stamme af P. aeruginosa, PGN5, hvor patogeniciteten og toksiciteten af organismen er stærkt svækket2. Det er vigtigt, at denne stamme stadig producerer store mængder polysaccharidalginat, en kommercielt interessant bestanddel af P. aeruginosa biofilm.
Den PGN5 stamme blev genereret ved hjælp af en to-trins allelisk udveksling procedure med pEX100T-NotI plasmid til sekventielt slette fem gener (Toxa, plch, phzm, wapr, Aroa) kendt for at bidrage til patogenicitet af organismen. pEX100T-noti blev genereret ved at ændre SMAI til en noti restriktion enzym anerkendelse site inden for multiple kloning site af plasmid pEX100T, som blev udviklet i Herbert Schweizer Lab3,4. Anerkendelses stedet for restriktions enzymet NotI er en sjældnere DNA-sekvens sammenlignet med SmaI og mindre tilbøjelige til at være til stede i sekvenser, der klones, således at det er mere bekvemt for kloning formål. Plasmid bærer gener, der giver mulighed for udvælgelse, herunder bla genet, som koder ß-lactamase og giver resistens over for carbenicillin, og B. subtilissacB genet, som giver følsomhed over for saccharose (figur 1A). Plasmid har også en oprindelse af replikation (ori) kompatibel med E. coli, og en oprindelse af overførsel (Orit), der giver mulighed for plasmid overførsel fra E. coli til Pseudomonas arter via konjugering. Plasmid mangler imidlertid en replikation, der er kompatibel med Pseudomonas, og kan derfor ikke replikere inden for Pseudomonas arter (dvs. det er en Pseudomonas selvmords vektor). Disse egenskaber gør pEX100T-NotI ideel til målretning af genetiske sletninger fra Pseudomonas kromosom. Plasmid klonings trin udføres ved hjælp af E. coli , og den resulterende plasmid overføres til Pseudomonas ved omdannelse eller konjugering. Derefter, gennem homologe rekombination begivenheder og selektive trin, den målrettede i-frame sletning genereres, markør-fri. Denne metode til sekventielt sletning af genomområder fra kromosom af P. aeruginosa kunne anvendes til at generere stærkt svækkede Pseudomonas stammer, som PGN5, eller til at designe stammer til andre specifikke anvendelser (f. eks. stammer mangelfuld i endonukleaser til plasmid formering eller stammer mangelfuld i proteaser til produktion af proteiner af interesse).
Den samlede virulens af bakteriestammer påvirkes af vækstbetingelser og-faser, hvor mutationer forekommer hyppigt. Derfor kan det være en udfordring at måle sikkerheden ved genetisk fremstillede stammer. For at evaluere bakterielle isolater til systemisk virulens tilpassede vi en tidligere offentliggjort infektions protokol ved intraperitoneal injektion af C57BL/6-mus5. Vi har ændret denne procedure for at bruge frosne bakterielle lagre til injektion, som tillod præcis dosering og nem validering af de anvendte stammer. I denne model, E. coli Strain BL21, som er blevet FDA-godkendt til produktion af biofarmaceutiske, blev brugt som en kontrol sikkerhedsstandard til bestemmelse af den relative patogenesen af stammen6,7,8. Den største fordel ved at bruge denne metode er, at det er reproducerbare og minimerer kilder til variation, som inficerende stammer er valideret for bakteriecelle nummer, fænotype, og genetiske markører både før og efter infektion. Med disse kontrollerede trin reduceres antallet af dyr, der kræves. I denne model er P. aeruginosa -stammerne, der resulterer i C57BL/6 murine dødelighed lig med eller mindre end E. coli BL21, når de injiceres intraperitonealt, kan betragtes som svækket. Denne simple musemodel af infektion kan også anvendes til at vurdere den svækkede patogenicitet af genetisk manipulerede stammer fra andre arter ved hjælp af FDA-godkendt E. coli stamme som reference. Trin 1-7 detaljeret generering af sekventielle sletninger i p. aeruginosa (figur 1) og trin 8-12 detaljeret brug af en musemodel til at teste patogeniciteten af p. aeruginosa -stammerne.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den pEX100T-Not1 plasmid er en effektiv mægler af sekventielle genomsletninger, der er markør frie og in-frame. Når tekniske bakteriestammer for svækket virulens, sletning af hele gensekvenser i stedet for at generere punktmutationer nedsætter sandsynligheden for tilbagevenden til en virulente fænotype. Derudover dæmper hver gensletning af patogenicitet yderligere det patogen, hvilket forstærker dæmpnings stabiliteten.
Denne metode kan også bruges til at generere genomændringer andr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) tilskud R44GM113545 og P20GM103434.
Materials
| 0.2 mL tubes with flat caps | ThermoScientific | AB-0620 | via Fisher Scientific |
| 1 mL Syringe | BD | 22-253-260 | via Fisher Scientific |
| 1.5 mL disposable polystyrene cuvette | Fisher Scientific | 14955127 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 27G needle | BD | 14-821-13B | via Fisher Scientific |
| 50 mL tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Centrifuge 5804R | Eppendorf | 04-987-372 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbenicillin disodium salt | Fisher Scientific | BP2648250 | |
| Culture Test Tube, Polystyrene | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| Dneasy UltraClean Microbial Kit (50) | Qiagen | 12224-50 | or preferred method/vendor |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50) | Omega bio-tek | D6493-01 | or preferred method/vendor |
| EcoRI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3101L | |
| Electroporation Cuvettes | Bulldog Bio | NC0492929 | via Fisher Scientific |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| GoTaq G2 Colorless Master Mix | Promega | M7833 | via Fisher Scientific |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System | Perkins and Elmer | CLS136340 | |
| Kanamycin monosulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | |
| Noble agar, ultrapure | Affymetris/USB | AAJ10907A1 | via Fisher Scientific |
| NotI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3189 | |
| One Shot TOP10 Electrocomp E. coli | Invitrogen | C404052 | via Fisher Scientific |
| Phosphate buffered saline powder | Sigma | P3813-10PAK | Sigma-Aldrich |
| Prism 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation broth | Alpha Biosciences | P16-115 | Custom made batch |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A24811 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Toothpicks, round | Diamond | Any brand of toothpicks, autoclaved | |
| TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing | Invitrogen | 45-0030 | |
| XAF-8 Anesthesia System Filters | Perkins and Elmer | 118999 | |
| XGI 8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/Xenogen |
References
- Gellatly, S. L., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).
- Valentine, M. E., et al. Generation of a highly attenuated strain of Pseudomonas aeruginosa for commercial production of alginate. Microbial Biotechnology. , (2019).
- Schweizer, H. P., Hoang, T. T. An improved system for gene replacement and xylE fusion analysis in Pseudomonas aeruginosa. Gene. 158 (1), 15-22 (1995).
- Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis. Journal of Bacteriology. 191 (7), 2285-2295 (2009).
- Yu, H., Boucher, J. C., Hibler, N. S., Deretic, V. Virulence properties of Pseudomonas aeruginosa lacking the extreme-stress sigma factor AlgU (sigmaE). Infection and Immunity. 64 (7), 2774-2781 (1996).
- Baeshen, M. N., et al. Production of Biopharmaceuticals in E. coli: Current Scenario and Future Perspectives. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (7), 953-962 (2015).
- Marisch, K., Bayer, K., Cserjan-Puschmann, M., Luchner, M., Striedner, G. Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during high-level SOD protein production. Microbial Cell Factories. 12, 58 (2013).
- Ferrer-Miralles, N., Domingo-Espin, J., Corchero, J. L., Vazquez, E., Villaverde, A. Microbial factories for recombinant pharmaceuticals. Microbial Cell Factories. 8, 17 (2009).
- Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 8 (5), 528-535 (1990).
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).
- Figurski, D. H., Helinski, D. R. Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (4), 1648-1652 (1979).
- Choi, K. H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nature Protocols. 1 (1), 153-161 (2006).
- Choi, K. H., Kumar, A., Schweizer, H. P. A 10-min method for preparation of highly electrocompetent Pseudomonas aeruginosa cells: application for DNA fragment transfer between chromosomes and plasmid transformation. Journal of Microbiological Methods. 64 (3), 391-397 (2006).
- Liang, R., Liu, J. Scarless and sequential gene modification in Pseudomonas using PCR product flanked by short homology regions. BMC Microbiology. 10, 209 (2010).
- Martinez-Garcia, E., de Lorenzo, V. Engineering multiple genomic deletions in Gram-negative bacteria: analysis of the multi-resistant antibiotic profile of Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 13 (10), 2702-2716 (2011).
- Song, C. W., Lee, S. Y. Rapid one-step inactivation of single or multiple genes in Escherichia coli. Biotechnology Journal. 8 (7), 776-784 (2013).
- Yan, M. Y., et al. CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering in Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 83 (17), (2017).
- Prakash, O., Nimonkar, Y., Shouche, Y. S. Practice and prospects of microbial preservation. FEMS Microbiology Letters. 339 (1), 1-9 (2013).
