Summary
Hier presenteren we een protocol voor het ontwerpen en fabriceren van aangepaste microfluïdische apparaten met minimale financiële en tijd investeringen. Het doel is het faciliteren van de invoering van microfluïdische technologieën in biomedische onderzoekslaboratoria en onderwijsinstellingen.
Abstract
Microfluïdische apparaten maken het manipuleren van vloeistoffen, deeltjes, cellen, micro-sized organen of organismen in kanalen variërend van de nano tot submillimeter schalen mogelijk. Een snelle toename van het gebruik van deze technologie in de biologische wetenschappen heeft een behoefte aan methoden die toegankelijk zijn voor een breed scala aan onderzoeksgroepen. De huidige fabricagenormen, zoals PDMS bonding, vereisen dure en tijdrovende lithografische en bonding technieken. Een levensvatbaar alternatief is het gebruik van apparatuur en materialen die gemakkelijk betaalbaar zijn, vereisen een minimale expertise en zorgen voor de snelle iteratie van ontwerpen. In dit werk beschrijven we een protocol voor het ontwerpen en produceren van Pet-laminaten (petls), microfluïdische apparaten die goedkoop zijn, gemakkelijk te fabriceren en aanzienlijk minder tijd verbruiken om te genereren dan andere benaderingen van microfluïdica-technologie. Ze bestaan uit thermisch gebonden film vellen, waarin kanalen en andere functies worden gedefinieerd met behulp van een ambachtelijke cutter. PETLs lost veld-specifieke technische uitdagingen op en vermindert de belemmeringen voor adoptie drastisch. Deze aanpak vergemakkelijkt de toegankelijkheid van microfluïdica-apparaten in zowel onderzoeks-als educatieve instellingen, en biedt een betrouwbaar platform voor nieuwe onderzoeksmethoden.
Introduction
Microfluidics maakt vloeistof controle op kleine schalen mogelijk, met volumes variërend van micro liters (1 x 10-6 l) tot picoliters (1 x 10-12 l). Deze controle is deels mogelijk gemaakt door de toepassing van microfabricage technieken geleend van de microprocessor industrie1. Het gebruik van micro-sized netwerken van kanalen en kamers stelt de gebruiker in staat om te profiteren van de kenmerkende fysische verschijnselen die kenmerkend zijn voor kleine dimensies. Op de schaal van de micrometer kunnen bijvoorbeeld vloeistoffen worden gemanipuleerd met behulp van laminaire stroming, waarbij visceuze krachten de inertiële krachten domineren. Dientengevolge, diffusief transport wordt het prominente kenmerk van microfluïdica, en kan worden bestudeerd kwantitatief en experimenteel. Deze systemen kunnen goed worden begrepen met behulp van Fick's wetten, de Brownse bewegings theorie, de warmtevergelijking en/of de Navier-Stokes vergelijkingen, die belangrijke afleidingen zijn op het gebied van vloeistofmechanica en transportverschijnselen2.
Omdat veel groepen in de biologische wetenschappen complexe systemen op microscopisch niveau bestuderen, werd oorspronkelijk gedacht dat microfluïdische apparaten een onmiddellijke en significante impact zouden hebben op onderzoekstoepassingen in de biologie2,3. Dit is te wijten aan de diffusie dominant in het transport van kleine moleculen over membranen of binnen een cel, en de afmetingen van cellen en micro-organismen zijn een ideale match voor sub-millimeter systemen en apparaten. Daarom, er was aanzienlijk potentieel voor het verbeteren van de manier waarop cellulaire en moleculaire experimenten wordt uitgevoerd. Echter, brede acceptatie van microfluïdische technologieën door biologen is achtergebleven achter de verwachtingen4. Een simpele reden voor het gebrek aan technologieoverdracht kan zijn de disciplinaire grenzen scheiden ingenieurs en biologen. Aangepast apparaatontwerp en fabricage zijn net buiten de capaciteiten van de meeste biologische onderzoeksgroepen gebleven, waardoor ze afhankelijk zijn van externe expertise en faciliteiten. Gebrek aan bekendheid met mogelijke toepassingen, kosten en de tijd die nodig is voorontwerp-iteratie zijn ook belangrijke belemmeringen voor nieuwe gebruikers. Het is waarschijnlijk dat deze barrières tot gevolg hebben dat innovatie wordt verstoord en de wijdverbreide toepassing van microfluïdica wordt voorkomen om uitdagingen in de biologische wetenschappen aan te pakken.
Een geval in punt: sinds de late 1990 de Soft-photolithografie is de methode van de keuze voor de vervaardiging van microfluïdische apparaten. PDMS (Polydimethylsiloxaan, een op siliconen gebaseerd organisch polymeer) is een veelgebruikt materiaal vanwege de fysische eigenschappen, zoals transparantie, vervormbaarheid en biocompatibiliteit5. De techniek heeft veel succes gehad, met lab-on-a-chip en Organ-on-a-chip-apparaten die voortdurend op dit platform6worden ontwikkeld. De meeste groepen die aan deze technologieën werken, zijn echter te vinden in technische afdelingen of hebben sterke banden met hen4. Lithografie vereist meestal clean-kamers voor de vervaardiging van mallen en gespecialiseerde bonding apparatuur. Voor veel groepen maakt dit standaard PDMS-apparaten minder dan ideaal vanwege hun kapitaalkosten en doorlooptijd, met name wanneer het nodig is om herhaalde ontwerpwijzigingen aan te brengen. Bovendien is de technologie meestal ontoegankelijk voor de gemiddelde bioloog en voor studenten zonder toegang tot gespecialiseerde technische laboratoria. Er is voorgesteld dat voor microfluïdische apparaten op grote schaal worden aangenomen, ze moeten nabootsen van enkele van de kwaliteiten van materialen die vaak worden gebruikt door biologen. Bijvoorbeeld, polystyreen gebruikt voor celkweek en bioassays is goedkoop, wegwerp, en vatbaar voor massaproductie. Daarentegen is de industriële productie van PDMS-gebaseerde microfluïdica nooit gerealiseerd vanwege zijn mechanische zachtheid, instabiliteit van de oppervlaktebehandeling en Gasdoorlatendheid5. Vanwege deze beperkingen, en met het doel om technische uitdagingen op te lossen met behulp van aangepaste apparaten gebouwd "in-House", beschrijven we een alternatieve methode die xurography7,8,9 protocollen en thermische laminering gebruikt. Deze methode kan worden aangenomen met weinig kapitaal en tijd investering.
PETLs zijn vervaardigd met behulp van polyethyleentereftalaat (PET) film, bekleed met het Thermo lijm ethyleen-vinyl acetaat (EVA). Beide materialen worden veel gebruikt in consumentenproducten, zijn biologisch compatibel en zijn direct beschikbaar tegen minimale kosten10. PET/EVA film kan worden verkregen in de vorm van lamineren zakjes of rollen. Met behulp van een computergestuurde ambachtelijke Cutter die vaak voorkomt in hobbyist of ambachtelijke winkels, worden kanalen uitgesneden uit een enkel film blad om de architectuur van het apparaat te definiëren11. De kanalen worden vervolgens verzegeld door het aanbrengen van extra film (of glas) lagen die zijn gebonden met behulp van een (Office) thermische laminator (Figuur 1A). Geperforeerde, zelfklevende vinyl bumpers worden toegevoegd om de toegang tot de kanalen te vergemakkelijken. De fabricage tijden variëren van 5 tot 15 minuten, waardoor een snelle ontwerp iteratie mogelijk is. Alle apparatuur en materialen die worden gebruikt om PETLs te maken zijn commercieel toegankelijk en betaalbaar (< 350 USD startkosten, in vergelijking met duizenden Usd's voor lithografie). Daarom bieden PETLs een nieuwe oplossing voor twee hoofdproblemen die worden veroorzaakt door conventionele microfluïdica: betaalbaarheid en tijd effectiviteit (Zie PDMS/PETL-vergelijking in aanvullende tabellen 1, 2).
Naast het bieden van onderzoekers de mogelijkheid om hun eigen apparaten te ontwerpen en te fabriceren, kan PETLs eenvoudig in de klas worden geadopteerd omdat ze eenvoudig en intuïtief te gebruiken zijn. PETLs kan worden opgenomen in de middelbare school en de onderwijsprogramma's8, waar ze worden gebruikt om studenten te helpen beter inzicht in fysische, chemische en biologische concepten, zoals diffusie, laminaire stroming, micromixing, nanodeeltjes synthese, gradiënt vorming en chemotaxis.
In dit werk illustreren we de algemene workflow voor de fabricage van model PETLs chips met verschillende niveaus van complexiteit. Het eerste apparaat wordt gebruikt om de beeldvorming van cellen en micro organen in een kleine kamer te vergemakkelijken. De tweede, meer complexe inrichting bestaat uit verschillende lagen en materialen, en wordt gebruikt voor onderzoek in Mechanobiology9. Ten slotte hebben we een apparaat gebouwd dat verschillende concepten van vloeistofdynamica (hydrodynamische scherpstelling, laminaire stroming, diffusief transport en micromixing) weergeeft voor educatieve doeleinden. De hier gepresenteerde workflow-en apparaatontwerpen kunnen eenvoudig worden aangepast voor een groot aantal doeleinden in zowel de onderzoeks-als de klassikale instellingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ontwerp
- Identificeer een applicatie voor de apparaten en vermeld de kanaal/kamer componenten die nodig zijn.
Opmerking: voor alle apparaten zijn invoer-en uitvoerkanalen vereist. Voor apparaten die voor microscopie worden gebruikt, is een beeldvormings kamer vereist. Complexere apparaten vereisen kanalen en kamers die zich in meerdere lagen bevinden. - Begin met de hand tekenen van elke laag, rekening houdend met hoe de functionaliteit van het apparaat wordt beïnvloed door de superpositie van de lagen.
- Teken de definitieve ontwerpen op een computer met behulp van software waarmee u lijnen en vormen tekenen.
- Teken elke laag afzonderlijk met zwarte, effen lijnen en vormen zonder tinten. Lijndikte van 6 of meer punten wordt aanbevolen. In dit stadium zijn de afmetingen van kanaal-en kamer functies minder belangrijk dan de totale verhoudingen.
- Gebruik de functie kopiëren en plakken bij het maken van functies en het opleggen van lagen. Zie afbeelding 1B voor voorbeelden van laag tekeningen.
- Importeer elke laag in de Craft Cutter software (Figuur 1C). Doe dit door een schermopname te maken van het getekende ontwerp en door een drag-and-drop-aanpak te gebruiken.
- Maak een nieuw document in de Craft Cutter software (gratis download). Laat het afbeeldingsbestand op de weergegeven mat vallen. De software zal de meeste beeldbestanden herkennen.
- Vergroot de afbeelding om de verwerking te vergemakkelijken door uit een hoek te trekken. Het ontwerp kan nu door de software worden herkend met behulp van de traceerfunctie.
Opmerking: gebruikers kunnen de Novo-ontwerpen rechtstreeks op deze software produceren (gebruik tekenhulpmiddelen in het ontwerp palet).
- Als u het ontwerp wilt traceren, selecteert u het pictogram traceren (vorm van een vlinder) aan de rechterkant van het venster en selecteert u de geïmporteerde ontwerpen volledig.
- Selecteer de optie voorvertoning traceren met het label overzicht. Pas (indien nodig) de drempel -en schaal instellingen aan om de gele tracering aan te passen aan het ontwerp.
- Selecteer traceren in het menu traceren zodra de gele tracering overeenkomt met het ontwerp. De kanalen worden nu weergegeven als een rode contour. Als de rode contour overeenkomt met het ontwerp, kan de geïmporteerde afbeelding worden geselecteerd en verwijderd. Het ontwerp is nu geïmporteerd en klaar voor dimensionering.
- De grootte van het apparaat door het getraceerde ontwerp te selecteren en door gebruik te maken van het door de software geleverde rooster. Trek om de breedte en lengte van kanalen en kamers te wijzigen.
Opmerking: de software biedt metingen en kleine lijnen kunnen tijdelijk worden getekend (gebruik het ontwerp palet aan de linkerkant van het venster) om de afmetingen binnen het apparaat te meten. Functionele kanaal-breedte afmetingen variëren van 100 μm tot 900 μm. de afmetingen moeten mogelijk aangepast worden na het testen van de eerste prototypes. Het is belangrijk dat alle lagen proportioneel worden aangepast, om te zorgen voor een goede uitlijning tijdens de montage.- Nadat het ontwerp correct is aangepast, selecteert u het gereedschap vierkant in het menu vorm tekenen om een vierkant/rechthoek rond elke laag van het apparaat te tekenen. Deze vorm moet van dezelfde grootte zijn voor alle lagen. Zie Figuur 1C voor voorbeelden.
- Maak een afzonderlijke toplaag met toegangspoorten tot de kanalen. Eenvoudige ontwerpen zullen bestaan uit een hoofd (middelste) kanaallaag, een onderste afdichtings laag (vaak glas) en een toplaag die cirkelvormige perforaties moet bevatten om toegang te krijgen tot de kanalen (inlaten/uitgangen).
Opmerking: voor ontwerpen met meer dan drie lagen zijn inlaat-/uitlaatperforaties in meerdere lagen nodig (Zie Figuur 1C, Figuur 5A). Deze perforaties zijn mogelijk al opgenomen in het ontwerp of kunnen op dit moment worden toegevoegd.- Selecteer het tekengereedschap aan de linkerkant van het scherm. Trek cirkels over de inlaat-en uitlaat poorten van het ontwerp.
- Kopieer en plak zowel het oorspronkelijke ontwerp als de cirkels. Wis de kanalen van het onderliggende apparaat.
Opmerking: Hierdoor blijven de inlaat/uitlaat poorten in de juiste positie die overeenkomt met het oorspronkelijke ontwerp. Vormen kunnen ook aan de omtrek van elke laag worden toegevoegd om te helpen bij het uitlijnen.
- Rangschik alle lagen die u op de weergegeven mat wilt knippen. Het apparaat is nu klaar om te snijden.
2. snijden
- Breng een enkele PET/EVA film (of ander materiaal) van de gewenste dikte (3 mil is standaard) op de zelfklevende snijmat. Zorg ervoor dat de lijm (matte) zijde naar boven en de plastic (glanzende) zijde naar beneden kijkt.
Opmerking: gebruik schone handschoenen om te voorkomen dat oliën en microdeeltjes in de lagen worden ingevoerd. - Afvlakken van de film tegen de mat (Figuur 1D), het verwijderen van alle lucht die kan zijn gevangen. Dit kan gedaan worden met handschoenen of een roller.
- Lijn de rand van de snijmat uit op de lijn die op de frees wordt aangegeven. Laad de mat door op de laadmat op de frees te drukken. Houd de instelling op het snijblad tussen 3 en 5, afhankelijk van de laagdikte.
- Sluit de USB-kabel van de Cutter aan op de computer.
- Selecteer het tabblad verzenden en selecteer een snij instelling.
Opmerking: een veelheid aan instellingen is beschikbaar in het trapsgewijze menu. Het-sticker papier, Clear-is een instelling die goed werkt met PET/EVA film met een dikte van 3 – 5 Mil (75 – 125 μm). Wijzig instellingen voor verschillende materialen en Sla aangepaste instellingen op voor toekomstig gebruik.
- Selecteer het tabblad verzenden en selecteer een snij instelling.
- Klik op verzenden. Het snijden zal beginnen (Figuur 1E). Zorg ervoor dat er voldoende ruimte in de achterkant van de frees is om de mat onbelemmerd te laten bewegen. Wanneer de frees klaar is, ontlaadt u de mat door lossen op de frees te selecteren. Trek de mat niet vóór het lossen.
3. uitlijning
- Plaats de snijmat naast een schoon oppervlak. Gebruik met handschoenen een pincet om elke laag van het microfluïdica-apparaat van de cut-mat te tillen (Figuur 1F). Wees vooral voorzichtig rond bochten en bochten in het kanaal; Deze zijn vooral delicaat en vatbaar voor scheuren en kromtrekken.
- Plaats de lagen van het microfluïdica-apparaat op een schoon oppervlak. Bestel ze volgens hun positie van boven naar beneden in het apparaat (Figuur 1G, Figuur 2a, Figuur 5a en Figuur 7a).
- Snijd kleine (~ 3 mm x 10 mm) stukjes dubbelzijdige tape die worden gebruikt om de lagen tijdelijk aan elkaar te bevestigen.
- De lagen één voor één superimpose, te beginnen met de onderste laag. Voeg een klein stukje dubbelzijdige tape toe aan een hoek tussen de lagen, weg van alle kanalen of inlaten/uitgangen (Figuur 1G, pijl). De tape, hoewel niet vereist, immobiliseert de lagen en verzekert dat ze niet verschuiven tijdens lamineren. Gebruik een draadmal om de uitlijning van lagen in apparaten met meer dan 4 lagen te vergemakkelijken (aanvullend figuur 3).
- Zorg ervoor dat de lijm (mat-EVA) zijde van de film altijd wordt geconfronteerd met de binnenkant (binnen-lagen gedeelte) van het apparaat.
Let op: blootgestelde lijm zal smelten tegen de inwendige delen van de laminator en zich aan hen houden, resulterend niet alleen in het verlies van het apparaat, maar ook van invloed op de toekomstige prestaties van de laminator. - Inspecteer het apparaat zodra alle lagen zijn opgedrongen. Er moet ten minste één EVA-zijde tussen alle lagen, en geen EVA moet worden blootgesteld. Bij de introductie van niet-EVA gecoate materialen (bijv. polyvinylchloride (PVC) film, glas), kan een film met EVA aan beide zijden nodig zijn, met name in het geval van complexere apparaten (Figuur 5).
4. lamineren
- Schakel de laminator in en stel deze in op de gewenste dikte instelling. Sommige lamineermachines bieden 3 en 5 mil-instellingen, terwijl sommige niet. Gebruik voor elk apparaat met 4 of meer lagen de instelling 5-mil.
- Zodra de laminator klaar is, voert u het apparaat door de lamineren rollen (Figuur 1H – I). Plaats het uiteinde waaraan dubbelzijdige tape is toegevoegd voor de beste resultaten.
Opmerking: bij het vervaardigen van apparaten van vijf of meer lagen, kunnen ze meerdere keren door de laminator worden uitgevoerd. - Herstel het gelamineerd apparaat.
Opmerking: het is raadzaam dat apparaten groot genoeg zijn om hun herstel van de laminator gemakkelijk te maken. Deze overweging heeft geen invloed op de grootte van de kanalen of chip-architectuur, het vraagt gewoon om een "frame" dat gemakkelijk kan gaan door de laminator zonder binnen te blijven.
5. inlaat-/uitlaatpoorten
- Gebruik een roterende tool en een 1/32 in. boor om een klein gaatje door het midden van een meubel bumper te snijden. U ook een 1 mm biopsie Punch gebruiken om de bumpers te perforeren.
Opmerking: een boor pers wordt aanbevolen. Hoewel de maten variëren, worden 2 mm x 6 mm-diameter bumpers aanbevolen. Vermijd simpelweg het "steken" van de bumper. Tenzij het materiaal wordt verwijderd, zal de bumper opnieuw verzegelen (aanvullend figuur 1). De hierboven aangegeven perforaties zijn bedoeld voor de koppeling met polyetheretherketon (Peek) buizen, pipet en tip, of een botte naald (16 – 18 G). Grotere perforaties kunnen worden bereikt met draaiende Pons tangen (aanvullend figuur 1). Deze zijn nuttig wanneer de bumper wordt gebruikt als een "reservoir" voor vloeistoffen of andere Biologicals. - Zorg ervoor dat de opening volledig helder is door het verwijderen van vuil (veroorzaakt doorboren of ponsen) met een paar kleine pincet.
- Nadat de inlaat-/uitlaatpoorten met succes zijn gewist, lijnt u de bumpers voorzichtig uit met de inlaat-/uitlaatpoorten op het gelamineerde apparaat (Figuur 1J – K). Deze stap is essentieel voor een goede stroom van vloeistoffen in en uit het apparaat. Houd de bumper achter het apparaat, plaats het klevende gezicht tegenover de open inlaat/uitlaat op het apparaat en lijn het uit en houd het vast. Apparaatassembly is nu voltooid.
6. testen
- Toegang tot de kanaal/kamer architecturen via de geperforeerde bumpers (poorten). Er zijn verschillende opties met betrekking tot het introduceren van vloeistoffen en Biologicals in de apparaten.
- Gebruik laboratorium-of medische/chirurgische slangen door deze aan een plastic connector (bijv. Luer adapters) of op een botte naald te bevestigen. Een standaard pipet en tip of PEEK-slang zonder adapters kunnen ook worden gebruikt (aanvullende figuur 2).
- Voer infusie of tekening van vloeistoffen met spuiten en slangen met behulp van spuiten of peristaltische pompen.
Opmerking: er zijn veel opties in de markt, beginnend bij ~ 300 USD op het moment van schrijven. - Stel verschillende instellingen voor de stroomsnelheid in op basis van het apparaat en het experiment.
Opmerking: we gebruiken routinematig debiet instellingen in het bereik van 0,01 – 100 μL/min, maar andere tarieven kunnen worden gebruikt.
Figuur 1: fabricage. A) een kantoor laminator en een ambachtelijke frees zijn de enige twee uitrustingsstukken die nodig zijn voor de fabricage. Beide zijn beschikbaar online of bij ambachten/kantoorbenodigdheden winkels. Andere vereiste gereedschappen zijn schaar en pincet. (B) kanaal-en kamer architecturen kunnen digitaal worden samengesteld met elk softwareprogramma dat tekenhulpmiddelen bevat (vectorafbeeldingen kunnen de voorkeur krijgen van sommige gebruikers, maar zijn niet verplicht). Lijnen en vormen worden in het zwart getekend met een witte achtergrond. Het bestand of een schermopname van het ontwerp kan worden geïmporteerd in de ambachtelijke Cutter software door te slepen en neer te zetten. (C) Craft Cutter software is gratis te downloaden en is vereist om de frees te besturen. De software verwerft het ontwerp en zorgt voor wijzigingen, zoals dimensionering. Het biedt ook tekenhulpmiddelen. D) de snijmat draagt de folie om te snijden. Het is een beetje lijm, waardoor immobilisatie van de materialen te snijden. De figuur toont vier verschillende materialen klaar voor het laden: 3 mil-dik huisdier/EVA film (top), 5 mil-dik huisdier/EVA film (midden), 6 mil-dikke EVA/PET/EVA (linksonder) en PVC film (rechtsonder). (E) frees is open voor weergave Blade (in zwart) eenheid en geladen mat. (F) na het knippen worden de afzonderlijke lagen met een pincet opgeheven. Uitsparingen van kanalen en kamers blijven op de mat bevestigd en worden later verwijderd en weggegooid. G) de afzonderlijke lagen worden uitgelijnd en bovenop de laminering aangebracht. Kleine stukjes dubbelzijdige tape (Arrow) worden vaak gebruikt om te helpen bij het uitlijnen en voorkomen van laag verschuiving tijdens lamineren. (H, I) Het apparaat wordt gevoed aan de bovenkant van de laminator en hersteld door de sleuf. Lamineren zorgt voor een robuuste afdichting, waardoor kanaal paden open gaan. (J, K) Om toegang te krijgen tot de kanalen, is het noodzakelijk om geperforeerde, zelfklevende vinyl bumpers toe te voegen. Afbeelding in (J) toont de "omgekeerde" benadering voor uitlijning, waarbij de bumper van achteren wordt geplaatst, waardoor de inlaat/uitlaat met de bumper perforatie visueel kan worden uitgelijnd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Naast lage kosten en snelle iteratie, kan PETL-technologie eenvoudig worden aangepast om specifieke uitdagingen op te lossen. Eerst beschrijven we een eenvoudig apparaat bestaande uit een glazen afdekplaat, een kamerlaag, een kanaallaag en een inlaat-/uitlaatlaag (Figuur 2). Dit apparaat is ontworpen om de beeldvorming van cellen en micro organen onder constante stroming te vergemakkelijken. Cultuurmedium wordt aangevuld met lage stroomsnelheden om voedings-en gasuitwisseling aan te moedigen. De ronde kamer is voorzien van een glazen bodem, die beeldvorming mogelijk maakt met behulp van een omgekeerde Microscoop. Er zijn ten minste twee redenen voor het gebruik van glas in dit apparaat. De eerste is optiek. PET en EVA zijn Thermoplastics die worden gebruikt voor hun optische transparantie en flexibiliteit, en kunnen worden gebruikt als interface voorbeeld vorming (met name bij lage vergrotende9. Lichtdoorlatendheid van PET in het zichtbare spectrum varieert van 87 tot 90%12. Glas heeft echter betere optische eigenschappen en is de standaard die wordt gebruikt in biologische beeldvorming. De tweede reden om glas te gebruiken is dat de cellen tot nu toe getest (zoogdier cellijnen), de neiging om meer gemakkelijk aan te hechten dan aan (onbehandeld) PET/EVA.
Figuur 2: eenvoudige kamer voor omgekeerde microscopie. (A) het apparaat bestaat uit een glazen laag en drie Pet/Eva-lagen (3 mil dik). Een glazen dekglaasje (24 mm x 60 mm) is de onderste laag. De volgende laag is voorzien van de onderkant van de Imaging kamer. De volgende laag is voorzien van de bovenste helft van de kamer en verbindt deze met het in/uitlaat kanaal. De hoogte van het kanaal is dus slechts 75 μm, terwijl de hoogte van de kamer 150 μm is. De breedte van het kanaal wordt bepaald door de gebruiker (500 μm wordt hier getoond). De bovenste laag verzegelt het kamer-/kanaalpad en biedt toegang tot de inlaat/uitgangen. De bovenliggende lagen worden rechts weergegeven. B) het afgewerkte apparaat wordt weergegeven met rode kleurstof voor visualisatie. Het laden kan worden bereikt met behulp van een micro pipet en tip, laboratorium of medische/chirurgische slang uitgerust met een botte naald, of PEEK tubing, zoals afgebeeld. C) het ontwerp van de kanaal/kamer kan worden herhaald in één enkel apparaat (bijvoorbeeld om observatie van verschillende individuele specimens te vergemakkelijken). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
De afmetingen van de kanalen en de kamer in dit apparaat zijn de moeite waard te beschrijven. Hoogte in PETLs is altijd een functie van film of laagdikte. In de handel verkrijgbare PET/EVA heeft een dikte gemeten in duizendsten van een inch (1 mil ≈ 25 μm). Daarom zijn kanaal-en kamer hoogten meestal veelvouden van 25 μm. standaard PETLs zijn gebouwd met behulp van 3 of 5 mil PET/EVA film, die resulteert in functies met een hoogte van 75 of 125 μm. Het apparaat getoond in Figuur 2 heeft kanalen met een hoogte van 75 μm, en een kamer gedefinieerd door twee lagen, met een totale hoogte van 150 μm. Er moet echter worden opgemerkt dat lagen kunnen bestaan uit verschillende materialen (bijvoorbeeld glas, folie, PVC, papier) en verschillende diktes kunnen presenteren, meestal variërend van 25 tot 250 μm.
Figuur 3: celbeeldvorming. A) de eenvoudige kamer petl kan worden gebruikt voor de korte termijn cultuur van de aanhandige cellen. Cellen hechten aan het glas blootgesteld in de kamer en kan worden waargenomen met behulp van een omgekeerde Microscoop. B) de basofielen van ratten werden bevlekt met Hoechst (blauw) en plasma membraan (rood) fluorescerende kleurstoffen voor visualisatie op een omgekeerde confocale Microscoop. C) helderveld beeld van cellen in een eenvoudig kamer apparaat. D) fase contrastafbeelding. Witschaal balk is 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
De aard van PETL-fabricage zorgt voor aanzienlijke complexiteit in het ontwerp van vloeiende paden. De eenvoudige kamer inrichting bestaat uit vier lagen met functies in twee niveaus van de z-as (kanaal en bovenkant van de kamer in één niveau, onderkant van de kamer in het tweede niveau). Een voordeel van PETLs is het gemak waarmee 3-dimensionale kanaal/kamer architecturen kunnen worden gebouwd. Toevoeging van functies zoals koeling of verwarmings kanalen, dialyse membranen, elektrische circuits of druklijnen (Zie Figuur 5) wordt bereikt door het aansluiten van meerdere lagen in drie dimensies. Een voorbehoud tot nu toe is de limiet voor het aantal lagen dat kan worden gelaagd. Warmteoverdracht nodig voor Eva curatie is onvoldoende gevonden in apparaten met een totale dikte boven 800 μm. Deze beperking kan op sommige apparaten worden aangepakt. In veel gevallen is het mogelijk om te lamineren telkens wanneer een nieuwe laag wordt toegevoegd. Dit is niet mogelijk wanneer een nieuwe laag de Thermo lijm (EVA) nodig heeft om de buitenkant van het apparaat onder ogen te zien.
Figuur 4: Micro-orgel beeldvorming. A) de eenvoudige kamer petl wordt gebruikt om een vleugel schijf van het embryo van Drosophila melanogaster (2x vergroting) op te beelden. De afmetingen van de vleugel schijf zijn ongeveer 90 μm x 250 μm x 500 μm. Een of meerdere organen kunnen door het afdekraam worden afgebeeld. Verhoogde vergrotende schijven van een andere vleugel schijf worden weergegeven in (B) 20x/0,75-Air, (C) 40x/1.30-Oil en (D) 100x/1,49-Oil doelstellingen met behulp van een draaiende schijf met confocale microscopie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
De studie van cellen in cultuur profiteert van instrumenten die dynamische toestand voorwaarden zoals constante stroming of mechanische stimuli bieden. Figuur 3 geeft een voorbeeld waarin een zoogdier cellijn wordt gekweekt en in een eenvoudig kamer apparaat wordt afgebeeld. Medium kan voortdurend worden uitgewisseld tijdens beeldvorming, waardoor niet alleen voor het behoud van ideale groeiomstandigheden, maar ook voor de gecontroleerde invoering van chemische stimuli terwijl beeldvorming in real-time. Dit geldt ook voor de beeldvorming van ex-vivo micro-organen, zoals weergegeven in Figuur 4. Kanaal-en kamer structuren kunnen worden ontworpen met specifieke afmetingen voor verschillende biologische specimens, van organen of weefsels tot hele organismen (bijvoorbeeld Drosophila -embryo's en imaginale schijven of C. elegans).
Figuur 5: mechano-PETL. De eenvoudige kamer PETL wordt gemodificeerd door toevoeging van een compressiekamer. (A) het apparaat bestaat uit zeven lagen met vier verschillende materialen: een glazen onderlaag (afdekplaat, niet getoond), vier Pet/Eva 3 mil lagen (kanaal/kamer lagen, spacer Layer en inlaat/uitlaat laag), een EVA/Pet/Eva 6 mil laag (kanaal/kamer afdichting en PVC hechting) en een VERVORMbare PVC-laag (voor compressie). (B, C) Het specimen kanaal/kamerpad wordt gevisualiseerd met behulp van rode kleurstof. Het compressie kanaal/kamerpad bevat alleen lucht. D) luchtdruk wordt handmatig (of mechanisch) toegepast op het compressiepad, wat resulteert in de uitbreiding van de PVC-film boven in de kamer. De expansie verpulst de kleurstof in de kamer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Mechanische perturbatie van biologische specimens verbetert ons begrip van cellulaire fysiologie en werpt licht op processen zoals embryonale ontwikkeling en differentiatie. Figuur 5 beschrijft een petl-apparaat dat bestaat uit een eenvoudige kanaal-/kamerarray en een compressiekamer. Het bestaat (in zijn eenvoudigste vorm) van zes lagen, waarvan er één een PVC-film is. De PVC-film afbuigt wanneer de luchtdruk wordt uitgeoefend, waardoor de specimens in de kamer worden gecomprimeerd. Dit apparaat is een voorbeeld van het gebruik van andere materialen dan PET/EVA, en het is met succes gebruikt9 in de vervanging van PDMS/glas apparaten gebruikt om mechanische belasting te bestuderen op Drosophila micro-organen13 (zoals afgebeeld op Figuur 6). PETL apparaten zijn herbruikbaar. Vanwege de lage fabricagekosten, de kleinere footprint en het potentieel voor delaminatie na voortdurende manipulatie of wassen, raden we aan om bij elke procedure nieuwe apparaten aan te maken.
Figuur 6: Mechanobiologie beeldvorming. A) eende-cadherin:: GFP die Drosophila -vleugel schijf uitdrukt, wordt in een mechano-petl afgebeeld met behulp van een draaiende schijf confocale Microscoop met een vergroting van 20x. B) druk door het membraan boven de kamer kan worden aangebracht door handmatig een met lucht gevulde spuit te bedienen of een spuitpomp te gebruiken. De ideale gaswet wordt gebruikt om de hoeveelheid kracht die wordt toegepast op het membraan9te schatten. Disc Pouch gebied (witte stippellijn) steeg met ongeveer 30% (rode stippellijn) met de toepassing van ~ 4 psi. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Vanwege het gemak van fabricage van PETL-apparaten hebben we het gebruik ervan in educatieve instellingen verkend, zoals chemie, biologie en technische klaslokalen en onderwijs laboratoria. Een voorbeeld van een educatieve PETL wordt weergegeven in Figuur 7. Het apparaat is ontworpen om enkele van de basiskenmerken van de vloeistofstroom op de micro-schaal weer te geven (bijv. laminaire stroming). Het bestaat uit vier lagen van 5 mil PET/EVA film (Figuur 7A) en een kanaal architectuur met drie convergerende ingangskanalen en een serpentine structuur. Circulaire "depressies" of "down" stappen zijn toegevoegd aan het pad naar het bevorderen van micromixing14. Met behulp van een spuitpomp wordt fenol rode oplossing geïnfundeerd via de buitenste poorten terwijl de pH 9-oplossing via de middelste poort wordt geïnfundeerd. Hydrodynamisch scherpstellen15 wordt gevisualiseerd met de buitenste vloeistofstroom waardoor de binnenstroom in een kleinere stroom wordt gedwongen (Figuur 7C). Laminaire stroming in het apparaat voorkomt convectieve menging, en geleidelijk diffusief mengen wordt getoond langs de lengte van het kanaal (pijlen). Apparaten zoals afgebeeld kunnen worden gebruikt om concepten te onderwijzen (bijv. diffusie, laminaire stroming) in vloeistofdynamica en biotransport. Als alternatief kunnen studenten worden uitgenodigd om hun eigen apparaten te ontwerpen en te fabriceren, een project dat kan worden uitgevoerd in een reguliere laboratorium sessie van twee tot drie uur8.
Figuur 7: PETLs in de klas. (A) het apparaat is vervaardigd met behulp van vier lagen van 5 mil Pet/Eva film. De tweede laag (van rechts naar links) beschikt over ronde kamers die onder het kanaal pad worden geplaatst. B) het afgewerkte apparaat is geladen met de pH-indicator fenolrood (2 mm, geel) en een transparante pH 9-oplossing (middenkanaal). Fenolrood verandert magenta bij contact met basisoplossingen. In de vakken worden de gebieden aangegeven onderC) tot en metF). C) hydrodynamische scherpstelling. D, E) laminaire stroming en diffusie. (E, F) micromixing. Witschaal balk is 2 mm in alle panelen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 1: bumper/poort perforatie. A) eenboor pers opstelling met een draaibaar gereedschap maakt bumper perforatie mogelijk. Boor stukjes van de maten 1/32 "en 3/64" worden gebruikt. (B) het proces is efficiënt en grote aantallen bumpers kunnen in korte tijd worden verwerkt. (C) biopsie perforatie is een alternatief voor boren. D) een draaiende Pons Tang wordt gebruikt voor grotere perforaties. Deze perforaties kunnen worden gebruikt voor het laden van grote specimens (door vloeistof terugtrekking in plaats van infusie) of als media reservoirs. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Aanvullend figuur 2: slang. (A) laboratorium-of medische/chirurgische slang (1/32 "ID, 3/32" od) is de eenvoudigere optie. Het is flexibel en gemakkelijk te knippen. Het vereist het gebruik van (18 G) botte naalden. B) een van de naalden wordt aan de spuit bevestigd met behulp van de (roze) Luer-adapter, die uit een tweede naald wordt verwijderd, zodat deze op de slang kan worden gemonteerd. (C) onderzoekers die al bekend zijn met Peek tubing (0,010 "ID, 1/32" od) kunnen het gebruiken met petls. (D) Peek fittingen. (E) de ingestelde spuitpomp is hetzelfde voor beide soorten buizen. (F) het opzetten van een laboratorium of medische/chirurgische slang vereist perforaties met een 3/64 "boor, terwijl PEEK tubing 1/32" perforaties nodig zal hebben. Perforaties gemaakt met een 1 mm biopsie Punch kan geschikt voor beide sets van buizen. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Aanvullend figuur 3: uitlijning met behulp van een draadmal. Het ontwerp van het apparaat kan perforaties bevatten die kunnen dienen als hulplijnen voor het uitlijnen van verschillende lagen. Draad Jigs zijn commercieel beschikbaar voor ongeveer 20 USD. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Aanvullend figuur 4: groottebeperkingen. Hoewel ambachtelijke scharen in staat zijn om rechte kanalen te knippen die ~ 100 μm breed (A) zijn, is de nauwkeurigheid van de snijpatronen sterk verminderd voor functies die 150 μm of minder meten (B). De afmetingen naast de vormen geven de kanaal breedte aan. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Aanvullende tabel 1: tijd en kosten voor de fabricage van microfluïdische chip in PDM'S. * Fabricage tijd wanneer wafer/Mold direct beschikbaar is en PDM'S kunnen worden genezen met behulp van een oven. Elke ontwerpwijziging vertegenwoordigt een vertraging van meerdere dagen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 2: tijd en kosten voor de fabricage van PETL microfluïdische chip. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Terwijl microfluïdica steeds meer aanwezig zijn in de gereedschapskist van laboratoria over de hele wereld, is het tempo van adoptie teleurstellend, gezien het potentieel voor zijn positieve effect16. Lage kosten en hoge efficiëntie van microfluïdische apparaatfabricage zijn essentieel om de acceptatie van deze technologie in het gemiddelde onderzoek laboratorium te versnellen. De hier beschreven methode maakt gebruik van meerdere film lagen om twee en driedimensionale apparaten te maken tegen een fractie van de tijd en kosten die worden vereist door lithografische methoden. Standaard lithografie kost duizenden dollars (USD) om te starten, en vereist dagen om te fabriceren, de opstartkosten van PETL fabricage zijn lager dan 350 USD en apparaten kunnen binnen enkele minuten worden gefabriceerd. Dit vergemakkelijkt hun adoptie niet alleen in het onderzoekslaboratorium, maar ook in instellingen waar snelle iteratie voordelig is (bijvoorbeeld prototyping voor standaard PDMS-apparaten), of waar de industriële productie van goedkope, wegwerp-apparaten vereist is. PETLs kunnen bijvoorbeeld worden gefabriceerd met behulp van biologisch afbreekbare materialen en kunnen worden aangepast voor gebruik in het veld gezondheidszorg, waardoor ze ideaal zijn als diagnostische hulpmiddelen. Ze kunnen worden gebruikt in de klas, hetzij als geprefabriceerd leermateriaal of als een creatieve uitdaging, waarin studenten hun eigen apparaten ontwerpen, fabriceren en testen.
PETL fabricage is bedoeld om ongecompliceerd te zijn. Het is echter nuttig om kritieke stappen en huidige beperkingen van deze techniek te identificeren. Sommige gebruikers zullen vinden dat de gasuitwisseling in PETL-apparaten wordt verlaagd in vergelijking met PDMS-apparaten, die worden gecompenseerd door een continue stroom van media tijdens experimenten. Een andere beperking is het dimensioneren. Kanalen en andere functies kleiner dan 150 μm liggen onder de resolutie limiet van de frees (aanvullend figuur 4). We raden aan om te werken met kanalen met een breedte in het bereik van 200 – 900 μm. Deze limieten zijn flexibel en hebben de neiging om met name op de bovenste drempel te variëren. Kanalen met een hoogte van 75 μm worden bijvoorbeeld samengevouwen wanneer de breedte van het kanaal 950 μm of meer is, maar blijven open als de hoogte toeneemt. Hoewel de architectuur van het apparaat zal variëren afhankelijk van de toepassing, gebruiken we routinematig kanalen met een hoogte van 75 of 125 μm, en een breedte van 400 – 600 μm.
Aandacht voor detail bij het uitlijnen van lagen en bumpers is belangrijk. De meeste van de weinige complicaties die voortvloeien uit PETL-fabricage zijn het gevolg van Uitlijningsproblemen. Blootgestelde EVA op het moment van lamineren kan zich aan de interne rollen houden en ze onbruikbaar maken. Vloeistof infusie kan worden geblokkeerd door een slecht geplaatste bumper. Gelukkig zijn PETLs niet alleen goedkoop, maar ook snel gebouwd, daarom kunnen defecte apparaten gemakkelijk worden vervangen of gewijzigd.
PETLs zijn bestand tegen infusie stroomsnelheden vergelijkbaar met die gebruikt in andere microfluïdische apparaten. Hoewel 0,01 tot 100 μL/min het bereik is dat door onze groep wordt gebruikt, kunnen stroomsnelheden tot 500 μL/min (en wellicht hoger bij het gebruik van met de handbediende micropipetten) worden gebruikt. We hebben geconstateerd dat PETLs de druk kan weerstaan in het bereik van 30 tot 57 psi8. Spuit pompen worden aanbevolen voor de meeste experimentele instellingen, hoewel ze geen absolute vereiste zijn. In de klas werden buretten gebruikt om de apparaten van studenten te testen15. Peristaltische pompen zijn nuttig in bepaalde instellingen zoals celkweek, vooral omdat de gasuitwisseling beperkt is in PETLs. PDM'S kunnen in dit opzicht voordeliger zijn, hoewel uitspoeling een punt van zorg kan zijn5. We hebben geprobeerd om hybride PET/EVA-PDMS te produceren, maar EVA zal zich niet direct aan PDM'S houden; het is mogelijk dat de oppervlakte modificatie van de laatste (bijvoorbeeld plasma behandeling of oppervlakteactieve behandelingen) dit probleem kan oplossen. Een andere aanpak die kan worden vergeleken met petls is de micro bewerking van kanalen met behulp van co2 laser ablatie17,18 van PMMA. We hebben geconstateerd dat lasersnijden onverenigbaar is met PET/EVA-film, omdat de geproduceerde warmte de neiging heeft om EVA te genezen en ongelijke kanaal randen te produceren. Het gebruik van adequate laserapparatuur kan ook de fabricagekosten aanzienlijk verhogen.
Kortom, PETLs bieden meerdere voordelen ten opzichte van de huidige technologieën: (i) kosten zijn aanzienlijk lager dan traditionele methoden als gevolg van het gebruik van materialen en apparatuur van consumenten kwaliteit, waardoor het gemakkelijk toegankelijk is voor zowel onderzoekers als studenten. (II) apparaten kunnen binnen enkele minuten worden ontworpen, gesneden en geassembleerd, wat een snelle prototype-iteratie mogelijk maakt en tijdbesparende experimenten vergemakkelijkt. (III) meerdere apparaten kunnen tegelijkertijd worden gefabriceerd, waardoor productie met een hoge doorvoer mogelijk is. (IV) een verscheidenheid aan materialen kan worden opgenomen, waardoor veelzijdigheid wordt toegevoegd en uitgebreide aanpassingen mogelijk zijn. De huidige en toekomstige ontwikkeling van nieuwe functionaliteiten met behulp van deze technologie berust op de creativiteit en de eisen van nieuwe gebruikers. Brede acceptatie van PETL-microfluïdische apparaten zal waarschijnlijk resulteren in het opnemen van nieuwe materialen en configuraties, omdat gebruikers nieuwe ontwerpen en benaderingen voor hun specifieke behoeften ontwikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Fernando Ontiveros is in het proces van de lancering van PETL FLUIDICS (LLC), een bedrijf dat zal commercialiseren en bieden adviesdiensten voor deze technologie. De co-auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het werk in dit manuscript werd deels gesteund door de National Science Foundation (subsidie nr. CBET-1553826) (en bijbehorende ROA supplement) en de National Institutes of Health (NIH) (Grant No. R35GM124935) naar J.Z., en de Notre Dame Melchor een bezoek aan het faculteits Fonds F.O. We willen Jenna Sjoerdsma en basar Bilgiçer bedanken voor het verstrekken van zoogdiercellen en cultuur protocollen en Fabio Sacco voor hulp bij aanvullende cijfers.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biopsy punch (1mm) | Miltex | 33-31AA | Optional, replaces rotary tool set up |
| Blunt needles | Janel, Inc. | JEN JG18-0.5X-90 | Remove plastic and attach to Tygon tubing |
| Coverslips | Any | 24 x 60 mm are preferred | |
| Cutting Mat and blades | Silhouette America or Nicapa | www.silhouetteamerica.com/shop/blades-and-mats | Re-use/Disposables |
| Double-sided tape | Scotch/3M | 667 | Small amounts, any width or brand |
| PEEK tubing | IDEX/any | 1581L | Different configurations available. Consider using Tygon tubing intead, if not already using PEEK |
| PET/EVA thermal laminate film | Scotch/3M & Transcendia | TP3854-200,TP5854-100 & transcendia.com/products/trans-kote-pet | 3 - 6 mil (mil = 1/1000 inch) laminating pouches or rolls. |
| PVC film - Cling Wrap | Glad / Any | Food wrapping | |
| Rotary tool-drill | Dremel/Any | 200-121 or other | 1/32 and 3/64" drill bits from Dremel recommended |
| Rubber Roller | Speedball | 4126 | To facilitate adhesion, any brand will work |
| Scissors & tweezers | Any | Fiskars-Inch-Titanium-Softgrip-Scissors |Cole-Parmer –# UX-07387-12 | Quality brands are recommended |
| Silhouette CAMEO Craft cutter | Silhouette America | www.silhouetteamerica.com/shop/cameo/SILHOUETTE-CAMEO-3-4T | Preferred craft cutter |
| Silhouette Studio software | Silhouette America | www.silhouetteamerica.com/software | Controls the craft cutter and provides drawing tools (free download MAC and PC) |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus or New Era | 70-4504 or NE-300 | Pumps are ideal, pipettes or burettes can be used. |
| Syringes | Any | 1-3mL | |
| Thermal laminator | Scotch/3M | TL906 | Standard home/office model |
| Tygon tubing (E-3603) | Cole-Parmer | EW-06407-70 | Use with blunt needle tips |
| Vinyl furniture bumpers | DerBlue/3M/ Everbilt | Clear, self-adhesive (6 x 2 mm and 8 x 3 mm) | Round bumpers are recommended |
References
- Xia, Y., Whitesides, G. M.
- Beebe, D. J., Mensing, G. A., Walker, G. M. Physics and Applications of Microfluidics in Biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 4 (1), 261-286 (2002).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3 (1), 335-373 (2001).
- Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).
- Berthier, E., Young, E. W. K., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia. Lab on a Chip. 12 (7), 1224 (2012).
- Zhang, B., Korolj, A., Lai, B. F. L., Radisic, M.
- Bartholomeusz, D. A., Boutte, R. W., Andrade, J. D. Xurography: rapid prototyping of microstructures using a cutting plotter. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (6), 1364-1374 (2005).
- Martínez-Hernández, K. J., Rovira-Figueroa, N. D., Ontiveros, F. Implementation and Assessment of Student-Made Microfluidic Devices in the General Chemistry Laboratory. , (2016).
- Levis, M., et al. Microfluidics on the fly: Inexpensive rapid fabrication of thermally laminated microfluidic devices for live imaging and multimodal perturbations of multicellular systems. Biomicrofluidics. 13 (2), 024111 (2019).
- Subramaniam, A., Sethuraman, S. Chapter 18 - Biomedical Applications of Nondegradable Polymers. Natural and Synthetic Biomedical Polymers. , 301-308 (2014).
- Yuen, P. K., Goral, V. N. Low-cost rapid prototyping of flexible microfluidic devices using a desktop digital craft cutter. Lab Chip. 10 (3), 384-387 (2010).
- Oya, K., et al. Surface Characteristics of Polyethylene Terephthalate (PET) Film Exposed to Active Oxygen Species Generated via Ultraviolet (UV) Lights Irradiation in High and Low Humidity Conditions. Journal of Photopolymer Science and Technology. 27 (3), 409-414 (2014).
- Narciso, C. E., Contento, N. M., Storey, T. J., Hoelzle, D. J., Zartman, J. J. Release of Applied Mechanical Loading Stimulates Intercellular Calcium Waves in Drosophila Wing Discs. Biophysical Journal. 113 (2), 491-501 (2017).
- Suh, Y. K., Kang, S. A Review on Mixing in Microfluidics. Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).
- Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing. Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).
- Weibel, D., Whitesides, G.
- Chen, X., Li, T., Shen, J. CO2 Laser Ablation of Microchannel on PMMA Substrate for Effective Fabrication of Microfluidic Chips. International Polymer Processing. 31 (2), 233-238 (2016).
- Chen, X., Shen, J., Zhou, M. Rapid fabrication of a four-layer PMMA-based microfluidic chip using CO2-laser micromachining and thermal bonding. Journal of Micromechanics and Microengineering. 26 (10), 107001 (2016).
