Snelle fabricage van aangepaste Microfluïdische apparaten voor onderzoeks-en educatieve toepassingen
Summary
Hier presenteren we een protocol voor het ontwerpen en fabriceren van aangepaste microfluïdische apparaten met minimale financiële en tijd investeringen. Het doel is het faciliteren van de invoering van microfluïdische technologieën in biomedische onderzoekslaboratoria en onderwijsinstellingen.
Abstract
Microfluïdische apparaten maken het manipuleren van vloeistoffen, deeltjes, cellen, micro-sized organen of organismen in kanalen variërend van de nano tot submillimeter schalen mogelijk. Een snelle toename van het gebruik van deze technologie in de biologische wetenschappen heeft een behoefte aan methoden die toegankelijk zijn voor een breed scala aan onderzoeksgroepen. De huidige fabricagenormen, zoals PDMS bonding, vereisen dure en tijdrovende lithografische en bonding technieken. Een levensvatbaar alternatief is het gebruik van apparatuur en materialen die gemakkelijk betaalbaar zijn, vereisen een minimale expertise en zorgen voor de snelle iteratie van ontwerpen. In dit werk beschrijven we een protocol voor het ontwerpen en produceren van Pet-laminaten (petls), microfluïdische apparaten die goedkoop zijn, gemakkelijk te fabriceren en aanzienlijk minder tijd verbruiken om te genereren dan andere benaderingen van microfluïdica-technologie. Ze bestaan uit thermisch gebonden film vellen, waarin kanalen en andere functies worden gedefinieerd met behulp van een ambachtelijke cutter. PETLs lost veld-specifieke technische uitdagingen op en vermindert de belemmeringen voor adoptie drastisch. Deze aanpak vergemakkelijkt de toegankelijkheid van microfluïdica-apparaten in zowel onderzoeks-als educatieve instellingen, en biedt een betrouwbaar platform voor nieuwe onderzoeksmethoden.
Introduction
Microfluidics maakt vloeistof controle op kleine schalen mogelijk, met volumes variërend van micro liters (1 x 10-6 l) tot picoliters (1 x 10-12 l). Deze controle is deels mogelijk gemaakt door de toepassing van microfabricage technieken geleend van de microprocessor industrie1. Het gebruik van micro-sized netwerken van kanalen en kamers stelt de gebruiker in staat om te profiteren van de kenmerkende fysische verschijnselen die kenmerkend zijn voor kleine dimensies. Op de schaal van de micrometer kunnen bijvoorbeeld vloeistoffen worden gemanipuleerd met behulp van laminaire stroming, waarbij visceuze krachten de inertiële krachten domineren. Dientengevolge, diffusief transport wordt het prominente kenmerk van microfluïdica, en kan worden bestudeerd kwantitatief en experimenteel. Deze systemen kunnen goed worden begrepen met behulp van Fick’s wetten, de Brownse bewegings theorie, de warmtevergelijking en/of de Navier-Stokes vergelijkingen, die belangrijke afleidingen zijn op het gebied van vloeistofmechanica en transportverschijnselen2.
Omdat veel groepen in de biologische wetenschappen complexe systemen op microscopisch niveau bestuderen, werd oorspronkelijk gedacht dat microfluïdische apparaten een onmiddellijke en significante impact zouden hebben op onderzoekstoepassingen in de biologie2,3. Dit is te wijten aan de diffusie dominant in het transport van kleine moleculen over membranen of binnen een cel, en de afmetingen van cellen en micro-organismen zijn een ideale match voor sub-millimeter systemen en apparaten. Daarom, er was aanzienlijk potentieel voor het verbeteren van de manier waarop cellulaire en moleculaire experimenten wordt uitgevoerd. Echter, brede acceptatie van microfluïdische technologieën door biologen is achtergebleven achter de verwachtingen4. Een simpele reden voor het gebrek aan technologieoverdracht kan zijn de disciplinaire grenzen scheiden ingenieurs en biologen. Aangepast apparaatontwerp en fabricage zijn net buiten de capaciteiten van de meeste biologische onderzoeksgroepen gebleven, waardoor ze afhankelijk zijn van externe expertise en faciliteiten. Gebrek aan bekendheid met mogelijke toepassingen, kosten en de tijd die nodig is voorontwerp-iteratie zijn ook belangrijke belemmeringen voor nieuwe gebruikers. Het is waarschijnlijk dat deze barrières tot gevolg hebben dat innovatie wordt verstoord en de wijdverbreide toepassing van microfluïdica wordt voorkomen om uitdagingen in de biologische wetenschappen aan te pakken.
Een geval in punt: sinds de late 1990 de Soft-photolithografie is de methode van de keuze voor de vervaardiging van microfluïdische apparaten. PDMS (Polydimethylsiloxaan, een op siliconen gebaseerd organisch polymeer) is een veelgebruikt materiaal vanwege de fysische eigenschappen, zoals transparantie, vervormbaarheid en biocompatibiliteit5. De techniek heeft veel succes gehad, met lab-on-a-chip en Organ-on-a-chip-apparaten die voortdurend op dit platform6worden ontwikkeld. De meeste groepen die aan deze technologieën werken, zijn echter te vinden in technische afdelingen of hebben sterke banden met hen4. Lithografie vereist meestal clean-kamers voor de vervaardiging van mallen en gespecialiseerde bonding apparatuur. Voor veel groepen maakt dit standaard PDMS-apparaten minder dan ideaal vanwege hun kapitaalkosten en doorlooptijd, met name wanneer het nodig is om herhaalde ontwerpwijzigingen aan te brengen. Bovendien is de technologie meestal ontoegankelijk voor de gemiddelde bioloog en voor studenten zonder toegang tot gespecialiseerde technische laboratoria. Er is voorgesteld dat voor microfluïdische apparaten op grote schaal worden aangenomen, ze moeten nabootsen van enkele van de kwaliteiten van materialen die vaak worden gebruikt door biologen. Bijvoorbeeld, polystyreen gebruikt voor celkweek en bioassays is goedkoop, wegwerp, en vatbaar voor massaproductie. Daarentegen is de industriële productie van PDMS-gebaseerde microfluïdica nooit gerealiseerd vanwege zijn mechanische zachtheid, instabiliteit van de oppervlaktebehandeling en Gasdoorlatendheid5. Vanwege deze beperkingen, en met het doel om technische uitdagingen op te lossen met behulp van aangepaste apparaten gebouwd “in-House”, beschrijven we een alternatieve methode die xurography7,8,9 protocollen en thermische laminering gebruikt. Deze methode kan worden aangenomen met weinig kapitaal en tijd investering.
PETLs zijn vervaardigd met behulp van polyethyleentereftalaat (PET) film, bekleed met het Thermo lijm ethyleen-vinyl acetaat (EVA). Beide materialen worden veel gebruikt in consumentenproducten, zijn biologisch compatibel en zijn direct beschikbaar tegen minimale kosten10. PET/EVA film kan worden verkregen in de vorm van lamineren zakjes of rollen. Met behulp van een computergestuurde ambachtelijke Cutter die vaak voorkomt in hobbyist of ambachtelijke winkels, worden kanalen uitgesneden uit een enkel film blad om de architectuur van het apparaat te definiëren11. De kanalen worden vervolgens verzegeld door het aanbrengen van extra film (of glas) lagen die zijn gebonden met behulp van een (Office) thermische laminator (Figuur 1A). Geperforeerde, zelfklevende vinyl bumpers worden toegevoegd om de toegang tot de kanalen te vergemakkelijken. De fabricage tijden variëren van 5 tot 15 minuten, waardoor een snelle ontwerp iteratie mogelijk is. Alle apparatuur en materialen die worden gebruikt om PETLs te maken zijn commercieel toegankelijk en betaalbaar (< 350 USD startkosten, in vergelijking met duizenden Usd's voor lithografie). Daarom bieden PETLs een nieuwe oplossing voor twee hoofdproblemen die worden veroorzaakt door conventionele microfluïdica: betaalbaarheid en tijd effectiviteit (Zie PDMS/PETL-vergelijking in aanvullende tabellen 1, 2).
Naast het bieden van onderzoekers de mogelijkheid om hun eigen apparaten te ontwerpen en te fabriceren, kan PETLs eenvoudig in de klas worden geadopteerd omdat ze eenvoudig en intuïtief te gebruiken zijn. PETLs kan worden opgenomen in de middelbare school en de onderwijsprogramma’s8, waar ze worden gebruikt om studenten te helpen beter inzicht in fysische, chemische en biologische concepten, zoals diffusie, laminaire stroming, micromixing, nanodeeltjes synthese, gradiënt vorming en chemotaxis.
In dit werk illustreren we de algemene workflow voor de fabricage van model PETLs chips met verschillende niveaus van complexiteit. Het eerste apparaat wordt gebruikt om de beeldvorming van cellen en micro organen in een kleine kamer te vergemakkelijken. De tweede, meer complexe inrichting bestaat uit verschillende lagen en materialen, en wordt gebruikt voor onderzoek in Mechanobiology9. Ten slotte hebben we een apparaat gebouwd dat verschillende concepten van vloeistofdynamica (hydrodynamische scherpstelling, laminaire stroming, diffusief transport en micromixing) weergeeft voor educatieve doeleinden. De hier gepresenteerde workflow-en apparaatontwerpen kunnen eenvoudig worden aangepast voor een groot aantal doeleinden in zowel de onderzoeks-als de klassikale instellingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Terwijl microfluïdica steeds meer aanwezig zijn in de gereedschapskist van laboratoria over de hele wereld, is het tempo van adoptie teleurstellend, gezien het potentieel voor zijn positieve effect16. Lage kosten en hoge efficiëntie van microfluïdische apparaatfabricage zijn essentieel om de acceptatie van deze technologie in het gemiddelde onderzoek laboratorium te versnellen. De hier beschreven methode maakt gebruik van meerdere film lagen om twee en driedimensionale apparaten te maken tegen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk in dit manuscript werd deels gesteund door de National Science Foundation (subsidie nr. CBET-1553826) (en bijbehorende ROA supplement) en de National Institutes of Health (NIH) (Grant No. R35GM124935) naar J.Z., en de Notre Dame Melchor een bezoek aan het faculteits Fonds F.O. We willen Jenna Sjoerdsma en basar Bilgiçer bedanken voor het verstrekken van zoogdiercellen en cultuur protocollen en Fabio Sacco voor hulp bij aanvullende cijfers.
Materials
| Biopsy punch (1mm) | Miltex | 33-31AA | Optional, replaces rotary tool set up |
| Blunt needles | Janel, Inc. | JEN JG18-0.5X-90 | Remove plastic and attach to Tygon tubing |
| Coverslips | Any | 24 x 60 mm are preferred | |
| Cutting Mat and blades | Silhouette America or Nicapa | www.silhouetteamerica.com/shop/blades-and-mats | Re-use/Disposables |
| Double-sided tape | Scotch/3M | 667 | Small amounts, any width or brand |
| PEEK tubing | IDEX/any | 1581L | Different configurations available. Consider using Tygon tubing intead, if not already using PEEK |
| PET/EVA thermal laminate film | Scotch/3M & Transcendia | TP3854-200,TP5854-100 & transcendia.com/products/trans-kote-pet | 3 – 6 mil (mil = 1/1000 inch) laminating pouches or rolls. |
| PVC film – Cling Wrap | Glad / Any | Food wrapping | |
| Rotary tool-drill | Dremel/Any | 200-121 or other | 1/32 and 3/64" drill bits from Dremel recommended |
| Rubber Roller | Speedball | 4126 | To facilitate adhesion, any brand will work |
| Scissors & tweezers | Any | Fiskars-Inch-Titanium-Softgrip-Scissors |Cole-Parmer –# UX-07387-12 | Quality brands are recommended |
| Silhouette CAMEO Craft cutter | Silhouette America | www.silhouetteamerica.com/shop/cameo/SILHOUETTE-CAMEO-3-4T | Preferred craft cutter |
| Silhouette Studio software | Silhouette America | www.silhouetteamerica.com/software | Controls the craft cutter and provides drawing tools (free download MAC and PC) |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus or New Era | 70-4504 or NE-300 | Pumps are ideal, pipettes or burettes can be used. |
| Syringes | Any | 1-3mL | |
| Thermal laminator | Scotch/3M | TL906 | Standard home/office model |
| Tygon tubing (E-3603) | Cole-Parmer | EW-06407-70 | Use with blunt needle tips |
| Vinyl furniture bumpers | DerBlue/3M/ Everbilt | Clear, self-adhesive (6 x 2 mm and 8 x 3 mm) | Round bumpers are recommended |
References
- Xia, Y., Whitesides, G. M. SOFT LITHOGRAPHY. Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).
- Beebe, D. J., Mensing, G. A., Walker, G. M. Physics and Applications of Microfluidics in Biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 4 (1), 261-286 (2002).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3 (1), 335-373 (2001).
- Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).
- Berthier, E., Young, E. W. K., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia. Lab on a Chip. 12 (7), 1224 (2012).
- Zhang, B., Korolj, A., Lai, B. F. L., Radisic, M. Advances in organ-on-a-chip engineering. Nature Reviews Materials. 3 (8), 257-278 (2018).
- Bartholomeusz, D. A., Boutte, R. W., Andrade, J. D. Xurography: rapid prototyping of microstructures using a cutting plotter. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (6), 1364-1374 (2005).
- Martínez-Hernández, K. J., Rovira-Figueroa, N. D., Ontiveros, F. . Implementation and Assessment of Student-Made Microfluidic Devices in the General Chemistry Laboratory. , (2016).
- Levis, M., et al. Microfluidics on the fly: Inexpensive rapid fabrication of thermally laminated microfluidic devices for live imaging and multimodal perturbations of multicellular systems. Biomicrofluidics. 13 (2), 024111 (2019).
- Subramaniam, A., Sethuraman, S. Chapter 18 – Biomedical Applications of Nondegradable Polymers. Natural and Synthetic Biomedical Polymers. , 301-308 (2014).
- Yuen, P. K., Goral, V. N. Low-cost rapid prototyping of flexible microfluidic devices using a desktop digital craft cutter. Lab Chip. 10 (3), 384-387 (2010).
- Oya, K., et al. Surface Characteristics of Polyethylene Terephthalate (PET) Film Exposed to Active Oxygen Species Generated via Ultraviolet (UV) Lights Irradiation in High and Low Humidity Conditions. Journal of Photopolymer Science and Technology. 27 (3), 409-414 (2014).
- Narciso, C. E., Contento, N. M., Storey, T. J., Hoelzle, D. J., Zartman, J. J. Release of Applied Mechanical Loading Stimulates Intercellular Calcium Waves in Drosophila Wing Discs. Biophysical Journal. 113 (2), 491-501 (2017).
- Suh, Y. K., Kang, S. A Review on Mixing in Microfluidics. Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).
- Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing. Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).
- Weibel, D., Whitesides, G. Applications of microfluidics in chemical biology. Current Opinion in Chemical Biology. 10 (6), 584-591 (2006).
- Chen, X., Li, T., Shen, J. CO2 Laser Ablation of Microchannel on PMMA Substrate for Effective Fabrication of Microfluidic Chips. International Polymer Processing. 31 (2), 233-238 (2016).
- Chen, X., Shen, J., Zhou, M. Rapid fabrication of a four-layer PMMA-based microfluidic chip using CO2-laser micromachining and thermal bonding. Journal of Micromechanics and Microengineering. 26 (10), 107001 (2016).
